沙苑子总黄酮提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用的制作方法

专利名称：：沙苑子总黄酮提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种传统中药的有效部位在制备防治肺纤维化药物中的应用，具体为沙苑子总黄酮提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用。
背景技术：
：月市(间质)纤维化(Pulmonaryfibrosis,PF)又称肺间质疾病(interstitiall皿gdisease,ILD)，是一种原因不明以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱，导致肺泡、肺间质纤维化，最终可引起呼吸衰竭的疾病。肺纤维化的病理特点主要是长期肺部炎症导致肺泡持续性损伤，肺内间质细胞增生及细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的大量沉积和广泛的肺实质重建。各种因素损伤肺泡上皮细胞和血管内皮细胞后，均可引起肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润，炎症细胞及其释放的细胞因子介导了早期的肺损伤，损伤的存在和反复将改变肺组织的微环境，特别是肺泡室，将导致修复程序的失调，最终形成肺纤维化。近年来，自由基损伤、脂质过氧化成为导致肺纤维化的热点之一。正常情况下，肺的抗氧化能力与机体不断产生自由基的氧化能力之间处于动态平衡。研究证实，超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，SOD活性高低直接反映了机体清除自由基的能力。机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，氧自由基能攻击生物体中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并形成脂质过氧化物，如醛基(丙二醛malondialdehyde，MDA)、酮基、羟基(.0H)、新的自由基等。因此，体内MDA的含量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度。机体氧化应激存在时，通过一氧化氮合酶(T-N0S)形成一氧化氮(NO)，可与超氧阴离子结合，形成过氧亚硝酸盐阴离子(0N00-)，从而产生肺毒性。胶原纤维是细胞外基质的重要组成部分，其生化成份是胶原蛋白(collagen,简称胶原)，羟脯氨酸(hydro邓roline,HYP)是机体胶原蛋白的主要成分之一，约占其氨基酸总量的13.4%，组织中HYP含量可作为胶原组织代谢、衡量胶原含量及反映间质胶原纤维沉积的重要指标。成纤维细胞增生聚集是肺间质纤维化的一个重要特征，成纤维细胞参与人体各种组织和器官的损伤、修复和再生。众多研究结果证实，与其他器官纤维化一样，肺纤维化(PF)是ECM过度沉积的过程，其中主要涉及炎症因子、脂质过氧化、自由基损伤、细胞间胶原沉积及成纤维细胞增生等因素的共同作用。此外，信号分子途径之间可能相互影响，存在多条旁路途径参与PF的形成与发展。总之，PF的发病机制是多种因素、多个环节参与的缓慢的错综复杂的过程，目前尚无可作用于多途径、多环节的特异有效的药物防治肺纤维化。中药具有多成分、多靶点、多途径的作用特点，在慢性肺纤维化疾病的治疗中显示了一定优势。研究发现黄酮类化合物具有抗炎、抗氧化、抗变态反应、抗菌和抗病毒等多方面的药理作用。2006年4月19日，本发明人曾获中国发明专利证书，公开了中药沙苑子和/或沙苑子黄酮提取物在制备预防或治疗肝纤维化及癌症药物中的应用(专利号ZL2003101064290,公告日2006年4月19日)。中药沙苑子(shayuanzi)为豆科扁茎黄芩(AstragaluscomplanatasR.Br)植物的干燥成熟种子，具有温补肝肾，固精、縮尿、益肝明目的功效，为补益肝肾的传统中药。二十世纪八十年代起，对沙苑子的化学成分和药理作用研究表明沙苑子主要含有黄酮类、三萜类、有机酸类、氨基酸、多肽、蛋白质、甾醇、多糖及铁、锌、铜等微量元素，其中沙苑子黄酮有沙苑子苷(complanatuside)、沙苑子新苷(neocompalnoside)、沙苑子杨梅苷(myricompalnoside)、鼠李拧檬素-3-0-P-D-葡糖糖苷(rhomnocitrin_3_0_P_D_glucoside)、紫云英苷(astragalin)、山奈酷(kaompferol)、杨梅树皮素(myricetin)、毛蕊黄酮-7-0-葡萄糖苷(calycosin-7-O-glucoside)等。现代药理研究表明，沙苑子具有解热镇痛、保肝降脂、抗炎、抗肝纤维化等作用。沙苑子总黄酮(totalflavonoidsofAstragaluscomplanali)是从沙苑子(shayuanzi)中提取的一个有效部位，至今未见沙苑子总黄酮提取物应用于防治肺纤维化疾病的文献报导。
