5,6,7,4′-四羟基黄酮的制备方法及其在药物中的应用的制作方法

专利名称：：5,6,7,4′-四羟基黄酮的制备方法及其在药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药学
技术领域：
，具体地说是以灯盏花素为原料制备5，6，7,4'-四羟基黄酮的方法，以及5,6,7,4'-四羟基黄酮在治疗老年性痴呆症、记忆衰退、糖尿病、关节炎、癌症、骨质疏松的药物中的应用。技术背景灯盏花^/gera"6"vhca;^(Vant.)Hand-Mazz又名灯盏细辛，属菊科短亭飞蓬类植物，具有活血化瘀、散寒解表、舒经活络等功效，临床常用于治疗心脑血管疾病。灯盏花素系从灯盏花全草中提取出的黄酮类有效成分，其主要成分为灯盏花乙素，此外还含有灯盏花甲素等多种成分。目前，灯盏花素在国内多个厂家已实现了大规模批量生产，并被作为原料药广泛使用，市场上销售的灯盏花素一般含灯盏花乙素在80-90%左右。灯盏花素在心脑血管疾病治疗方面的应用已有很多的文献报道，临床应用表明具有增加脑、冠状血管血流量，降低血管阻力，抗血小板、红细胞凝聚，降低血液粘稠度等作用，疗效确切。5,6，7,4'-四羟基黄酮为灯盏花乙素的苷元，又称野黄芩素，1989年Wollenweber,E.等人[1]首次报道了从天然植物Centaurea/MM中提取、分离得到了该化合物，此后，又相继有人[2、3、4]报道了从灯盏花等不同植物中也提取、分离得到了该化合物。虽然从上述天然植物中可以提取、分离得到5，6,7，4'-四羟基黄酮，但由于该化合物在植物中的存在量极低，兼之提取、分离方法复杂，收率低，因此采用植物提取的方法获取较大量的5,6,7,4'-四羟基黄酮基本是不能现实的。为大规模获取5，6，7,4'-四羟基黄酮，采取人工合成或半合成方法进行制备是一种较为理想的选择。化学上，通过酸水解苷类物质来制备相应的苷元是一种较为常用的方法，5，6,7,4'-四羟基黄酮为灯盏花乙素的苷元，故可通过传统的酸水解方法由灯盏花乙素来进行制备。中国专利CN1683357A(申请号200410033687.5)便采用了这种方法，即将灯盏花乙素在浓度为3-20%的硫酸、盐酸、磷酸或硝酸水溶液中加热反应制得灯盏花乙素苷元(即5,6，7，4'-四羟基黄酮)。采用这种方法时，由于灯盏花乙素在水中基本不溶，即使在浓度高达20%的强酸溶液中也只能部分溶解，导致原料与反应介质不能充分接触，反应属于非均相反应，4因此酸水解反应相当困难。为促进反应的进行，需将反应体系中的酸浓度提高，甚至是直接使用原酸浓度的酸，然而，在如此高浓度强酸的作用下，灯盏花乙素本身极易发生复杂的氧化、裂解、磺化或硝化等诸多副反应，使得产物杂质多，后处理困难，产品收率极低。另外，该方法由于使用高浓度强酸，对设备、安全及环保方面的要求均较为苛刻，因此，很难实现工业化大规模生产。目前，5，6,7，4'-四羟基黄酮(即灯盏花乙素苷元)在抗心脑血管疾病和抗癌方面的药理作用和应用已有研究和报道，如中国专利CN1657042A(申请号200410039161.8)公开了灯盏花乙素苷元在制备治疗或预防脑卒中、心脑血管疾病药物中的应用，中国专利CN1657061A(申请号200410043991.7)公开了灯盏花乙素苷元或其药学上可接受的盐类与中、西药物组方在治疗或预防心脑血管疾病药物中的应用。有文献[2]研究了5,6，7,4'-四羟基黄酮对蛋白激酶C(PKC)的抑制作用，认为5,6,7,4'-四羟基黄酮具有很强的PKC抑制作用，其PKC抑制作用明显强于灯盏花乙素等黄酮类化合物，并认为5,6,7，4'-四羟基黄酮对PKC的抑制作用属非竟争性抑制。有人对5,6,7，4'-四羟基黄酮在动物体内的药代及动力学进行了研究，认为动物口服5,6,7,4'-四羟基黄酮后的代谢产物为灯盏花乙素[5]，其药动学行为呈非线性[6〗，并认为5,6,7,4'-四羟基黄酮口服易于吸收，与灯盏花乙素相比，其相对生物利用度为301.8%[7]。目前，5，6,7,4'-四羟基黄酮在治疗老年性痴呆症、记忆衰退、糖尿病、关节炎、骨质疏松的药物应用方面的研究尚无文献和专利报道。参考文献[l]Wollenweber，E.etal.,ExudatefalvonoidsinmiscellaneousAeteraceae，;一oc/7e肌扁"21，19.1989。[2〗徐光，等.野黄芩苷元及其类似物对蛋白激酶C的抑制作用.上海医科大学学报,1993,20(3),187-191。[3]Babu,G.J.,Naidu，K.C.,andGanapatyr,S..phytoconstituentsfromthestemofp/w附/en'.ZV"i/g51，35，514,1998。[4]Tian,Guilian;Zhang,Ubin;Zhang,Tianyou;Yang,Fuquan;Ito,Yoichiro.SeparationofflavonoidsfromtheseedsofF^wom'ota加/e/附/w"'caWilldbyhigh-speedcounter-currentchromatography.JournalofChromatographyA,2004,1049(1-2)，219-222。[5]车庆明，等.灯盏花乙素苷元的胆汁排泄研究.中国中药杂志，2006，30(20)，1710-1712。[6]车庆明，等.灯盏花乙素苷元不同给药剂量的大鼠药动学比较.中国新药杂志，2006,15(18)，1557-1561。[7]车庆明，等.灯盏花乙素苷元的药动学研究.中国药学杂志，2007，42(18)，1418-1421。[8]张均田.现代药理实验方法.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998。
