专利名称：保守淋球菌表位的拟肽及应用它们的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及淋病奈瑟球菌(#e/Mer2'a gooorr力oeae)的保守表位 的拟肽(peptide mimics)，这些表位在人血型抗原上没有发现。本 发明也涉及应用这些拟肽预防淋病传染的方法和组合物。
背景技术：
性传播疾病淋病作为最常报道的传染病之一，造成世界范围的危 险。淋病是由一种革兰氏阴性双球菌淋病奈瑟球菌引起的。尽管该病 原体主要感染粘膜，但它能侵入组织并避开宿主的防御。淋病奈瑟球 菌是多种后遗症的病原体。从男性及女性的无症状粘膜感染到明显的 疾病综合征。更严重的综合征包括，例如，男性及女性中的传播性淋 球菌感染("DGI")，以及女性中的输卵管炎或盆腔炎疾病("PID，，)。 输卵管炎或PID本身可导致长期的后遗症，包括异位妊娠和不育。其 它重要的后遗症(有时需要外科手术)包括复发感染、慢性骨盆痛、 性交困难、骨盆内粘连和其它炎性残留物。
据估计，在美国，治疗PID和相关异位妊娠和不育症的直接和间 接费用1984年总计达26亿美元(53) 。 1990年，总的直接费用估计 达21.8亿美元，间接费用为15.4亿美元。假定通货膨胀和PID的发 病率恒定，该疾病的总花费预计在2000年将达80亿美元(9)。
尽管在美国公共卫生致力于控制淋球菌感染和有效抗生素治疗的 应用性，但每年疾病控制中心("CDC")仍报道有接近315000例淋 病U2)。所有淋病病例中有相当比例发生在无症状感染个体中，他 们是群体内大多数新病例的来源(6)。抗生素抗性菌林越来越多的流行使该感染的治疗更加复杂(10, 11， 52)。
淋病奈瑟球菌具有多种毒力因子。该病原体的表面成分在附着并侵入宿主细胞中起重要作用，并为宿主免疫应答提供潜在靶标。淋球菌感染引发对表现为细菌表面暴露抗原的几种成分的局部和全身性体液和细胞免疫应答，特别是菌毛、孔蛋白("Por")或蛋白I( "PI")、浑浊相关蛋白质("0pa")或蛋白11、Rmp或蛋白III和脂寡糖("L0S")(7)。菌毛、0pa、 Por和L0S全都与附着和侵入宿主有关，其表面暴露区全都显示相当大的变异(26， 45， 46)。淋球菌表面成分的菌林内和菌林间变异导致关于不同部位的组织特异性和生物再感染和持续毒力的潜能的假说。
在有症状和无症状患者中，淋球菌感染显示能刺激抗淋球菌血清免疫球蛋白水平提高。外周体液应答主要是IgG(大多数是亚类IgG3)，有较少量的IgM和IgA (13)。在数量上，抗体应答主要针对菌毛、0pa蛋白和L0S。局部抗体存在于生殖器分泌物中，但含量减少(48)，可能是针对与血清中的不同的抗原靶(27)。分泌中存在的主要抗体类别也是IgG (主要是IgG3)，而不是分泌型IgA( "sIgA" ) (7)。也存在抗LOS抗体，但其量少于抗菌毛、Por和0pa的抗体。尽管感染淋病奈瑟球菌的患者可能显示对多种淋球菌抗原的抗体应答，但从传播性感染(DGI)患者中分离的淋病奈瑟球菌对正常人血清("NHS，，)和大多数恢复期患者血清的杀菌作用有抗性(38)。这种血清抗性表型，称为稳定的血清抗性("SR"),可使生物能避开局部防御，穿过粘膜屏障，并通过血流传播。
在传代培养后，许多淋球菌菌林对NHS的杀伤成为表型敏感的或血清敏感的(38)。这些生物被称为血清敏感的("SS，，)或不稳定的血清抗性的。这些生物通常从局部炎症重度表现或临床明显的PID的女性中分离。急性输卵管炎，PID的病理相对疾病(由SS淋球菌引起)，极少发展为菌血症或DGI。这提示由SS淋球菌引起的剧烈局部炎症反应可能足以包括感染并预防菌血症，尽管要付出损伤局部组织的代价。SS淋球菌比SR淋球菌产生显著多量的补体衍生的趋化肽C5a
6(16)。这可引起SS淋球菌产生的多形核白细胞("PMN，，)介导的炎症反应。
淋病奈瑟球菌的抗生素抗性林的发展使得这种感染的控制越来越困难。不充分治疗淋球菌感染的潜能加速了对抗淋球菌疫苗的需要。淋球菌感染，特别是PID的严重并发症的预防已经是许多研究人员的目标。但是，正在进行的研发有效抗淋球菌疫苗的努力遇到许多困难。
应用病原体的个体表面成分作为常规疫苗的靶标的尝试未获成功，这是由于它们的抗原变异性。菌毛疫苗只对同源菌林(用来生产菌毛疫苗)感染有保护性，Por接种甚至在人体实验攻击中也未成功。另外，淋病奈瑟球菌表现明显的表型不均一性， 一般以103个生物中>1的频率从一种抗原形式向另一种变换(49, 50 )，这使该生物的表面成为大多数疫苗方案的移动目标。尽管疫苗候选林引起抗体应答，但产生的抗体和免疫应答没有广泛的保护性。
L0S是淋病奈瑟球菌的一种重要的毒力决定因素。有相当多的证据支持L0S作为针对淋病奈瑟球菌表面的杀菌抗体的主要靶标的作用(2, 16, 18， 37， 47)。 L0S抗体具有几个重要的功能杀细菌活性、通过经典或旁路补体途径的补体激活(2)，和调理素活性(16)。另外，L0S被认为是诱导对同源和异源淋球菌的功能性抗体应答的最有效的淋球菌抗原(51)。
单克隆抗体("mAb" ) 2C7 (30)检测在淋球菌临床分离株中似乎广泛保守和表达的L0S衍生寡糖("OS")表位。糖类一般是不依赖T细胞的抗原。当作为免疫原单独施用时，它们通常只引起初级抗体应答。另外，寡糖较小(<10糖单位)(19),可能需要其它的生物化学衍生使它们有免疫原性。因此，这些寡糖作为疫苗候选物的用途在几个方面受到限制。
