专利名称：：二咖啡酰奎宁酸的新用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及二咖啡酰奎宁酸的新用途，具体地，是在制备脑神经保护剂的药物中的用途，属医药领域。
背景技术：
：中风病又名卒中，是以突然昏仆、半身不遂、口舌歪斜、言语蹇涩或不语、偏身麻木为主症，并具有起病急、变化快的特点，好发于中老年的一种疾病，是中老年人的常见多发病，严重威胁着人类的生存和健康。本病相当于西医学的缺血性脑血管病(IschemicCerebralvascularDisease,ICVD)，亦称缺血性卒中，具有较高的病死率及致残率，严重威胁着人类的健康和生命安全(饶明俐，林世和.脑血管疾病.人民卫生出版社，2002.172)。作为一种常见病、多发病，ICVD尤其是局限性脑梗死已经与心脏病、恶性肿瘤并列多数国家的三大致死疾病。流行病学调査发现，我国属于该病高发地区之一(陈捷.缺血性脑卒中的流行病'学.实用心脑肺血管病杂志.2000，8(3):179181)。祖国医学认为，中风病其病位在脑，与心、肾、肝、脾密切相关，为本虚标实之证，病因病机复杂，本虚在于肝肾不足，气虚血少；标实乃肝风内动，风火相煽，火热内郁，痰湿壅盛，最终导致痰瘀内阻，随气机上逆，扰乱清空，蒙蔽清窍，成上实下虚，阴阳不相维系之危急证候。其突然昏仆不省人事之症状，又可纳入窍闭神昏之范畴。据统计，在中风的证候分类中，血瘀证为主导地位，占中风病的73%以上(陶根鱼，杜晓泉.益气活血法在缺血性中风病中的地位[J].陕西中医学院学报，1998，21(3):1)。缺血性中风的病机虽然复杂，但归结起来，主要矛盾在于瘀血阻滞。近IO年来，中、西医界对活血化瘀法治疗缺血性中风进行了深入的临床及实验研究，活血化瘀法治疗缺血性中风病的疗效已基本得到肯定，其临床报道也较多。李祖蔑，二咖啡酰奎宁酸(dicaffeoylquinicacids，DCQ)药理实验研究进展，医学综述2004年第10巻第4期，报道了，报道了二咖啡酰奎宁酸是一类由奎宁酸(quincacid)与数目不等的咖啡酸(caffeicacid)通过酯化反应综合而成的酚酸类天然成分，广泛存在于植物界如金银花、旋覆花、苍耳等中药及茶叶、山楂等果树中。目前报道DCQ的抗氧化、抗炎、抗病毒、抗纤维化、抑制平滑肌收縮、降血脂等诸多作用。如,利申请号99105113.0，发明名称1,5-二-O-咖啡酰奎宁酸衍生物的制备方法，公开了1，5-二-O-咖啡酰奎宁酸衍生物的制备方法；申请号03141616.0，发明名称灯盏花素和二咖啡酰奎宁酸药物组合及其应用，公开了灯盏细辛中提取的有效部位灯盏花素和二咖啡酰奎宁酸组合及其在治疗急、慢性肝病中的新用途；申请号03117754.9，发明名称灯盏细辛酚及其制备方法和在制药中的应用，公开了灯盏细辛酚有效部位包括灯盏乙素及二咖啡酰奎宁酸的制备方法及在治疗心脑血管疾病、老年痴呆疾病、防治高脂疾病的药用中的应用。申请号96101141.6,发明名称二咖啡酰氧基奎宁酸在制药中的应用，公开了3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸的制备及药物组合在心脑血管疾病中的应用。申请号03117753，发明名称飞蓬酯乙及其制备方法和在制药中的应用，公开了新咖啡酸酯类化合物飞蓬酯乙，提取分离方法及作为治疗心脑血管疾病药物。目前尚无报道二咖啡酰奎宁酸用于脑神经保护剂的用途，也没有将1,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸等二咖啡酰奎宁酸为原料单独或联合用药的相关报道。
发明内容本发明的技术方案是提供了二咖啡酰奎宁酸的新用途，具体地，是在制备脑神经保护剂的药物中的用途。本发明还提供一种脑神经保护剂药物组合物。本发明提供了二咖啡酰奎宁酸在制备脑神经保护剂的药物中的用途。其中，所述的药物是治疗缺血性中风的药物。其中，所述的二咖啡酰奎宁酸为1，5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸，结构如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>1，5-二咖啡酰奎宁酸4，5-二咖啡酰奎宁酸3，4-二咖啡酰奎宁酸OH3，5-二咖啡酰奎宁酸。本发明提供了一种脑神经保护剂的药物组合物，它是由1，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸中的一种其一种以上混合为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅料性成分制备而成的药剂。