发明内容本发明目的是研究沙苑子总黄酮提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用，尤其是从中药中提取分离防治肺纤维化的有效部位，以便制备疗效好、毒副作用小、价格便宜、服用方便可供长期使用的抗肺纤维化药物。为解决上述问题，本发明提供技术方案如下沙苑子总黄酮提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用。本发明的技术方案是通过气管内滴注博莱霉素(Bleomycin,BLM)制备小鼠肺纤维化模型。该模型的病理过程与人类特发性肺间质纤维化(IPF)相似，作为肺纤维化的经典模型而被广泛应用。本发明首次选用沙苑子总黄酮提取物作为治疗药物，研究沙苑子总黄酮提取物对肺纤维化动物肺组织和血清相关生化指标及病理学变化的影响，观察沙苑子总黄酮提取物对肺纤维化动物模型的防治作用，从而为沙苑子总黄酮提取物用于防治肺纤维化提供实验依据。本实验所用沙苑子总黄酮提取物，总黄酮含量^50%，批号070623，由我所植化室利用现有技术提取，也可商业购得。本发明人在研究中药抗肺纤维化疾病的过程中，以博莱霉素滴注小鼠气管28天后，与正常组相比，模型组小鼠血清超氧化物歧化酶(S0D)活性显著降低(P<0.001)，氧化代谢产物丙二醛(MDA)含量显著增加(P<0.001)，抑制羟自由基(*0H)产生的能力显著降低(P<0.001);肺组织中总抗氧化能力(T-A0C)显著降低(P<0.001)，而MDA含量增加(P<0.05)，总一氧化氮合酶(T-N0S)活性显著增加(P<0.01)，抑制羟自由基(0H)产生的能力明显降低(P<0.05)，羥脯氨酸(HYP)显著升高(P<0.001)，肺系数显著增加(P<0.001)。病理观察所见，肺组织的肺泡炎和纤维化程度显著加重(P<0.001)，呈典型的肺纤维化实质改变。(实施例l-6)本发明人发现用中药沙苑子的有效部位——沙苑子总黄酮提取物(总黄酮含量^50%)，给BLM诱导的肺纤维化小鼠灌服28天后，沙苑子总黄酮提取物各剂量组小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性显著增强(P〈0.01)，小鼠血清丙二醛(MDA)含量减少或显著减少(P<0.05，P<0.001)(实施例1)。血清抑制羟自由基(OH)的能力明显增强(P<0.01)(实施例2)。沙苑子总黄酮提取物各剂量组小鼠肺组织中总抗氧化能力(T-AOC)显著增强或明显增强(P<0.OOl，P<0.01)，沙苑子总黄酮提取物各剂量组小鼠肺组织中丙二醛(MDA)含量显著减少(P<0.001)(实施例3)。肺组织中总一氧化氮合酶(T-NOS)含量显著或明显降低(P<0.OOl，P<0.01)，沙苑子总黄酮提取物各剂量组小鼠肺组织抑制羟自由基(*OH)产生的能力增强或显著增强(P<0.05，P<0.01)(实施例4)。沙苑子总黄酮提取物各剂量组小鼠肺组织中羟脯氨酸(HYP)含量显著降低(P<0.001)，小鼠肺系数降低、明显降低或显著降低(P<0.05，P<0.Ol，P<0.001)(实施例5)。肺纤维化小鼠肺脏病理学观察显示沙苑子总黄酮提取物各剂量组肺纤维化小鼠与肺纤维化模型组小鼠相比，肺组织结构、肺泡壁厚度、肺泡间隔宽度及成纤维细胞产生、胶原纤维沉积程度均有不同程度的改善(见附图l)，结果表明沙苑子总黄酮提取物各剂量组小鼠肺脏的肺泡炎程度降低或明显降低(P<0.05，P<0.01)，肺纤维化程度降低或明显降低(P<0.05，P<0.01)(实施例6)。综合上述实验结果表明给昆明种小鼠气管滴注博莱霉素28天之后，成功制备了小鼠肺纤维化模型。沙苑子总黄酮提取物连续给药28天，可降低肺纤维化小鼠肺系数、月市泡炎程度及肺纤维化程度，提示其具有防治小鼠肺纤维化作用。实验结果还表明其防治肺纤维化作用机制与其抗炎症作用、提高机体抗氧化能力、抑制自由基生成、增强自由基清除、减少胶原生成及成纤维细胞增生有关。由鉴于此，按本发明所述沙苑子总黄酮提取物有可能作为潜在的候选药物，被用于肺阻塞性疾病，特别是肺纤维化的预防和治疗。因此，本发明的目的是提供一种传统中药沙苑子的有效部位——沙苑子总黄酮提取物用于防治肺阻塞性疾病，特别是肺纤维化疾病的药物中的应用。所述制备预防治疗肺纤维化药物中的应用，其沙苑子黄酮提取物包括沙苑子中黄酮类化合物及其医药可接受的盐，为沙苑子黄酮钠盐、沙苑子黄酮磺酸盐。所述制备预防或治疗肺纤维化药物中的应用是指制备预防或治疗肺纤维化的药物，所述药物为含有治疗有效量的沙苑子和/或沙苑子黄酮提取物和药学上可接受的载体。可以按照工作中已知的方法将本发明的药物制成片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂、膏剂及溶液剂和悬浮剂。其中优选的是适用于胃肠道给药的胶囊剂和片剂。在制备适用于口服给药的胶囊齐U、片齐U、丸剂和粉末剂时，可以使用蔗糖、乳糖、玉米淀粉、微晶纤维素、羧甲基纤维素作为载体或赋形剂。此外，也可以使用制药工业中已知的方法和辅助成分将本发明的药物制成适于口服给药的溶液剂和悬浮剂。为了制备适于胃肠道外途径给药的溶液剂或悬浮剂，可以使用蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠溶液或葡萄糖溶液，或者低浓度(例如l-100mM)磷酸盐缓冲液(PBS)作为载体或稀释剂。可以在这些胃肠道外给药的制剂中加入一种或多种其他辅助成分或添加剂，例如可使用抗坏血酸作为抗氧化剂，使用苯甲酸钠等作为防腐剂。在这些剂型中还可以含有其他适当的增溶剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、分散剂或表面活性剂。—般说来，本发明药物组合物的口服给药剂量为0.l-100mg/Kg体重/天，较好为0.l-50mg/Kg体重/天，最好为l-10mg/Kg体重/天。然而，更确切的用药剂量应根据待治疗的疾病或病例状况性质、严重程度、病人的年龄、体重、待治疗病人所用药的敏感性及给药方式等因素由临床医生决定。