专利名称：：石榴皮提取物及其生产方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及从植物石榴的果皮中提取的提取物及其生产方法和应用的
技术领域：
，是一种石榴皮提取物及其生产方法和应用即一种石榴皮提取物及其生产方法和弱极性大孔树脂在石榴皮提取物的生产方法中的应用。
背景技术：
：流感是由甲、乙、丙三型流感病毒所引起的急性呼吸道传染病。三型流感病毒均为正黏科病毒，是有包膜的单股负链RNA病毒，其中，甲型流感病毒对人类的危害最大，可造成世界性的流感大流行；乙型多造成局部爆发；丙型则主要侵犯婴幼儿。流感病毒传入人群后，造成流感流行的显著特点为突然爆发，迅速蔓延，影响面广，发病率高并伴有一定的死亡率。传染源主要是患者，主要传播途径是带有流感病毒的空气飞沫。死亡通常是继发细菌感染所造成，合并症常发生于婴幼儿、老年人和慢性病患者。流感的危害众所周知，人类迄今尚无力阻止每10至50年一次的世界性流感大流行，近年来禽流感、甲型流感的流行不仅损害了人们的身体健康，而且由此造成巨大的经济损失和沉重的社会负担，因此，防治流感已成为世界各国传染病控制的核心问题。但由于流感病毒的变异性极高，抗流感病毒药物的研究发展缓慢。为了更积极地应对流感的大流行，国际医药界一直在努力寻找防治流感的有效药物。在我国，从传统中药材中发掘抗流感有效物质更受到广泛关注。乙肝病毒是嗜肝DNA病毒中的一个成员，乙肝病毒感染机体后进入血液循环，在白细胞中繁殖，最后定位于肝实质细胞，导致乙型肝炎。乙型肝炎的传播途径为肠道外传播。患急性乙型肝炎后，90%的患者可以临床治愈，获得病后免疫；10%的患者转为慢性乙型肝炎，其中一部分人将发展为肝硬化及肝癌。乙型肝炎是世界性传染病，东南亚、非洲和我国属于高发区，人群乙肝病毒感染率高达60%。乙型肝炎高发区的主要流行特征是儿童期的感染率很高，他们作为稳定的传染源在社会上长期存在，危害人群，同时又将是肝硬化及肝癌的受害者。虽然乙肝病毒基因工程亚单位疫苗可控制病毒感染的流行，但由于乙型肝炎高发区均为经济不发达地区，全员计划免疫还无法实现。由于目前临床上可用的抗乙肝药物非常有限，而且疗效都不尽理想，对社会上大量存在的乙肝患者进行有效的治疗，以提高其生存质量，延长生存期，是国际医学界需要攻克的难题。开发研制安全有效的抗乙肝病毒新药，则是广大药学工作者努力的方向。爱滋病毒属人类逆转录病毒，为有膜的RNA病毒。人体感染爱滋病毒后，大多数患者需7至10年才发展成爱滋病并导致死亡。缓慢的病程源于爱滋病毒渐进性地破坏人体免疫功能而最终继发危及生命的各类并发症。然而，爱滋病的传播速度惊人，在被发现后的短短20年时间里，这种疾病已扩散到了全球各个角落，中国虽属于低发区，但感染者也已远远超过ioo万，爱滋病的传播给人类健康带来了巨大威胁。在爱滋病的防治方面，虽然用疫苗预防感染一直是国际上研究的热点，但由于爱滋病毒极易产生基因突变而逃逸免疫保护等种种原因，疫苗研制至今没有取得突破性的进展。抗爱滋病毒化疗药物的开发取得了一定的成绩，已上市的多个化药对预防母婴传播和意外感染显示了一定效果。然而，化疗药物不能完全抑制病毒复制，依赖药物剂量的毒性、耐药性及价格昂贵等缺陷极大地限制了其疗效和广泛的临床应用。科学家们正在努力争取抗爱滋病毒药物研发的实质性进展。病毒性疾病的防治已成为国际医学界迫切需要解决的重大难题之一，特别是流感、乙型肝炎和艾滋病等世界性瘟疫，对人们的生存质量乃至社会的经济发展影响深远，因此，抗病毒药物的研究是医药领域迫切需要取得突破的科研课题。在我国，利用传统中药防治病毒性疾病一向备受重视，由于中药多组分、多靶点、多种作用机制的优势，从中药材中提取分离到的一些抗病毒有效成分显示出良好的开发应用前景。石榴皮为石榴科植物石榴(P皿icagranatumL)的干燥果皮，性酸，味涩，具有涩肠、杀虫、止血之功效。石榴是我国重点发展的水果之一，其种植面积正向规模化发展，但占石榴果实近三分之一的石榴皮还没有充分利用起来，大部被废弃，造成严重的资源浪费。据报道，石榴皮中含有多种化学成分，主要有黄酮类、鞣质类、石榴皮碱以及树脂类成分等。目前，从石榴皮中制备提取物，并用于开发抗病毒药物的研究在国内外未见报道，采用大孔树脂吸附技术从石榴皮中分离纯化黄酮类成分的研究亦未见正式报道，且未查到有相关的专利申请或授权。本发明提供一种应用于制备广谱抗病毒药物的石榴皮提取物及其生产方法和弱极性大孔树脂在石榴皮提取物的生产方法中的应用，克服了现有技术之不足，该石榴皮提取物含有30%至70%(重量百分比)的黄酮类成分和10%至30%(重量百分比)的鞣质类成分；该石榴皮提取物的生产方法首次应用弱极性大孔树脂吸附分离技术从石榴皮粗提物中分离纯化石榴皮中的黄酮类成分；该石榴皮提取物特别能用于制备治疗流感和/或乙型肝炎和/或爱滋病等疾病的广谱抗病毒药物。本发明的技术方案之一是通过以下方式得到的一种用于制备广谱抗病毒药物的石榴皮提取物，其按重量百分比含有30%至70%的黄酮类成分和10%至30%的鞣质类成分。下面是对上述技术方案之一的进一步优化和/或选择该石榴皮提取物按下述步骤得到第一步，石榴皮粗粉用水和/或乙醇粗提，其中，水粗提为将石榴皮粗粉加8倍至10倍量水，在8(TC至10(TC下提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液；乙醇粗提为将石榴皮粗粉加8倍至10倍量30%至70%的乙醇，在6(TC至8(TC提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液；第二步，将上述滤液浓縮至原体积的三分之一，加相当于浓縮液体积2倍量的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀得到乙醇溶液；第三步，将上述乙醇溶液浓縮后调节ra值为3至7，上大孔树脂层析柱吸附；其中，大孔树脂采用HPD400、HPD600、D-101、D-201、AB-8型弱极性大孔树脂中的一种；
发明内容第四步，以相当于3至8个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱，再以30%至70%的乙醇为洗脱剂进行洗脱，洗脱剂的用量相当于3至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并；第五步，将上述合并后的乙醇洗脱液在6(TC至9(TC下浓縮，回收乙醇，再在50°C至8(TC下减压干燥，即得所需的石榴皮提取物。本发明的技术方案之二是通过以下方式得到的一种石榴皮提取物的生产方法按下述步骤进行第一步，石榴皮粗粉以水和/或乙醇粗提；第二步，加乙醇沉淀粗提物中的杂质；第三步，乙醇溶液浓縮后调节ra值，以大孔树脂吸附粗提物中的总黄酮；第四步，用乙醇从大孔树脂上洗脱总黄酮得到洗脱液；第五步，将洗脱液浓縮并回收乙醇，减压干燥，即得石榴皮提取物。其中，大孔树脂采用HPD400、HPD600、D_101、D_201、AB-8型弱极性大孔树脂中的一种。下面是对上述技术方案之二的进一步优化和/或选择在上述第一步中将石榴皮粗粉加8倍量至10倍量的水，在6(TC至8(TC提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液。在上述第一步中将石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在6(TC至8(TC提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液。