发明内容本发明提供了一种以市售灯盏花素为原料，通过酸催化醇解方式制备5，6,7,4'-四羟基黄酮的新方法。本发明的另一目的是提供5,6，7,4'-四羟基黄酮在制备用于治疗老年性痴呆症、记忆衰退、糖尿病、关节炎、癌症、骨质疏松的药物中的应用。本发明的5，6,7，4'-四羟基黄酮的制备方法是以灯盏花素为原料，采取酸催化醇解方式，即将灯盏花素在含有催化量的酸的醇溶液中加热回流反应，制得5,6,7，4'-四羟基黄酮。具体为用灯盏花素原料1220g，加入醇类物200500ml和浓度为45%的酸13ml，加热回流反应，产物经过滤，烘干至恒重，得5,6,7，4'-四羟基黄酮。再用甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯等溶剂重结晶，过滤，烘干至恒重，得纯度为9599.9%的精品。上述方法中，所述的灯盏花素是指通过植化提取或人工合成方式获得的主要含有式II化合物一灯盏花乙素的黄酮类化合物，其中，式11化合物的含量大于或等于50%。式II上述方法中，所述的醇为ci-cio的一元醇、二元醇或二元以上多元醇中的任何一种，或由它们以任意比例组成的混合物。其中，优选的醇为C2-C5的一元醇、二元醇或三元醇中的任何一种，或由它们以任意比例组成的混合物；最优选的醇为乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇中的任何一种，或由它们以任意比例组成的混合物。上述方法中，所述的酸为硼酸、草酸、醋酸、磷酸、盐酸、硫酸、硝酸、高氯酸中的的任何一种，或由它们以任意比例组成的混合物。其中，优选的酸为磷酸、盐酸、硫酸。上述方法中，反应体系中的酸/醇(w/w)比例为0.00001/10010/100,优选的酸/醇(w/w)比例为0.0001/1001/100，最优选的酸/醇(w/w)比例为0.001/1000.1/100。采用上述方法制得的5，6,7,4'-四羟基黄酮，粗产品纯度达95%以上，理论收率为85%左右。所得产品用甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯等溶剂重结晶，纯度可达99%以上，不仅可作原料药使用，而且可以作为对照品。本发明制备的5,6,7，4'-四羟基黄酮化合物用于制备治疗老年性痴呆症、记忆衰退、糖尿病、关节炎、癌症、骨质疏松的药物。每天使用剂量为0.00120000毫克，优选的剂量范围为0.015000毫克，最优选的剂量范围为12000毫克，每天一次或分数次给药。以下是式I化合物的性能和急性、慢性毒性实验和药理作用实验。一、式I化合物的结构鉴定与波谱数据化学名称:5，6,7，4'-四羟基黄酮分子式Cl5H10O6分子量:286结构波谱数据:UVmax(MeOH)(Abs.):205(0.41)，219(0.45),294(0.33),349(0.27)nm.IRmax:3535，3428，1741，1660，1606，1506，1464，1351，834cm-1.'H(500MHz，DMSO-^)and13CNMR(125MHz，DMSO-c/6):见表1.PositiveFABMS:附々287[M+H]+,PositiveHRFABMSw/z287.0559[M+H]+，calcdforCi5Hu06，287.0555.表1.式I化合物的13C和'HNMR数据2(inDMSOO2(inD20)a'4)No13C13C2163.5164.2102.36.57(s)102.96.57(s)4182.0182.7153.3154.06129.2129.9了147.1147.7893.96.72(s)94.66.73(s)9149.7150.410104.0104.71，121.5122.22',6'128.37.90(d,8.45)129.17.903'，5'116.06.91(d，8.45)116.66.914,161.0161.7a)文献[4]报道数据二、式I化合物急性、慢性毒性实验实验l:单次灌胃对小鼠的急性毒性实验受试药物式I化合物(由昆明制药集团股份有限公司提供，批号为2007011)，临用前用0.5%羧甲基纤维素钠碾磨均匀，配成浓度为O.lg/ml的悬浮液。试验动物ICR小鼠18-22g，40只，雌雄各半(由昆明制药集团股份有限公司动物实验室提供，生产许可证号SCXK(滇)2005-0006，使用许可证号SYXK(滇)2005-0006)。