曾提出在疫苗中使用内影像(internal i歸ge)决定条(36 )。利用mAb技术能生产针对病原体上目的表位的保护性抗体(Abl )。能纯化特定抗体(Abl)，随后作为免疫原，用来产生可能是病原体上原始表位的内影像的抗独特型抗体(Ab2)。;f艮据Jerne "网络"理论(23)预测，用抗初级抗体(Abl)抗原
疫应答。产生的抗-抗独特型抗体(或Ab3)应当能与最初的初级抗原反应。如果初级抗原是一种寡糖(因此预计可引起不依赖T细胞的免疫应答)，则用Ab2 (蛋白质相当物)免疫可引发T细胞依赖的应答。
已经证明mAb 2C7的抗独特位在小鼠和兔中产生抗L0S抗体，它们与补体一起是杀淋球菌的，来自该抗独特型抗体免疫的动物的血清也支持人PMN的调理素吞噬作用(20)。
也已经显示，通过与抗命名抗原的特异性抗体结合模拟命名抗原的合成肽也能引发针对命名抗原的免疫应答(29, 24， 54)。
具有对可用于预防淋病的药剂的需要，目的在于预防淋球菌输卵
管炎---种可能与衰老和慢性骨盆痛有关的感染、不育症和异位妊
娠(42)。另一个重要目的是预防生物从感染但无症状的宿主向另一个免疫性伴侣传播。这是重要的，因为男性和女性中所有淋病病例的相当一部分是无症状的，而无症状感染的、性活跃的人可能是大多数新的感染的主要来源。因此， 一种只降低有症状淋病的严重性的淋球菌疫苗能引起较高比例的无症状/有症状病例，因此，这种疫苗可能促进淋病的扩散，除非也防止传播(41)。
发明概述
本发明通过提供在人血型抗原中不存在的淋病奈瑟球菌的广泛保守寡糖表位的拟肽，普遍解决了上述问题。也提供了生产根据本发明的拟肽的方法。
根据本发明的拟肽在预防淋病奈瑟球菌感染的方法和组合物中有用。
附图简述
图1显示mAb 2C7与大肠杆菌克隆结合的Western印迹分析。7个单独的大肠杆菌克隆(PEP1-PEP7 ) ( SEQ ID N0S: 1-7 )在含有100Mg/ml氨节青霉素的IMC培养基中生长，然后诱导表达融合蛋白。制备每一个克隆的细菌裂解物，加样到14% SDS-PAGE凝胶中，电泳后，用Biorad电泳转移装置(Biorad, Hercules CA)将蛋白质转移到Immobilon PVDF转移膜上。该膜用mAb 2C7 (A)或抗-石充氧还蛋白抗体(B )探查。一个不能结合mAb 2C7的阴性克隆作为对照[SEQ ID NO: 9〗。
图2显示由能结合mAb 2C7的7个大肠杆菌克隆得到的拟肽序列。
图3显示mAb 2C7与表达拟肽融合的大肠杆菌克隆结合的FACS分析。大肠杆菌克隆在含有100pg/ml氨节青霉素的IMC培养基中生长，然后诱导表达融合蛋白。细菌细胞用1M氐聚甲醛固定，然后用mAb2C7染色，随后用FITC-偶联的抗小鼠IgG染色。 一个不能结合mAb 2C7的阴性克隆作为对照[SEQ ID NO: 9]。大肠杆菌克隆下面的数字代表与对照相比，结合mAb 2C7的群体的荧光强度中值；括号中的数字表示群体中细胞的百分数(总群体=100%)。
图4显示表达融合肽的大肠杆菌克隆对mAb 2C7结合LOS的抑制。大肠杆菌克隆在含有100jug/ml氨节青霉素的IMC培养基中生长，然后诱导表达融合蛋白。大肠杆菌细胞与mAb2C7温育30分钟，之后加样到LOS包被的平板上。 一个不能结合mAb 2C7的阴性克隆作为对照[SEQ ID N0:9]。数据代表至少2次实验(双孔)的平均值。PEP1克隆显示mAb 2C7与LOS结合的最大抑制(66%) [SEQ ID NO: 1] 。 PEP7、PEP3、 PEP4、 PEP2、 PEP6和PEP5显示结合抑制分别降低[分别为SEQ IDNO: 7， 3， 4， 2， 6和5]。
图5显示含有共有序列(DE-GLF) [SEQ ID N0:8]的肽对mAb 2C7结合LOS的抑制。数据代表3次实验(双孔)的平均值土SE。肽PEP1以剂量反应的方式抑制mAb 2C7与LOS的结合。
图6显示mAb 2C7与多抗原肽("MAP" ) MAPI的结合。
图7显示多抗原肽对mAb 2C7结合L0S的抑制。
图8显示小鼠中八MAPl(octa-MAPl)诱导的IgG抗-LOS抗体应答。(A) 8只小鼠在第0天接受在弗氏佐剂中乳化的剂量为50jug的八MAP1，并在第21天再次接受。(B) 4只小鼠用纯化的LOS免疫作为阳性对照。小鼠用弗氏佐剂免疫(C)或无关的八MAP对照肽(D)免
疫作为阴性对照。
图9显示所有免疫小鼠中的IgG抗-LOS抗体应答。显示所有小鼠(包括不表现应答的动物)的IgG抗-L0S抗体应答(平均值土SE )。
图IO只显示应答小鼠中的IgG抗-L0S抗体应答。抗体应答定义为高于0. 4jug/ml的IgG抗-LOS(平均值土SE)(高于基线IgG抗-L0S水平4倍)。小鼠用八MAP1、 L0S、单独的弗氏佐剂或无关的八MAP对照肽免疫。诱生的IgG抗-LOS抗体水平以浓度对时间作图。
图ll只显示应答小鼠中的IgM抗-L0S抗体应答。小鼠用八MAP1、L0S、单独的弗氏佐剂或无关的八MAP对照肽免疫。诱生的IgG抗-L0S抗体水平以浓度对时间作图。
图12显示暴露于小鼠免疫血清(67。/。[150iil总反应体积中的100