在上述第二步中将滤液浓縮后加相当于浓縮液体积2倍量的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀得到乙醇溶液；在第三步中将乙醇溶液浓縮后调节ra值为3至7，上大孔树脂层析柱吸附；其中，所用大孔树脂选用HPD400、HPD600、D_101、D_201、AB-8型弱极性大孔树脂中的一种；在第四步中以相当于3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30%至70%的乙醇为洗脱剂进行洗脱，洗脱剂的用量相当于3至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并；在第五步中将乙醇洗脱液在60°C至9(TC下浓縮，回收乙醇，再在5(TC至8(TC下真空干燥，即得到所需的石榴皮提取物。本发明的技术方案之三是通过以下方式得到的弱极性大孔树脂在上述石榴皮提取物的生产方法中的应用，其所用大孔树脂为HPD400、HPD600、D-101、D-201、AB-8型弱极性大孔树脂的一种。本发明的技术方案之四是通过以下方式得到的上述石榴皮提取物应用于制备针对流感病毒和/或乙肝病毒和/或爱滋病毒的广谱抗病毒药物。本发明石榴皮提取物具有明显的抗流感病毒、乙肝病毒及爱滋病毒作用，可用于制备广谱抗病毒药物；本发明首次提出石榴皮提取物在抗流感病毒、乙肝病毒及爱滋病毒方面的作用；并在该石榴皮提取物的生产方法中首次应用大孔树脂吸附分离技术，从石榴皮粗提物中富集石榴皮中的黄酮类成分，并得到总黄酮含量达30%至70%(重量百分比)，同时含10%至30%(重量百分比)鞣质类成份的提取物。该方法简单易行，工艺可靠，适合工业化生产。具体实施例方式本发明不受下述实施例的限制，可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。6下面结合实施例对本发明作进一步论述。通过下述实施例对本发明石榴皮提取物进行详细说明实施例1:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水于8(TC至IO(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，滤液浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上AB-8型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为每小时2至5个层析柱体积，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例2:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水于8(TC至IO(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，滤液浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上AB-8型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为每小时2至5个层析柱体积，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例3:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水IO(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀12小时，滤除沉淀，滤液浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上AB-8型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为2个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。其中，所用大孔吸附树脂选用D-201、D-301、HPD400、HPD600、AB-8等型号的大孔树脂中的一种。实施例4:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30^的乙醇于6(TC至8(rC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上AB-8型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例5:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上AB-8型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例6:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上AB-8型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例7:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上AB-8型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例8:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上AB-8型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例9:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上AB-8型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为5至10个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例10:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上AB-8型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例11:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上AB-8型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例12:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上AB-8型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例13:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水于8(TC至IO(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，滤液浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上HPD400型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为每小时2至5个层析柱体积，