人变形链球菌基因工程龋齿疫苗及其制备方法

专利名称：人变形链球菌基因工程龋齿疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医药生物技术领域，尤其涉及一种人变形链球菌基因工程龋齿 疫苗及其制备方法。
背景净支术
变形链球菌(S.Mutans)是人类主要的致龋微生物，它在口腔中的定植与龋 病的发生密切相关。而龋病目前是人类发病率最广泛的一种疾病，2003年WHO 就将其列为继心血管疾病和癌症之后的第三种需重点防治的疾病。全世界60% 到90%的儿童和成人都曾受到龋病的困扰(The World Oral Health R印ort 2003 )。 2007年第三次全国口腔健康流行病学调查显示我国龋齿发病率高达 70%-80%。由于龋病进展緩慢，通常不危及患者生命，因此在发展中国家未 受到重视。"牙痛不是病，痛起来真要要命！"实际上龋齿给人类造成的危害 甚大，乳牙龋病严重影响儿童牙齿的发育和正常的咀嚼功能，感染的变形链球 菌可能与人体发生交叉免疫反应而引起类风湿性关节炎、肾炎、风湿性心脏病 等。现有的预防措施如氟化物、机械法、抗菌药物及限糖饮食防龋等都只能在 一定程度上降低龋齿发生水平，根本不可能阻断龋病的流行。而研制安全有效 的防龋疫苗是预防龋齿最简单、经济、快捷的手段。
S.Mutans作为人类主要的致龋菌，其致龋机制在于它能翁附定植于牙面， 发酵蔗糖产酸，并具备在酸性环境下的生存繁殖能力。而它在牙面黏附定植及 菌斑形成中最重要的两个蛋白成分葡糖基转移酶(glucosyltransferase ， GTF) 和葡聚糖结合蛋白(glucan-binding proteins, Gbps)是龋病发生的关键因素。 GTF同时具有葡糖基转移酶活性及葡聚糖结合活性，编码GTF基因缺失的变形链 3求菌其致龋力明显降{氐(Yamashita， Y和Bowen, W. H. , Burne， R. A. Infect. Immun. 199 3 61:3811 3817. ) 。 Childers等以GTF为主要免疫原研制的防 龋疫苗进行了大量临床试验研究，发现该疫苗通过鼻内腔免疫可诱导受试者IgA 产生并激发保持机体对S.Mutans抗原的二次免疫应答，减少龋齿的发生率，同时也证实S.Mutans分离的天然GTF作为免疫原在人体应用的安全性 (l.Childers, N. K.和Tong, G, Michalek, S. M. Oral Microbiol. Immunol. 1997.12: 329 335; 2. Childers NK和Li F, Kirk L J Dent Res 2003; 82 (special issue); 3. Dasanayake AP和Li Y, Kirk K. Oral Microbiol Immunol 2003; 18: 271 277; 4. Childers NK和Li F, Dasanayake AP. Oral Microbiol Immunol. 2006 21 (5): 309-13 )。而GTF羧基端的葡聚糖结合区 (glucan-binding region, GLU)能与葡聚糖结合，介导S. Mutans在牙面的积聚， 在菌斑成熟过程中发挥重要作用，是龋病发生的主要因素。GLU具有良好的免疫 原性和免疫保护性，其可高效诱导抗GTF抗体，从而抑制GTF合成葡聚糖的能 力，减少菌斑的形成.(l.Q.A. Xu和F. Yu， M.W. Fan. Vaccine 2007 25:1191 1195; 2. Jespersgaard C和Ha jishengallis G， Greenway TE. Infect I腿un 1999 67 (2): 810—81; 3. Mar tin A. Taubman和Cynthia J， Holmberg. Infect, Immun 2001:69, 4210 4216 )
Gbps结合葡聚糖介导蔗糖依赖性的S.Mutans初始熟附和集聚，在菌斑成熟 中发挥重要作用。S.Mutans至少产生4类Gbps即:GbpA、 GbpB、 GbpC和GbpD。 但只有GbpB可诱发针对龋齿的强保护性免疫，通过唾液区的皮下注射或鼻内免 疫途径都可诱导高水平的IgA水平，抑制S.Mutans的黏附(Smith,DJ和 Taubman，MA， Infect—Immun. 1996 64 (8): 3069—73,)。同时流行病学研究显 示在大多数未感染S.Mutans儿童唾液中存在抗GbpB的唾液IgA,说明抗GbpB 的唾液IgA水平在抑制S. Mutans的初期縣附中起着关键性作用(Nogueira， R. D和A. C. Alves， M. H. Napimoga. Infect. Immun. 73: 5675 5684. ) 。 Smiths 等通过对GbpB的基因序列的分析发现GbpB蛋白N端三分之一处有三段紧密相 连的免疫显性区多肽表位，合成了其中两段多肽(SYI和QGQ),并在动物实验 中检测其免疫效能，都在大鼠体内诱导高浓度的血清IgG和唾液IgA抗体，且 该抗体都能与GbpB蛋白反应(Daniel J. Smith和Wi 11 iam F. King, Leigh A. Barnes. Infect Immun 2003 71 (3): 1179 1184 ) 。 Nogueira等对儿童唾液中 IgA抗体反应性进行分析，证实GbpB蛋白N末端52 - 132位氨基酸序列具有良 好的免疫反应性，与唾液中抗GbpB抗体水平密切相关，可能在抑制S.Mutans 的初期翁附中起着关键性作用(RucheleD. Nogueira和Alessandra C. Alves，