度为17%体积百分比])的淋球菌15253林及其lgtG突变体(2C7表位阴性)的存活率。细菌实验用(A)抗15M3林(阳性对照)和15253lgtG林(阴性对照)的mAb 2C7小鼠进行(4) 。 25ng/ml mAb 2C7
(150jul总反应混合物体积中lOOpl)介导100%的15253林杀伤，不杀死l5253 lgtG株。(B)正常小鼠血清(20只小鼠血清的合并，IgG抗-L0S抗体的平均浓度为0. 1 p g/ml )不能杀死任一林。(C )釆自八MAPI免疫的单只小鼠的血清(含有5, 05 n g/ml IgG抗-LOS抗体，由第卜11周采的血合并)对15253林显示92%的杀伤率(8°/。存活)，而l5253 lgtG林全部存活。(D)采自L0S免疫的单只小鼠的血清(含有21.Mjug/ml IgG抗-L0S抗体，由第7-11周采的血合并)不杀死15253株(179%存活)和15253 lgtG林(133%存活)。用阴性对照抗原(E)单独的弗氏佐剂或(F)无关的八MAP对照肽免疫的单只小鼠不杀死任一林。图l2对照包括不含抗体的补体来源(15253林137. 9%±1. 0%存活(不杀伤)，15253 lgtG突变体132. 5%±14. 3%存活
(不杀伤))。
图13显示IgG抗-LOS抗体浓度对淋病奈瑟球菌15253林杀伤率的图。来自八MAP1免疫的3只小鼠中每一只的IgG抗-L0S抗体水平 对细菌百分杀伤率作图。含有1.38、 2. 50和5.05pg/ml抗-LOS抗体 的小鼠血清对15253林分别显示31%、 74%和92%的杀伤率。mAb 2C7 的杀伤率在5个分别的LOS抗体浓度处显示，作为阳性对照。
发明详述
定义
在此使用时，"抗体"是含有各两条免疫球蛋白轻链和重链的完 整的免疫球蛋白分子。因此，抗体包括IgA、 IgG、 IgE、 IgD、 IgM型 (及其亚型)的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是K或 入型。
在此使用时，"单克隆抗体，，是最初由单个克隆的抗体形成细胞 产生的单特异性抗体。
在此使用时，"免疫预防有效的"是指在正常个体中诱导足以保 护该患者在一定时间免受淋病奈瑟球菌感染的免疫应答的能力。
在此使用时，"肽"是指一种线性或环状氨基酸链，长度一般为 至少4个、少于50个氨基酸。
在此使用时，"拟肽"是指显示与已知表位类似的免疫抗体结合 图的一种肽。
拟肽及其在根据本发明的组合物和方法中的应用 本发明涉及可与针对淋病奈瑟球菌保守寡糖表位的抗体免疫特异 性反应的拟肽，该寡糖表位在人血型抗原中不存在。这些拟肽能以类 似于如美国专利5, 476,784和6, 099,839 (均在此引用作为参考)所 述的抗独特型抗体的方式使用，作为一种替代抗原，引发针对淋病奈 瑟球菌寡糖表位的T细胞依赖的免疫应答。
可以对未感染的个体施用这种拟肽，以诱导针对淋球菌生物或携 带该寡糖抗原的细胞的特异性免疫应答。这种免疫应答在性质上可能 是免疫预防的，因为当受体接触淋球菌生物或携带该寡糖抗原的细胞时，它将预防感染。
为了鉴定候选拟肽，可以根据抗体结合特异性筛查随机肽库。这 种筛查技术为本领域技术人员所周知。在一种方法中，可以利用在大 肠杆菌鞭毛上表达的随机肽库鉴定能与淋病奈瑟球菌保守寡糖表位结
合的肽，该寡糖表位在人血型抗原中不存在。例如，可以测定与mAb 2C7 的结合来鉴定候选拟肽。结合可以用Western印迹、流式细胞分析或 通过固相ELISA对mAb 2C7结合L0S的竟争来表征。
也可以利用抗体建模确定抗独特位的互补决定区(CDR)中对应于 目的表位的免疫原性位点。这种分析可以得到关于免疫原性位点的三 维构象的信息，这在免疫原性位点的拟肽设计中有用。
一旦鉴定并测序特异拟肽，即可通过本领域周知的方法合成生产 该拟肽。
为了引发更强的免疫应答，也可以利用半抗原、利用佐剂、将拟 肽与载体蛋白连接、利用多抗原肽、将拟肽与补体蛋白偶联或通过本
领域周知的其它方法修饰拟肽。
本发明优选的药用组合物类似于用其它舦免疫人的组合物。本发 明的拟肽一般悬浮于治疗用无菌盐水溶液中。可以用其它方式配制药 用组合物，以控制活性成分的释放，或延长它们在患者系统中的存在。 许多合适的药物输送系统已知，包括，例如可植入药物释放系统、 水凝胶、羟甲基纤维素、微胶嚢、脂质体、微乳剂、小球体等。
本发明的药用组合物可以通过任何合适的方法施用，例如经口 、 鼻内、皮下、肌肉内、静脉内、动脉内或肠胃外施用。 一般优选静脉 内(i. v.)或肠胃外施用。
本领域技术人员应当明白，免疫预防有效量的本发明的拟肽尤其 取决于施用日程、所施用的拟肽的单位剂量、拟肽是否与其它治疗剂 结合施用、免疫状态和患者健康、所施用的拟肽的治疗活性和治疗医 生的判断。
为了更好地理解本发明，列出了下列实施例。这些实施例只是为 了说明，不应视作以任何方式限制本发明的范围。
12I.编码可特异结合mAb 2C7的肽的克隆的鉴定
A. 随机肽展示
用FliTrxTM随机肽库(Invitrogen， Carlsbad CA)在大肠杆菌表 面表达随机序列的肽(12-mer)。将编码该肽库的DNA插入编码石充氧 还蛋白活性环的基因中，该基因本身插入鞭毛基因的非必需区中。该 融合肽的表达受载体FliTrx 中噬菌体入主要左侧启动子(P,)的控 制。在该系统中，通过加入色氨酸诱导P"当诱导时，融合蛋白输出， 并在细菌细胞表面装配为鞭毛，准备展示该肽。
