专利名称：：抗肿瘤坏死因子受体1的单域抗体及其使用方法抗肿瘤坏死因子受体1的单域抗体及其使用方法本申请是申请日为2005年10月7日，申请号为200580042042.0的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。相关申请本申请是于2004年11月10日申请的美国专利申请号10/985，847的部分继续申请，它是1)于2004年10月8日申请的国际专利申请号PCT/GB2004/004253(指定国为美国)的部分继续申请；禾口2)于2003年12月24日申请的国际专利申请号PCT/GB2003/005646(指定国为美国)的部分继续申请，并且要求于2002年12月27日申请的英国申请号GB0230202.4和于2003年11月28日申请的英国申请号GB0327706.8的优先权，它是于2003年6月30日申请的国际专利申请号PCT/GB2003/002804(指定国为美国)的部分继续申请，并且要求于2002年12月27日申请的英国申请GB0230202.4的优先权，它是于2002年6月28日申请的国际专利申请号PCT/GB02/03014(指定国为美国)的部分继续申请。上述申请的全部公开内容都通过引用结合到本文中。
背景技术：
：抗体的抗原结合域包含两个单独的区重链可变区(VH)和轻链可变区(、可以是Vk或VA)。抗原结合位点本身由六个多肽环构成3个来自VH区(Hl、H2和H3)，3个来自Vl区(Ll、L2和L3)。編碍Vh区和vl区的v基因的多变初级库(diverseprimaryr印ertoire)是由基因区段组合重排而产生的。VH基因由VH、D和JH三个基因区段重组产生。在人类，约有51个功能性Vh区段(Cook和Tomlinson(1995)ImmunolToday,16:237)、25个功能性D区段(Corbett等(1997)J.Mol.Biol.，268:69)和6个功能性JH区段(Ravetch等(1981)Cell,27:583)，这取决于单元型(haplotype)。VH区段编码多肽链区，构成VH区的第一和第二抗原结合环(HI和H2)，而VH、D和JH区段组合形成VH区的第三抗原结合环(H3)。、基因仅由、和1两个基因区段重组产生。在人类，约有40个功能性vk区段(Schable和Zachau(1993)Biol.Chem.Hoppe-Seyler，374:1001)、31个功能性VA区段(Williams等(1996)J.Mol.Biol.，264:220;Kawasaki等(1997)GenomeRes.，7:250)、5个功能性Jk区段(Hieter等(1982)J.Biol.Chem.，257:1516)和4个功能性JA区段(Vasicek和Leder(1990)J.Exp.Med.，172:609)，这取决于单元型。、区段编码多肽链区，构成、区的第一和第二抗原结合环(Ll和L2)，而、和1区段组合形成、区的第三抗原结合环(L3)。据信，从该初级库中选出的抗体具有足够的多样性，使得能以至少中等亲和力结合几乎所有的抗原。高亲和力抗体由重排基因的"亲和力成熟"产生，其中产生点突变并通过免疫系统根据改进的结合进行选择。对抗体结构和序列的分析已经表明，6个抗原结合环中有5个(Hl、H2、Ll、L2、L3)具有数目有限的主链构象或正则结构(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196:901;Chothia等(1989)Nature,342:877)。主链构象由以下两点来确定(i)抗原结合环的长度，和(ii)抗原结合环和抗体构架中某个关键位置的特定残基或残基种类。对环长度和关键残基进行分析，已经让我们能够预测由大多数人类抗体序列所编码的H1、H2、L1、L2和L3的主链构象(Chothia等(1992)J.Mol.Biol.，227:799;Tomlinson等(1995)EMBOJ.，14:4628;Williams等(1996)J.Mol.Biol.，264:220)。尽管H3区在序列、长度和结构上多样性高得多(因为使用了D区段)，但是它也构成数目有限的短环长度的主链构象，这取决于环及抗体构架的关键位置上特定残基的长度和存在与否，或残基种类(Martin等(1996)J.Mol.Biol.，263:800;Shirai等(1996)FEBSLetters,399:1)。包含VH区和、区互补对的双特异性抗体是本领域已知的。这些双特异性抗体必定包含两对VH和、，每对VH/X结合一个抗原或表位。该方法涉及杂种杂交瘤(Milstein和CuelloAC，Nature305:537-40)、微型抗体(minibody)(Hu等(1996)CancerRes56:3055-3061)、双链抗体(diabody)(Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90，6444-6448;W094/13804)、螯合重组抗体(CRAb;(Neri等(1995)J.Mol.Biol.246，367-373)、biscFv(例如Atwe11等(1996)Mol.Immunol.33，1301-1312)、"杵臼结构(knobsinholes)"稳定的抗体(Carter等(1997)ProteinSci.6，781-788)。在多种情况下，每种抗体都包含两个抗原结合位点，各自由VH区和、区互补对形成。因此，各抗体能同时结合两个不同抗原或表位，而与EACH抗原或表位的结合是由VH及其互补、区介导的。这些技术各有各的缺点；例如就杂种杂交瘤而论，无活性VH/、对可极大地减少双特异性IgG部分。此外，大多数双特异性方法依赖于不同V/、对的缔合或VH链与Vj连的缔合，以得到两个不同VH/\结合位点。