5William F. King. Clin Vaccine Immunol, June 2007,14 ( 6 ) p. 804 807 )。 我们认为该段多肽是GbpB主要的免疫显性区(GbpB Immunodominant Regions, GIR)，抗原表位集中，甚至可引发比GbpB全蛋白更强的抗体反应，同时去掉 了大量无关多肽，降^^了交叉反应的危险，可作为一理想的防龋疫苗候选抗原。
防龋疫苗的理想目标是能在唾液中诱导产生特异、有效、持续的IgA抗体 反应，干扰S.Mutans在牙面的黏附定植，从而预防龋病的发生。单一的可溶性 蛋白抗原或多肽抗原难以达到此目的，必须辅以能有效诱发教膜免疫的佐剂， 才能产生大量分泌型IgA,获得有效的免疫保护效果。目前常用的恭膜免疫佐剂 主要有大肠杆菌毒素B亚单位(LTB)及霍乱毒素B亚单位(CTB),相比而言， LTB毒性更低，更利于疫苗的临床开发。在S.Mutans感染过程中，由于宿主和 致病菌之间存在复杂的作用机制，单一抗原组分构建的疫苗难以产生有效的保 护作用，以融合基因方式将多抗原成分与黏膜免疫佐剂构建的分子内佐剂疫苗， 可以激发机体更强的免疫应答，同时既降低纯化成本，又可以保证融合蛋白质 量稳定、批间差异小。

发明内容
本发明在疫苗抗原的选择上直接针对在S. Mutans致龋发病机制中发挥重 要作用的保护性亚单位抗原分子，强调多个致病因子保护性抗原的重要功能区 及免疫显性区段的组合以诱导更全面的免疫效应，并结合黏膜免疫佐剂的作用 以激发更强烈持久的保护作用，提供一种人变形链球菌基因工程龋齿疫苗及其 制备方法。
本发明提供的人变形链球菌基因工程龋齿疫苗至少包含变形链球菌葡糖基 转移酶C末端的葡聚糖结合区GLU、葡聚糖结合蛋白B的N端免疫显性区GIR两 种免疫保护性抗原及黏膜免疫佐剂大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位LTB。
本发明将变形链球菌葡糖基转移酶C末端的葡聚糖结合区GLU、葡聚糖结合 蛋白B的N端免疫显性区GIR、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位LTB在基因水平 进行连接构建融合蛋白，进而获得不同保护性抗原亚单位抗原融合方式的疫苗 抗原。优选的，其构建顺序为GLU-GIR-LTB。
本发明优先采用以下连接方式及连接子1. 葡聚糖结合蛋白B的N端免疫显性区GIR和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚 单位LTB连接方式是GIR的编码基因通过编码连接子的一段核甘酸序列与LTB 基因连接，从而获得融合蛋白GIR-LTB。编码所述融合蛋白的基因序列可以是图 1所示的核甘酸序列或与其具有遗传密码简并性的核甘酸序列。所述将GIR的编 码基因和LTB基因相连接的方式是GIR位于5'端，LTB的编码基因通过编码连 接子(甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸，GSGGSG)的一段序列连 接于GIR基因的3，端。
2. 葡糖基转移酶C末端的葡聚糖结合区GLU、葡聚糖结合蛋白B的N端免 疫显性区GIR、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位LTB的优选连接方式是上述融 合蛋白GIR-LTB通过编码连接子的一段核甘^列与GLU基因连接，从而获得 融合蛋白GLU-GIR-LTB。编码所述融合蛋白的基因序列是图3所示的编码核甘酸 序列或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的核甘酸序列。所述的融 合蛋白的结构是SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。所述将GIR-LTB融合基因与 GLU基因相连接的优选方式是GIR-LTB融合基因位于3'端，GLU编码基因通 过编码连接子(酪氨酸-丙氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-脯氨酸，YAPQDP) 的一段核苷S臾序列连接于GIR-LTB融合基因的5，端。在GLU-GIR-LTB大肠杆菌 不耐热肠毒素B亚单位LTB基因3，端连接6聚组氨酸编码序列。获得的融合蛋 白具有较高的表达量，建立了融合蛋白GLU-GIR-LTB的纯化工艺，初步的动物 试验证明该融合蛋白可刺激机体产生高效的免疫应答。
