专利名称：以灵芝子实体为原料提取灵芝三萜与灵芝多糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种以灵芝子实体为原料提取灵芝三萜与灵芝多糖的方法。
(二)
背景技术：
灵芝(G朋ocfenwa /wc/血m )是我国传统的名贵中药材和药用真菌， 其主要功效成分为灵芝三碎和灵芝多糖。其中灵芝多糖的功能主要在于抗 肿瘤、调节免疫、抗氧自由基、活血化瘀作用和抗衰老，而灵芝三萜则具 有护肝排毒、抗氧化、抗菌抗炎、抗fflV病毒、镇痛、抑制血管紧张素 转化酶、抑制胆固醇合成、P争低血小板聚集、抑制组胺释放、抑制肝脏肿 瘤细胞等作用。
目前， 一般采用有机溶剂法提取灵芝三萜，通常需要较长的提取时间 并消耗大量的提取溶剂，同时大量有机溶剂的使用会给人体和环境带来不 利的影响。传统的灵芝多糖提取方法主要是采用热水浸提法、酸浸提法、 碱浸提法提取。酸或碱浸提法虽能提高提取率，但对设备要求高且极易破 坏多糖的结构，还存在环境污染问题。另外由于灵芝子实体由纤维素、半 纤维素和木质素等主要成分构成，结构紧密，活性多糖有效成分附着在细 胞壁内侧，传统的热水浸提法时间长、耗能高，活性成分提取物得率低。 中国专利CN1181271介绍了使用低压水煮工艺，多糖的药理活性比常规 水煮要高，但多糖提取率偏低，且所得提取物中灵芝三萜酸含量也偏低。 中国专利CN1560072通过釆用超临界CO2萃取灵芝三萜酸提取液，提余 物再经热水浸提得灵芝多糖提取液。但该方法所需设备投入较大、操作难度和生产成本也较高，且灵芝多糖提取率和多糖含量偏低。
发明内容
本发明的目的是，提供一种应用超声波、酶提等高新技术优化灵芝生 物活性成分(灵芝多糖和灵芝三碎)的提取工艺，提高名贵药用菌灵芝的 综合利用率和附加值，降低资源消耗和生产成本，减少提取设备投入。
本发明釆用的技术方案是
一种以灵芝子实体为原料提取灵芝三萜与灵芝多糖的方法，所述方法 包括(1)取干燥灵芝子实体粉碎得到干粉，在超声频率15 100KHz、 40 90。C条件下以50 100%乙醇(乙醇体积浓度50~100°/。的乙醇水溶液， 100%乙醇即为无水乙醇)为溶剂提取10min 90min,过滤，滤液干燥得 到灵芝三萜提取物，滤渣用于灵芝多糖的提取；(2)步骤(1)滤渣在35~ 70°C、 pH3.5 7.0条件下，加入适量水在复合酶作用下酶解水提0.5h 4h, 灭酶、分离得到上清液，浓缩至体积为上清液体积的1/2 1/6得到浓缩液， 再加入浓缩液体积的2~5倍量的75~100%乙醇进行醇沉，分离、干燥得 到灵芝多糖提取物；所述复合酶为下列两种以上的混合物① 4800~80000U/g干粉的木瓜蛋白酶、②90 1500U/g干粉的纤维素酶、③ 32 200U/g干粉的果胶酶。所用酶均可采用市购商品酶，通常纤维素酶 单位酶活为 10000U/g~20000U/g , 木瓜蛋白酶单位酶活为 700000U/g~800000U/g,果胶酶单位酶活为15000 U/g~25000U/g，复合酶 用量约为灵芝干粉质量的0.1 20%。
步骤(1 )中50~100%乙醇用量为5~50mL/g干粉。
步骤(2)中酶解水提时水用量为10 100mL/g干粉。
步骤(2 )中以1 .Omol/L NaOH或1 .Omol/L HC1调节溶液的pH值。优选的，步骤(2 )中复合酶为9600~80000U/g干粉的木瓜蛋白酶和 180~1500U/g干粉的纤维素酶的混合物。
优选的，步骤(2)中复合酶为4800 12800U/g干粉的木瓜蛋白酶、 卯 240U/g干粉的纤维素酶和32-200 U/g干粉的果力交酶的混合物。
具体的，所述方法如下