进一步优选地，它是由1，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸为活性成分配伍制备而成的药剂，其重量配比为1，5-二咖啡酰奎宁酸1-10份、4，5-二咖啡酰奎宁酸1-10份、3，4-二細啡酰奎宁酸1-10份、3，5-二咖啡酰奎宁酸1-10份。其中，所述的1，5-二咖啡酰奎宁酸和3，4-二咖啡酰奎宁酸来源于灯盏细辛Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.—Mazz.药材，具体提取分离方法为用95呢乙醇60L，70义乙醇20L乙醇渗漉，真空减压回收乙醇。乙酸乙酯层浸膏，常压硅胶柱层析和反相C18柱层析反复纯化可得到1，5-二咖啡酰奎宁酸和3,4-二咖啡酰奎宁酸。本发明四个化合物均为公知的化合物，可按下述文献进行提取(I.Merfort.CaffeoylquinicacidsfromflowersofarnicaMontanaandarnicachamissonis[J].Phytochemistry,1992,31(6):2111.H.Morshita.Chromatographicseparationandidentificationofnaturallyoccurringchlorogenicacidsby'Hnuclearmagneticresonacespec-troscopyandmassspectrometry[J].Chromatography,1984,315:253.BarbaranTi咖ermann，JosephHoffmann.Constituentsofchrysothamnuspaniculatus3:3，4，5—tricai"feoylquinicacidand3，4，-3，5-and4,5-dicaffeoylquinicacids[J].J.Nat.Prod,1983，46(3):578.滕荣伟，等.白花刺参中的咖啡酰基奎宁酸成分.波谱学杂志，2002，19(2):167~174)'其中，所述的制剂为注射剂、滴丸或气雾剂。本发明还提供了药物组合物在制治疗备缺血性中风的药物中的用途。本发明提供的一种治疗缺血性中风的药物组合物，可以通过如下技术方案来实现1、从灯盏细辛中提取各化合物，然后加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。2、也可以采用市售或植物来源的二咖啡酰奎宁酸为原料，然后加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。本发明上述药物组合可以购自市售的商品原料，也可以按照已有文献报道方法提取或制备。本发明还提供了该药物组合物在制备治疗缺血性中风后遗症、脑血管疾病的脑神经损伤的药物中的应用。实验研究表明，二咖啡酰奎宁酸类成分是一类具有较好脑神经保护的有效成分，具有促进体外大脑皮层神经细胞存活和抗氧化作用，且具有一定透过血脑屏障能力；用于治疗缺血性中风药效明确，为临床提供了一种新的选择。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实伊J。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。具体实施例方式实施例l本发明化合物的制备灯盏细辛Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.药材(去杂草)，分别用9596乙醇60L，70y。乙醇20L乙醇渗漉，真空减压回收乙醇。乙酸乙酯层浸膏，常压硅胶柱层析和反相C18柱层析反复纯化可得到1,5-二咖啡酰奎宁酸和3，4-二咖啡酰奎宁酸。本发明四种化合物也可以来源于市售品种，如1,5-二咖啡酰奎宁酸(中山康之源生物科技有限公司)、4，5-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸(石家庄岩峰医药科技有限公司)、3,4-二咖啡酰奎宁酸自制，纯度大于95%。实施例2本发明药物注射液的制备.取1，5-二咖啡酰奎宁酸5g、4，5-二咖啡酰奎宁酸5g、3,4-二咖啡酰奎宁酸5g、3,5-二咖啡酰奎宁酸5g，氯化钠85g，亚硫酸钠2g，加注射用水溶解，制成10000ml，分装成3mg/2ml/支的注射液，中间体检测，灌封，灭菌，贴签。