本发明所提供的优选人变形链球菌基因工程龋齿疫苗的融合蛋白的氨基酸 序列为SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。
本发明还提供一种制备人变形链球菌基因工程龋齿疫苗的方法，其包括以 下步骤
1) 培养变形链球菌，获取其基因组DNA;
2) 克隆变形链球菌的GLU及GIR的编码基因及以本室构建并保存的 pET-11c-LTB质粒为模板克隆LTB编码基因；
3 )以获得的以获得的GIR及LTB编码基因为基础，构建融合基因GIR-LTB 表达质粒；
74 )以获得的GLU及GIR-LTB为基础，构建融合基因GLU-GIR-LTB表达质粒；；
5 )以融合基因GLU-GIR-LTB表达质粒转化宿主菌，获得目的蛋白；以及 6)分离并纯化目的蛋白，制成基因工程龋齿疫苗
其中，构建融合基因GIR-LTB表达质粒包括以下步骤
1 )以PCR方法扩增获得GIR和LTB编码基因；
2 )以重叠延伸PCR的方法获得融合基因GIR-LTB的编码基因；
3 )用限制性酶切GI R-LTB的克隆质粒；
4) 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离；
5 )切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带；
6 )将GIR-LTB目的基因的回收产物克隆入原核细胞表达载体pET28a (+), 获得重组质粒pET28a (+) -GIR-LTB,以及
7 )将含有pET28a (+) -GIR-LTB转化大肠杆菌； 所述构建融合基因GLU-GIR-LTB表达质粒可以包括以下步骤
1) 以PCR方法扩增获得GLU编码基因；
2) 用限制性酶切GLU和重组质粒pET28a (+) -GIR-LTB;
3) 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离；
4 )切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带；
5) 将GLU和重组质粒pET28a(+)-GIR-LTB的回收产物酶连，获得含有 GLU-GIR-LTB基因的重组质粒，以及
6 )将含有GLU-GIR-LTB基因的重组质粒转化大肠杆菌。
融合基因GIR-LTB的基因序列如SEQ ID NO: 1所示，融合蛋白GIR-LTB的 氨基S臾序列如SEQ ID N0:2所示；融合基因GLU-GIR-LTB的基因序列如SEQ ID N0:3所示，融合蛋白GLU-GIR-LTB氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。
本发明的基因工程重组菌及重组融合蛋白具有如下基本特性①宿主菌为 BL21，表达载体为pET-28a;②重组蛋白以包涵体形式表达，分子量为55kDa;
8③重组蛋白的表达量在35%以上；纯化的重组蛋白能够诱导动物产生较高滴度 的抗体，并有良好的免疫保护作用。
本发明采用基因工程手段构建表达包含两种保护性抗原亚单位分子内佐剂 融合蛋白疫苗，所得人变形链球菌基因工程龋齿疫苗便于分离纯化，刺激机体 产生高效的免疫应答。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳 实施例，并配合附图，作详细i兌明如下


图1重组质粒pET28a(+)- GIR-LTB构建策略示意图2重组质粒pET28a (+) - GLU-GIR-LTB构建策略示意图3为本发明目的基因GIR和LTB的PCR克隆扩增
泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker);
泳道2为目的基因GIR的PCR扩增产物(279bp);
泳道3为目的基因的LTB PCR扩增产物(327bp);
结果表明目的基因GIR和LTB的PCR克隆扩增效果良好；
图4为融合基因GIR-LTB的重叠延伸PCR克隆扩增
泳道1中箭头所指为融合基因GIR-LTB的PCR扩增产物(588bp);
泳道2为核酸(DNA)分子量标准(Marker );
结果表明尽管在300bp处有杂带出现，但依然获得了融合基因GIR-GIR重 叠延伸PCR克隆产物；
图5为重組质粒pET28a(+)- GIR-LTB的酶切鉴定
泳道l为核酸(DNA)分子量标准(Marker);
泳道2为重组质粒的BamHI和Xhol双酶切产物(588bp )
酶切片段大小与设计一致，初步证明重组质粒构建成功，目的基因连接正
确；
9图6为目的基因GLU的PCR克隆扩增
泳道l为核酸(DNA)分子量标准(Marker);
泳道2为目的基因GIR的PCR扩增产物(879bp);
结果表明目的基因GIR和LTB的PCR克隆扩增效果良好；
图7为重组质粒pET28a(+)- GLU-GIR-LTB的酶切鉴定
泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker );
泳道2为重组质粒的Ncol和Xhol双酶切产物(1472bp )
泳道3为重组质粒的Ncol和BamHI双酶切产物(879bp )
酶切片段大小与设计一致，初步证明重组质粒构建成功，目的基因连接正
