专利名称：：蛤蟆油在制备治疗、预防免疫功能异常所致疾病药物中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及蛤蟆油的新用途，尤其是公开一种蛤蟆油在制备治疗、预防免疫功能异常所致疾病药物中的用途，属于医药
技术领域：
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背景技术：
：蛤蟆油是东北长白山地区道地药材，为中国林蛙(RanatemporariachensinenssDavid)雌体的输卵管干制品，在我国及东南亚地区有广泛的药用基础。目前，随着现代科技水平的进步，国内学者对蛤蟆油的研究也越来越深入和广泛。蛤蟆油为营养滋补强壮佳品，其味甘、咸，性平，归肾、肺经；具有补肾益精、养阴润肺之功效，对阴虚体弱、神疲乏力、心悸失眠、盗汗不止、痨嗽咳血等症有良好疗效。现代药理学研究表明，蛤蟆油具有明显的抗应激、促进生长发育、提高机体免疫功能、抗疲劳、抗衰老等药效，用于治疗病后及产后虚弱、气血亏损、精力耗损、免疫功能低下、记忆力不佳、神经衰弱等病症和一些消耗性疾病。此外，对改善肿瘤病人放、化疗的不良反应和抗衰老、美容养颜、提高体能等方面也有令人十分满意的效果。许多疾病的发生、发展与机体免疫系统的功能失调有着密切的联系，因此从调节机体免疫功能入手治疗疾病已受到广泛的重视。如果正常机体的免疫系统不能对衰老、变性细胞进行调控，相应组织器官就会发生病变；如肿瘤的发生，当机体内正常细胞发生突变转化成肿瘤细胞时，免疫系统可对肿瘤细胞产生一系列免疫应答，消灭肿瘤细胞。但当机体免疫功能下降时，肿瘤就可逃避免疫监视而在体内发生发展。又如艾滋病等疾病也为机体免疫系统受累导致免疫功能低下所致，因此，通过提高患者免疫功能来增强机体抗病力的治疗方法受到广泛关注。提高免疫功能，可帮助免疫低下的病人抵御疾病，但过度的免疫反应同样会产生疾病，如过敏性疾病与自身免疫病等。人类生存的环境中有大量能引起免疫应答的物质(过敏原)，接触这些抗原不仅能够产生保护性免疫应答，也可引起组织损伤，引起过敏性疾病。外源性的过敏原存在于微生物、灰尘、花粉、食物、药物化学物品以及用于临床治疗的血清制品等物质中。常见疾病有过敏性鼻炎、哮喘、荨麻疹、接触性皮炎等。而自身免疫病则是免疫系统攻击自身组织成分，引起的组织损伤。常见有I型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症等。针对不同疾病和不同对象，而选择增强还是降低免疫功能，因此，对于免疫调节药物的研究巳成为医学研究的重点。经检索，有关哈蟆油具有免疫调节作用目前尚未见到相关文献报道。
发明内容本发明提供一种哈蟆油在制备治疗、预防免疫功能异常所致疾病药物中的用途，用于自身免疫疾病的预防和治疗。所述治疗、预防免疫功能异常所致疾病涉及的疾病，包括过敏性疾病、风湿性关节炎、过敏性哮喘、慢性疲劳、I型糖尿病、枯草热、红斑狼疮及多发性硬化症、重症肌无力、慢性非特异性溃疡性结肠炎、慢性活动性肝炎、恶性贫血与萎縮性胃炎、自身免疫性肾小球肾炎、艾滋病、肿瘤等免疫功能异常所致疾病。以下药理实验证明本发明的治疗效果1、哈蟆油对小鼠脾T淋巴细胞亚群的影响机体的免疫应答由细胞免疫和体液免疫组成，T淋巴细胞是执行特异性细胞免疫的免疫活性细胞，CD3存在于所有成熟T细胞膜表面，通常与T细胞抗原受体结合，联结CD3-TCR复合体，介导抗原刺激反应。T淋巴细胞按其功能可分为CD4+和CD8+两个亚群，CD4+T细胞亚群通过合成和分泌细胞因子发挥其辅助性和效应性功能；CD8+T细胞具有细胞毒性功能，还可通过分泌细胞因子参与细胞免疫应答及免疫调节，各功能亚群之间是相互联系、相互促进、相互制约的。CD47CD8+的动态平衡反映了机体免疫调控状态和免疫水平，CD47CD8+降低标志着机体细胞免疫功能抑制。另外CD4+T细胞亚群介导的是一种迟发性细胞免疫，与机体炎症的发生密切相关；CD8+T细胞亚群可以抑制炎症的发生，CD4+和CD8+细胞功能异常，可导致体液免疫增强，引起B细胞功能亢进，而导致免疫球蛋白分泌失控，产生大量免疫球蛋白，其中亦包括自身抗体在内；反之则相反。因此脾细胞中的T淋巴细胞亚群水平，尤其是CD4+T细胞亚群、CD47CD8+是决定机体免疫状态和免疫水平的中心环节，是反映机体免疫系统内环境稳定状况的重要指标。