试验方法与结果选取健康ICR小鼠，体重20士2g，20只，雌雄各半，对小鼠一次灌胃式I化合物浓度为0.1g/ml的悬浮液0.8ml/20g体重，连续观察7d，小鼠活动正常、敏捷，未引起死亡或异常反应。限于给受试样品浓度和体积不能再增大，故进行最大耐受量试验另选择健康ICR小鼠20只，体重20土2g，雌雄各半，每鼠灌胃式I化合物浓度为O.lg/ml的悬浮液0.2ml/20g，每隔2h灌胃一次，共6次，此后连续观察7d，此期间让小鼠自由进食和饮水，观察期间小鼠活动正常、敏捷，未引起死亡或异常反应。由此可知，式I化合物的最大耐受量不小于6g/kg体重(计算公式0，0"6"000/20-6g/kg体重),属于实际无毒级化合物，服用安全。实验2:静脉注射对小鼠的急性毒性实验受试药物式I化合物(由昆明制药集团股份有限公司提供，批号为2007011)，临用前溶于丙二醇土温80:水为l:I:8的溶剂中待用。试验动物ICR小鼠18-22g，60只，雌雄各半(由昆明制药集团股份有限公司提供，生产许可证号SCXK(滇)2005-0006，使用许可证号SYXK(滇)2005-0006)。试验方法选取健康ICR小鼠，体重20士2g，60只，雌雄各半，分为6组，每组IO只第1、2、3、4、5组为受试药物组，给药剂量分别为0.9g/kg、1.05g/kg、1.25g/kg、1.45g/kg、2.00g/kg，第6组为溶剂组(注射等体积的丙二醇土温80:水为l:1:8的溶剂)。各组小鼠尾静脉注射给受试药物，观察给药后14天内小鼠的中毒及死亡情况，未死亡小鼠于第14天称重后处死，解剖，检査各脏器是否有病变。用Bliss法计算静脉注射给予式I化合物对小鼠的LD50及其95%可信限。结果死亡小鼠经尸检，肉眼检査各脏器，未见明显病变。未死亡小鼠于给药后第14天断颈处死，解剖，肉眼检査各脏器未见明显异常。根据试验结果，计算得出静脉注射给予式I化合物对小鼠的LDso为1.256g/kg，其95%可信限为1.105-1.468。实验3:慢性毒性试验实验受试药物式I化合物(由昆明制药集团股份有限公司提供，批号为2007011)，用前用0.5%羧甲基纤维素钠碾磨均匀，配成浓度为0.1g/ml的悬浮液。试验动物SD雄性大鼠，体重200-250g(由昆明医学院实验动物中心提供，生产许可证号SCXK(滇)2005-0008，使用许可证号SYXK(滇)2005-0008)。试验方法与结果SD雄性大鼠30只，体重200-250g，分为3组，每组10只。式I化合物按lg/kg、0.5g/kg、0.1g/kg剂量分别灌胃3个月后检测得知，对肝肾功能、周围血象、行为、大小便常规均无明显影响，对心、肝、肺等重要器官的病理学检査也未发现异常。三、式I化合物对治疗老年性痴呆症的药理作用实验试验材料式I化合物，由昆明制药集团股份有限公司药物研究院提供，批号为2007011，临用前用0.5%羧甲基纤维素钠碾磨均匀，配成所需浓度的悬浮液；致老年痴呆药物Amyloide-蛋白(APl-42片段)，分子量4514.1，sigma公司产品；阳性对照药双益平(石杉碱甲片)，上海医科大学制药厂出品，批号2007001。试验动物ICR小鼠18-22g，60只，雌雄各半，由昆明制药集团股份有限公司动物实9验室提供，生产许可证号SCXK(滇)2005-0006，使用许可证号SYXK(滇)2005-0006。试验方法及结果分组及给药ICR小鼠60只，随机分为6组，每组10只，即式I化合物高剂量(40mg/kg)、中剂量(20mg/kg)、低剂量(10mg/kg)组，双益平阳性对照组(20mg/kg)组，空白对照组及正常对照组。造模次日开始给药，连续20d每天灌胃一次。A0所致小鼠痴呆模型制备除正常组外，各组小鼠腹腔注射0.45%戊巴比妥钠0.1ml/kg体重麻醉，碘酒、酒精消毒头顶皮肤后，纵向正中切开颅顶皮肤，暴露颅骨，在bregzna点后2.0mm左右处用注射器钻一小孑L，以5ul注射器缓速注入2U1AP溶液，浓度为8ixg/ul，25分钟内注射完毕，留针5分钟，取出注射器，缝合皮肤。水迷宫法实验水迷宫法实验按morris法进行，水迷宫直径为60cm，水池深30cm，水深25cm,水温25士rC，整体为一黑色铁桶。池壁上漆有白色的符号，如三角形、目形、波浪形、长方形。并标有东、西、南、北4个入水点，将池分成四个相等的象限，分别为SW、NW、SE、NE象限。在任一象限正中放置一直径为10cm、高24cm的圆形活动黑色平台作为安全岛，安全岛平台面低于水面lcm左右。训练期间迷宫外参照物的位置保持不变。整个实验历时四天(分别于造模后第14、15、16、17d进行)，每天进行4次。实验时，操作者随机选择一个入水点，将小鼠面向池壁放入水中，4次实验分别从不同象限放入水中。由摄像机和计算机自动跟踪、拍摄及统计小鼠由入水点入水后寻找到安全岛所需时间(寻找安全岛潜伏期，SPL)为学习记忆成绩。如在60s内未能找到安全岛，实验者将小鼠诱导至安全岛上，此时SPL按60s计算。避暗实验避暗实验在避暗箱中进行，避暗箱分为明、暗两室，明室上方以钨灯照明，暗室的底部铜栅通以38V交流电。两室之间设4cm的圆孔。造模后18d将各组大鼠分别放入明室，利用大鼠嗜暗的特性让其钻入暗室，然后关闭小门，进行通电、电击30s后放出，使其获得记忆。