B. 可结合mAb 2C7的肽的筛选
FliTrxTM肽库(1. 77xl()8初级克隆)在含有100 n g/ml氨节青霉素 的IMC培养基(0. 2% w/v酪蛋白氨基酸、0. 5% w/v葡萄糖、42mM Na2HP04、 22mM KH2P04、 8. 5mM NaCl、 18. 7mM NH4C1和ImM MgCl2)中25匸生长 过夜。通过加入L-色氨酸至终浓度为100jag/ml，诱导融合肽的表达， 培养物在251C下生长6小时。然后将诱导的肽融合文库与2C7 mAb-包被的平板(20yg/ml)温育。温育1小时后，平板用含有lOOyg/ml 氨苄青霉素和1% cc-曱基甘露糖苷的IMC培养基洗涤5次。通过机械 剪切或者通过与从淋球菌15"3林制备的纯化LOS (已知mAb 2C7表 位在15253林中表达)竟争，洗脱结合的大肠杆菌，然后在25。C下生 长过夜。在第5轮淘洗后，洗脱结合的大肠杆菌，并在25"C下平板接 种于含有100 |i g/ml氨节青霉素的RMG琼脂上(2% w/v酪蛋白氨基酸、 0. 5%w/v葡萄糖、42mM Na2HP04、 22mM KH2P04、 8. 5mMNaC1、18. 7mMNH4Cl、 lmMMgCl2和1. 5%琼脂)。选择个别菌落通过Western印迹测定与mAb 2C7的结合(一种分泌mAb 2C7的杂交瘤细胞系被美国模式培养物保 藏中心["ATCC，，]保藏，分配的ATCC保藏号为HB-11859 )。
用包被于Mmm组织培养板上的mAb 2C7对该文库进行5轮正选择， 或者首先用无关的IgG3 (Sigma， St. Louis， M0 )进行负选择1小时， 之后用mAb 2C7继续进行5轮正选择。
随机选择107个菌落，利用Western印迹筛查其结合mAb 2C7的能力。鉴定出14个可结合mAb2C7的克隆。然后从阳性克隆中制备质 粒DNA，利用可与位于插入肽的核苷酸序列5'和3'侧的区域结合的 引物测序。鉴定出7个独特克隆，如图l和图2所示[SEQIDNOS:l-7]。
C. 流式细胞分析
阳性大肠杆菌克隆在含有100jig/ml氨节青霉素的IMC培养基中 25X:生长过夜，然后诱导表达融合肽6小时。大肠杆菌细胞在水上用 0. 5%低聚甲搭固定IO分钟。固定生物的200 jul等份以2000xg离心 10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬浮于含有mAb 2C7的封闭緩沖液(含 有100jLig/ml氨节青霉素、1%脱脂奶粉、150mM NaCl和1% a-甲基 甘露糖苷的IMC培养基)中。悬液在37C下温育30分钟，之后以2000xg 离心IO分钟。用100 iu 1洗涤緩冲液(含有100jLig/ml氨千青霉素和 1% a-甲基甘露糖苷的IMC培养基)洗涤沉淀，然后重悬浮于含有 FITC-偶联的抗小鼠IgG (Sigma， St. Louis, M0)的100pl封闭緩 冲液中。混合物在37X:下温育30分钟，之后以2000xg离心IO分钟。 弃去上清液，用100 ju 1洗涤緩冲液洗涤沉淀，之后重悬浮于lml PBS 中。应用CellQuest软件(Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ ) 在FACS上分析该悬液。 一个不能结合mAb 2C7的阴性克隆作为对照。
观察到大肠杆菌细胞与fflAb 2C7的结合从大肠杆菌克隆PEP3、 PEP4、 PEP6、 PEP5、 PEP2、 PEP7到PEP1依次增强(根据焚光强度中 值，"MFI" ) [SEQ ID N0S:3， 4， 6, 5, 2， 7， 1]。大肠杆菌克隆 PEP1显示与mAb 2C7的最大结合(MFI-19. 81，与对照MFI-4. 91相比), 如图3所示[SEQ ID NO:l]。
D. 抑制ELISA
阳性大肠杆菌克隆在含有100 n g/ml氨节青霉素的IMC培养基中 25'C生长过夜，然后诱导表达融合肽6小时。将培养物标准化为相同 的OD读数(OD6。。nm=0. 7 ),加入1%脱脂奶粉、150mM NaCl和1% ct-曱基甘露糖苷，以阻断非特异性结合。50jal等份的每种培养液与50 li 1 mAb 2C7 (终浓度20ng/ml)在37X:下温育30分钟，然后将100 ju 1混合液加样到用从15253林制备的纯化LOS ( 80 u g/ml )包被的微量板的孔中。孔在37tl下温育1小时，然后洗涤。洗涤孔后，用与碱 性磷酸酶偶联的抗小鼠IgG检测结合的mAb 2C7。一种不能结合mAb 2C7 的阴性克隆作为对照。
PEP1克隆显示mAb 2C7与L0S结合的最大抑制(66%) [SEQ ID NO:l]。 PEP7、 PEP3、 PEP4、 PEP2、 PEP6和PEP5显示结合抑制分别降 低，如图4所示[SEQ IDN0S: 7， 3, 4, 2, 6， 5]。抑制ELISA结果与 流式细胞分析结果相关，因为PEP1也显示与mAb 2C7的最大结合。大 肠杆菌细胞与mAb 2C7的结合与大肠杆菌克隆抑制mAb 2C7结合L0S 的降低大致相关。