(1) 取干燥灵芝子实体粉碎得到干粉，在超声频率15~100KHz、 40~90°C 条件下，加入5~50mL/g干粉的50~100%乙醇为溶剂提取 10min 90min，过滤，滤液喷雾干燥得到灵芝三碎提取物，滤渣用
于灵芝多糖的提取；
(2) 步骤(1)滤渣在35-70。C、 pH3.5~7.0条件下，加入10~100mL/g
干粉的蒸馏水，在复合酶作用下酶解0.5h 4h,灭酶，离心取上清
液浓缩至体积为上清液体积的1/6-1/2，浓缩液加入体积为浓缩液体
积3倍的95%乙醇，搅拌、静置12h 24h,离心取沉淀喷雾干燥得
到灵芝多糖提取物； 本发明的内容涉及一种利用超声波-醇提、复合酶-水提集成技术从灵 芝子实体中高效提取灵芝三萜与灵芝多糖的方法。其特点是将灵芝子实
体粉碎，先采取超声波辅助醇提(超声波-醇提)提取灵芝三萜后，再以 复合酶辅助水提醇沉(复合酶-#)制备灵芝多糖，分别经喷雾干燥得 到灵芝三萜提取物和灵芝多糖提取物。
与现有技术相比，本发明具有下列特点
(1)同一灵芝子实体原料分步提取灵芝三萜和灵芝多糖，且先提灵 芝三碎，后提灵芝多糖，避免脂溶性的三萜类物质挥发散失，比水提醇沉 法、酸提法、碱提法仅提取灵芝多糖对灵芝子实体原料利用率大大提高。(2)采取超声波辅助醇提灵芝三碎，且采用先提灵芝三萜后提灵芝 多糖的工艺路线，使高附加值的灵芝三萜提取得率大大提高。所用溶剂安 全、无毒，与超临界二氧化碳提取灵芝三萜的方法相比，设备投入大大降 低、操作筒便可行，生产成本大幅度降低，更适宜作保健食品原料。
(3 )经超声波醇提提取灵芝三碎后的灵芝残渣，再以复合酶辅助水
提醇沉制备灵芝多糖，被纤维素、半纤维素和木质素等包裹在细胞壁内侧
的多糖很容易被分离提取出来，且无需像传统的热水浸提那样高温浸提，
提取工艺条件温和且节省能耗，多糖提取物得率得以提高。
本发明方法所用溶剂安全、无毒，避免了传统方法中采用氯仿、甲醇
等有机溶剂对环境的污染。与超临界二氧化碳萃取法相比，具有提取温度 低、设备简单、操作方便、成本低、速度快、收效高等特点。采用超声波 辅助提取灵芝三萜，相对于传统的有机溶剂法，可使灵芝三萜提取率显著 提高；采用生物酶法提取灵芝多糖，相对于传统的热水浸提法，可使灵芝 多糖提取率和灵芝多糖含量得到较大提高，避免了高温热水浸提或酸、碱 提取对多糖结构的影响，且易除去杂质、最大限度地保持多糖活性等优点。 釆用该工艺综合提取灵芝中的三萜和多糖类活性物质，使总活性物质得率 比单一提取方法得到大幅提高。 具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此
实施例1:
(1)取50.0g干燥的灵芝子实体粉(上海中灵生物科技有限公司)装入超声萃取斧中，加入50°/。的乙醇2500ml，在温度为90°C,超声频率为 50KHz下超声10min，过滤得到灵芝三辟提取液经喷雾干燥得到灵芝三萜 提取物1.38g，提取率为2.76%,其中灵芝三辟含量为34.8%。 (2 )向步骤(1 )所得的滤渣中加入500ml的蒸馏水，加入0.6g木瓜蛋 白酶(酶活800000 U/g)和1.2g纤维素酶(酶活15000U/g),用l.Omol/L NaOH和l.Omol/L HC1调节溶液的pH值为7.0。在温度为35。C下酶解提 取4.0h。
(3) 高温灭酶酶解完成后升温至100。C灭酶0.5h。
(4) 醇沉提取液离心后上清液浓缩至原体积的1/6,向浓缩液中加入2 倍体积的100%乙醇，搅拌均匀静置12h后离心、取沉淀经喷雾干燥得到 灵芝粗多糖提取物1.42g,提取率为2.84%，其中多糖含量为34.3%。
实施例2:
(1)取50.0g干燥的灵芝子实体粉装入超声萃取斧中，加入80%乙醇 500ml,在温度为60°C,超声频率为15KHz下超声50min,过滤得到灵芝 三辟提取液经喷雾干燥得到灵芝三萜提取物1.41g,提取率为2.82%,其 中灵芝三萜含量为41%。