确；
图8为重组工程菌GIR-GIR-LTB /BL21诱导表达PAGE电泳图
泳道l为蛋白质分子量标准(Marker);
泳道2为工程菌BL21 (DE3)
泳道3为pET-28a (+) /BL21 <DE3)空质粒；
泳道4为重组蛋白诱导前；
泳道5 ~ 7为重组蛋白加入IPTG诱导2， 4， 6 h;
泳道8重组工程菌诱导后为破菌上清
泳道8包涵体〖容解液；
(箭头所示为重组融合蛋白GLU-GIR-LTB )
基因重組菌经过诱导后在分子量55KDa处有增加的蛋白表达条带，与目的 蛋白分子量一致。经过UVP图像扫描分析，诱导4小时目的蛋白表达量约35%;
图9为目的蛋白GLU-GIR-LTB纯化效果PAGE电泳图
泳道l为蛋白质分子量标准(Marker);
泳道2 ~ 6为目的蛋白洗脱峰样品；
结果显示经过纯化步骤，目的蛋白的纯度得到明显改善，收获的目的蛋白
10峰经UVP扫描分析纯度达到92. 5 % ;
图10和图11分别为融合基因GIR-LTB和GLU-GIR-LTB测序结果图。
具体实施例方式
以下结合附图及实施例对本发明进行进一步的描述，这些实例用于对本发 明中的一种疫苗的制备方法进行描述，其余组合方式与此类似，应理解的是， 这些实例是用于本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本 发明制备方法的筒单改进，都属于本发明要求保护的范围
本发明采用上述技术方案的技术路线及主要步骤
1. GIR-LTB融合基因的构建
1 )克隆变形链球菌UA159 (安徽医科大学口腔医院)的GIR编码基因和LTB 编码基因(本室构建并保存的pET-11c-LTB质粒)。
① 培养变形链球菌UA159
② 用PCR方法扩增变形l^求菌UA159的GIR编码基因和LTB的编码基因。
③ PCR产物的克隆。
2) 构建GIR和LTB的融合基因。 '
① 以GIR和LTB为模板，用重叠延伸PCR扩增融合基因GIR-LTB。
② PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离。
③ 切下琼脂糖凝胶上的目的DM电泳带。
④ 将GIR-LTB目的基因的回收产物克隆入原核细胞表达载体pET28a (+),获 得重组质粒pET28a (+) -GIR-LTB,以及
⑤ 将含有GIR-LTB基因的重组质粒转化大肠杆菌；
3) 测定GIR-LTB融合基因的序列。
2. 原核表达质粒pET28a (+) - GLU-GIR-LTB的构建。 1 )构建GLU-GIR-LTB的融合基因。
①以PCR方法扩增获得变形链球菌的GLU编码基因；②用限制性酶切GLU和含有GIR-LTB基因的重组质粒；
② 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离；
③ 切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带；
将GLU和重组质粒pET28a(+)-GIR-LTB的酶切回收产物连4妾，获得含有 GLU-GIR-LTB基因的重组质4立，以及
⑤将含有GLU-GIR-LTB基因的重组质粒转化大肠杆菌；
2 )测定GLU-GIR-LTB融合基因的序列。
3 )诱导表达GLU-GIR-LTB融合基因，获得目的蛋白GLU-GIR-LTB。
4 )纯化分离目的蛋白GLU-GIR-LTB。
5 )鉴定目的蛋白GLU-GIR-LTB的纯度。
此目的蛋白GLU-GIR-LTB即为融合型人重组变形链球菌葡糖基转移酶C末 端的葡聚糖结合区(glucan—binding region, GLU)和葡聚糖结合蛋白B的N 末端免疫显性区(GbpB Immunodominant Regions, GIR)及黏膜免疫佐剂LTB 的基因工程龋齿疫苗。
实施例1 融合基因GIR-LTB的表达载体的构建
1.引物设计及PCR扩增
1)引物设计如下才艮据从GenBank查到的S.Mutans (UA159标准才朱)编 码GIR的基因和不耐热肠毒素B亚单位LTB基因，利用软件Primer Premier5. 0 进行引物的设计和分析。将linker (框区部分)序列分别设计在上游基因(GIR) 的5'端并引入勘/m7/位点，3'端引入linker (框区部分)序列，同时在下游 基因LTB的5'端引入linker序列(框区部分)，3'端引入J力o/位点，利用重 叠延伸PCR方法将GIR基因和LTB基因连接起来。引物由上海英俊公司合成。
GIR:上游引物PI: SEQ ID NO: 5
5，
TACGCGCCGCAGGATCCTCAAGCACAAGTTAAT-3'(
下游引物P2: SEQ ID NO: 6 5' —GCCACTGCCACCACTTCClATCAGAAACTGATTT -3，LTB:上游引物P3: SEQ ID NO: 7
5，—GGAAGTGGTGGCAGTGGClGCTCCCCAGTCTATT _3，
下游引物P4: SEQ ID NO: 8 5， -CTCGAGGTTTTCCAT6CTGATTGC -3，(勘/) 2)目的基因的PCR扩增