II.可与mAb 2C7结合的合成拟肽
合成(Boston Biomolecules， MA )了序列对应于共有序列"DE—GLF，， 并包含两个半胱氨酸侧翼区(分别位于N-端和C-端的CGP-和-GPC残 基)的一种合成肽(PEP1; IPVLDENGLFAP),用来通过抑制ELISA评 估与2C7mAb的特异性结合，并确定表征为疏氧还蛋白-融合蛋白的拟 肽是否保留不依赖于融合内容的抗原性[SEQ ID NO:IO]。
加入半胱氨酸侧翼区，估计拟肽的环化是否影响抗体结合。在这 些拟肽中，半胱氨酸残基允许在它们之间形成二硫键，产生环形拟肽。 这些构象限定的肽可能更加类似于它们所模拟的表位，因此可能更具 免疫原性。
将这些肽在封闭緩冲液(1%卵白蛋白，0.05%吐温20, 0.5MNaCl 在PBS中)中稀释，产生不同浓度(O.l、 0.5、 lmg/ml)的混合液。 每一浓度的50jul等份与50jalmAb2C7 (贮存浓度为2pg/ml，在封 闭緩冲液中稀释)在37TC下温育1小时，然后将100 jil混合液加样 到用从l5253抹中制备的纯化L0S ( 80 ju g/ml )包被的微量板的孔中。 孔在37C下温育1小时，然后洗涤。洗涤孔后，用与碱性磷酸酶偶联 的抗小鼠IgG检测结合的mAb 2C7。从淋球菌15253株中制备的纯化 L0S作为阳性对照。上述随机肽库系统产生的非反应性15-mer肽序列 作为阴性对照肽[SEQ ID N0:9]。PEP1以剂量反应方式抑制mAb 2C7与LOS的结^<对于浓度为0. 1、 0. 5、 1. Omg/ml的PEP1,百分抑制分别等于17%、 77%、 91%)，如图5 所示。对照15-mer肽合成为环肽(*CKSNPIHIIKNRRNIPC* ) [SEQ ID N0:9]。这种阴性对照肽不能抑制2C7mAb与纯化LOS包被的平板的结 合。
利用本领域周知的方法，如上所述的环状拟肽可进一步含有一条 或多条"尾"，用于偶联第二种试剂，如佐剂或栽体蛋白。
III.提高拟肽的免疫原性
尽管小肽可能有免疫原性，但几次研究报道，某些小肽可能缺乏 免疫原性而引起无效的免疫应答(特别是体液应答)(3, 43)。已经 应用许多策略来提高小肽的免疫原性。包括将肽与载体蛋白连接(54， 28， 54)，将肽与佐剂组合(21， 22)，使用多抗原肽(MAP )提供可 能具有更强免疫原性的较大构型的结构(39)，将肽与补体蛋白偶联 增强体液免疫应答(15)。 A.多抗原肽合成
多抗原肽(MAP )法是一种将拟肽与树枝状矩阵的赖氨酸残基结合 的技术(44， 8， 43)。肽与赖氨酸构架(scaffold)的氨基连接，产 生一个大分子，它在复合物表面提供高密度的希望的肽表位。这种方 法能增强对肽的免疫应答(39， 40)。
合成了 PEP1的多抗原肽和对照肽(Boston Biomolecules， MA)， 并通过直接和抑制ELISA测定了与mAb 2C7的结合。
进行固相ELISA评估mAb 2C7与多抗原肽的结合。对于直接ELISA， 用多抗原肽(ljig/孔)包被Immulon 1平板过夜，并与不同浓度的 mAb2C7反应。对于抑制ELISA，平板用从淋病奈瑟球菌15253林制备 的纯化L0S ( 80 ju g/ml ) 37t:包被3小时。肽(线性或MAP )用封闭緩 冲液(l。/。卵白蛋白，0. 05%吐温20， 0. 5MNaCl在PBS中)稀释，产生 不同浓度的混合物。每一浓度的50jul等份与50m1 mAb 2C7 (li存 浓度为0, 4jLig/ml，在封闭緩冲液中稀释)在37C下温育1小时，然后将100m 1混合液加样到微量板的孔中，孔在37tl下温育1小时， 然后洗涤。孔洗涤后，用与碱性磷酸酶偶联的抗小鼠IgG检测结合的 mAb 2C7。从淋球菌15253林中制备的纯化LOS在抑制ELISA中作为阳 性对照。
含有4种线性PEP1分子("四MAPI")或8种线性PEP1分子("八 MAPI")的PEP1的多抗原肽形式显示与mAb 2C7强烈结合，而对照 MAP在直接ELISA中不显示结合，如图6所示。四MAPI和八MAPI两 者都比线性PEP1更强地抑制mAb 2C7与LOS的结合，如图7所示。四 MAPI和八MAP1两者的半数最大抑制(IC5。)分别在1.26iuM和0.23 jnM处观察到。线性PEP1的I"为55uM。这可能是由于MAPI与mAb 2C7结合的亲和力提高。对照MAP不显示明显的抑制。
在小鼠+用八MAPl免疫诱导IgG抗-L0S抗体应答，如图8所示。 反应图见图8 (A)，其中没有明显的IgG抗-LOS抗体应答，直到第3 周时加强，表明八MAP1在应答小鼠中引发T细胞依赖的免疫应答。这 些结果证明了用拟肽(如八MAP1)免疫人类对抗淋病奈瑟球菌感染的 预言。
在图8(A)中，8只小鼠在第O天接受在弗氏佐剂中乳化的剂量 为50ug的八MAP1，并在第21天再次接受。模拟2C7寡糖表位的八 MAP1在8只小鼠的3只中诱导IgG抗-L0S抗体。这3只小鼠中的IgG 抗-L0S应答在第3周的第一次加强后显著升高，在第7周达到高f测 量的下一时间)，之后降低。图8 (B)显示阳性对照实验，其中4只 小鼠用纯化的LOS免疫。在这些小鼠中，IgG抗-LOS效价在第一次免 疫后最低程度地增加，在加强后升高。用弗氏佐剂(C)或无关的八 MAP对照肽(D)免疫的4只小鼠(均为阴性对照)引起较弱的或没有 IgG抗-LOS应答。图9显示了所有免疫小鼠(来自图8所示的实验) 的平均IgG抗-L0S抗体应答(平均值土SE，包括不表现应答的动物)。