24h进行测试，记录小鼠第l次进入暗室的时间为潜伏期，以及小鼠5min内进入暗室的次数作为错误次数。跳台法实验各组小鼠末次给药后进行跳台法实验。跳合法实验采用反应箱进行，反应箱底铺有通36V电的铜栅，箱内设一绝缘的平台。实验时，将动物放入反应箱内适应环境3min，然后立即通以36V的交流电。动物受到电击，其正常反应是跳回平台，以躲避伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至桐栅上，即为错误反应，持续训练5min，记录每鼠5min内出现错误反应的次数，以此作为学习成绩。24h后重复作试验，即记忆保持试验。记录动物第一次跳下平台的潜伏期和3min内的错误总数，计算动物3min内出现错误反应的频率。表2式I化合物对老年性痴呆症模型小鼠的水迷宫法实验结果(XiSD,n-lO)剂量寻找安全岛潜伏期(SPL)组别(mg/kg)造模后14天造模后15天造模后16天造模后17天空白对照组0.5%43.7±22.340.4±20.438.7±19.537.7±10.2CMCNa式I化合物低剂量组1042.8±22,140.7±22.738.1±19.833.4±11"式I化合物中剂量组2041.2±23.635.9土16，30.8±11.4**26.7±8.2**式I化合物高剂量组4039.7±21.2*28.9±10.7**22.7±7.1**20.9±4.8**双益平阳性对照组2040.9±21.5*32.2±13.3*23.6±6.8**21.2±9.5**正常对照组0.5%36.2±22.2**26.4±6.6**21.3±7.6"19.7±5.4**CMCNa与空白对照组比较:*P<O.05,**P<O.01表3式I化合物对老年性痴呆症模型小鼠的避暗实验结果(XiSD，n40)剂量潜伏期及改善率错误次数及错误减少率组别(mg/kg)潜伏期(s)改善率(％)5min内错误次数错误减少率(％)空白对照组0,5%35.9±12.1-5.4±1.6-CMCNa式I化合物低剂量组1054.1±16.550.73.6±1.233.3式I化合物中剂量组2058.9±13.564.12.8±1.348.1式I化合物高剂量组.4064.9±11.580.82.3±0.957.4双益平阳性对照组2053.2±17.248,23.5±1.735.2正常对照组0.5%64.2±15.178.82.4±1.555.6CMCNa表4式I化合物对老年性痴呆症模型小鼠的跳台法实验结果(X士SD，1^10)组别剂量训练试验24h后记忆保持试验(mg/kg)5min错误次较空白组错误3min内错误次较空白组错误数减少率(％)数减少率(％)空白对照组0.5%3.6±1.7-1.7±1.6-CMCNa式I化合物低剂量组102.9±1.619.40.8±1.152.9式I化合物中剂量组201.8±0.750.00.4±0.776.5式I化合物高剂量组401.3±0.963.90.5±0.370.6双益平阳性对照组201.2±1.566.70.3±0.882.4正常对照组0.5%1.4±0.861.10.8±0.552.9CMCNa由上述实验结果证明，式I化合物对老年痴呆模型小鼠脑记忆的获得、巩固和再现均表现出明显的增强作用，提示具有抗痴呆作用。四、式I化合物对樟柳碱致脑记忆衰退模型小鼠的药理作用实验试验材料式I化合物，由昆明制药集团股份有限公司药物研究院提供，批号为2007011，临用前用0.5%羧甲基纤维素钠碾磨均匀，配成所需浓度的悬浮液；樟柳碱(Anisodine)，由Sigma公司生产；阳性对照药达纳康(Tanakan)，由法国博福一益普生制药工业公司生产。试验动物ICR小鼠18-22g，60只，雌雄各半，由昆明制药集团股份有限公司动物实验室提供，生产许可证号SCXK(滇)2005-0006，使用许可证号SYXK(滇)2005-0006。试验方法及结果分组、给药及模型制备取ICR小鼠60只，随机分为6组，每组10只，即正常对照组，空白对照组，式I化合物高剂量(40mg/kg)、中剂量(20mg/kg)、低剂量(10mg/kg)组，达纳康阳性对照组(20mg/kg)组。各组小鼠腹腔注射樟柳碱5mg/kg体重,30min后，按表5剂量灌胃给受试样品，连续给药20d，经Y型迷宫实验和跳台法实验测定小鼠的学习记忆能力。Y型迷宫实验Y型迷宫，有3个臂，相邻的两个臂夹角为120度，每臂为30cmx10cmxlOcm。3臂中，只有一臂为安全区，迷宫底部铺以铜栅电极。安全区铺铜栅，但不导电。试验时将动物放在非安全区的一臂的顶端，然后给予电击，动物慌忙逃窜，最后偶然进入12安全区，这时为训练一次，如此反复训练3次，记录第3次到达安全区所需的时间(s)。24h后，重复测试，记录到达安全区时间。每组小鼠均需完成此试验。跳台法实验各组小鼠末次给药后进行跳台法实验。每鼠持续训练5min，记录每鼠5min内出现错误反应的次数。24h后重复作记忆保持试验，记录动物第一次跳下平台的潜伏期和3min内的错误总数，计算动物3min内出现错误反应的频率。