实施例3本发明药物注射液的制备取1，5-二咖啡酰奎宁酸5g、4，5-二咖啡酰奎宁酸50g、3，4-二咖啡酰奎宁酸50g、3，5-二咖啡酰奎宁酸50g，氯化钠85g，亚硫酸钠2g，加注射用水溶解，制成10000ml，分装成3mg/2ml/支的注射液，中间体检测，灌封，灭菌，贴签。实施例4本发明药物注射液的制备取1，5-二咖啡酰奎宁酸50g、4，5-二咖啡酰奎宁酸5g、3，4-二咖啡酰奎宁酸5g、3，5-二咖啡酰奎宁酸5g，氯化钠85g，亚硫酸钠2g,加注射用水溶解，制成10000ml，分装成3mg/2ml/支的注射液，中间体检测，灌封，灭菌，贴签。以下通过药效学试验进一步证明本发明的有益效果。试验例1本发明化合物对体外培养大脑皮层神经细胞存活的影响本发明公开1,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸的药效研究结果。铺板取96孔板，每孔加入0.1mgmL-1多聚赖氨酸50A，振荡均匀，室温静置过夜，备用。，制备细胞悬液将乳鼠断颈处死，75%酒精浸泡消毒，无菌条件分离大脑皮层组织，尽量除去脑血管膜，置入冰Hanks液中漂洗3次。将所获组织剪成lmm3组织块，用0.25%的胰蛋白酶+0.05%1I型胶原酶37"C下消化，30min后加入培养液终止消化，用75Mm细胞筛网滤过。将滤液1000rmin-l离心8min，弃上清液。加入完全培养液(900mL'l^DMEM高糖培养基，100mLL—1胎牛血清，L-谷氨酰胺0.45gL-1，NaHC033gL-l，HEPES4.5g*L-1，青霉素1X105UL—\链霉素1X105U*L—0，吸管吹打使之分散均匀制成单细胞悬液。计数并调整培养液量使每mL含1X106个细胞。接种培养和药物加入方法将细胞悬液接种于经包被的96孔板中，每孔IOOPL培养24h后换液，72h后加入阿糖胞苷以抑制非神经细胞生长，以后每2d半量换液，第7d换液后根据实验要求，分别加入各种质量浓度梯度的各受试药物(设5个剂量组，按一定比例稀释)，每孔总体积200PL，同时加入培养液作为空白对照组继续培养。MTT微量自动比色法加入药物作用ld后，每孔加入MTT液(四甲基偶氮唑盐，5mg'mL—1)，继续培养4h后，去上清液，PBS液漂洗2次，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150PL，充分振荡，室温静置10min，用酶标仪于492nin波长处测定吸收值。结果表明，以上化合物均有较好的促进体外大脑皮层神经细胞存活的作用。结果见表13。表13，5-DCQ和1，5-DCQ对体外培养大脑皮层神经细胞存活的影响(X，『6)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>灯盏细辛有效成分对体外培养大脑皮层神经细胞存活的影响(X，<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表33，4-DCQ对体外培养大脑皮层神经细胞存活的影响(X，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>1,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸透血脑屏障研究结果，结果表明，1，5-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸可不同程度的透过体外血脑屏障模型。综合以上脑神经保护的研究结果，1，5-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁可透过血脑屏障发挥脑神经保护作用。试验例2体外血脑屏障模型建立及透血脑屏障由于血脑屏障的存在，几乎所有大分子药物和98%的小分子药物都不能进入大脑及中枢神经系统，而药物能否跨越血脑屏障并达到有效的治疗浓度是至关重要的。为寻找和进一步分析灯盏细辛脑靶向神经保护的药效物质基础，本实验采用原代脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞共培养模型体外模拟血脑屏障。用高效液相色谱分析，在8h内不同时间点测定本发明化合物的透过率。1、材料与仪器日本岛津LC-10A高效液相色谱仪，SPD-10AV紫外检测器；SCL-10A系统控制器；CBL恒温箱，N2000色谱数据工作站。