(2 )向步骤(1)所得的滤渣中加入2500ml的蒸馏水，加入1.2g木瓜 蛋白酶(酶活800000 U/g )和0.6g纤维素酶(酶活15000U/g),用l.Omol/L NaOH和l.Omol/L HC1调节溶液的pH值为5.0。在温度为50。C下酶解提 取l.Oh。
(3) 高温灭酶酶解完成后升温至100。C灭酶0.5h。
(4) 醇沉提取液离心后上清液浓缩至原体积的1/4,向浓缩液中加入5 倍体积的70%乙醇，搅拌均匀静置12h后离心、取沉淀经喷雾干燥得到灵芝粗多冲奮提取物1.58g,提取率为3.16%，其中多糖含量为36.5%。 实施例3:
(1 )取50.0g干燥的灵芝子实体粉装入超声萃取斧中，加入100%的乙醇 250ml,在温度为40。C，超声频率为lOOKHz下超声90min,过滤得到灵 芝三萜提取液经喷雾千燥得到灵芝三萜提取物L51g，提取率3.02%,其 中灵芝三萜含量为48%。
(2 )向步骤(1 )所得的滤渣中加入5000ml的蒸馏水，加入0.3g木瓜 蛋白酶(酶活800000 U/g) 、 5.0g果胶酶(酶活20000 U/g)和0.3g纤维 素酶(酶活15000U/g),用1.0mol/LNaOH和1.Omol/LHC1调节溶液的 pH值为5.0。在温度为50。C下酶解提取l.Oh。
(3) 高温灭酶酶解完成后升温至100。C灭酶0.5h。
(4) 醇沉提取液离心后上清液浓缩至原体积的1/5,向浓缩液中加入3 倍体积的90%乙醇，搅拌均匀静置12h后离心、取沉淀经喷雾干燥得到 灵芝粗多糖提取物1.65g，提取率为3.3%，其中多糖含量为35.0%。
实施例4:
(1)取50.0g干燥的灵芝子实体粉装入超声萃取斧中，加入90%的乙醇 500ml,在温度为50°C,超声频率为80KHz下超声30min，过滤得到灵芝 三萜提取液经喷雾干燥得到灵芝三萜提取物1.55g,提取率为3.1%，其中 灵芝三碎含量为51.0%。
(2 )向步骤(1)所得的滤渣中加入2000ml的蒸馏水，加入0.8g木瓜 蛋白酶(酶活800000 U/g) 、 0.8g果月交酶(酶活20000 U/g)和0.8g纤维 素酶(酶活15000U/g),用1.0mol/LNaOH和1.Omol/LHC1调节溶液的pH值为4.0。在温度为40。C下酶解提取2.0h。
(3) 高温灭酶酶解完成后升温至100。C灭酶0.5h。
(4) 醇沉提取液离心后上清液浓缩至原体积的1/2,向浓缩液中加入3 倍体积的75%乙醇，搅拌均匀静置12h后离心、取沉淀经喷雾干燥得到 灵芝粗多糖提取物1.72g,提取率为3.44%,其中多糖含量为38.0%。
实施例5:
(1)取50.0g干燥的灵芝子实体粉装入超声萃取斧中，加入60%的乙醇 1000ml，在温度为30°C，超声频率为70KHz下超声50min,过滤得到灵 芝三萜提取液经喷雾干燥得到灵芝三萜提取物1.63g，提取率为3.26%, 其中灵芝三萜含量为52.0%。
(2 )向步骤(1 )所得的滤渣中加入3000ml的蒸馏水，加入5.0g木瓜 蛋白酶(酶活800000 U/g )和5.0g纤维素酶(酶活15000U/g),用1.Omol/L NaOH和1.0mol/LHCl调节溶液的pH值为5.5。在温度为60。C下酶解提 取3.0h。
(3) 高温灭酶酶解完成后升温至100。C灭酶0.5h。
(4) 醇沉提取液离心后上清液浓缩至原体积的1/3，向浓缩液中加入4 倍体积的85%乙醇，搅拌均匀静置12h后离心、取沉淀经喷雾干燥得到 灵芝粗多糖提取物1.80g,提取率为3.6%,多糖含量为37.0%。