分别以人变形链球菌UA159基因组DNA (煮沸破菌上清液)和本室构建并保 存的重组质粒pET-llc-LTB为模板。94。C预变性5分钟，按照94°C30秒—55°C 30秒-72°C1分钟进行30个循环，最后72。C延伸10分钟，扩增GIR和LTB基 因片段。(扩增结果如图3所示)
3 )重叠延伸PCR扩增GIR-LTB融合基因
以2 )中扩增的PCR回收产物为才莫^1,以Pl， P4为引物，94。C预变性5min, 按照94°C30s —57°C30s —72。Clmin进行35个循环，最后72。C延伸10rain,扩 增出GIR-LTB融合基因。(扩增结果如图4所示)
2. GIR-LTB融合基因表达载体的构建(质粒构建策略如图l所示)
1) GIR-LTB融合基因的克隆
将3)中扩增获得的GIR-LTB融合基因片段克隆入pMD18-T,转化五c^/DH5 a,氨节抗性筛选阳性重組子，抽提质粒，用^Vco/和J力o/做双酶切鉴定，鉴 定正确后回收基因片，史。
2) GIR-LTB融合基因表达载体的构建
将1 )中回收的GIR-LTB融合基因片段构建于表达载体pET-28a (+)，用勘/z^/ 和做双酶切鉴定。(酶切结果如图5所示)
3) 将酶切鉴定无误的基因重组质粒转化至宿主菌AcW/' BL21 (DE3)，获 得重组工程菌
4) 重组工程菌GIR-LTB/BL21送上海英j泉^^司测序，测序结果如图IO所示。 实施例2 GLU-GIR-LTB融合基因表达载体及重组表达型工程菌的构建与表达
1.引物设计及PCR扩增
131)引物设计如下根据从GenBank查到的S.Mutans (UA159标准林)编 码GLU的基因，利用l欠件Primer Premier5. 0进行引物的设计和分析。将linker (框区部分)序列设计在GLU编码基因的3'端，并分别在上下游引物引入NcoI 和BamHI位点，，以化/z^/酶切的粘性末端即可与融合基因(GIR-LTB )进行正 确连接。引物由上海英4复公司合成。
GLU:上游引物PI: SEQ ID NO: 9
5， ccatggatgaaatgggctatcaagc-3'
下游引物P2: SEQ ID NO: 10
5， - I ggatcctgcggcgcgtaIccgaactcgttctccag-3，
2 )目的基因的pcr扩增
以变形链球菌UA159基因组DNA (煮沸破菌上清液)为模板。94。C预变性5 分钟，按照94。C30秒—58。C30秒—72°C1分钟进行30个循环，最后72。C延伸 IO分钟，扩GLU目的基因片段。(扩增过程如图2所示，构建结果如图6所示)
2. GLU-GIR-LTB融合基因表达载体及重组表达型工程菌的构建
1) pcr产物的克隆
将获得的GLU基因片段克隆入pMD18-T,转化丑co/iDH5oc,氨千抗性筛 选阳性重组子，抽提质粒，用餘o/和5譜#/做双酶切鉴定，鉴定正确后回收基 因片段。
2) GLU-GIR-LTB融合基因表达载体的构建
将1 )中回收的GLU融合基因片段构建于融合基因表达载体pET-28a(+)-GIR - LTB,分别进行2个双酶切鉴定舵o/和J力o/。(酶切结 果如图7所示)
3) 将酶切鉴定无误的基因重组质粒转化至宿主菌BL21 ( DE3 )，获 得重组工程菌。
4) 重组工程菌GLU-GIR-LTB/BL21送上海英俊公司测序，测序结果如图11 所示。
14
3. 重组工程菌的诱导表达及形式鉴定
重组工程菌在含有卡那霉素(50|jg/ml )的LB液体培养基中培养，至菌液 0D6。。《 0. 6时加入IPTG至终浓度为1. Ommol/L,诱导不同时间收集菌液，超声波 破菌，差速离心分别留取上清和沉淀，处理后进行凝胶电泳鉴定表达形式及表 达量。(诱导表达及形式鉴定如图8所示)
4. 融合蛋白GLU-GIR-LTB的纯化
重组菌的发酵，采用德国B.Braun 10L发酵罐，按照本实验室工程菌发酵 常规工艺进行。发酵结束后离心收集细菌，称重后冻存备用。用pH值7. 8的TE 緩冲液重悬细菌，经高压匀浆仪进行破菌，差速离心收集包涵体，分别用含1 % Triton XI00的TE緩冲液和含1M、 2M尿素TE緩冲液洗涤包涵体，用8M尿素 溶解包涵体，透析后利用蛋白所带的6个His标签，采用亲和层析的方法进行 蛋白纯化。
5. 纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE,检定其纯度，目的蛋白纯度达到90 %以上(纯化结果如图9所示)
实施例3融合蛋白的免疫原性初探
1. 免疫小鼠
目的蛋白GLU-GIR-LTB经过纯化后免疫4 ~ 5周龄的Balb/c小鼠，lOOug/ 只/次，lOOiaL抗原与等量福氏完全佐剂混合，注射小鼠腹部和腹股沟皮下免疫。 免疫程序是0、 1、 2周，共3次，第1、 2次加入福氏完全佐剂，第3次不加 佐剂，接种于小鼠腹部及腹股沟皮下，注射抗原和佐剂的量约为0. 2ml，每周一 次，第3次免疫后6天断尾采血，ELISA检测血清特异性抗体效价的改变。
2. 特异性免疫应答的检测。
(1) ELISA抗原包^皮板的准备