本发明的目的是提供一种传统中药沙苑子提取物沙苑子总黄酮用于预防和治疗肺梗塞性疾病，特别是肺纤维化疾病的药物中的应用。本发明的再一个目的是提供含有本发明所述的沙苑子总黄酮提取物，及一种或多种原药上可接受的载体和/或赋形剂的药物。本发明的药物除含有本发明制备的沙苑子总黄酮提取物外，还含有一种或多种具有相同或相似作用的其他天然或化学合成的活性成分。本发明的优点是1、本发明首次将传统中药沙苑子的有效部位——沙苑子总黄酮提取物应用于经典而被广泛应用的肺纤维化动物模型，进行防治肺纤维化的实验研究。2、本发明发现沙苑子总黄酮提取物可明显地降低博莱霉素所致肺纤维化小鼠的肺系数、肺泡炎程度和肺纤维化程度，提示具有一定的抗肺纤维化作用。3、本发明发现沙苑子总黄酮提取物抗博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化作用机制与其抗炎、抗氧化、抑制自由基生成及增强自由基清除、减少细胞间质胶原生成及成纤维细胞增生有关。4、沙苑子药材丰富，价格低廉，沙苑子总黄酮提取工艺成熟，疗效确切，服用方便，可长期服用。本发明基于中药沙苑子提取物沙苑子黄酮组成的药物，成分单一，疗效确切，使用方便，可广泛应用于制备防治肺纤维化及相关疾病的药物中。以下实施例旨在进一步举例证明，而不是限制本发明。在不违背本发明的精神和原创前提下，对发明个别技术步骤进行的任何改动都将落入本发明待批权利要求范围内。下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述图1为沙苑子总黄酮提取物治疗28天对小鼠肺组织病理形态变化的影响(HE染色)。其中图l-A为正常组肺组织结构完整清晰，肺泡壁未见增厚，肺泡腔透亮，腔内未见明显渗出，无炎性细胞浸润，无成纤维细胞增生。图l-B为模型组肺泡结构破坏，肺泡间隔增宽，大量炎性细胞浸润及成纤维细胞增生，肺纤维化形成。图l-C为阳性对照药泼尼松组肺泡间隔较宽，肺泡腔变窄，较多炎性细胞浸润及成纤维细胞增生，病变程度较模型组有所减轻。图l-D为沙苑子总黄酮提取物300mg/kg:沙苑子总黄酮提取物大剂量组肺组织结构较完整清晰，肺泡壁轻度增厚，少量炎性细胞浸润，少量成纤维细胞增生。图l-E为沙苑子总黄酮提取物150mg/kg:沙苑子总黄酮提取物中剂量组肺组织结构轻度破坏，肺泡壁轻度增厚，较少炎性细胞浸润，较少成纤维细胞增生。图l-F为沙苑子总黄酮提取物75mg/kg:沙苑子总黄酮提取物小剂量组肺泡结构清晰，较多成纤维细胞增生，有少数纤维化病灶，病灶处炎性细胞浸润。具体实施方式实施例11.1实验目的观察沙苑子总黄酮提取物对BLM诱发肺纤维化小鼠血清S0D、MDA的影响1.2实验材料实验动物昆明种小鼠60只，雌雄兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007，实验动物使用许可证号SYXK(苏)2007-0035。实验药物沙苑子总黄酮提取物(总黄酮含量^50%)，批号070623，棕黄色、粉末状固体，蒸馏水溶解，4t:冰箱保存备用，由本所植化室提供；博莱霉素A5(BLMA5)，白色冻干粉末，15mg/支，由日本化药株式会社生产，产品批号640110，药品进口注册证号H20040205;注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，国药准字H13020657;4%水合氯醛；醋酸泼尼松片，5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，批号32022681。试剂与仪器超氧化物歧化酶(SOD)与丙二醛(MDA)试剂盒(批号20090519)均购自南京建成生物技术研究所。紫外可见分光光度计，T6新世纪型，为北京普析通用仪器有限责任公司生产，仪器编号18-1650-01-016;高速低温冷冻离心机，5417R型，德国艾本德股份公司生产；电热恒温水浴锅，H.H.S6型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司出品。1.3实验方法动物分组昆明种小鼠60只，雌雄兼有，称重、编号、随机分为6组，即正常组、模型组、阳性对照药泼尼松组(6.67mg/kg)、沙苑子总黄酮大剂量组(300mg/kg)、中剂量组(150mg/kg)、小剂量组(75mg/kg)，每组小鼠10只。模型制备模型组与各治疗组小鼠采用BLM复制动物肺纤维化模型。具体操作步骤如下实验时，小鼠用4%的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰卧手术台，固定头部及四肢，常规消毒，无菌条件下行颈正中切口，钝性分离暴露气管，lml注射器剌入模型组、沙苑子总黄酮提取物各剂量组及醋酸泼尼松组小鼠气管软骨环间隙缓慢注入BLMA5(5mg/kg)，正常对照组在相同条件下注入等体积生理盐水。注药后立即将小鼠直立，沿身体纵轴左右旋转3-5min，使药液均匀分布于两侧肺内，然后缝合皮肤、消毒，待小鼠清醒后送清洁级观察室常规饲养。整个手术过程严格遵循无菌操作原则。术前l日及术后3天，所有小鼠每天肌肉注射80万单位青霉素钠(0.lml/只)。给药方案各组动物经博莱霉素滴入气管造模后，第二天开始小鼠每隔一天称重一次，按照相应的体重灌服给药，正常组及模型组给予等体积生理盐水，阳性对照组给予泼尼松，各治疗组分别给予不同剂量的沙苑子总黄酮提取物。连续给药28天。