氮吹仪(KL-512，北京康林科技有限责任公司)高速离心机(centrifuge5417c，印pendorf公司)超声波清洗仪(AS10200，天津奥特赛恩斯仪器有限公司)甲醇、乙腈(Fisher公司，色谱纯)，实施例1的方法所述的化合物1，5-二咖啡酰奎宁酸(中山康之源生物科技有限公司)、4，5-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸(石家庄岩峰医药科技有限公'司)、3，4-二咖啡酰奎宁酸自制，纯度大于95%。2、方法与结果2.1样品制备选择试漏实验阳性的孔进行通透性实验，向供池中加入1，5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎f酸(0.2mg*mL—》受池中加600叱AC培养液。在第0、1、2、4、8小时分别从受池中小心收集滤液各IOOuL、50nL、50nL、50uL、50yL于-20°C保存，待所有取样结束后做样品处理。其中O小时为空白对照，向供池内加入的药液为供池的起始浓度(参见图5-1)。将各样品氮气吹干(37°C)，分别向其中加入甲醇，超声处理20min，离心(5000r*min-lX10min)，取上清液，作HPLC分析供试品溶液。2.2HPLC分析色谱条件岛津LC-IOA高效液相色谱仪；色谱柱:.为十八烷基硅烷键合硅胶柱，依利特SinoCh画ODS-BP5陶(250X4.6mm)柱号E1817666,流速1mLmin—N柱温室温；3，5-二咖啡酰奎宁酸流动相为乙腈力.6%甲酸(20:80)。检测波长为330分别精密吸取20A供试品溶液注入高效液相色谱仪，进行检测。2.3透过率计算根据HPLC测定结果，取以下公式计算透过率。A供池xV供池其中A受池为受池样品的峰面积，A供池为供池峰面积，V受池为受池体积,V供池为供池体积。计算结果见表4。表4透体外BBBM成分透过率Tab.4ThepermeabilityofcompoundsontheinvitroBBBmodel<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>上述试验表明，4，5-DCQ、1，5-DCQ、3，5-DCQ、3，4-DCQ均能透过BBBM。其中3，5-DCQ透过BBBM的效果最佳。上述试验证明，本发明四个化合物均是新的透血脑屏障的脑神经保护有效成分。权利要求1、二咖啡酰奎宁酸在制备脑神经保护剂的药物中的用途。2、根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的药物是治疗缺血性中风的药物。3、根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的二咖啡酰奎宁酸为1，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸或3，5-二咖啡酰奎宁酸，结构如下4，5-二咖啡酰奎宁酸3，4-二咖啡酰奎宁酸OH3,5-二咖啡酰奎宁酸。4、一种脑神经保护剂的药物组合物，其特征在于它是由1，5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸中的一种或两种以上的混合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅料性成分制备而成的药剂。5、根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于它是由1,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸为活性成分配伍制备而成的药剂，其重量配比为1，5-二咖啡酰奎宁酸1-10份、4，5-二咖啡酰奎宁酸1-10份、3，4-二咖啡酰奎宁酸1-l.O份、3,5-二咖啡酰奎宁酸卜10份。6、根据权利要求4-5任意一项所述的药物组合物，其特征在于所述的制剂为注射剂、滴丸或气雾剂。7、权利要求4-5任意一项所述的药物组合物在制备治疗缺血性中风的药物中的用途。全文摘要本发明提供了二咖啡酰奎宁酸在制备脑神经保护剂的药物中的用途，该药物可用于治疗缺血性中风。本发明还提供了一种脑神经保护剂的药物组合物。药效试验研究表明，二咖啡酰奎宁酸类成分是新的一类具有较好脑神经保护的有效成分，具有促进体外大脑皮层神经细胞存活和抗氧化作用，且具有一定透过血脑屏障能力。文档编号A61K31/21GK101642450SQ200910164179公开日2010年2月10日申请日期2009年8月4日优先权日2008年8月6日发明者孟宪丽,艺张,静张申请人:成都中医药大学