表5式I化合物对樟柳碱致脑记忆衰退模型小鼠的Y型迷宫实验结果(X士SD,1^10)剂量训练试验24h后记忆保持试验<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表6式I化合物对樟柳碱致脑记忆衰退模型小鼠的跳台法实验结果(X土SD，1^10)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由实验可知，式I化合物对M-胆碱能抑制剂樟柳碱所致脑记忆衰退模型小鼠的学习记忆功能有明显改善作用。五、式I化合物对治疗关节炎的药理作用实验试验材料:式I化合物，由昆明制药集团股份有限公司药物研究院提供，批号为2007011，临用前用0.5%羧甲基纤维素钠碾磨均匀，配成所需浓度的悬浮液；地塞米松注射液，批号0206101，天津金辉氨基酸有限公司提供；风湿宁注射液，批号604003，罗浮山业提供；Freund，s完全佐剂，Sigma公司产品，帮定生物技术公司提供；大鼠TNF-a，IL-1P定量试剂盒，Sigma公司产品，均由北京帮定生物技术公司提供。试验动物SD雄性大鼠，体重200-250g，70只，由昆明医学院实验动物中心提供，生产许可证号SCXK(滇)2005-0008，使用许可证号SYXK(滇)2005-0008。试验方法及结果分组及给药剂量SD雄性大鼠70只，随机分为7组，即正常对照组，空白对照组，西药对照组(地塞米松注射液2.0mg/kg)，中药对照组(风湿宁注射液5.0mg/kg),式I化合物高、中、低(2.0mg/kg，5.0mg/kg，10.0mg/kg)剂量组。造模与给药正常对照组大鼠右后足趾皮内注射生理盐水，其余各组于每只大鼠右后足跖皮内注射Freund's完全佐剂O.lm傲炎。并记录大鼠的右后足踝关节的周长。于造模后第9天开始颈背皮下注射给药，连续给药12d。每隔3d记录右后足踝关节肿胀情况，末次给药(造模后第2i天)m后处死大鼠。大鼠足肿胀的测量用记号笔标记右后足肿胀踝关节周径，每日以特制软皮尺测量踝关节周长(软皮尺无弹性，最小刻度为0.1cm)。关节炎指数(AI)的评分致炎后12日开始观察并记录全身病变程度，每3日1次。全身病变按5级评分法[8]评价，根据未注射佐剂的其余3只肢体的病变程度累计积分，计算出AI。0分无红肿；l分小趾关节红肿；2分趾关节及足跖肿胀；3分踝关节以下的足爪肿胀；4分包括踝关节在内的全部足爪肿胀。各个关节的积分累计即为每只大鼠的AI。大鼠炎性组织液中促炎因子TNF-a，IL-ie的测定大鼠致炎21d后处死，在致炎侧关节上方0.5cm处摘取肿胀足爪，纵向切开，放入5ml生理盐水的试管中4'C浸泡过夜，离心(3000r/min)，取上清液，按试剂盒说明书进行促炎因子TNF-a,IL-le的测定。表7式I化合物对Freund's完全佐剂致关节炎大鼠足肿胀的影响(X士SD,t^10)组别剂量药前药后mg/kg模后第8天模后第12天模后第15天模后第18天模后第21天空白对照组0.5%2.71±0.0452.73±0.0682.72±0.0472.70±0.0792.71±0.055CMCNa式I化合物22.70±0.0722.65±0.0542.62±0.0632.59±0.0552.57±0.062*低剂量组式I化合物52.72±0.0542.65±0.0712.61±0扁2.56±0.082*2.50±0.039*中剂量组式I化合物102.70±0.0742.61±0.0592.56±0駕*2.51±0.041*2.48土0.048"高剂量组地塞米松对22.69±0.0592.62±0.0812.54±0.079*2.53±0.059*2.52±0.082*照组风湿宁对照52.71±0.0782.66±0.0722.63±0.0592.60±0.0772.58±0駕*组正常对照组0.5%2.24±0.036**2.25±0.044**2.32±0.041**2.35土0.041"2.35士0.051"CMCNa与空白对照组比较*P<O.05，**P<O.01表8式I化合物对Freund's完全佐剂致关节炎大鼠关节炎指数(AI)的影响(X土SD，iFlO)组别齐!j量(mg/kg)给药前l天给药后6天给药后12天空白对照组0.5%CMCNa7.9±L09.2±1.38.6±1.6式I化合物低剂量组27.9±1.65.7±1.2*3.9±1.1"式I化合物中剂量组8.1±1.25.2±1.4*3.5±1.5**式I化合物高剂量组108.0±1.54.5±1.0**3.0±1.3**地塞米松对照组7.9±1.75.6±1.2*3.2±1.9**风湿宁对照组8.0±1.85.9±1.5*4.3±1.6**正常对照组0.5%CMCNa---与空白对照组比较*P<O.05,**P<0.