血清的制备各组小鼠眼眶静脉取全血后3500r/min离心10min，小心取上清置于1.5ml离心管内，转移后的上清再次3500r/min离心10min。制备好的血清液-8(TC冰箱保存，以测定血清中SOD活性和MDA含量等生化指标。1.4统计方法数据以；±s表示，采用SPSS11.0统计软件，各组数据采用t检验，比较组间差异，P<0.05有统计学意义。1.5实验结果与正常组相比，肺纤维化模型组小鼠血清SOD活性及MDA含量均显著降低(P<0.001)。给药28天后，沙苑子总黄酮提取物各剂量组小鼠血清SOD活性高于模型组小鼠(P<0.05)。沙苑子总黄酮提取物各剂量组小鼠血清MDA含量低于或显著低于模型组(P<0.05，P<0.001)。阳性对照药泼尼松组小鼠血清SOD活性高于模型组(P<0.05)，MDA含量显著低于模型组(P<0.OOl)，见表l。表1沙苑子总黄酮提取物对肺纤维化小鼠血清中SOD活性和MDA含量的影响(;±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注##P<0.01，###P<0.001vscontrol;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vsmodel.1.6结论造模后28天，模型组小鼠血清SOD活性显著降低，氧化代谢产物MDA含量显著增加；连续给药28天后，沙苑子总黄酮提取物各剂量组肺纤维化小鼠血清中SOD活性增强，MDA的含量显著降低或降低。醋酸泼尼松可增强肺纤维化小鼠血清SOD的活性，并可显著降低MDA的含量。提示沙苑子总黄酮提取物可增强肺纤维化小鼠血清SOD活性，从而增强清除氧自由基，减少血清MDA含量，表明沙苑子总黄酮提取物可降低体内脂质过氧化程度。实施例22.1实验目的观察沙苑子总黄酮提取物对BLM诱发肺纤维化小鼠血清血清抑制羟自由基(OH)产生的能力的影响2.2实验材料实验动物昆明种小鼠60只，雌雄兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007，实验动物使用许可证号SYXK(苏)2007-0035。实验药物沙苑子总黄酮提取物(总黄酮含量》50%)，批号070623，棕黄色、粉末状固体，蒸馏水溶解，4t:冰箱保存备用，由我所植化室提供；博莱霉素A5(BLMA5)，白色冻干粉末，15mg/支，由日本化药株式会社生产，产品批号640110，药品进口注册证号H20040205;注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，国药准字H13020657;4%水合氯醛；醋酸泼尼松片，5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，批号32022681。试剂与仪器羟自由基(0H)试剂盒(批号20090519)购买于南京建成生物技术研究所。紫外可见分光光度计，T6新世纪型，为北京普析通用仪器有限责任公司生产，仪器编号18-1650-01-016;高速低温冷冻离心机，5417R型，德国艾本德股份公司生产；电热恒温水浴锅，H.H.S6型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司出品。2.3实验方法动物分组昆明种小鼠60只，雌雄兼有，称重、编号、随机分为6组，即正常组、模型组、阳性对照药泼尼松组(6.67mg/kg)、沙苑子总黄酮大剂量组(300mg/kg)、中剂量组(150mg/kg)、小剂量组(75mg/kg)，每组小鼠10只。模型制备模型组与各治疗组小鼠采用BLM复制动物肺纤维化模型。具体操作步骤如下实验时，小鼠用4%的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰卧手术台，固定头部及四肢，常规消毒，无菌条件下行颈正中切口，钝性分离暴露气管，lml注射器剌入模型组、沙苑子总黄酮提取物各治疗组及醋酸泼尼松组小鼠气管软骨环间隙缓慢注入BLMA5(5mg/kg)，正常对照组在相同条件下注入等体积生理盐水。注药后立即将小鼠直立，沿身体纵轴左右旋转3-5min，使药液均匀分布于两侧肺内，然后缝合皮肤、消毒，待小鼠清醒后送清洁级观察室常规饲养。整个手术过程严格遵循无菌操作原则。术前l日及术后3天所有小鼠每天肌肉注射80万单位青霉素钠(0.lml/只)。给药方案各组动物经博莱霉素造模后，第二天开始小鼠每隔一天称重一次，按照相应的体重灌胃给药，正常组及模型组给予等体积生理盐水，阳性对照组给予泼尼松，各治疗组分别给予不同剂量的沙苑子总黄酮提取物。连续给药28天。血清的制备各组小鼠眼眶静脉取全血后3500r/min离心10min，小心取上清置于1.5ml离心管内，转移后的上清再次3500r/min离心10min。制备好的血清液-80。C冰箱保存，以测定血清抑制羟自由基(*0H)产生的能力。2.4统计方法数据以；士s表示，采用SPSS11.0统计软件，各组数据采用t检验，比较组间差异，P<0.05有统计学意义。2.5试验结果造模后28天，与正常组小鼠相比，模型组小鼠血清抑制羟自由基产生能力显著降低(P<0.001);给药28天，与模型组小鼠相比，沙苑子总黄酮提取物各剂量组小鼠血清抑制羟自由基产生的能力明显增强(P<0.01);阳性对照药泼尼松组小鼠血清抑制羟自由基产生能力显著增强(P<0.001)，见表2。