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例14:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水于8(TC至IO(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，滤液浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上HPD400型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为每小时2至5个层析柱体积，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例15:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水IO(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀12小时，滤除沉淀，滤液浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上HPD400型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为2个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。其中，所用大孔吸附树脂选用D-201、D-301、HPD400、HPD600、AB-8等型号的大孔树脂中的一种。实施例16:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇于6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上HPD400型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例17:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上HPD400型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例18:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上HPD400型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例19:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上HPD400型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例20:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上HPD400型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例21:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上HPD400型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为5至10个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例22:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上HPD400型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例23:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上HPD400型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例24:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上HPD400型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例25:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水于8(TC至IO(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，滤液浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上HPD600型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为每小时2至5个层析柱体积，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。10实施例26:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水于8(TC至IO(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，滤液浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上HPD600型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为每小时2至5个层析柱体积，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例27:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水IO(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀12小时，滤除沉淀，滤液浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上HPD600型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为2个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。其中，所用大孔吸附树脂选用D-201、D-301、HPD400、HPD600、AB-8等型号的大孔树脂中的一种。实施例28:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇于6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上HPD600型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例29:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上HPD600型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例30:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上HPD600型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例31:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上HPD600型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例32:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上HPD600型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例33:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上HPD600型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为5至10个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例34:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上HPD600型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例35:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上HPD600型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例36:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上HPD600型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例37:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水于8(TC至IO(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，滤液浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上D-101型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为每小时2至5个层析柱体积，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例38:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水于8(TC至IO(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，滤液浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上D-101型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为每小时2至5个层析柱体积，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例39:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水IO(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀12小时，滤除沉淀，滤液浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上D-101型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为2个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。其中，所用大孔吸附树脂选用D-201、D-301、HPD400、HPD600、AB-8等型号的大孔树脂中的一种。实施例40:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇于6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上D-101型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例41:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上D-101型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例42:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上P-101型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例43:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上D-101型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例44:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上D-101型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例45:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上D-101型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为5至10个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例46:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上D-101型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例47:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上D-101型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例48:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上D-101型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例49:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水于8(TC至IO(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，滤液浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上D-201型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为每小时2至5个层析柱体积，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例50:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