将GLU抗原用包被液稀释至5 n g/ml， 100 |a 1/孔包被ELISA板，4。C过夜。 洗涤液洗4次。每孔加入300jul 1%BSA， 37。C封闭2h,洗涤液洗4次后，4°C 保存备用。
(2) 小鼠血清标本的采集血清采集分别于免疫前及免疫2、 3次后7天，将每只小鼠断尾采血约100 pi, 1. 5ml无菌EP管收集，室温放置lh, 5000gxl0min,收集血清，分装， -7(TC保存
(3)血清特异性抗体IgG的检测
血清抗原特异性IgG的检测从l: 5000开始，以抗体稀释液倍比稀释待检血清， 1: IOO稀释阴性血清，100/al/孔，37。C酵育60min,洗涤液洗4次，加入HRP标 记的羊抗鼠IgG(l: 20 000), lOOial/孔,37。C孵育30min，洗涤液洗4次，加入 OPD底物显色液，室温避光反应30min， 50 ja l终止液终止反应，以PBS孔作空白 对照，492nm测定各孔0W直。
3.结果
GLU-GIR-LTB免疫3次后的抗体阳性率在92%,免疫4次后的抗体阳性率达到 95°/。。提示融合蛋白GLU-GIR-LTB能有效的刺激机体产生较强的免疫应答，是一 种良好的龋齿疫苗候选抗原。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所 属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许之更动 与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。序列表
〈110>中国人民解放军第三军医大学
< 120〉 一种人变形链球菌基因工程龋齿疫苗及其制备方法
<130>
<160> 10
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 588
<212> DNA
<213〉融合基因GIR-LTB的基因序列
<400> 1
tacgcgccgcELgg3tCCtCELagcacaagtta_a_ta<cg￡Lttcaaggacaagtaagtgcttta60
aagctg犯ttacaagctg犯ttgaagctcagtctgctact120
ttgggtcaacaaattcaaacactttcaagccacgt犯tgaatctttgaag180
caacaagctcgtogtgctcagcagctaccagctatattaatgctatcatt240
cagtttctgaggcagtggcgctccccagtc300
ctatgttcggcacacaaatatatacgataa360
acggaatcgatggc鄉c犯aag兆aaBtggttatcattacatttaagagcggcgcaaca420
tttcaggtcgaagtcccgggcagtcaacatatagactccccattgaia^gg480
cgcatatctgaccgagaccaattatgtgta540
tggaat^tattcaattgcggcaatcagtatggaaaac588
<210> 2
<211〉 190
〈212〉 PRT
<213>融合蛋白GIR-LTB的氨基酸序列
〈400〉 2
Gin Ala 1
Gin Gin
Ala Thr
Arg Asn 50 Ala Ala 65
A印Gly
Ser Glu
Ser Tyr
Phe Lys 130 lie Asp 145
Gin
Ala
Leu
35
Glu
Thr
Ser
Tyr
Thr 115
Ser
Ser
Val
Glu
20
Gly
Ser
Ser
Gly
Arg 100 Glu
Gly
Gin
Asn 5
Leu
Gin
Leu
Tyr
Gly
85
Asn
Ser
Ala
Lys
Thr
Gin
Gin
Lys
lie
70
Ser
Thr
Met
Thr
Lys 150
lie Ala lie
Gin
55 Asn
Gly
Gin
Ala
Phe 135 Ala
Gin
Glu
Gin
40
Gin
Ala
Ala
lie
Gly 120 Gin
lie
Gly
Asn
25
Thr
Ala
lie
Pro
Tyr 105 Lys
Val
Glu
Gin
10
Gin
Leu
Arg
lie
Gin
90
Thr
Arg
Glu
Arg
Val
Arg
Ser
Ser
Asn
75
Ser
lie
Glu
Val
Met 155
Ser
Leu
Ser
Ala
60
Ser
lie
Asn
Met
Pro 140 Lys
Ala
Glu
Lys
45
Gin
Lys
Thr
Asp
Val 125 Gly
Asp
Leu
Ala
30
lie
Lys
Ser
Glu
Lys 110 lie
Ser
Thr
Gin
15
Gin
Val
Ser
Val
Leu
95
lie
lie
Gin
Leu
Thr
Ser
Ala
Asn
Ser
80
Cys
Leu
Thr
His
Arg 160<formula>formula see original document page 18</formula>Tyr Phe Arg Ala Asn Gly Val Gin Val Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp 65 70 75 80