()1泰9式I化合物对Freund，s完全佐剂致关节炎大鼠炎性组织液促炎因子TNF-a，IL-1e的影(X士SD，n40)组别剂量(mg/kg)TNF-aIL-10空白对照组0.5%CMCNa449.56±43.52130.12±16.52式I化合物低剂量组425.82±14.39*121.59±11.38*式I化合物中剂量组5419.27±11.21*111.42±9.84*式I化合物高剂量组10407.40±17.25**104.87±7.72**地塞米松对照组2409.16±19.37**103.48±11.26**风湿宁对照组418.23±16.22*120.79±9.66*正常对照组0.5%CMCNa381.88±21.28**97.52±9.87**与空白对照组比较*p<o.05，**p<aoi15上述实验证明，式I化合物能有效抑制Freund's完全佐剂致关节炎大鼠足肿胀、降低关节炎指数(AI)，降低致炎大鼠血清和局部炎性组织中IL-ie和TNF-ci的水平，抑制致炎大鼠踝关节的急性炎症反应，改善多发性关节炎四肢足爪的红肿、肿胀，抑制致炎大鼠继发性病变的恶化趋势，提示式I化合物对关节炎等炎症有良好的治疗效果。六、式I化合物对治疗糖尿病的药理作用实验试验材料式I化合物，由昆明制药集团股份有限公司药物研究院提供，批号20070U,临用前用0.5%羧甲基纤维素钠配制所需浓度的混悬液；链脲佐菌素Sigma公司产品，临用前溶解在pH4.5的枸椽酸缓冲液中；尿白蛋白测定试剂盒，法国SPI公司产品；PKC活性测定试剂盒，Calbiochem公司产品；格列本脲，Sigma公司产品。试验动物SD雄性大鼠，体重200-250g，60只，由昆明医学院实验动物中心提供，生产许可证号SCXK(滇)2005-0008，使用许可证号SYXK(滇)2005-0008。试验方法及结果造模与分组SD雄性大鼠，体重200-250g,60只，随机分为6组，即正常对照组、空白对照组与式I化合物高、中、低剂量(20mg/kg，40mg/kg，60mg/kg)组和格列本脲(40mg/kg)阳性对照组。各组大鼠均行右侧肾切除术，2周后，除正常对照组注射200mg/kg的枸橼酸缓冲液外，其余各组均接受腹腔一次性注射链脲佐菌素200mg/kg，2d后，各组按表10剂量灌胃受试样品，连续给受12d。所有大鼠在整个实验期间均喂标准饮食，自由饮水，不应用胰岛素，整个实验观察8周。标本收集与指标测定大鼠处死前2d进代谢笼，准确收集24h尿液，离心分装后采用尿白蛋白测定试剂盒测定尿白蛋白含量，24h尿白蛋白排泄率(AER)为尿白蛋白含量与24h尿量乘积。然后在戊巴比妥腹腔注射麻醉下行右侧颈总动脉插管收集血标本，4'C离心取血浆，采用血糖仪测定血糖量。取大鼠肾组织，采用超速离心法分离肾组织细胞膜和细胞浆，按照试剂盒说明书，分别测定胞浆和胞膜PKC活性。PKC活性单位表示为pmol/(minmg),胞浆PKC(PKCc)及胞膜PKC(PKCm)活性均以所测的实际活性与对照组所得的活性之差表示，细胞PKC总活性(PKCt)为胞浆及胞膜PKC活性之和。16表10式I化合物对糖尿病模型大鼠血糖量和尿白蛋白排泄率(AER)的影响(X士SD，n40)组别剂量(mg/kg)血糖(mmol/L)AER(mg/24h)空白对照组0.5%CMCNa28.27±1.374.25±0.57式I化合物低剂量组2025.84土1.391112.59±0.21*式I化合物中剂量组4020.26±1.21*2.01±0.19**式I化合物高剂量组6018.41±1.25**1.76±0.12**格列本脲组4018.29±1.34**2.51±0.23*正常对照组0,5%CMCNa.6.07±0.52**0.87±0.09**与空白对照组比较*P<O.05，**P<0.01表l1式I化合物对糖尿病模型大鼠PKC的影响(X士SD，iFlO)组别剂量(mg/kg)PKCcPKCmPKCt空白对照组0.5%CMCNa17.21±2.1218.52±2.5735.74±3.98式I化合物低剂量组2011.39±1.59*5.22±0.69**16.6U1.74**式I化合物中剂量组409.24±1.62**4.72±0.49**13.94±1.85**式I化合物高剂量组608.57±1.12"3.92土0.23"12.50±1.99**格列本脲组409.58±1.94**4.89±0.57**14.45±2.18**正常对照组0.5%CMCNa7.58±0.89**2.27±0.32**9.85±0.92**与空白对照组比较*P<O.05，**P<0.01上述实验结果证明，式I化合物能抑制糖尿病肾组织PKC活性，并有明显的降血糖、降尿白蛋白的作用，提示其对糖尿病有一定的治疗作用。七、式I化合物对治疗骨质疏松的药理作用实验-试验材料式I化合物，由昆明制药集团股份有限公司药物研究院提供，批号20070U，临用前以0.5。/。CMCNa配制成所需浓度的悬液；维甲酸(RA)，上海南翔试剂有限公司,批号20060809;骨疏康(Gsk)，东港市康辰制药有限公司，批号20060903;骨钙素(BGP)放免试剂盒，中国原子能科学研究院，批号20060708;血清钙(s-Ca)及血清磷(s-P)试剂盒均由南京建成生物技术有限公司提供。实验动物SD雄性大鼠，体重200-250g，48只，由昆明医学院实验动物中心提供，生产许可证号SCXK(滇)2005-0008，使用许可证号SYXK(滇)2005-0008。