水于8(TC至IO(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，滤液浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上D-201型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为每小时2至5个层析柱体积，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例51:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水IO(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀12小时，滤除沉淀，滤液浓縮后以稀盐酸调节Wl值为7，上D-201型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为2个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。其中，所用大孔吸附树脂选用D-201、D-301、HPD400、HPD600、AB-8等型号的大孔树脂中的一种。实施例52:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇于6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上D-201型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例53:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加浓縮液体积2倍量的无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上D-201型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例54:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上D-201型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例55:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上D-201型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例56:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上D-201型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例57:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀1524小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上D-201型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为5至10个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例58:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为3，上D-201型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例59:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为5，上D-201型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以50%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例60:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提两次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓縮至原体积的三分之一，加2倍量无水乙醇放置沉淀24小时，滤除沉淀，浓縮后以稀盐酸调节ra值为7，上D-201型大孔树脂层析柱，待上样液全部吸附后，以3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以70%的乙醇进行洗脱，乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，合并后于6(TC至9(TC浓縮，浓縮液再于5(TC至8(TC减压干燥，即得石榴皮提取物。实施例61:对上述实施例1至60所得石榴皮提取物按下述方法进行总黄酮含量的测定对照品溶液的配制精密称取干燥至恒重的芦丁对照品50毫克，置25毫升容量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取10毫升，置100毫升容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得每毫升含0.2毫克无水芦丁的对照品溶液。标准曲线的制备精密量取对照品溶液1、2、3、4、5、6毫升，分别置25毫升的容量瓶中，各加水至6毫升，加5%亚硝酸钠溶液1毫升，混匀，放置6分钟，再加入10%硝酸铝溶液1毫升，摇匀，放置6分钟，再加入氢氧化钠试液10毫升，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，于500纳米处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。样品测定分别精密称取上述实施例1至60所得石榴皮提取物样品1.Og，置100毫升的容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取10毫升，置100毫升的容量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取3毫升，置25毫升容量瓶中，加水至6毫升，加5%亚硝酸钠溶液1毫升，混匀，放置6分钟，再加入10%硝酸铝溶液1毫升，摇匀，放置6分钟，再加入氢氧化钠试液10毫升，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，于500纳米处测定吸收度，从上述标准曲线上读出样品溶液中含无水芦丁的量，计算石榴皮提取物样品中总黄酮(以无水芦丁计)的含量，应在30%至70%的范围内。实施例62:对上述实施例1至60所得石榴皮提取物按下述方法进行鞣质含量的磷钼钨酸试液的配制取钨酸钠100g、钼酸钠25g，加水700ml使溶解，加盐酸100ml、磷酸50ml，加热回流10小时，放冷，再加硫酸锂150g、水50ml和溴0.2ml，煮沸除去残留的溴(约15分钟)，冷却，加水稀释至1000ml，滤过，即得。试液应呈黄色，如放置后变为绿色，可加溴O.2ml，煮沸除去多余的溴即可。对照品溶液的制备精密称取没食子酸对照品50mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每lml中含没食子酸0.05mg)。