表2沙苑子总黄酮提取物对肺纤维化小鼠血清抑制羟自由基产生能力的影响(;±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注##P<0.01，###P<0.001vscontrol;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vsmodel.2.6结论造模28天，模型组小鼠血清抑制羟自由基产生的能力明显降低；给药28天，沙苑子总黄酮提取物各剂量组肺纤维化小鼠血清抑制羟自由基产生的能力明显增强。阳性对照药泼尼松亦可显著增强实验小鼠血清抑制羟自由基能力。提示沙苑子总黄酮提取物通过增强血清抑制羟自由基产生的能力而具有抗氧化作用；实施例33.1实验目的观察沙苑子总黄酮提取物对BLM诱发肺纤维化小鼠肺组织T_A0C、MDA含量的影响3.2实验材料实验动物昆明种小鼠60只，雌雄兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007，实验动物使用许可证号SYXK(苏)2007-0035。实验药物沙苑子总黄酮提取物(总黄酮含量》50%)，批号070623，棕黄色、粉末状固体，蒸馏水溶解，4t:冰箱保存备用，由本所植化室提供；博莱霉素A5(BLMA5)，白色冻干粉末，15mg/支，由日本化药株式会社生产，产品批号640110，药品进口注册证号H20040205;注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，国药准字H13020657;4%水合氯醛；醋酸泼尼松片，5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，批号32022681。试剂与仪器总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)试剂盒(批号20090519)购自南京建成生物技术研究所。紫外可见分光光度计，T6新世纪型，为北京普析通用仪器有限责任公司生产，仪器编号18-1650-01-016;高速低温冷冻离心机，5417R型，德国艾本德股份公司生产；电热恒温水浴锅，H.H.S6型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司出品。3.3实验方法动物分组昆明种小鼠60只，雌雄兼有，称重、编号、随机分为6组，即正常组、模型组、泼尼松组(6.67mg/kg)、大剂量组(300mg/kg)、中剂量组(150mg/kg)、小剂量组(75mg/kg)，每组小鼠10只。模型制备模型组与各治疗组小鼠采用BLM复制动物肺纤维化模型。具体操作步骤如下实验时，小鼠用4%的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰卧手术台，固定头部及四肢，常规消毒，无菌条件下行颈正中切口，钝性分离暴露气管，lml注射器剌入模型组、沙苑子总黄酮提取物各治疗组及醋酸泼尼松组小鼠气管软骨环间隙缓慢注入BLMA5(5mg/kg)，正常对照组在相同条件下注入等体积生理盐水。注药后立即将小鼠直立，沿身体纵轴左右旋转3-5min，使药液均匀分布于两侧肺内，然后缝合皮肤、消毒，待小鼠清醒后送清洁级观察室常规饲养。整个手术过程严格遵循无菌操作原则。术前l日及术后3天所有小鼠连续肌肉注射80万单位青霉素钠(0.lml/只)。给药方案各组动物经博莱霉素造模后，第二天开始小鼠每隔一天称重一次，按照相应的体重灌胃给药，正常组及模型组给予等体积生理盐水，阳性对照药给予泼尼松，各治疗组分别给予不同剂量的沙苑子总黄酮提取物。连续给药28天。肺组织匀浆制备称取适量肺组织，加入体积为所称取肺组织重量9倍的冰冷生理盐水，利用内切式组织匀浆器制成10%的组织匀浆，然后按照试剂盒说明书测定肺纤维化小鼠肺组织中总抗氧化能力(T-AOC)及丙二醛(MDA)的含量。3.4统计方法数据以；±s表示，采用SPSS11.0统计软件，各组数据采用t检验，比较组间差异，P<0.05有统计学意义。3.5试验结果造模28天，与正常对照组小鼠相比，肺纤维化模型组小鼠肺组织总抗氧化能力(T-A0C)显著降低(P<0.001)，肺组织中丙二醛(MDA)含量下降(P<0.05)。给药28天，与模型组小鼠相比，沙苑子黄酮各剂量组小鼠肺组织总抗氧化能力(T-AOC)增强、明显增强、显著增强(P<0.05，0.01，P<0.OOl)，小鼠肺组织中丙二醛(MDA)含量均显著下降(P<0.001)。阳性对照药泼尼松组小鼠肺组织总抗氧化能力(T-AOC)增强(P<0.05)，丙二醛(MDA)含量显著减少(P<0.001)，见表3。表3沙苑子总黄酮提取物对肺纤维化小鼠肺组织中T-A0C、MDA浓度的影响(；±s，n=10)组别剂s(rag/kg)T-AOC(U/mgprot))MDA(nmolAigprot)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注##P<0.01，###P<0.001vscontrol;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vsmodel.3.6结论造模28天，模型组小鼠肺组织总抗氧化能力(T-AOC)显著降低，氧化代谢产物丙二醛(MDA)增加。给药28天，沙苑子总黄酮提取物可明显增强小鼠肺组织总抗氧化能力(T-AOC)，显著减少丙二醛(MDA)含量。阳性对照药醋酸泼尼松亦可增强总抗氧化能力(T-AOC)，并可显著减少丙二醛(MDA)含量。提示沙苑子总黄酮提取物具有增强肺组织的总抗氧化能力和抗体内脂质过氧化的作用。