因此，在装配分子中不可能控制结合位点与各抗原或表位的比例，所以许多装配分子能结合一个抗原或表位，但不结合其它抗原或表位。在某些情况下，可以改造重链或轻链的亚单位界面(Carter等，1997)，以便改善对两个抗原或表位具有结合位点的分子数量，但是这却不能使所有分子都能结合两个抗原或表位。有些证据表明，两个不同的抗体结合特异性可以结合到同一结合位点，但是这些一般代表两个或更多个特异性，所述特异性对应于结构相关的抗原或表位或者具有广泛交叉反应的抗体。例如交叉反应性抗体已有描述，通常，其中两个抗原在序列和结构上相关(例如鸡卵清溶菌酶和火鸡溶菌酶(McCafferty等，W092/01047))，或者对应于游离半抗原和缀合在载体上的半抗原(GriffithsAD等，EMBOJ.1994，13:143245-60)。在另一个实例中，WO02/02773(AbbottLaboratories)描述了具有"双特异性"的抗体分子。所述抗体分子是指针对多种抗原而产生或选择的抗体，使得它们的特异性跨越不止一种抗原。W002/02773的抗体中的各互补VH/、对，针对两个或更多个结构相关抗原具有单结合特异性；这样的互补对中的VH区和、区各自并不具有单独的特异性。因此，抗体具有针对两个结构相关抗原的广泛的单特异性。此外，多反应性的天然自身抗体已有描述(Casali和Notkins，Ann.Rev.Immunol.，7，515-531)，可与至少两个(通常更多)结构无关的不同抗原或表位反应。也已经知道，采用噬菌体展示技术对单克隆抗体进行随机肽库的选择，将会鉴定出一系列适合抗原结合位点的肽序列。某些序列是高度相关的，适合共有序列，而其它序列则十分不同，称为模拟表位(mimotope)(Lane禾PSt印hen，CurrentOpinioninImmunology,1993，5，268-271)。因此，显然天然四链抗体，包括连接和互补的VH区和、区在内，具有与许多不同抗原结合的潜力，这些抗原来自各种各样的已知抗原。尚不太清楚在同一抗体中怎样产生针对两个给定抗原的结合位点，尤其是当它们并不一定是结构相关时。蛋白质工程方法已经表明与这些方面有关。例如，也已知道可以产生催化性抗体，其具有通过一个可变区而与金属离子结合的活性，并具有通过与金属离子和互补可变区接触而与半抗原(底物)结合的活性(Barbas等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90，6385-6389)。然而在这种情况下，认为与底物(第一抗原)的结合和催化，需要与金属离子(第二抗原)的结合。因此，与VH/X对的结合涉及单组分抗原而不是多组分抗原。从骆驼抗体重链单域产生双特异性抗体的方法已有描述，该方法中在一个可变区产生对第一抗原的结合接触，在第二可变区产生对第二抗原的结合接触。然而，可变区并不互补。因此，针对第一抗原选择第一重链可变区，针对第二抗原选择第二重链可变区，再将这两个区一起连接在同一链上，得到双特异性抗体片段(Conrath等，J.Biol.Chem.270，27589-27594)。然而，骆驼重链单域是异乎寻常的，因为它们来源于没有轻链的天然骆驼抗体，而且重链单域无法与骆驼轻链结合形成互补VH和、对。也已描述了单个重链可变区，来源于天然抗体，通常与轻链相连接(来自单克隆抗体或来自结构域库；参见EP-A-0368684)。已经知道，这些重链可变区与一个或多个相关抗原具有特异性相互作用，但却不能结合其它重链或轻链可变区，以产生对两个或更多个不同抗原具有特异性的配体。此外，已经知道，这些单域的体内半衰期非常短。因此，这些结构域的治疗价值有限。已经知道，通过将具有不同特异性的重链可变区连接在一起，可制备双特异性抗体片段(如上所述)。该方法的缺点就是分离的抗体可变区可能具有疏水界面，该界面通常与轻链相互作用并且暴露给溶剂，而且是"粘性的"，使得单域能与疏水表面结合。此外，当配偶体轻链不存在时，两个或更多个不同重链可变区的组合及其结合(可能通过其疏水界面)，可阻止它们结合配体中的一个、而不是两个，而在分离时它们是可以结合两个配体的。此外，在这种情况下，重链可变区将不与互补轻链可变区结合，因此稳定性下降且容易解折叠(Worn和Pluckthun，1998，Biochemistry37,13120-7)。发明概述本发明涉及肿瘤坏死因子l(TNFRl、p55、CD120a、P60、TNF受体超家族成员1A、TNFRSF1A)拮抗剂以及所述拮抗剂的使用方法。优选的拮抗剂在治疗、抑制或预防慢性炎性疾病中有效，并且基本上不拮抗肿瘤坏死因子2(TNFR2、P75、P80、CD120b、TNF受体超家族成员1B、TNFRSF1B)。在某些实施方案中，所述拮抗剂是单价的。在其它实施方案中，所述拮抗剂是抗体或其抗原结合片段，例如对TNFR1具有结合特异性的单价抗原结合片段(例如scFv、Fab、Fab'、dAb)。其它优选的拮抗剂是本文所述的能结合TNFR1的配体。配体包含对TNFR1具有结合特异性的免疫球蛋白单可变区或域抗体(single曹iabledomainordomainantibody,dAb)，或所述dAb的合适形式的互补决定区。在某些实施方案中，所述配体是dAb单体，由对TNFR1具有结合特异性的免疫球蛋白单可变区或dAb组成，或者基本上由其组成。在其它实施方案中，所述配体是包含合适形式(例如抗体形式)的dAb(或dAb的CDR)的多肽。在某些实施方案中，所述配体是双特异性配体，它包含能结合TNFR1的第一dAb和具有与第一dAb不同的结合特异性的第二dAb。在一个实例中，双特异性配体包含能结合TNFR1上第一表位的第一dAb以及能结合不同靶上的表位的第二dAb。在另一实例中，第二7dAb能结合血清白蛋白上的表位。