标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.Oml，分别置25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液lml，再分别加水11.5、ll、10、9、8、7ml，用29X碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀。放置30分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2005版一部附录VA)，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。样品溶液的制备取供试品适量，精密称定，置250ml棕色量瓶中，加水150ml，放置过夜，超声处理10分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置(使固体物沉淀)。滤过，弃去初滤液50ml，精密量取续滤液20ml，置100ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。测定总酚精密量取样品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自"加入磷钼钨酸试液lml"起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出样品溶液中没食子酸的量(mg)，计算，即得。测定不被吸附的多酚精密量取样品溶液25ml，加至已盛有干酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，置30°C水浴中保温1小时，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自"加入磷钼钨酸试液lml"起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出样品溶液中没食子酸的量(mg)，计算，即得。样品中鞣质含量的计算鞣质含量=总酚量_不被吸附的多酚量按上述方法计算石榴皮提取物样品中鞣质的含量，应在10%至30%的范围内。在本发明中首次提出弱极性大孔树脂在石榴皮提取物生产方法中的应用。所用弱极性大孔树脂选用D-101、D-201、HPD400、HPD600、AB-8型大孔树脂中的一种。通过以下实验例对本发明石榴皮提取物的广谱抗病毒作用进行说明实验例l本发明石榴皮提取物对流感病毒致细胞病变的抑制作用。1.材料和方法1.l病毒株流感甲型病毒(H具亚型粤防72243株)，流感乙型病毒(济防97-13株)，购自中国预防医学科学院病毒学研究所。1.2实验样品石榴皮提取物样品SL1、SL2、SL3，为淡棕色至深棕色的浸膏粉，样品中总黄酮含量(重量百分比)SL1为30%、SL2为50%、SL3为70%，鞣质含量(重量百分比)SL1为30%、SL2为20%、SL3为10%。实验前均以高纯水配制成10mg/ml的原药液，过滤除菌后备用；阳性对照药利巴韦林，规格100mg/片，临床服用2片/次，3次/日，实验前用高纯水配制成10mg/ml的原药液，过滤除菌后备用。2.方法与结果样品对MDCK细胞毒性的测定样品SL2、SL2、SL3和阳性对照原液均以培养液作2倍稀释，取1:5至1:320共7个稀释度，将各稀释度的药液分别加到已接种Hela细胞并长成单层的培养板中，100微升/孔，每浓度4个平行孔，同时设细胞对照。将培养板置37°C、5%C02条件培养四天，每日观察细胞生长情况，以细胞不出现明显退变的最小稀释倍数为最大无毒浓度(TC。)。并按Reed-Muench法计算50%有毒浓度(TC5。)，结果见表1。样品对病毒致细胞病变的影响取已长成单层的MDCK细胞，接种流感甲型病毒10—5(50%细胞培养感染量CCID5。的15倍)、流感乙型病毒10—2(CCID5。的30倍)，于37t:吸附2小时后倾去病毒液，以不含血清的维持液洗细胞表面2次。实验设细胞对照组、病毒对照组和各样品不同稀释度的给药组，每组4个平行孔，细胞对照组、病毒对照组加等体积的维持液，给药组样品取TC。以下的5个倍比稀释度分别给药。37°C、5%C02条件培养，每日观察细胞病变情况，细胞病变程度按六级标准判断(-:无病变；士细胞病约占整个单层的10%以下；1:细胞病变约占整个单层的10%至25%;2:细胞病变约占整个单层的25%至50%;3:细胞病变约占整个单层的50%至75%;4:细胞病变约占整个单层的75%以上)。当病毒对照组细胞病变为4时记录实验结果。按Reed-Muench法计算半数有效浓度EC5。，并计算样品的选择指数TI(TC5。/EC5。)，结果见表2。根据选择指数TI的计算结果，认为石榴皮提取物SL1、SL2、SL3在体外细胞培养中对甲型流感病毒和乙型流感病毒均有抑制作用。实验结果说明石榴皮提取物样品SL1、SL2、SL3有明显的抗流感病毒作用。实验例4:本发明石榴皮提取物对人乙肝病毒的抑制作用1.实验材料1.1样品石榴皮提取物SL1、SL2、SL3，实验前均以高纯水配制成10mg/ml原药液，过滤除菌后于4t:保存，临用时以培养液稀释成所需浓度给药；阳性对照药拉米夫定用高纯水配制成lmg/ml的原液，实验前以细胞培养液配成所需浓度给药。1.2试剂MEM培养基，GiBco，InvitrogenCorporation;胰酶，北京三博远志生物技术有限公司；小牛血清、HEPES，中国医科院生物医学工程研究所；乙肝病毒核酸定量检测试剂、cPCR-荧光探针，中山大学达安基因股份有限公司。1.3细胞株2.2.15细胞，乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆转染人肝癌细胞(H印G2)的2.2.15细胞系，购自北京大学人民医院肝病中心，以含谷氨酰胺的MEM培养液于37°C，5%C02条件下培养，大约一周传代一次。2.方法及结果细胞毒性的测定2.2.15细胞接种96孔培养板，待细胞长成单层时，吸弃上清，设细胞对照组和SL1、SL2、SL3各6个浓度的给药组，每组4孔。各样品原液分别以培养液作2倍稀释，取1/5至1/320共7个稀释度，分别加样，细胞对照组加培养液，200y1/孔，于37°C、5%C02条件培养，第4天各组换相应浓度的药液，第8天于显微镜下观察，以细胞病变CPE为指标，程度分为五级，完全破坏为4;75%为3;50%为2;25%为1;无病变为0。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制百分率。观察最大无毒浓度TC。，并按Reed&Muench法18计算半数有毒浓度TC5。，结果见表3。样品对乙肝病毒DNA复制的抑制作用2.2.15细胞接种96孔细胞培养板(约10万个/毫升)，每孔200微升，371\5%C02条件培养，待细胞长成单层后，设细胞对照组、拉米夫定(1微克/毫升)组、Hl、H2、H3各四个浓度(均取TC。及其以下的3个2倍稀释度)，每浓度4孔，加样，200微升/孑L于37°C、5%C02条件培养，第4天换一次药液，继续培养，于第8天收集细胞培养上清液，以荧光定量PCR法测定乙肝病毒DNA表达量(拷贝/毫升)，计算样品的抑制率。按Reed&Muench法计算半数有效浓度IC5。，并计算选择指数SI，结果见表4。