图10只显示了应答小鼠(来自图8所示的实验)的IgG抗-L0S 抗体应答。抗体应答被定义为高于0. 4 p g/ml的IgG抗-L0S (平均值 ±SE)(高于基线IgG抗-L0S水平4倍)。在初次免疫后的第7周和第10周，八MAP1免疫的应答小鼠产生高于(p<0. 001)阴性对照抗原 (单独的弗氏佐剂或无关八MAP对照肽)诱发的抗体水平的IgG抗-LOS 抗体水平。
图11只显示了应答小鼠(来自图8所示的实验)的IgM抗-LOS 抗体应答。用八MAP1免疫、已经产生IgG抗-LOS应答的小鼠不能对 比阴性对照抗原免疫的小鼠更高的IgM抗-LOS水平应答。用LOS (阳 性对照)免疫产生比八MAP 1或阴性对照抗原(单独的弗氏佐剂或无关 八MAP对照肽)免疫的动物更高的IgM抗-LOS抗体水平。 来自八MAP1免疫的小鼠的血清对淋病奈瑟球菌15253林显示2C7特异 性补体介导的杀细菌活性，如图12所示。图12显示了一张图，显示 暴露于小鼠免疫血清(67%体积百分比的小鼠免疫血清终浓度)加上加
淋病奈瑟球菌15253林及其lgtG突变体(2C7表位阴性)的存活率。 15253抹显示2C7表位。15253 lgtG林含有破坏的脂寡糖(LOS ) 葡糖基转移酶G等位基因，该酶可将葡萄糖(通过ct键)转移到LOS 核心中的庚糖-2上(4) 。 lgtG基因座的破坏导致2C7表位表达的丧 失。
进行标准细菌测定来评估小鼠血清中补体介导的杀细菌活性 (11)。在该测定中，在人补体(17%终体积)存在下，小鼠血清(67% 终体积)(来自如下所述免疫的或未免疫的不同小鼠)与悬浮于Morse A培养基(33)中的大约2. 5xl(T个细菌温育。然后在37。C下连续振 摇反应混合物30分钟。在0时间和30分钟时将反应混合物的等份接 种到巧克力琼脂平板上。存活率表示为30分钟时比0分钟时平板上菌 落的百分增加。测定中高于100%的存活率表明30分钟温育期间的生 长。
用mAb 2C7作为对照，因为它与加入的补体一起能杀死淋病奈瑟 球菌15253林，但不能杀死15253 lgtG突变林。如图12(A)所示， mAb 2C7对携带2C7表位的淋球菌具有杀细菌活性。25 ji g/ml mAb 2C7 (总体积150 iu 1反应混合物中的100 jLi 1 )介导15253林的100%杀伤，采自八MAP1免疫的单只小鼠的血清(含有5. 05 jug/ml IgG抗-L0S 抗体，由第7-11周采的血合并)对15253林显示92%的杀伤率(8%存 活)，而15253 lgtG林全部存活，如图12 (C)所示。
代表20只小鼠血清的集合的正常小鼠血清(IgG抗-L0S抗体的平 均浓度为0. ljLig/ml)不能杀死任一种菌林，如图12(B)所示。不含 补体的对照小鼠血清对15253林显示116. 1%±4. 7%的存活率(不杀伤), 对15253 lgtG突变体显示123. 1°/。±3. 5%的存活率(不杀伤)。不含抗 体的补体来源对15253林显示137. 9%±1. 0%的存活率(不杀伤)，对 15253 lgtG突变体显示132. 5%±14. 3%的存活率(不杀伤)。
采自L0S免疫的单只小鼠的血清(含有21. 98 u g/ml IgG抗-L0S 抗体，由第7-11周采的血合并)不杀死15253林(179%存活)和15253 lgtG林(133%存活)，如图l2 (D)所示。从用单独的弗氏佐剂或无 关八MAP对照肽作为阴性对照抗原免疫的单只小鼠中采集的血清不杀 死任一菌林，分别如图12 (E)和图12 (F)所示。
从八MAP1免疫的小鼠中获得的IgG抗-L0S抗血清对淋病奈瑟球 菌15253林显示浓度依赖的杀伤，如图13所示。
图13显示IgG抗-L0S抗体浓度对淋病奈瑟球菌15253林杀伤率 的图。当来自八MAP1免疫的3只小鼠中每一只的IgG抗-L0S抗血清 水平对细菌杀伤率作图时，得到剂量-反应图(含有1. 38、 2. 50和5. 05 jig/ml抗-L0S抗体的小鼠血清对15253林分别显示31°/。、 74%和92% 的杀伤率)。也在5个分别的L0S抗体浓度处显示mAb2C7的杀伤率， 作为阳性对照。
B.偶联A拟肽与补体蛋白C3d
预计通过与补体因子C3d偶联，能进一步提高淋球菌表位的拟肽 (如此处所述的八MAP1)的免疫原性。
大量研究证明了补体蛋白C3在诱导体液免疫应答中的重要作用 (1， 5， 14， 17， 25， 32， 34和35 ) 。 C3缺乏的小鼠对T细胞依赖 的蛋白质抗原如匙孔戚血蓝蛋白("KLH")显示降低的抗体应答(34，35 )。补体受体1- ( CR1或CD35 )和补体受体2- ( CR2或CD21)缺乏 的小鼠具有降低的T细胞依赖的抗体应答(l， 14， 3"。进一步表明， 与鸡蛋溶菌酶("HEL")共价连接的C3d引起增强的对HEL抗原的抗 体应答(15 )。由3个拷贝C3d和1个拷贝HEL组成的融合蛋白免疫 的小鼠使得抗-HEL抗体应答比单独用HEL免疫的小鼠的抗体应答提高 10000倍。该融合蛋白诱导的抗-HEL抗体应答比在弗氏佐剂中乳化的 HEL诱导的抗体应答约高100倍。