在其它实施方案中，所述配体是多特异性配体，它包含对TNFRl具有结合特异性的第一表位结合域和至少一个其它表位结合域，后者具有不同于第一表位结合域的结合特异性。例如，第一表位结合域可以是结合TNFRl的dAb，或者可以是包含能结合TNFRl的dAb的CDR的结构域(例如移植到合适蛋白质支架或骨架上的CDR，例如亲和体(affibody)、SpA支架、LDL受体A类区或EGF区)，或者可以是结合TNFRl的结构域，其中所述结构域选自亲和体、SpA区、LDL受体A类区或EGF区。在某些实施方案中，所述配体或dAb单体具有一个或多个以下特征1)从人TNFRl上解离下来的解离常数(Kd)为50nM20pM，K解离速率常数为5X10—S—11X10—s—1;2)抑制肿瘤坏死因子a(TNFa)与TNFRl结合的IC5。为500nM50pM;3)在标准L929细胞测定中，中和人TNFRl的ND5。为500nM50pM;4)在标准细胞测定中，拮抗TNFRl活性的ND5。《lOOnM，在所述测定中，当浓度《10iiM时，激动TNFRl的活性《5%;5)在小鼠LPS/D-半乳糖胺诱发的脓毒性休克模型中抑制致死率；6)抗聚集作用；7)当在大肠杆菌(E.coli)或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))中表达时，其分泌量至少约为0.5mg/L;8)能可逆地解折叠；9)在选自以下的慢性炎性疾病模型中有效小鼠胶原诱发的关节炎模型、小鼠关节炎AARE模型、小鼠炎性肠病AARE模型、小鼠葡聚糖硫酸钠诱发的炎性肠病模型、小鼠吸烟所致慢性阻塞性肺病模型及合适的灵长类模型(例如灵长类胶原诱发的关节炎模型)；和/或10)在治疗、抑制或预防慢性炎性疾病中有效。在具体的实施方案中，所述配体或dAb单体从人TNFRl上解离下来的解离常数(Kd)为50nM20pM，K解离速率常数为5X10—V"1X10—7s—1;抑制肿瘤坏死因子a(TNFa)与TNFRl结合的IC5。为500nM50pM;在标准L929细胞测定中，中和人TNFRl的ND5。为500nM50pM。在其它具体的实施方案中，所述配体或dAb单体从人TNFRl上解离下来的解离常数(Kd)为50nM20pM，K解离速率常数为5X10-、-1IX10-7s-1;抑制肿瘤坏死因子a(TNFa)与TNFRl结合的IC5。为500nM50pM;在选自以下的慢性炎性疾病模型中有效小鼠胶原诱发的关节炎模型、小鼠关节炎AARE模型、小鼠炎性肠病AARE模型、小鼠葡聚糖硫酸钠诱发的炎性肠病模型、小鼠吸烟所致慢性阻塞性肺病模型及合适的灵长类模型(例如灵长类胶原诱发的关节炎模型)。在其它具体的实施方案中，所述配体或dAb单体从人TNFRl上解离下来的解离常数(Kd)为50nM20pM，K解离速率常数为5X10—、—11X10—s—1;在标准L929细胞测定中，中和人TNFRl的ND5。为500nM50pM;在标准细胞测定中，拮抗TNFRl活性的ND5。《lOOnM，在所述测定中，当浓度《10yM时，激动TNFRl的活性《5%。在更具体的实施方案中，所述配体或dAb单体的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90%同源性TAR2h-12(SEQIDNO:32)、TAR2H3(SEQIDNO:33)、TAR2h-14(SEQIDNO:34)、TAR2H6(SEQIDNO:35)、TAR2H7(SEQIDNO:36)、TAR2h-18(SEQTAR2h_21(SEQTAR2h_24(SEQTAR2h_27(SEQTAR2h-32(SEQIDNO:37)、TAR2h_19(SEQIDNO:38)、TAR2h_20(SEQIDNO:39)、IDNO:40)、TAR2h_22(SEQIDNO:41)、TAR2h_23(SEQIDNO:42)、IDNO:43)、TAR2h_25(SEQIDNO:44)、TAR2h_26(SEQIDNO:45)、IDNO:46)、TAR2h_29(SEQIDNO:47)、TAR2h_30(SEQIDNO:48)、IDNO:49)、TAR2h—33(SEQIDNO:50)、TAR2h_10_l(SEQIDNO:51)、8)，6—qZMV丄、(8S，ON(IIQ3S)S6—qZMV丄、US，ONCOQ3S)Z6-q^IV丄、(9S，ONaiQ3S)T6-q^IV丄、(SS，ONaiQ3S)06-qMV丄、(，S，ONaiQ3S)68—q^IV丄、(SS，ONaiQ3S)88—q^IV丄、(ZS，ONCOQ3S)丄8—q^IV丄、(TS，ONaiQ3S)98-qMV丄、(OS，ONdlQ3S)S8-q^IV丄、(6种ONaiQ3S)，8-qMV丄、(8种:ONaiQ3S)S8-q^IV丄、U种ONaiQ3S)Z8-q^IV丄、(9种ONaiQ3S)T8-q^IV丄、(S计ONaiQ3S)08-戰V丄、(附ONaiQ3S)丄,T-悩V丄、(附ONaiQ3S)，U服、(附:ONaiQ3Sn-ZST-戰V丄、(WONaiQ3S)8-TST-戰V丄、,ONaiQ3S)Z-W-戰V丄、(6S，ONaiQ3S)S—0T—，ST—qzaV丄、(8S，ONaiQ3S)SZ—S8T—qzaV丄、(丄S，ONaiQ3S)Z-8-ST-MW丄、(9^:ONaiQ3ST-8-ST-^W丄、(SS，O顕IQ3S)8-ST-q^IV丄、(M，:ONaiQ3S)HH-戰V丄、(WONaiQ3S)8-in-q^V丄莉'激留％06據《丟阜w「《sfe/鍋奪篤胡qvp土ra目黎封「i^fef鍋奪篤胡斜亩qvp腔斜s彩巡'^奪《躯笼胡^g承[woo]。