权利要求
1. 一种以灵芝子实体为原料提取灵芝三萜与灵芝多糖的方法，所述方法包括(1)取干燥灵芝子实体粉碎得到干粉，在超声频率15～100KHz、40～90℃条件下以50～100％乙醇为溶剂提取10min～90min，过滤，滤液干燥得到灵芝三萜提取物，滤渣用于灵芝多糖的提取；(2)步骤(1)滤渣在35～70℃、pH3.5～7.0条件下，在复合酶作用下酶解水提0.5h～4h，灭酶、分离得到上清液浓缩至体积为上清液体积的1/2～1/6得到浓缩液，再加入浓缩液体积2～5倍量的75～100％乙醇进行醇沉，分离、干燥得到灵芝多糖提取物；所述复合酶为下列两种以上的混合物①4800～80000U/g干粉的木瓜蛋白酶、②90～1500U/g干粉的纤维素酶、③32～200U/g干粉的果胶酶。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1 )中50~100%乙醇用量 为5~50mL/g干粉。
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于步骤(2)中酶解水提时水用量 为10 100mL/g干粉。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中以1.0mol/L NaOH 或1.Omol/LHC1调节溶液的pH值。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中复合酶为 9600 80000U/g干粉的木瓜蛋白酶和180-1500U/g干粉的纤维素酶的混 合物。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中复合酶为 4800~12800U/g干粉的木瓜蛋白酶、90~240U/g干粉的纤维素酶和32~200 U/g干粉的果胶酶的混合物。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述方法如下(1 )取干燥灵芝子实体粉碎得到干粉，在超声频率15~100KHz、40~90 。C条件下，加入5 50mL/g干粉的50 100%乙醇为溶剂醇提 10min 90min,过滤，滤液喷雾干燥得到灵芝三辟提耳又物，滤渣用于灵芝多糖的提取； (2 )步骤(1 )滤渣在35 ~ 70。C 、 pH3.5~7.0条件下，加入10~100mL/g 干粉的蒸馏水，在复合酶作用下酶解水提0.5h 4h,灭酶，离心 取上清液浓缩至体积为上清液体积的1/6 1/2,向浓缩液中加入体 积为浓缩液体积3倍的95%乙醇，搅拌、静置12h 24h,离心取 沉淀喷雾干燥得到灵芝多糖提^4勿。
全文摘要
本发明提供了一种利用超声波-醇提、复合酶-水提集成技术从灵芝子实体中高效提取灵芝三萜与灵芝多糖的方法。其特点在于将灵芝子实体粉碎，先采取超声波辅助醇提(超声波-醇提)提取灵芝三萜后，再以复合酶辅助水提醇沉(复合酶-水提)制备灵芝多糖，分别经喷雾干燥得到灵芝三萜提取物和灵芝多糖提取物。本发明方法所用溶剂安全、无毒，避免了传统方法中采用氯仿、甲醇等有机溶剂对环境的污染。具有萃取温度低、设备简单、操作方便、成本低、速度快、收效高等特点。采用该工艺综合提取灵芝中的三萜和多糖类活性物质，使总活性物质得率比单一提取方法得到显著提高。
文档编号A61P35/00GK101530436SQ20091009777
公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月20日 优先权日2009年4月20日
发明者付立忠, 吴学谦, 吴庆其, 李海波, 程俊文, 亮 贺, 魏海龙 申请人:浙江省林业科学研究院