实验方法及结果分组、造模与给药取健康雄性SD大鼠48只，随机分为6组，即正常对照组、空白对照组、骨疏康阳性对照组和式I化合物高、中、低剂量组，每组8只。实验开始后15d内每天上午正常对照组灌胃给予0.5。/。CMCNa溶液，其余各组给予维甲酸70mg/kg。自实验开始当天下午各组大鼠依次灌胃给予以下药物正常对照组、空白对照组给予0.5n/。CMCNa溶液5ml/kg;骨疏康组给予骨疏康4g/kg;式I化合物高、中、低剂量组分别给予式I化合物200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg连续给药5周。骨密度测定实验结束前2天，大鼠在乙醚麻醉下对腰椎和股骨进行双能X线骨密度测试分析。血清生化指标测定实验结束时大鼠股动脉取血，分离血清，测定血清钙(s-Ca)、磷(s-P)和骨钙素(s-BGP)含量。骨矿含量测定实验结束后，剥离大鼠右侧股骨，于iicrc烘箱中干燥ih，测定股骨干重，将干燥股骨炭化后置于马福炉中60(TC灰化8h，取出后将骨灰溶于6mol/LHCl溶液中，领iJ定骨钙(b—Ca)、骨磷(b-P)含量。表13式I化合物对维甲酸诱导骨质疏松大鼠骨密度的影响(XiSD,1^8)组别剂量(mg/kg)腰椎骨密度(g/cm2)股骨骨密度(g/cm2)空白对照组0.5%CMCNa0.297±0.0170.453±0.028式I化合物低剂量组500.298±0.0240.484±0.019*式I化合物中剂量组1000.306±0.028*0.520±0.027**式I化合物高剂量组2000.314±0.031*0.529±0.032**骨疏康组40000.303±0.032*0.511±0.027*正常对照组、0.5%CMCNa0.307±0.022*0.514±0扁*与空白对照组比较:*P<0.05，**P<0.01表14式I化合物对维甲酸诱导骨质疏松大鼠血清钙(s-Ca)、磷(s-P)和骨钙素(s-BGP)含量的影响(X±SD，n=8)组别剂量(mg/kg)s-Ca(mmo1/1)s-P(mmo1/1)s-BGP(ng/1)空白对照组0.5%CMCNa2.285±0.2182.672±0.5130.536±0.092式I化合物低剂量组502.489±0.2252.789±0.1860.605±0.221*式I化合物中剂量组1002.608±0.410*4.037±1.583**0.627±0.167**式I化合物高剂量组2002.518±0.343*4扁±1.220**0.709±0.253**骨疏康组40002.373±0.6642.988±0.321*0.598±0.203*正常对照组0.5%CMCNa2.354±0.2312.827±1.278*0.602±0.163*与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01表15式I化合物对维甲酸诱导骨质疏松大鼠骨矿含量的影响(XiSD，t^8)组别剂量(mg/kg)b—Ca(g/g)b-P(g/g)空白对照组0.5%CMCNa16.68±1.2716.69±1.48式I化合物低剂量组5017.25±1.7417.53±2.08*式I化合物中剂量组10017.67±1.63*17.81±2.11*式I化合物高剂量组20018.58±1.41**18.25±1.09*骨疏康组400018.48±1.82*18.08±0.19*正常对照组0.5%CMCNa16.88±1.9217.51±2.67*与空白对照组比较*P<0.05,**P<0.01上述试验结果表明，式I化合物能提高维甲酸诱导骨质疏松大鼠血清钙(s-Ca)、磷(s-P)和骨钙素(s-BGP)含量，明显增加骨矿含量和骨密度，提示其具有增强成骨细胞活性、促进骨形成的作用，因而对骨质疏松有一定的预防和治疗作用。本发明的方法与现有技术相比具有以下特点1、现有方法采用的是酸水热解工艺，即将原料在浓度为3-20%的硫"、盐酸、磷酸或硝酸水溶液中加热反应制得到5,6,7，4'-四羟基黄酮(灯盏花乙素苷元)。而本发明采用的则是酸催化醇解工艺，即将原料在仅含有催化量的酸的醇溶液(醇中酸浓度仅为0.0010.1%)中加热反应制得到5，6，7,4'-四羟基黄酮。本发明中，由于灯盏花素原料在优选的醇中较易溶解，原料与反应介质能充分密切接触，反应平稳快速，兼之作为催化剂使用的酸在反应体系中的浓度极低，不易引起氧化、裂解、磺化或硝化等副反应的发生，因此产品收率较现有的酸水解工艺显著提高，产品杂质少，纯度高，后处理较为简单容易。2、现有的酸水解工艺，由于使用浓度高达3-20%的强酸，对设备的耐腐蚀能力要求较高，生产操作困难，易引发安全事故，产生的废酸废水处理量大，对环境较不友好。本发明采用的酸催化醇解工艺，醇中酸浓度极低，仅为0.0010.1%，因此设备要求相对简单，生产较为安全，产生的含酸醇溶液经回收后可反复循环利用，较为经济、环保。3、现有方法以灯盏花乙素为原料，由于目前国内仅有个别厂家拥有生产高纯度灯盏花乙素原料药的技术，并且处于小规模生产阶段，因此以灯盏花乙素为原料不仅成本高，而且在市场上难于购买得到，无法保证大规模工业化生产的需要。