(WONaiQ3S)ST-戰V丄胜(潘ONaiQ3S)6丄-戰V丄、,ONaiQ3S)8丄-柳V丄、(66S:ON(IIQ3S)U-柳V丄、(86S:ONaiQ3S)9丄-柳V丄、(丄6S:ONaiQ3S)S丄一qZMV丄、(96S:ONdlQ3S)，丄一qZMV丄、(S6S:ON(IIQ3S)S丄一qZMV丄、(，6S:ONaiQ3S)Z丄-MW丄、(S6S:ONaiQ3S)U-q^IV丄、(Z6S:ONaiQ3S)0丄-qMV丄、(T6S:ONaiQ3S)89-q^IV丄、(06S:ONaiQ3S)丄9-q^IV丄、(68S:ONaiQ3S)99-qMV丄、(88S:ONaiQ3S)TS-q^IV丄、U8S:ONdlQ3S)OS-q^IV丄、(98S:ONaiQ3S)8卜qMV丄、(S8S:ONaiQ3S)丄卜q^IV丄、(，8S:ONaiQ3S)S，-q^IV丄、(S8S:ONaiQ3S)，卜q^IV丄、(Z8S:ONaiQ3S)S卜柳V丄、(T8S:ONaiQ3S)ZHZ皿、(08S:ONaiQ3S)T卜悩V丄、(6丄S:ONaiQ3S)0卜戰V丄、(8丄S:ONdlQ3S)6S-戰V丄、U丄S:ONaiQ3S)8S-戰V丄、(9丄S:ONaiQ3S)丄s-q^IV丄、(s丄s:onaiQ3S)9S-q^IV丄、(，丄s:onaiQ3S)ss-q^IV丄、(s丄s:onaiQ3S),S-戰V丄、(86:ONaiQ3S)O丄-OT-戰V丄、(丄6:ONaiQ3S)6S-0T-戰V丄、(96:ONai(S6:ONQ3S)SS-OT-戰V丄、(％:ONaiQ3S)09-0T-戰V丄、(，6:ONaiQ3S)S9-0T-戰V丄aiQ3S)Z9-0T-aiQ3S)69-0T-aiQ3S)，9-0T-aiQ3S)9S-0卜aiq3su卜0T-aiQ3S)0T-aiQ3S)TS-0T-aiQ3S)KH-aiQ3S)6T-0卜aiQ3S)9T-0T-戰V丄、(S9:ONaiQ3S)ST-OT-戰V丄、(，9:ONaiQ3S)W-OT-戰V丄、(S9:ONaiQ3S)n-0T-q^IV丄、(Z9:ONaiQ3S)ZT-0T-q^IV丄、(T9:ONaiQ3S)n-OT-qMV丄、(09:ONaiQ3S)0T-0T-戰V丄、(6S:ONaiQ3S)6-0T-戰V丄、(8S:ONaiQ3S)8-0T-戰V丄、US:ONaiQ3Sn-0T-戰V丄、(9S:ONaiQ3S)9-0T-戰V丄、(SS:ONaiQ3S)S-0T-戰V丄、(,S:ONaiQ3S),-0T-戰V丄、(SS:0顧IQ3S)d皿、防0NaiQ3S)Z-0T-戰V丄-戰v丄、(26:ONaiQ3S)T9--OT-(T6:ONaiQ3S)Z9--OT-(06-戰v丄、(68:ONaiQ3S)89--OT--戰V丄、(88:ONaiQ3S)S9--OT--戰v丄、(98:ONaiQ3S)99--OT--戰V丄、(S8:ONaiQ3S)8S--OT--戰v丄、(附，v丄、(S8:ONaiQ3S)丄S--OT--戰v丄、(28:ONaiQ3S)8，--OT--戰V丄、(T8-戰v丄、(08:ONaiQ3S)S，--OT-(6丄:ONaiQ3S)8S--OT--戰V丄、(8Z-戰v丄、U丄:ONai-OT--戰v丄、(9丄:ONaiQ3S)SS--OT--呢av丄、(s丄-戰v丄、似:ONai-OT--戰V丄、ONaiQ3S)-OT--戰v丄、(U:ONai-OT--戰V丄、ONai-OT--戰v丄、(69:.戰v丄、(89:ONai-OT--戰v丄、U9:ONaiQ3S)丄卜-OT--戰V丄、(99:TAR2h--103(SEQIDNO:467)、TAR2h--104(SEQIDNO:468)、TAR2h--105(SEQIDNO:469)、TAR2h--106(SEQIDNO:470)、TAR2h--107(SEQIDNO:471)、TAR2h--108(SEQIDNO:472)、TAR2h--109(SEQIDNO:473)、TAR2h--IIO(SEQIDNO:474)、TAR2h--111(SEQIDNO:475)、TAR2h--112(SEQIDNO:476)、TAR2h--113(SEQIDNO:477)、TAR2h--114(SEQIDNO:478)、TAR2h--115(SEQIDNO:479)、TAR2h--116(SEQIDNO:480)、TAR2h--117(SEQIDNO:481)、TAR2h--118(SEQIDNO:482)、TAR2h--119(SEQIDNO:483)、TAR2h--120(SEQIDNO:484)、TAR2h--121(SEQIDNO:485)、TAR2h--122(SEQIDNO:486)、TAR2h--123(SEQIDNO:487)、TAR2h--124(SEQIDNO:488)、TAR2h--125(SEQIDNO:489)、TAR2h--126(SEQIDNO:490)、TAR2h--127(SEQIDNO:491)、TAR2h--128(SEQIDNO:492)、TAR2h--129(SEQIDNO:493)、TAR2h--130(SEQIDNO:494)、TAR2h--131(SEQIDNO:495)、TAR2h--132(SEQIDNO:496)、TAR2h--133(SEQIDNO:497)、TAR2h--151(SEQIDNO:498)、TAR2h--152(SEQIDNO:499)、TAR2h--153(SEQIDNO:500)、TAR2h--154(SEQIDNO:501)、TAR2h--159(SEQIDNO:502)、TAR2h--165(SEQIDNO:503)、TAR2h--166(SEQIDNO:504)、TAR2h--168(SEQIDNO:505)、TAR2h--171(SEQIDNO:506)、TAR2h--172(SEQIDNO:507)、TAR2h--173(SEQIDNO:508)、TAR2h--174(SEQIDNO:509)、TAR2h--176(SEQIDNO:510)、TAR2h--178(SEQIDNO:511)、TAR2h--201(SEQIDNO:512)、TAR2h--202(SEQIDNO:513)、TAR2h--203(SEQIDNO:514)、TAR2h--204(SEQIDNO515)、TAR2h-185-25(SEQIDNO:516)、TAR2h-154—10(SEQIDNO:517)和TAR2h-205(SEQIDNO:627)。