Arg Tyr Gly Arg lie Ser Tyr Tyr Asp Ser Asn Ser Gly Asp Gin lie
85 90 95
Arg Asn Arg Phe Val Arg Asn Ala Gin Gly Gin Trp Phe Tyr Phe Asp
100 105 110
Asn Asn Gly Tyr Ala Val Thr Gly Ala Arg Thr lie Asn Gly Gin His
115 120 125
Leu Tyr Phe Arg Ala Asn Gly Val Gin Val Lys Gly Glu Phe Val Thr
130 135 140
Asp Arg His Gly Arg lie Ser Tyr Tyr Asp Gly Asn Ser Gly Asp Gin 145 150 155 160
lie Arg Asn Arg Phe Val Arg Asn Ala Gin Gly Gin Trp Phe Tyr Phe
165 170 175
Asp Asn Asn Gly Tyr Ala Val Thr Gly Ala Arg Thr lie Asn Gly Gin
180 185 190
His Leu Tyr Phe Arg Ala Asn Gly Val Gin Val Lys Gly Glu Phe Val
195 200 205
Thr Asp Arg Tyr Gly Arg lie Ser Tyr Tyr Asp Ser Asn Ser Gly Asp
210 215 220
Gin lie Arg Asn Arg Phe Val Arg Asn Ala Gin Gly Gin Trp Phe Tyr 225 230 235 240
Phe Asp Asn Asn Gly Tyr Ala Val Thr Gly Ala Arg Thr lie Asn Gly
245 250 255
Gin His Leu Tyr Phe Arg Ala Asn Gly Val Gin Val Lys Gly Glu Phe
260 265 270
Val Thr Asp Arg Tyr Gly Arg lie Ser Tyr Tyr Asp Ala Asn Ser Gly
275 280 285
Glu Arg Val Arg Tyr Ala Pro Gin Asp Pro Gin Ala Gin Val Asn Thr
290 295 300
lie Gin Gly Gin Val Ser Ala Leu Gin Thr Gin Gin Ala Glu Leu Gin 305 310 315 320
Ala Glu Asn Gin Arg Leu Glu Ala Gin Ser Ala Thr Leu Gly Gin Gin
325 330 335
lie Gin Thr Leu Ser Ser Lys lie Val Ala Arg Asn Glu Ser Leu Lys
340 345 350
Gin Gin Ala Arg Ser Ala Gin Lys Ser Asn Ala Ala Thr Ser Tyr lie
355 360 365
Asn Ala lie lie Asn Ser Lys Ser Val Ser Asp Gly Ser Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Ala Pro Gin Ser lie Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr 385 390 395 400
Gin lie Tyr Thr lie Asn Asp Lys lie Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met
405 410 415
Ala Gly Lys Arg Glu Met Val lie lie Thr Phe Lys Ser Gly Ala Thr
420 425 430
Phe Gin Val Glu Val Pro Gly Ser Gin His lie Asp Ser Gin Lys Lys
435 440 445
Ala lie Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg lie Ala Tyr Leu Thr Glu
450 455 460
Thr Lys lie Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser 465 470 475 480lie Ala Ala lie Ser Met Glu Asn Leu Glu His His His His His His 485 490 495
〈210〉 5 <211> 33 〈212〉 DNA
〈213> GIR上游引物序列 <400> 5
tacgcgccgc aggatcctca agcacaagtt aat 33