实施例44.1实验目的观察沙苑子总黄酮提取物对BLM诱发肺纤维化小鼠肺组织中总一氧化氮合酶(T-N0S)活性和抑制羟自由基(OH)产生能力的影响4.2实验材料实验动物昆明种小鼠60只，雌雄兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007，实验动物使用许可证号SYXK(苏)2007-0035。实验药物沙苑子总黄酮提取物(总黄酮含量》50%)，批号070623，棕黄色、粉末状固体，蒸馏水溶解，4t:冰箱保存备用，由本所植化室提供；博莱霉素A5(BLMA5)，白色冻干粉末，15mg/支，由日本化药株式会社生产，产品批号640110，药品进口注册证号H20040205;注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，国药准字H13020657;4%水合氯醛；醋酸泼尼松片，5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，批号32022681。试剂与仪器总一氧化氮合酶(T-NOS)和羟自由基(*0H)试剂盒(批号20090519)购买于南京建成生物技术研究所。紫外可见分光光度计，T6新世纪型，为北京普析通用仪器有限责任公司生产，仪器编号18-1650-01-016;高速低温冷冻离心机，5417R型，德国艾本德股份公司生产；电热恒温水浴锅，H.H.S6型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司出品。4.3实验方法动物分组昆明种小鼠60只，雌雄兼有，称重、编号、随机分为6组，即正常组、模型组、泼尼松组(6.67mg/kg)、大剂量组(300mg/kg)、中剂量组(150mg/kg)、小剂量组(75mg/kg)，每组小鼠10只。模型制备模型组与各治疗组小鼠采用BLM复制动物肺纤维化模型。具体操作步骤如下实验时，小鼠用4%的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰卧手术台，固定头部及四肢，常规消毒，无菌条件下行颈正中切口，钝性分离暴露气管，lml注射器剌入模型组、沙苑子总黄酮提取物各治疗组及醋酸泼尼松组小鼠气管软骨环间隙缓慢注入BLMA5(5mg/kg)，正常对照组在相同条件下注入等体积生理盐水。注药后立即将小鼠直立，沿身体纵轴左右旋转3-5min，使药液均匀分布于两侧肺内，然后缝合皮肤、消毒，待小鼠清醒后送清洁级观察室常规饲养。整个手术过程严格遵循无菌操作原则。术前l日及术后3天小鼠每天肌肉注射80万单位青霉素钠(0.lml/只)。给药方案各组动物经博莱霉素造模后，第二天开始小鼠每隔一天称重一次，按照相应的体重灌胃给药，正常组及模型组给予等体积生理盐水，阳性对照组给予泼尼松，各治疗组分别给予不同剂量的沙苑子总黄酮提取物。连续给药28天。肺组织匀浆制备称取适量肺组织，加入体积为所称取肺组织重量9倍的冰冷生理盐水，利用内切式组织匀浆器制成10%的组织匀浆，然后按照试剂盒说明书测定肺组织总一氧化氮合酶(T-NOS)活性和抑制羟自由基(OH)产生的能力。4.4统计方法数据以；±s表示，采用SPSS11.0统计软件，各组数据采用t检验，比较组间差异，P<0.05有统计学意义。4.5实验结果造模28天，与正常对照组小鼠相比，肺纤维化模型组小鼠肺组织中总一氧化氮合酶(T-NOS)的活性明显增强(P<0.01)，而抑制羟自由基(OH)产生的能力明显降低(P<0.01);与模型组小鼠相比，沙苑子总黄酮提取物各剂量组小鼠肺组织中总一氧化氮合酶(T-NOS)活性明显增强或显著增强(P<0.Ol，P<0.001)，而沙苑子总黄酮提取物各剂量组小鼠肺组织抑制羟自由基产生的能力增强或明显增强(P<0.05，P<0.01);阳性对照药泼尼松组小鼠肺组织中总一氧化氮合酶(T-NOS)活性显著增强(P<0.001)，抑制羟自由基产生的能力增强(P<0.05)，见表4。表4沙苑子总黄酮提取物对肺纤维化小鼠肺组织中T-NOS活性和抑制羟自由基产生能力的影响(；±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注##P<0.01，###P<0.001vscontrol;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vsmodel.4.6结论造模28天，模型组小鼠肺组织中总一氧化氮合酶(T-NOS)活性明显增强，肺组织抑制羟自由基(OH)产生能力下降。连续给药28天后，沙苑子总黄酮提取物各剂量组可显著减弱肺纤维化小鼠肺组织中的一氧化氮合酶(T-NOS)的活性，增强肺组织抑制羟自由基(*0H)产生的能力。阳性对照药泼尼松亦可显著降低肺组织一氧化氮合酶活性，同时增强肺组织抑制羟自由基(*0H)产生的能力。以上结果提示沙苑子总黄酮提取物通过减弱一氧化氮合酶活性而减少一氧化氮的产生；并通过增强肺组织抑制羟自由基(*0H)产生的能力而减少体内羟自由基的生成，从而减少对肺组织的损伤。实施例55.1实验目的观察沙苑子总黄酮提取物对BLM诱发肺纤维化小鼠肺组织中羟脯氨酸(HYP)和肺系数的影响5.2实验材料实验动物昆明种小鼠60只，雌雄兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007，实验动物使用许可证号SYXK(苏)2007-0035。