本发明涉及肿瘤坏死因子l(TNFRl)拮抗剂，所述拮抗剂能结合肿瘤坏死因子l(TNFRl)并抑制通过TNFR1的信号转导，其中所述拮抗剂不抑制TNFa与TNFR1的结合。在某些实施方案中，所述拮抗剂包含第一域抗体(dAb)单体和第二dAb单体，其中所述第一dAb单体能结合选自域1、域2、域3和域4的TNFR1域，所述第二dAb单体能结合选自域1、域2、域3和域4的TNFR1域，其中在标准L929细胞毒性测定或标准HeLaIL-8测定中，当浓度约为1PM时，所述拮抗剂不激动TNFR1。在某些实施方案中，本发明是域抗体(dAb)单体或包含dAb的配体，其能结合肿瘤坏死因子1(TNFR1)并抑制通过TNFRl的信号转导，其中所述dAb单体不抑制TNFa与TNFRl的结合。在其它实施方案中，本发明是域抗体(dAb)单体或包含dAb的配体，其能结合肿瘤坏死因子1(TNFR1)，其中所述dAb能结合TNFR1的域1并与TAR2m-21_23竞争性结合小鼠TNFR1或者与TAR2h-205竞争性结合人TNFRl。在其它实施方案中，本发明是域抗体(dAb)单体或包含dAb的配体，其能结合肿瘤坏死因子1(TNFRl)，其中所述dAb能结合TNFRl的域3并与TAR2h_131_8、TAR2h_15_8、TAR2h-35-4、TAR2h_154_7、TAR2h-154_10或TAR2h_185_25竞争性结合人TNFRl。本发明也涉及抗体或其抗原结合片段，它们对TNFRl具有结合特异性并在治疗、抑制或预防慢性炎性疾病中有效。在某些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是单价抗原结合片段。本发明也提供dAb单体、以及包含dAb单体的配体，其对TNFRl具有结合特异性并能抑制TNFR-l介导的信号传导，但基本上不抑制TNFa与TNFRl的结合。在某些实施方案中，dAb单体抑制由TNFa诱导的细胞表面上TNFRl的交联或成簇。本发明也提供编码本发明配体的分离和/或重组的核酸分子、以及包含所述重组核酸分子的载体。也提供包含本发明重组核酸分子或载体的宿主细胞和用于制备配体的方法。本发明也涉及药物组合物，所述组合物包含本发明的拮抗剂或配体以及药理学上、生理上或药学上可接受的载体。本发明也涉及治疗、抑制或预防疾病或障碍(例如慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病、关节炎、多发性硬化、炎性肠病、慢性阻塞性肺病、肺炎、脓毒性休克)的方法，该方法包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的本发明拮抗剂或配体。本发明也涉及用于治疗或诊断的本发明拮抗剂或配体，以及本发明拮抗剂或配体在制备用于治疗、抑制或预防如上所述的疾病或障碍(例如慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病、关节炎、多发性硬化、炎性肠病、慢性阻塞性肺病、肺炎或脓毒性休克)的药物中的用途。在其它实施方案中，所述疾病可以是囊性纤维化或严重甾体抵抗型哮喘。本发明还涉及用于治疗、抑制或预防本文所述的疾病或障碍(例如慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病、关节炎、多发性硬化、炎性肠病、慢性阻塞性肺病、肺炎或脓毒性休克)的药物组合物，所述组合物包含本发明的拮抗剂或配体作为活性成分。在其它实施方案中，所述疾病可以是囊性纤维化或严重甾体抵抗型哮喘。对TNFR1和配体具有结合特异性的单可变区或域抗体(dAb)以及包含这些单可变区或dAb的配体，具有若干优势。例如，本文所述的对TNFR1具有结合特异性的单可变区或dAb能拮抗TNFR1。因此，可以给予包含本发明抗TNFR1免疫球蛋白单可变区或dAb的治疗药(例如用于治疗、诊断或预防目的)，所述治疗药的副作用(例如免疫抑制)危险因为结合和/或拮抗TNFR2而基本降低。靶向TNFa的治疗药例如ENBREL(entarec印t;ImmunexCorporation)拮抗TNFR1和TNFR2，给予这些药物可产生免疫抑制及相关副作用(例如严重感染)。这些副作用限制了这类药物的使用，尤其是对于需要长期给药的慢性疾病。(KolliasG.禾口KontoyiannisD.，CytokineGrowthFactorRev.，73(4-5):315-321(2002))。相比之下，因为本发明的配体特异性拮抗TNFR1，所以对于慢性疾病而言，它们可以长期给予，其副作用的危险性降低，并能提供治疗炎性病症和慢性炎性病症(包括特征为静止期和活动性炎症期的长期疾病，例如炎性肠病和关节炎)的优势。附图简述图1显示VH/HAS在位置H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98的多样化(DVT或NNK分别编码)，它们在VHHAS的抗原结合位点中。(SEQIDNO:1，核苷酸序列；SEQIDN0:2，氨基酸序列)。Vk序列在位置L50、L53具有多样性。图2示意图显示用于制备单链Fv(scFv)文库的质粒pITl/pIT2的结构，并显示跨越表达控制和克隆区的质粒核苷酸序列(SEQIDNO:3)以及所编码的氨基酸序列(SEQIDNO:4)。