从实验结果可以看出，正常小鼠在接受大剂量J射线照射后，与空白对照组比较，其脾淋巴细胞中CD3+、CD4+T细胞亚群和CD47CD8+明显增高(P<0.001)，CD4+和CD47CD8+极显著增高，表明T细胞亚群异常。CD4+T细胞的增高不仅能导致产生多种淋巴因子的能力增强，而且还导致协助B细胞产生抗体和辅助其它细胞亚群等功能增强，影响细胞免疫反应及抗体形成，从而使机体免疫功能增强，说明实验鼠出现免疫机能增强；而CD8+T细胞亚群水平降低，是由于其与CD4+T细胞亚群动态平衡所致。在对免疫力增强小鼠进行灌胃哈蟆油，CD3+、CD4+T细胞亚群和CD47CD8+明显降低(P<0.001)，4CD8，细胞亚群水平增高，说明小鼠服用哈蟆油后，免疫力受到抑制，提示哈蟆油具有降低小鼠免疫功能的作用。2、哈蟆油对小鼠脾淋巴细胞中IL-2含量的影响IL-2是T细胞和自然杀伤(NK)细胞产生的相对分子量为15500的糖蛋白，在机体免疫应答中起重要作用。IL-2是由活化T细胞产生的多功能免疫应答调节剂，其最重要的作用是诱导T淋巴细胞增殖和分化。T细胞受多种刺激后产生IL-2，通过自分泌作用诱导T细胞自身增殖、分化和发挥功能。IL-2能增强CD8+细胞的杀伤活性，诱导其IL-2受体的表达，诱导各效应细胞分泌干扰素(IFN)-y、IL-4、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)等细胞因子，从而增强机体免疫功能。实验结果显示，正常小鼠在接受大剂量/射线照射后，与空白对照组比较，脾淋巴细胞中的IL-2含量极显著性下降，说明大剂量X射线照射能够抑制小鼠脾内单核巨噬细胞分泌IL-2的能力，从而引起机体免疫功能降低。在对免疫力低下小鼠进行哈蟆油溶液灌胃后，三个剂量组小鼠的IL-2水平均出现极显著性升高，说明哈蟆油能促进IL-2分泌，增强机体免疫力。具体试验步骤如下1、哈蟆油对小鼠脾T淋巴细胞亚群的影响采用流式细胞术(FCM)测定小鼠脾脏中CD3+、CD4+、CD8+的含量。流式细胞术是根据所测定的细胞性质的不同组合，从细胞群体中把某个亚群分选出来，并对它的功能和形态学进行研究后进一歩培养分析。流式细胞术具有快速、灵敏和同时进行多参数检测等优点，具体操作如下1.1小鼠脾淋巴细胞悬液的制备50只ICR小鼠，20士2g，雌性，随机分为5组，每组10只，一组为空白对照组，二组为模型对照组，每日灌胃蒸馏水一次，剂量10ml/kg，其余三组分别灌胃不同剂量的哈蟆油混悬液(分别相当于生药0.4g、0.6g、lg)，每日灌胃一次，各组每天称重，记录。釆用急性放射性损伤造成小鼠免疫力异常模型制备后24h，断头处死，无菌取脾，置于含2.5%胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲液溶液(PBS)中，经轻柔研磨吹打后制成细胞悬液，以Ficoll液用密度梯度法分离得到小鼠脾脏的单个核细胞，经PBS离心，洗涤两次后，细胞重悬于PBS中。-2(TC保存。1.2CFDA-SE标记淋巴细胞羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)用DMSO溶解成5mmol/L的储存液，-20。C保存。临用前，取适量用PBS稀释成2,01几、4拜ol/L、10,ol/L的系列工作液，平衡至室温备用。用PBS调整上述制备的细胞悬液密度为2X107ml,取500W加入等体积的CFM-SE工作液(终浓度分别为lnmol/L、2,ol/L、5,ol/L),细胞染色体系为lml，充分混匀，在37。C条件下轻轻振荡8min。迅速用预冷的含10%FBS的PBS洗涤细胞3次。悬浮于含10%FBS的IMDM完全培养液中，并调整细胞密度为2X107ml。L3实验结果实验结果见表l，与空白对照组比较，模型组小鼠的脾T淋巴细胞亚群CD3、CD4水平和CD4/CD8比值明显升高，CD8水平略有下降；此结果说明当免疫增强时，哈蟆油有降低免疫力的作用。表l哈蟆油对小鼠脾T淋巴细胞亚群的影响(5±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注与空白对照组比较，A为P〈0.05，AA为P〈0.01;AAA为P〈0.001;与模型组比较，*为P〈0.05,**为？