实验药物沙苑子总黄酮提取物(总黄酮含量^50%)，批号070623，棕黄色、粉末状固体，蒸馏水溶解，4t:冰箱保存备用，由本所植化室提供；博莱霉素A5(BLMA5)，白色冻干粉末，15mg/支，由日本化药株式会社生产，产品批号640110，药品进口注册证号H20040205;注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，国药准字H13020657;4%水合氯醛；醋酸泼尼松片，5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，批号32022681。试剂与仪器羟脯氨酸(HYP)试剂盒(批号20090519)购买于南京建成生物技术研究所。紫外可见分光光度计，T6新世纪型，为北京普析通用仪器有限责任公司生产，仪器编号18-1650-01-016;高速低温冷冻离心机，5417R型，德国艾本德股份公司生产；电热恒温水浴锅，H.H.S6型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司出品。5.3实验方法动物分组昆明种小鼠60只，雌雄兼有，称重、编号、随机分为6组，即正常组、模型组、泼尼松组(6.67mg/kg)、大剂量组(300mg/kg)、中剂量组(150mg/kg)、小剂量组(75mg/kg)，每组小鼠10只。模型制备模型组与各治疗组小鼠采用BLM复制动物肺纤维化模型。具体操作步骤如下实验时，小鼠用4%的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰卧手术台，固定头部及四肢，常规消毒，无菌条件下行颈正中切口，钝性分离暴露气管，lml注射器剌入模型组、沙苑子总黄酮提取物各治疗组及醋酸泼尼松组小鼠气管软骨环间隙缓慢注入BLMA5(5mg/kg)，正常对照组在相同条件下注入等体积生理盐水。注药后立即将小鼠直立，沿身体纵轴左右旋转3-5min，使药液均匀分布于两侧肺内，然后缝合皮肤、消毒，待小鼠清醒后送清洁级观察室常规饲养。整个手术过程严格遵循无菌操作原则。术前l日及术后3天所有小鼠连续肌肉注射80万单位青霉素钠(0.lml/只)。给药方案各组动物经博莱霉素造模后，第二天开始小鼠每隔一天称重一次，按照相应的体重灌胃给药，正常组及模型组给予等体积生理盐水，阳性对照组给予泼尼松，各治疗组分别给予不同剂量的沙苑子总黄酮提取物。连续给药28天。羟脯氨酸测定动物处死当日，取右肺中叶约30克置于带刻度的10ml玻璃离心管中，-20°。冰箱保存，以备测定各实验组小鼠肺组织中羟脯氨酸的含量；测定方法具体如下将0.5ml水解液准确加入冷冻保存小块肺组织的刻度玻璃试管内，混匀，加盖后沸水浴水解20min，其中10min混匀一次。之后将试管液体pH值调至6.5左右，加适量活性炭，混匀，转移至1.5ml离心管中，3500r/min离心10min，取上清0.5ml，依次加入三种反应试剂，混匀，6(TC水浴15min，冷却后3500r/min离心10min，取上清于550nm，lcm光镜下测定各管的吸光度，按说明书公式计算肺组织中HYP含量。肺系数测定各组小鼠在处理当日，各组小鼠处理前12小时禁食，不禁水，处理当日小鼠称体重，计算各实验组动物的平均体重作为观察指标。各组经颈椎脱臼法处死，在无菌条件下分离出气管和两侧肺脏，称重。按以下公式计算肺系数，肺系数=肺湿重(mg)/体重(g)，肺系数是反映小鼠炎症和纤维化程度的一个重要指标。5.4统计方法数据以；±s表示，采用SPSS11.0统计软件，各组数据采用t检验，比较组间差异，P<0.05有统计学意义。5.5实验结果造模后给药28天，与正常对照组相比，模型组小鼠体重显著减轻，肺组织中HYP含量显著增加(P<0.001)，肺系数显著高于正常组(P<0.001);沙苑子总黄酮提取物各剂量组小鼠体重显著增加，小鼠肺组织中HYP的含量明显低于模型组(P<0.001)，肺系数均低于、明显低于或显著低于模型组(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。阳性对照药泼尼松组小鼠肺组织中羟脯氨酸含量与模型组相比显著降低(P<0.001)，肺系数亦有所下降，(P>0.05)，见表5。表5沙苑子总黄酮提取物对肺纤维化小鼠肺组织中羟脯氨酸(HYP)和肺系数的影响(；±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注##P<0.01，###P<0.001vscontrol;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vsmodel.5.6结论造模28天后，模型组小鼠体重显著减轻，肺组织中羟脯氨酸含量显著升高，肺系数显著增加。给药28天，沙苑子总黄酮提取物可增加或显著增加纤维化小鼠体重，可显著降低小鼠肺组织中羟脯氨酸含量，明显降低肺系数。阳性对照药醋酸泼尼松亦可减少肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸含量，降低肺系数。提示沙苑子总黄酮提取物可通过降低肺组织中羟脯氨酸的含量而减少肺泡间质胶原的生成，并可降低肺系数，从而发挥抗纤维化作用。实施例66.1实验目的观察沙苑子总黄酮提取物对BLM诱发肺纤维化小鼠肺组织病理形态的影响6.2实验材料实验动物昆明种小鼠60只，雌雄兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007，实验动物使用许可证号SYXK(苏)2007-0035。