<210> 6 〈211〉 33 〈212〉薩
<213〉 GIR下游引物序列 <400> 6
gccactgcca ccacttccat cagaaactga ttt 33
<210> 7 〈211〉 33 <212〉 DNA
<213> LTB上游引物序列 <400〉 7
ggaagtggtg gcagtggcgc tccccagtct att 33
〈210〉 8 〈211〉 24 <212> DNA
<213> LTB下游引物序列 <400> 8
ctcgaggttt tccatgctga ttgc 24
<210〉 9 〈211〉 25 <212> 腿
〈213> GLU上游引物序列 <■> 9
ccatggatga aatgggctat caagc 25
〈210〉 10 <211> 34 <212> 丽
<213> GLU下游引物序列 <400> 10
ggatcctgcg gcgcgtaccg aactcgttct ccag 34
20
权利要求
1. 一种人变形链球菌基因工程龋齿疫苗，其特征在于，至少包含变形链球菌葡糖基转移酶C末端的葡聚糖结合区GLU、葡聚糖结合蛋白B的N端免疫显性区片段GIR和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位LTB三种免疫保护性抗原。
2. 根据权利要求1所述的基因工程疫苗，其特征在于，其为所述变形链球 菌葡糖基转移酶C末端的葡聚糖结合区GLU、葡聚糖结合蛋白B的N端免疫显性 区片段GIR以及大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位LTB在基因水平进行连接构建 而成的融合蛋白。
3. 根据权利要求2所述的基因工程疫苗，其特征在于所述融合蛋白的构 建顺序为GLU-GIR-LTB.
4. 根据权利要求3所述的基因工程疫苗，其特征在于所述融合蛋白的氨基 酸序列为SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。
5. —种制备人变形链球菌基因工程龋齿疫苗的方法，其特征在于包含步骤l)培养变形链球菌，获取其基因组DNA;2 )克隆变形链球菌的GLU及GIR的编码基因及以pET-llc-LTB质粒为模 板克隆LTB编码基因；3)以获得的GIR的编码基因为基础，构建融合基因GIR-LTB表达质粒；4 )以获得的GLU及GIR-LTB为基础，构建融合基因GLU-GIR-LTB表达质粒;5) 融合基因GLU-GIR-LTB表达质粒转化宿主菌，获得目的蛋白；6) 分离并纯化目的蛋白GLU-GIR-LTB,制成基因工程龋齿疫苗。
6.根据权利要求5所述的基因工程龋齿疫苗制备方法，其特征在于，所述 构建融合基因GIR-LTB表达质粒包括以下步骤1 )以PCR方法扩增获得GIR和LTB编码基因；2 )以重叠延伸PCR的方法获得融合基因GIR-LTB的编码基因；(9)用限制性酶切GIR-LTB的克隆质粒； 4)酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离；(5 )切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带；96)将GIR-LTB目的基因的回收产物克隆入原核细胞表达载体，获得含有 GIR-LTB基因的重组质粒，以及(7 )将含有GIR-LTB基因的重组质粒转化大肠杆菌；
7.根据权利要求5所述的基因工程龋齿疫苗制备方法,其特征在于，所述 构建融合基因GLU-GIR-LTB表达质粒包括以下步骤(1 )以PCR方法扩增获得GLU编码基因；(2) 用限制性酶切GLU和含有GIR-LTB基因的重组质粒；(3) 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离；(4 )切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带；(5 )将GLU的回收产物克隆入原核细胞表达载体，获得含有GLU-GIR-LTB基 因的重组质粒，以及(6)将含有GLU-GIR-LTB基因的重组质粒转化大肠杆菌。
全文摘要
本发明属生物制药领域，涉及一种人变形链球菌基因工程龋齿疫苗的构建及制备方法，其主要采用人主要致龋菌-变形链球菌的主要保护性抗原葡糖基转移酶C末端的葡聚糖结合区和葡聚糖结合蛋白B的N末端免疫显性区基因与黏膜免疫佐剂不耐热肠毒素B亚单位通过基因重组方法构建融合工程菌，经高密度发酵及一系列的纯化程序从而获得高纯度的融合蛋白分子疫苗。上述疫苗的制备工艺简捷、易于放大、重复性好，所获目标蛋白纯度较高，初步的动物试验证明该融合蛋白可刺激机体产生高效的免疫应答，证实其可作为基因工程龋齿疫苗的良好的候选抗原，具有良好的应用前景。
文档编号A61K39/09GK101474400SQ20091010308
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月19日 优先权日2009年1月19日
发明者涛 刘, 张卫军, 毛旭虎, 云 石, 邹全明, 鹰 郭 申请人:中国人民解放军第三军医大学