八MAPI能与C3d偶联，方法是将八MAPI DNA序列克隆到C3d融 合蛋白盒中，并用该构件转化表达系统。八MAP1-C3d融合蛋白于是能 得到表达、纯化并用作免疫原。此外，按照本领域周知的方法，八 MAPI-C3d基因融合也能以DNA的形式用作DNA疫苗。
产生抗独特型抗体(其显示与本发明的拟肽类似的免疫反应性)的 杂交瘤的实例有1993年3月26日在ATCC ( 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 U.S.A.)保藏、分配ATCC 保藏号HB 11311的细胞培养物。
分泌mAb 2C7(其显示与本发明的拟肽类似的免疫反应性)的杂交 瘤2C7的实例有1995年3月9日在ATCC保藏的命名为2C7的细胞培 养物。该培养物分配ATCC保藏号HB-11859。
尽管我们在上文中已经描述了本发明的许多实施方案，但显然我 们的基本结构能够改变，以提供应用本发明的方法和组合物的其它实 施方案。因此，应当理解，本发明的范围将由附加的权利要求书所限 定，而不是由上文中以实施例的方式描述的具体实施方案所限定。
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26序列表
<110> Rice, Peter
<120>保守淋球菌表位的拟肽及应用它们的方法和组合物
<130> BOS-3
<140> 待分配
<141> 2000-10-27
<150> 60/162491
<151> 1999-10-29
<160> 10
<170> Patentln version 3.0
<210> 1
<211> 12
<212〉 PRT
<213〉 人工/未知
<220>
<221> 肽
<222> (1)…(12)
<223> 合成构建体
<400> 1
lie Pro Val Leu Asp Glu Asn Gly Leu Phe Ala Pro 15 10
<210〉 2
<211> 12
-<212> PRT
<213〉 人工/未知
<220〉 <221> 肽 <222> (1)..(12)
<223〉合成构建体
<400> 2
Trp Gly Leu Asp Tyr Glu Arg Gly Asn Tyr Glu Glu 15 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT <213>人工/未知<220>
<221> 肽
<222> (1).-(12) <223>合成构建体
<400> 3
Asp Ala Leu Ala Val Asp Gin Met Gly Arg Phe Gly 15 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213〉 人工/未知
<220>
<221> 肽
<222> (1) (12)
<223> 合成构建体
<400> 4
Val Leu Val Gly Glu Lys Gly Leu Phe Glu Gly Gly 15 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工/未知
<220>
<221> 肽
<222〉 (1) .. (12)
<223> 合成构建体
<權> 5
Glu Ala Leu Val Leu Asp Thr Asn Gly Leu Met Ser 15 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT <213>人工/未知
<220> <221> 肽 <222> (1)..(12)
<223> 合成构建体<400> 6
Ala Asp Arg Thr GJUi Gly Leu Gly Trp Gly Ala Ser 1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工/未知
<220>
<221> 肽
<222> (1) (12) <223>合成构建体
<400> 7
Glu Glu Val Gly Ser lie Leu Tyr Gly Leu Gly Gly 1 5 10
<210〉 8
<211> 6
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<213> 人工/未知
<220〉
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<222> (3) - - (3)
<223> X-任一氨基酸
<220>
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<220>
<221> 狀
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<220>
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<400> 10
Cys Gly Pro lie Pro Val Leu Glu1 5