抑制率(％)=(对照组表达量_给药组表达量)/对照组表达量X100%选择指数SI=TC50/IC50三个样品抑制乙肝病毒复制的选择指数均大于2，表明石榴皮提取物具有明显的抗乙肝病毒作用。试验例4:本发明石榴皮提取物在人类嗜T淋巴细胞病毒I型感染的T细胞系MT-4细胞中对爱滋病毒HIV-1P24抗原的抑制作用MT-4细胞悬液计数，用100CCID5。的HIV-1IIIB感染细胞，在37°C，5%C02培养箱中吸附1.5小时。用无血清的1640培养液洗去未吸附病毒，用培养液将感染病毒的细胞配成2X105个细胞/毫升，接种于96孔细胞培养板内，每孔100微升；再分别加入3倍稀释的样品溶液和5倍稀释的阳性对照药齐多夫定(AZT)溶液100微升。每个稀释度重复3个孔，同时设细胞对照组和病毒对照组。培养板置于371\5%0)2饱和湿度培养箱内培养。4天后吸出上清，-20°〇冻存，待测HIV-1P24抗原滴度，细胞加MTT染色测定样品对细胞的毒性。MTT染色测定细胞毒性上述培养板每孔加5毫克/毫升的MTT溶液10微升染色，37°C、5%0)2饱和湿度培养箱内培养4小时后，每孔加入100微升50%DMF-17%TritonX-100脱色液，置37t:下过夜，在酶标仪上测定波长为570纳米处的吸收度值，计算样品的半数有毒浓度(CC5。)。测定样品在细胞培养内抑制HIV-1P24抗原的EC5。将上述冻存的感染病毒的MT-4上清液融化后进行稀释，按预实验结果调整稀释比例。按照HIV-1P24抗原检测试剂盒说明测定HIV-1P24抗原滴度，加样组与病毒对照组比较，计算样品的EC5。及选择指数TI(CC5。/EC5。)。结果见下表5。本实验中石榴皮提取物SL1、SL2、SL3对HIV_1P24抗原抑制作用的选择指数SI表明本发明石榴皮提取物具有明显的抗爱滋病毒作用。从上述实施例可以看出，本发明石榴皮提取物具有广谱抗病毒作用，可用于制备防治流感、乙型肝炎和艾滋病的广谱抗病毒药物。下面为表1至表5:表1样品对MDCK培养细胞的TC。和TC5。样品原液(毫克/毫升)TC。(微克/毫升)TC5。(微克/毫升)SL1105001349.619<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表2.石榴皮提取物对流感病毒的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表3样品在2.2.15细胞培养内的毒性<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表4样品在2.2.15细胞培养中第8天对HBV-DNA的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>权利要求一种用于制备广谱抗病毒药物的石榴皮提取物，其特征在于该石榴皮提取物按重量百分比含有30％至70％的黄酮类成分和10％至30％的鞣质类成分。2.根据权利要求1所述的石榴皮提取物，其特征在于该提取物按下述步骤得到第一步，石榴皮粗粉用水和/或乙醇粗提，其中，水粗提为将石榴皮粗粉加8倍至10倍量水，在8(TC至10(TC下提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液；乙醇粗提为将石榴皮粗粉加8倍至10倍量30%至70%的乙醇，在6(TC至8(TC提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液；第二步，将上述滤液浓縮至原体积的三分之一，加相当于浓縮液体积2倍量的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀得到乙醇溶液；第三步，将上述乙醇溶液浓縮后调节ra值为3至7，上大孔树脂层析柱吸附；其中，大孔树脂采用HPD400、HPD600、D-101、D-201、AB-8型弱极性大孔树脂中的一种；第四步，以相当于3至8个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱，再以30%至70%的乙醇为洗脱剂进行洗脱，洗脱剂的用量相当于3至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并；第五步，将上述合并后的乙醇洗脱液在6(TC至9(TC下浓縮，回收乙醇，再在5(TC至8(TC下减压干燥，即得所需的石榴皮提取物。3.—种石榴皮提取物的生产方法，其特征在于该方法按下述步骤进行第一步，石榴皮粗粉以水和/或乙醇粗提；第二步，加乙醇沉淀粗提物中的杂质；第三步，乙醇溶液浓縮后调节Kl值，以大孔树脂吸附粗提物中的总黄酮；第四步，用乙醇从大孔树脂上洗脱总黄酮得到洗脱液；第五步，将洗脱液浓縮并回收乙醇，减压干燥，即得石榴皮提取物。其中，大孔树脂采用HPD400、HPD600、D_101、D_201、AB-8型弱极性大孔树脂中的一种。4.根据权利要求3所述石榴皮提取物的生产方法，其特征在于在第一步中将石榴皮粗粉加8倍量至10倍量的水，在6(TC至8(TC提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液。5.根据权利要求3所述石榴皮提取物的生产方法，其特征在于在第一步中将石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在6(TC至8(TC提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液。6.根据权利要求3或4或5所述的石榴皮提取物的生产方法，其特征在于在第二步中将滤液浓縮后加相当于浓縮液体积2倍量的无水乙醇，放置沉淀24小时，滤除沉淀得到乙醇溶液；在第三步中将乙醇溶液浓縮后调节ra值为3至7，上大孔树脂层析柱吸附；其中，所用大孔树脂选用HPD400、HPD600、D_101、D_201、AB-8型弱极性大孔树脂中的一种；在第四步中以相当于3至8个层析柱体积的去离子水冲洗层析柱，再以30%至70%的乙醇为洗脱剂进行洗脱，洗脱剂的用量相当于3至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并；在第五步中将乙醇洗脱液在6(TC至9(TC下浓縮，回收乙醇，再在5(TC至8(TC下真空干燥，即得到所需的石榴皮提取物。7.弱极性大孔树脂在权利要求3或4或5或6所述石榴皮提取物的生产方法中的应用，其特征在于所用大孔树脂为HPD400、HPD600、D_101、D_201、AB-8型弱极性大孔树脂的一种。8.—种根据权利要求1或2所述的石榴皮提取物应用于制备针对流感病毒和/或乙肝病毒和/或爱滋病毒的广谱抗病毒药物:全文摘要本发明涉及从植物石榴的果皮中提取的提取物及其生产方法和应用的
技术领域：
，是一种石榴皮提取物及其生产方法和应用。该石榴皮提取物含有黄酮类成分和鞣质类成分。本发明石榴皮提取物具有明显的抗流感病毒、乙肝病毒及爱滋病毒作用，可用于制备广谱抗病毒药物；本发明首次提出石榴皮提取物在抗流感病毒、乙肝病毒及爱滋病毒方面的作用；并在该石榴皮提取物的生产方法中首次应用大孔树脂吸附分离技术，从石榴皮粗提物中富集石榴皮中的黄酮类成分，并得到总黄酮含量达30％至70％(重量百分比)，并含10％至30％(重量百分比)鞣质类的提取物。该方法简单易行，工艺可靠，适合工业化生产。文档编号A61K131/00GK101695511SQ20091011350公开日2010年4月21日申请日期2009年10月29日优先权日2009年10月29日发明者刘砥威,姚华,徐芳,赵军,顾政一,黄华申请人:新疆维吾尔自治区药物研究所;