本发明直接以灯盏花乙素含量大于或等于50%以上的灯盏花素为原料，使用前不需提纯或精制，具有原料易得，成本低廉等特点。本发明通过实验证明，5,6，7，4'-四羟基黄酮对老年痴呆模型小鼠脑记忆的获得、巩固和再现均表现出明显的增强作用，对M-胆碱能抑制剂樟柳碱致小鼠脑记忆衰退模型小鼠的学习记忆均有明显的改善作用，能显著提高小鼠近期记忆和长期记忆能力。实验还表明，5,6，7，4'-四羟基黄酮能有效抑制AA大鼠足肿胀，降低AA大鼠血清和局部炎性组织中IL-1P和TNF-a的水平，抑制AA大鼠踝关节的急性炎症反应，降低关节炎指数(AI)，提示5,6,7，4'-四羟基黄酮对关节炎具有治疗作用。此外，实验证明，5，6,7,4'-四羟基黄酮对糖尿病和骨质疏松也具有较好的治疗作用。具体实施方式式I化合物的制备实例实施例l:称取灯盏花素原料20.0g，加入乙二醇500ml，4。/。稀盐酸lml，加热回流反应4小时，产物经过滤，烘干至恒重，得5，6,7，4'-四羟基黄酮10.6g，经高效液相检测纯度为96.2%。用60%甲醇重结晶，过滤，烘干至恒重，得精品10.1g，经高效液相检测纯度为98.9%。实施例2:称取灯盏花素原料15.0g，加入l，2-丙二醇300ml，5%稀硫酸lml，加热回流反应3小时，产物经过滤，烘干至恒重，得5，6,7,4'-四羟基黄酮7.9g,经高效液相检测纯度为95.8%。用乙醇重结晶，过滤，烘干至恒重，得精品7.1g，经高效液相检测纯度为99.5%。实施例3:称取灯盏花素原料12.0g，加入正丁醇400ml，5%稀硝酸lml，加热回流反应5小时，产物经过滤，烘干至恒重，得5，6,7,4'-四羟基黄酮6.5g，经高效液相检测纯度为95.7%。用丙酮重结晶，过滤，烘干至恒重，得精品5.8g，经高效液相检测纯度为99.9%。实施例4:称取灯盏花素原料15.0g，加入丙三醇200ml，5Q/。磷酸2ml，加热回流反应3小时，产物经过滤，烘干至恒重，得5，6,7,4'-四羟基黄酮7.8g，经高效液相检测纯度为97.5%。用乙酸乙酯重结晶，过滤，烘干至恒重，得精品7.0g，经高效液相检测纯度为99.7%。本发明通过实验证明，5,6，7，4'-四羟基黄酮具有低毒性和高安全性，应用于制备治疗老年痴呆、关节炎、糖尿病和骨质疏松等病症的药物，具有良好的治疗效果。20权利要求1、一种5，6，7，4′-四羟基黄酮化合物的制备方法，其特征在于以灯盏花素为原料，将其与醇在酸的催化作用下加热回流反应，即用灯盏花素原料12～20g，加入醇类物200～500ml和浓度为4～5％的酸1～3ml，加热回流反应，产物经过滤，烘干至恒重，得式I的5，6，7，4′-四羟基黄酮式I。2、根据权利要求1所述的5，6,7,4'-四羟基黄酮化合物的制备方法，其特征在于灯盏花素是指通过植化提取或人工合成方式获得的主要含有式II化合物一灯盏花乙素的黄酮类化合物，其中式11化合物的含量大于或等于50%。3、根据权利要求1所述的5，6，7,4'-四羟基黄酮化合物的制备方法，其特征在于醇为C1-C10的一元醇、二元醇或二元以上多元醇中的任何一种，或由它们以任意比例组成的混合物。4、根据权利要求3所述的5，6,7，4'-四羟基黄酮化合物的制备方法，其特征在于醇为乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇中的任何一种，或由它们以任意比例组成的混合物。5、根据权利要求1所述的5，6，7,4'-四羟基黄酮化合物的制备方法，其特征在于酸为硼酸、草酸、醋酸、磷酸、盐酸、硫酸、硝酸、高氯酸中的的任何一种，或由它们以任意比例组成的混合物。6、根据权利要求1所述的5，6,7,4'-四羟基黄酮化合物的制备方法，其特征在于反应体系中的酸/醇(w/w)比例为0.00001/10010/100。7、根据权利要求6所述的5，6，7,4'-四羟基黄酮化合物的制备方法，其特征在于酸/醇(w/w)比例为0.001/1000.1/100。8、用权利要求1所述的5，6,7，4'-四羟基黄酮化合物的制备方法制备的5，6,7，4'-四羟基黄酮化合物在制备治疗老年性痴呆症、记忆衰退、糖尿病、关节炎、癌症、骨质疏松的药物中的应用。全文摘要本发明是一种5，6，7，4′-四羟基黄酮化合物的制备方法。其特征在于以灯盏花素为原料，将其与醇在酸的催化作用下加热回流反应，即用灯盏花素原料12～20g，加入醇类物200～500ml和浓度为4～5％的酸1～3ml，加热回流反应，产物经过滤，烘干至恒重，得式I的5，6，7，4′-四羟基黄酮。通过实验证明，5，6，7，4′-四羟基黄酮对老年痴呆模型小鼠脑记忆的获得、巩固和再现均表现出明显的增强作用，对M-胆碱能抑制剂樟柳碱致小鼠脑记忆衰退模型小鼠的学习记忆均有明显的改善作用，能显著提高小鼠近期记忆和长期记忆能力。实验还表明，5，6，7，4′-四羟基黄酮对关节炎具有治疗作用。5，6，7，4′-四羟基黄酮对糖尿病和骨质疏松也具有较好的治疗作用。文档编号A61P25/28GK101591321SQ20091009466公开日2009年12月2日申请日期2009年6月25日优先权日2009年6月25日发明者周荣光申请人:昆明制药集团股份有限公司