该质粒用于制备文库1:种系Vk/DVTVH，文库2:种系Vk/NNKVH，文库3:种系VH/DVTVk，禾口文库4:种系VH/NNKVk，以噬菌体展示/ScFv形式。根据结合蛋白A和蛋白L通用配体，对这些文库进行预筛选，使得大部分克隆和所选文库是功能性的。针对HSA(第一轮)和P-gal(第二轮)或HSAP-gal选择或者针对13-gal(第一轮)和HSA(第二轮)13-galHSA选择，对文库进行选择。扩增序列中这些来自PCR克隆的可溶性scFv。选出一个编码双特异性抗体K8的克隆进行进一步工作。图3显示以下序列的比对Va链(VHdummy(SEQIDN0:5)、K8(SEQIDNO:6)、VH2(SEQIDNO:7)、VH4(SEQIDNO:8)、VHC11(SEQIDNO:9)、VHAlOsd(SEQIDNO:10)、VHAlsd(SEQIDNO:11)、VHA5sd(SEQIDNO:12)、VHC5sd(SEQIDNO:13)、VHCllsd(SEQIDNO:14))和Vk链(Vkdummy(SEQIDNO:16)、K8(SEQIDNO:17)、E5sc(SEQIDNO:18)、C3(SEQIDNO:19))。图4显示K8抗体的结合特性的表征，K8抗体的结合特性经单克隆噬菌体ELISA而表征，发现双特异性K8抗体能结合HSA和13-gal并展示在噬菌体表面，其吸收信号大于1.0。没有检测到与其它蛋白质的交叉反应性。图5显示可溶性scFvELISA的结果，采用已知浓度的K8抗体片段。96孔板用浓度100iigHSA、10iig/mlBSA禾口100iig/mlP—gal禾口1iig/ml蛋白A包丰皮。采用50iig系列稀释的K8scFv，用蛋白L-HRP检测结合抗体片段。ELISA结果证实了K8抗体的双特异性。图6显示克隆K8VK/dummyVH的结合特征，分析采用可溶性scFvELISA。可溶性scFv片段通过IPTGi秀导产生，参见Harrison等，MethodsEnzymol.1996;267:83-109，然后直接测定含有scFv的上清液。按照实施例1所述，进行可溶性scFvELISA，用蛋白L-HRP测定结合scFv。ELISA结果表明，该克隆仍能结合P-gal，而结合BSA则被消除掉。图7显示可变区载体1和2的序列(SEQIDNO:2和SEQIDNO:3)。图8是用于构建VH1/VH2多特异性配体的CH载体图谱。图9是用于构建Vk1/Vk2多特异性配体的Ck载体图谱。图10显示TNF受体测定，与TAR1-5二聚体4、TAR1-5-19二聚体4和TAR1-5-19单体进行比较。图11显示比较TAR1-5二聚体1_6的TNF受体测定。所有二聚体都经FPLC纯化，显示优化二聚体种类的结果。图12显示不同形式的TAR1-519同型二聚体的TNF受体测定具有3U、5U或7U接头的dAb-接头-dAb形式，Fab形式和半胱氨酸铰链接头形式。图13显示文库1的DummyVh序列。(氨基酸序列((SEQIDNO:5;核苷酸序列编码链(SEQIDN0:20)，非编码链(SEQIDNO:21)。VH构架序列基于种系序列DP47_JH4b。NNK随机化(N二A或T或C或G核苷酸；K=G或T核苷酸)结合到文库1中的位置用粗体加上下划线表示。图14显示文库2的DummyVH序列。(氨基酸序列((SEQIDNO:22;核苷酸序列编码链(SEQIDNO:23)，非编码链(SEQIDNO:24)。VH构架序列基于种系序列DP47_JH4b。NNK随机化(N二A或T或C或G核苷酸；K=G或T核苷酸)结合到文库2中的位置用粗体加上下划线表示。图15显示文库3的DummyVk序列。(氨基酸序列((SEQIDN0:16;核苷酸序列编码链(SEQIDN0:25)，非编码链(SEQIDNO:26)。Vk构架序列基于种系序列DPk9-Jk1。NNK随机化(N二A或T或C或G核苷酸；K=G或T核苷酸)结合到文库312中的位置用粗体加上下划线表示。图16显示抗MSAdAbMSA16的核苷酸序列和氨基酸序列(核苷酸序列(SEQIDN0:27)、氨基酸序列(SEQIDNO:28)和MSA26(核苷酸序列(SEQIDNO:29)、氨基酸序列(SEQIDNO:30))。图17显示MSA16和26的抑制biacore。通过抑制biacore对纯化dAbMSA16和MSA26进行分析，得出Kd。简而言之，测定dAb，以求出在用高密度MSA包被的biacoreCM5芯片上达到200RU响应所需的dAb浓度。一旦测出所需dAb浓度，将预期Kd左右浓度范围的MSA抗原与dAb预混合并孵育过夜。然后以30ii1/分钟的高流速，测定各预混物中dAb与MSA包被的biacore芯片的结合。图18显示注射后MSA16的血清水平。测定小鼠的dAbMSA16血清半衰期。给CD1小鼠单次静脉注射约1.5mg/kgMSA16。用2区室模型建模，显示MSA16的tl/2a为0.98小时，tl/2P为36.5小时，AUC为913小时.mg/ml。与HEL4(—种抗鸡卵清溶菌酶dAb)相比，MSA16的半衰期相当长，tl/2a为0.06小时，tl/2P为0.34小时。图19a-19c显示ELISA(图19a)和TNF受体测定(图19b、19c)，表明TNF与包含MSA26Ck和TAR1-5-19CH的Fab样片段的结合被抑制。加入带有Fab样片段的MSA可降低抑制水平。一个用1Pg/mlTNFa包被的ELISA板用双特异性VkCH和VkCkFab样片段来探测，同时也用对照TNFa结合dAb来检测，其浓度为经计算在ELISA中给出相似信号的浓度。在2mg/mlMSA存在或不存在下，采用双特异性dAb和对照dAb来探测ELISA板。双特异性孔的信号下降超过50X，但dAb孔的信号却完全没有下降(参见图19a)。