Asn Gly Leu Phe Gly Pro Cys10 15
lie Lys Asn Arg Arg Asn lie10 15
A
s
y
o
y p
c 权利要求
1.在人血型抗原上没有发现的保守淋球菌表位的一种拟肽，其中该拟肽能在哺乳动物中诱导对该保守淋球菌表位的免疫应答。
2. 根据权利要求1的拟肽，其中该拟肽的氨基酸序列包含序列DE-GLF。
3. 根据权利要求l的拟肽，其中免疫应答是T细胞依赖的。
4. 根据权利要求1或2的拟肽，其中该拟肽的氨基酸序列在每一端都含有半胱氨酸残基。
5. 根据权利要求4的拟肽，其中通过该序列每一端的半胱氨酸残基之间的二硫键形成环肽。
6. 根据权利要求5的拟肽，其中该拟肽还含有至少一条用于与第二种试剂偶联的尾。
7. 根据权利要求6的拟肽，其中第二种试剂是一种佐剂。
8. 根据权利要求1或2的拟肽，其中该拟肽还含有一种佐剂或载体蛋白。
9. 根据权利要求1或2的拟肽，其中该拟肽是一种多抗原肽的一部分。
10. 根据权利要求1或2的拟肽，其中该拟肽与淋球菌L0S竟争结合单克隆抗体2C7。
11. 一种拟肽，它可免疫特异性结合一种可与淋病奈瑟球菌的寡糖表位结合的抗体，该寡糖表位在人血型抗原中不存在。
12. 根据权利要求11的拟肽，其中该拟肽能与单克隆抗体2C7结合。
13. 根据权利要求ll的拟肽，其中该拟肽能结合通过用一种抗独特型单克隆抗体免疫动物产生的单克隆抗体，或其片段，它由具有ATCC保藏的HB 11311的特征的杂交瘤细胞系产生。
14. 根据权利要求ll的拟肽，其中该拟肽是一种多抗原肽的一部分。
15. —种用于对抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的组合物，其含有免疫预防有效量的根据权利要求1-3、 5-7、 9或11-14任一项的拟肽，
16. —种用于对抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的组合物，其含有免疫预防有效量的拟肽，该拟肽具有SEQ ID N0:1的肽序列。
17. —种用于对抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的组合物，其含有免疫预防有效量的拟肽，该拟肽具有SEQ ID N0:2的肽序列。
18. —种用于对抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的组合物，其含有免疫预防有效量的拟肽，该拟肽具有SEQ ID N0:3的肽序列。
19. 一种用于对抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的组合物，其含有免疫预防有效量的拟肽，该拟肽具有SEQ ID N0:4的肽序列。
20. —种用于对抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的组合物，其含有免疫预防有效量的拟肽，该拟肽具有SEQ ID N0:5的肽序列。
21. —种用于对抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的组合物，其含有免疫预防有效量的拟肽，该拟肽具有SEQ ID N0:6的肽序列。
22. —种用于对抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的组合物，其含有免疫预防有效量的拟肽，该拟肽具有SEQ ID NO: 7的肽序列。
23. —种用于对抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的组合物，其含有免疫预防有效量的拟肽，该拟肽具有SEQ ID N0:10的肽序列。
24. —种用于免疫哺乳动物对抗淋病奈瑟球菌感染的方法，其包括对该哺乳动物施用免疫预防有效量的根据权利要求1-3任一项的拟肽和药学可接受的载体的步骤。
25. —种用于免疫哺乳动物对抗淋病奈瑟球菌感染的方法，其包括对该哺乳动物施用免疫预防有效量的根据权利要求11-14任一项的拟肽和药学可接受的载体的步骤。
26. 根据权利要求1或11的拟肽，其中该拟肽与一种补体蛋白偶联。
27. 根据权利要求26的拟肽，其中该拟肽与补体蛋白C3d偶联。
28. —种用于免疫哺乳动物对抗淋病奈瑟球菌感染的方法，其包括对该哺乳动物施用免疫预防有效量的根据权利要求27的拟肽和药学可接受的栽体的步骤。
29. —种用于对抗淋病奈瑟球菌感染而免疫的组合物，其含有免疫预防有效量的根据权利要求27的拟肽。
30. —种提高根据权利要求1或11的拟肽的抗原性的方法，包括将该拟肽与一种补体蛋白偶联的步骤。
31. 根据权利要求30的方法，其中该补体蛋白是C3d。
全文摘要
本发明涉及淋病奈瑟球菌的保守淋球菌表位的拟肽，该表位在人血型抗原上没有发现。本发明也涉及应用这些拟肽预防淋病传染的方法和组合物。
文档编号A61K39/00GK101638433SQ20091013689
公开日2010年2月3日 申请日期2000年10月27日 优先权日1999年10月29日
发明者尤达马斯·恩加姆佩苏达多, 彼得·A·赖斯, 萨尼塔·古拉蒂 申请人:彼得·A·赖斯;尤达马斯·恩加姆佩苏达多;萨尼塔·古拉蒂