<0,01;***为？<0.001。2哈蟆油对免疫力低下小鼠脾淋巴细胞中IL-2含量的影响采用ELISA法测定小鼠脾淋巴细胞中IL-2的含量。ELTSA是酶联接免疫吸附剂测定法(Enzyme-L]'nkedI誦unosorbnentAssay)的简称，它是以免疫学反应为基础，将抗原的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。2.1小鼠脾淋巴细胞悬液的制备同1.1项2.2标准曲线的建立及样品测定将试剂盒中标准品用300u1蒸馏水溶解，洗涤液按1:20稀释，显色前510分钟将OPD放入底物稀释液中溶解。设标准孔8孔，每孔加样品稀释液100|jl，第一孔加标准品10(^1，混匀后移入第二孔10(Hi1，如此反复作对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出10(Vl弃去，第八孔为空白对照。再向待测品孔中各加入100|al待测样品，将反应板置37。C，120min，用洗涤液将反应板充分洗涤46次，继续加入抗体工作液lOOfxl，置37。C,120min，重复三次，每孔加入终止液硫酸，使成深黄色，在492nm处测定吸光度。2.3结果统计所有0D值为减除空白值后的计算值。以1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、Opg/ml所对应0D值作标准曲线，小鼠IL-2浓度与0D值成正比，根据样品0D值在标准曲线图上查出对应小鼠脾淋巴细胞中IL2含量，结果进行统计学处理。结果见表2，与空白对照组比较，模型组小鼠的脾T淋巴细胞中IL-2含量明显下降；与模型组比较，哈蟆油水溶液三个剂量组小鼠的脾T淋巴细胞中IL-2含量有极显著性升高，其中低、中剂量组的上升趋势与给药量成正比，高剂量组的IL-2含量略有下降。表2哈蟆油水溶液对小鼠脾T淋巴细胞中IL-2含量的影响G±s，n=10)空白对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组OD值i.n±o.04林*0.82±0.061.13±0.08AAA1.44±0.07***AAA0.97±0.09**AAA浓度(pg/ml)253.4±24.28憎105.3±9.77157.4±10.22***AAA207.4±14.73***AAA131.4±16.65***AAA注与宇:白对照组比较，a为p〈0.05，aa为p〈0.01;aaa为p〈0.001;丄j模型组比较，*为p〈0.05，**Aip<o.oi;***;/jp<o.ooi。具体实施例方式哈蟆油和/或哈蟆油中提取的免疫调节活性部位/成分可以制成各种制剂，如新技术制剂如微囊、微球、缓释、脂质体、类脂质体等；口服剂型如片剂、颗粒剂、散剂、合剂、糖浆剂、胶囊剂、滴丸等；还可以制成注射剂和膜剂、巴布剂、栓剂、软膏剂、凝胶剂等外用制剂；以及气雾剂、喷雾剂、粉雾剂等。权利要求1.哈蟆油在制备治疗、预防免疫功能异常所致疾病药物中的用途。2.权利要求1所述治疗、预防免疫功能异常所致疾病涉及的疾病，包括过敏性疾病、风湿性关节炎、过敏性哮喘、慢性疲劳、I型糖尿病、枯草热、红斑狼疮及多发性硬化症、重症肌无力、慢性非特异性溃疡性结肠炎、慢性活动性肝炎、恶性贫血与萎縮性胃炎、自身免疫性肾小球肾炎、艾滋病、肿瘤等免疫功能异常所致疾病。全文摘要本发明公开一种哈蟆油在制备治疗、预防免疫功能异常所致疾病药物中的用途。本发明采用流式细胞术及ELISA法，通过小鼠脾T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8和CD4/CD8比值的结果表明，在免疫增强时，哈蟆油具有降低免疫力的作用；通过小鼠T淋巴细胞中IL-2含量的结果表明，当免疫力低下时，哈蟆油具有增强免疫力的作用，证明哈蟆油具有免疫调节作用。这种新用途表明哈蟆油对免疫功能失衡疾病如哮喘、自身免疫疾病、肝炎和肿瘤具有治疗作用，开发了哈蟆油在制备治疗、预防免疫功能异常所致疾病药物中的用途。文档编号A61K35/56GK101637478SQ20091006727公开日2010年2月3日申请日期2009年7月15日优先权日2009年7月15日发明者洋于,姜大成,孙黎黎,张炜煜,李春影,雪杨,肖井雷,里范,蔡广知申请人:长春中医药大学