在有或没有MSA的情况下，将相同的双特异性蛋白也进行受体测定，并且也表现出与MSA竞争(参见图19c)。这证明MSA竞争性结合双特异性蛋白和TNFa。图20显示TNF受体测定，表明TNF与二硫键键合的TARl-5_19dAb和MSA16dAb异型二聚体的结合被抑制。加入带有二聚体的MSA，以剂量依赖性方式降低抑制水平。在恒定浓度的异型二聚体(18nM)和系列稀释的MSA和HAS的存在下，进行TNF受体测定(图19(b))。一定浓度范围(最多2mg/ml)的HAS的存在不引起二聚体抑制TNFa的能力下降。然而加入MSA，剂量依赖性地降低了二聚体抑制TNFa的能力(图19a)。这证明MSA和TNFa竞争性结合cys键合的TAR1_5_19、MSA16二聚体。在测定中，MSA和HAS单用对TNF结合水平没有影响。图21A-21M显示一些对人TNFR1具有结合特异性的人免疫球蛋白可变区的氨基酸序列(SEQIDNO:31-98和SEQIDNO:373-401和431)。所示的氨基酸序列是连续的，没有空位；序列中插入了符号，表示互补决定区(CDR)的位置。CDR1的两侧是，CDR2的两侧是，CDR3的两侧是。图22A-22T显示一些编码图21A-21M所示的人免疫球蛋白可变区的核酸的核苷酸序歹lj(SEQIDNO:99-166和SEQIDNO:402-430和432)。所示的核苷酸序列是连续的，没有空位；序列中插入了符号，表示编码CDR的序列的位置。编码CDR1的序列的两侧是，编码CDR2的序列的两侧是，编码CDR3的序列的两侧是。图23A-23B显示一些对小鼠TNFR1具有结合特异性的人免疫球蛋白可变区的氨基酸序列(SEQIDNO:167-179)。所示的氨基酸序列是连续的，没有空位；在某些系列中插入了符号，表示互补决定区(CDR)的位置。CDR1的两侧是，CDR2的两侧是，CDR3的两侦!j是c图24A-24C显示一些编码图23A-23B所示的人免疫球蛋白可变区的核酸的核苷酸序歹lj(SEQIDNO:180-192和626)。SEQIDNO:186禾卩SEQIDNO:626都编码SEQIDNO:173的氨基酸序列。编码CDR1的SEQIDNO:626序列的两侧是，编码CDR2的序列的两侧是，编码CDR3的序列的两侧是。图25A-25L显示编码一些人免疫球蛋白可变区的核苷酸序列以及所编码的人免疫球蛋白可变区的氨基酸序列(SEQIDNO:193-198和200-295)。图26曲线图显示在L929测定中抗TNFR1dAb形式基本上不激动TNFR1。将L929细胞在含有以下成分的培养基中培养不同浓度的抗TNFR1dAb单体(TAR2m-21-23)、市售抗myc抗体(9E10)交联的TAR2m-21_23单体、双特异性抗TNFR1dAb/抗SAdAb(TAR2m-21-233UTAR7m-16)或PEG化抗TNFR1dAb单体(TAR2m-21-2340KPEG)。就抗myc抗体交联TAR2m-21-23单体而论，在培养之前，将dAb和抗体按2:1的比例混合并在室温下预孵育1小时，以模拟体内免疫交联效应。(TAR2m-21-23单体包含myc表位)。将浓度为3，OOOnM的TAR2m-21-23单体与L929细胞一起孵育。TAR2m-21_23单体和抗Myc抗体一起孵育，dAb浓度为3，OOOnM。将浓度为25nM、83.3nM、250nM、833nM和2，500nM的TAR2m-21-233UTAR7m-16与细胞一起孵育。将浓度为158.25nM、527.5nM、1582.5nM、5，275nM和15，825nM的TAR2m-21_2340KPEG与细胞一起孵育。孵育过夜后，评价细胞存活率。结果表明，将L929细胞与10nM、lnM或0.InM能交联和激动TNFR1的市售抗TNFR1IgG抗体(目录号AF-425-PB;R&D系统，Minne即olis，MN)—起孵育，导致以剂量依赖方式增加无活力细胞，因此证明了这些细胞对TNFR1激动剂的敏感性。相比之下，与不同数量的抗TNFR1形式孵育，并不拮抗TNFR1，也不导致培养物中无活力细胞数量的增加，甚至当采用超过1000倍市售抗TNFR1IgG抗体浓度时。图27A-27I显示一些对人TNFR1具有结合特异性的人免疫球蛋白可变区的氨基酸序列(SEQIDNO:433-517和627)。所示的氨基酸序列是连续的，没有空位；序列中插入了符号，表示互补决定区(CDR)的位置。CDR1的两侧是，CDR2的两侧是，CDR3的两{j|I|J:^^二图28A-280显示一些编码图27A-27H所示的人免疫球蛋白可变区的核酸的核苷酸序列(SEQIDNO:518-602和628)。所示的核苷酸序列是连续的，没有空位；序列中插入了符号，表示编码CDR的序列的位置。编码CDR1的序列的两侧是，编码CDR2的序列的两侧是，编码CDR3的序列的两侧是。发明详述在本发明说明书中描述了许多实施方案，撰写方式使得本发明说明书能够既清楚又简明，但是应当理解，在不偏离本发明的情况下，可以对这些实施方案进行各种组合或分开。定义"互补"，当两个免疫球蛋白结构域属于能构成关联对或关联组的结构家族时，或者它们来源于这样的家族并保留了该特征时，则它们是"互补"的。例如，抗体的VH区和、区就是互补的；两个VH区则不互补，两个、区也不互补。在免疫球蛋白超家族其它成员中也可发现互补区，例如T细胞受体的V。和Ve(或Y和S)区。在本发明第二格局的情况14下，非互补区并不协同结合靶分子，而是独立作用于相同或不同分子上的不同靶表位。人工结构域，例如基于蛋白质支架的结构域(它们不结合表位，除非经改造使它们结合表位)，是非互补的。同样，基于(例如)免疫球蛋白结构域和纤连蛋白结构域的两个结构域不是互补的。"