实验药物沙苑子总黄酮提取物(总黄酮含量^50%)，批号070623，棕黄色、粉末状固体，蒸馏水溶解，4t:冰箱保存备用，由本所植化室提供；博莱霉素A5(BLMA5)，白色冻干粉末，15mg/支，由日本化药株式会社生产，产品批号640110，药品进口注册证号H20040205;注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，国药准字H13020657;4%水合氯醛；醋酸泼尼松片，5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，批号32022681。实验仪器光学显微镜，OLYMPUSCX31。6.3实验方法动物分组昆明种小鼠60只，雌雄兼有，称重、编号、随机分为6组，即正常组、模型组、泼尼松组(6.67mg/kg)、大剂量组(300mg/kg)、中剂量组(150mg/kg)、小剂量组(75mg/kg)，每组小鼠10只。模型准备模型组和各给药组采用博莱霉素复制动物肺纤维化模型，具体方法实验小鼠用4%的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉。取仰卧固定位，常规消毒，行颈正中切口，钝性分离暴露气管，模型组，醋酸泼尼松组、治疗组于气管软骨环间隙穿剌缓慢注入BLMA5(5mg/kg)，正常对照组注入等体积生理盐水，注药后立即将小鼠直立旋转3-5min，使药液均匀分布于两侧肺内，然后缝合皮肤，并在缝合处消毒，待清醒后送清洁级观察室饲养。给药方案造模第二天开始给药，给药组按上述剂量给药，每天一次，正常组和模型组按同样的方法给予同等体积的蒸馏水，连续给药28天。肺组织病理切片染色取右肺，按常规病理学方法进行固定、包埋、切片。将病理切片进行HE染色，然后参照Szaopiel等方法略加改良将肺泡炎和肺纤维化的程度分为四级0级，无病理明显改变，肺泡结构清晰，肺泡透亮，肺泡间隔正常；极少量炎性细胞浸润，极少量成纤维细胞生成；无胶原纤维生成；1级，轻度病理改变，肺泡结构略有紊乱，肺泡间隔因炎性细胞浸润和成纤维细胞增生而增宽；较少量炎性细胞浸润，较少量成纤维细胞增生；较少量胶原纤维生成，病变范围小于全肺的20%;2级，中度病理改变，肺泡结构紊乱，肺泡间隔明显增宽；少量炎性细胞浸润，少量成纤维细胞增生，少量胶原纤维生成，病变范围占全肺的20%50%;3级，重度病理改变，肺泡结构紊乱，肺泡融合，肺泡间隔显著增宽；大量炎性细胞浸润，大量成纤维细胞增生，大量胶原纤维沉积，可见明显的肺纤维化病灶，病变范围占全肺的50%以上。6.4统计方法数据以；±s表示，采用SPSS11.0统计软件，各组数据采用t检验，比较组间差异，P<0.05有统计学意义。6.5实验结果造模28天后，与正常对照组相比，模型组小鼠肺组织中肺泡炎程度和肺纤维化程度显著加重(P<0.001)，呈肺纤维化实质病变；与模型组相比，沙苑子总黄酮提取物各剂量组小鼠肺组织肺泡结构，肺泡间隔炎细胞浸润，胶原沉积及成纤维细胞增生，均有不同程度的改善。肺泡炎和肺纤维化程度均减轻或明显减轻(P<0.05，P<0.01);阳性对照药泼尼松组小鼠肺组织肺泡炎及肺纤维化程度均较模型组小鼠呈减轻趋势，但无统计学意义(P>0.05)，见表6、图1。表6肺泡炎和肺纤维化程度评分结果G±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>人剂,纤i.加()0.83±0.4f0.83±().72"中剂量组1500.70±0.48":s0.73±0.79"'小剂量组750.70±0.48"0.83±0.72"注##P<0.01与假手术组比较；*P<0.05，**P<0.01与模型组比较6.6结论造模28天，模型组小鼠肺组织肺泡炎和肺纤维化程度显著加重，呈典型的肺纤维化实质病变。给药28天，沙苑子总黄酮提取物各剂量组小鼠肺系数明显降低，肺组织肺泡炎及肺纤维化程度明显减轻。提示在本实验条件下，成功复制了小鼠肺纤维化模型。沙苑子总黄酮提取物可明显降低肺纤维化小鼠的肺泡炎和肺纤维化程度，具有防治肺纤维化疾病的作用。综上所述，沙苑子总黄酮提取物具有预防和治疗抗肺纤维化作用，其机制可能与其具有抗炎作用、抗氧化作用和抑制胶原生成作用及成纤维细胞增生有关。LU'"」假手术组(lOml/kg)模型组(lOml/kg)权利要求沙苑子总黄酮提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用。2.权利要求1所述沙苑子总黄酮提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用，其特征在于所述沙苑子总黄酮提取物中总黄酮的含量为^50%。3.权利要求1所述制备预防或治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于所述的药物为含有治疗有效剂量的沙苑子总黄酮提取物可与药学上可接受的载体结合制备药物。全文摘要本发明公开了一种沙苑子总黄酮提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用，通过气管内滴注博莱霉素(BLM)复制小鼠肺纤维化模型。首次使用沙苑子总黄酮提取物作为治疗药物，观察肺纤维化动物肺组织和血清相关生化指标及病理学变化，阐明沙苑子总黄酮提取物对肺纤维化动物模型的治疗作用及其机制，从而为沙苑子总黄酮提取物用于治疗肺纤维化提供实验依据。所述的药物为含有治疗有效量的沙苑子总黄酮提取物可与药学上可接受的载体结合制备药物。文档编号A61K131/00GK101744868SQ200910186880公开日2010年6月23日申请日期2009年12月28日优先权日2009年12月28日发明者周忠继,蒋小岗,贺海彪,郭次仪,顾振纶申请人:苏州中药研究所