免疫球蛋白"，是指这样的多肽家族其保留抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，含有两个P折叠，一般还含有一个保守二硫键。免疫球蛋白超家族成员在体内参与细胞和非细胞相互作用的许多方面，包括在免疫系统(例如抗体、T细胞受体分子等)中具有广泛作用，参与细胞粘附(例如ICAM分子)和胞内信号转导(例如受体分子，例如PDGF受体)。本发明适用于所有具有结合域的免疫球蛋白超家族分子。优选本发明涉及抗体。"结合"，本发明的各可变区结合在一起构成一组结构域；例如，互补区可以结合在一起，例如、区与Vh区結合在一起。非互补区也能结合在一起。结构域可以以大量方式结合在一起，包括各结构域通过共价或非共价方式连接。"domain(域，结构域，区)"，是经过折叠的蛋白质结构，它保留了蛋白质三级结构，但独立于蛋白质的其余部分。通常，各结构域负责蛋白质的分离的功能性，并且在许多情况下可以添加、去除或转移给其它蛋白质，而不丧失该蛋白质和/或该结构域的其余部分的功能。单抗体可变区(singleantibodyvariabledomain)是指经过折叠的多肽区，包含特征为抗体可变区的序列。因此，它包含完整抗体可变区和修饰可变区(例如其中一个或多个环已经被不具有抗体可变区特征的序列所取代)，或者已被截短或包含N-端或C-端延伸的抗体可变区，以及保留全长结构域的至少部分结合活性和特异性的可变区的折叠片段。"库(r印ertoire)"，一级序列不同的多样化变异体(例如多肽变异体)的集合。本发明所用的文库可包括含有至少1000个成员的多肽库。"文库(library)"，术语文库是指异源多肽或核酸的混合物。文库由成员组成，每个成员都具有一个多肽或核酸序列。就这一方面而言，文库(library)和库(r印ertoire)同义。文库成员间的序列差异造成文库的多样性。文库可以呈多肽或核酸的简单混合物的形式，或者可以呈用核酸文库转化的生物体或细胞的形式，例如细菌、病毒、动植物细胞等。优选各个生物体或细胞仅含有一个文库成员或数目有限的文库成员。最好将核酸掺入到表达载体中，以表达该核酸所编码的多肽。因此，在一个优选的方面，文库可以呈宿主生物体群体的形式，每个生物体含有一个或多个拷贝的表达载体，所述载体含有呈核酸形式的文库的一个成员，所述核酸可以表达而产生其相应多肽成员。因此，宿主生物体群体具有编码很大的具有遗传多样性的多肽变异体库的潜力。"闭合构象多特异性配体(closedconformationmulti-specificligand)"用于描述本文所定义的多特异性配体，包含至少两个本文所定义的表位结合域(印itopebindingdomain)。术语"闭合构象"(多特异性配体)是指配体的表位结合域是这样排列的使得通过一个表位结合域的表位结合，与通过另一个表位结合域的表位结合发生竞争。也就是说，关联表位可以通过每个表位结合域单独结合，而不是同时结合。采用本文所述的方法，可得到配体的闭合构象。"抗体"，抗体(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)或其片段(例如Fab、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗体、二硫键连接的scFv、双链抗体)，无论是来自任何物种的天然产生的抗体，还是由重组DNA技术产生的抗体；无论是从下列哪种样品中分离的血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌。"双特异性配体"，是指包含本文所定义的第一免疫球蛋白单可变区和第二免疫球蛋白单可变区的配体，其中可变区能结合两个不同抗原或同一抗原上的两个表位，而它们通常并不与单特异性免疫球蛋白结合。例如，两个表位可以在同一半抗原上，而不是同一表位或足够近以便结合单特异性配体。本发明的双特异性配体由具有不同特异性的可变区组成，但不包括具有相同特异性的相互互补的可变区对。"抗原"，一种能与本发明的配体结合的分子。通常，抗原与抗体配体结合并能在体内产生抗体反应。抗原可以是多肽、蛋白质、核酸或其它分子。一般而言，针对特定抗原的靶特异性而选择本发明双特异性配体。就常规抗体及其片段而言，由可变环(L1、L2、L3和H1、H2、H3)所限定的抗体结合位点能够结合抗原。"表位"，与免疫球蛋白V/、对常规结合的结构单元。表位限定针对抗体的最少结合位点，因此代表了抗体特异性的耙。就单域抗体而言，表位代表了与分离的可变区结合的结构单元。"通用配体(genericligand)"，能结合某一库中所有成员的配体。一般而言，并不通过上述抗原结合位点而结合。非限制性实例包括蛋白A、蛋白L和蛋白G。"选择"，来自筛选或来自达尔文选择过程，其中在结构域与抗原或表位之间或者在抗体与抗原或表位之间发生结合相互作用。因此，在互补可变区存在或不存在下，可以选择结合抗原或表位的第一可变区。"通用构架(universalframework)"，单抗体构架序歹lj，对应于序列中的保守抗体区，根据Kabat(〃SequencesofProteinsofImmunologicalInterest"，USDepartmentofHealthandHumanServices(美国健康和人类服务部))所定义；或者对应于人种系免疫球蛋白库或结构，根据Chothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196:910-917所定义。本发明提供单构架或一组这样的构架的用途，已经发现它们允许事实上任何结合特异性的来源，尽管变异仅在超变区内。"半衰期"，是指配体的血清浓度在体内降至50%所需要的时间，例如因为通过天然机制所致的配体降解和/或清除或螯合。本发明的配体在体内是稳定的，其半衰期因结合抗降解和/或清除或螯合的分子而延长。通常，这类分子是天然存在的蛋白质，它们本身在体内具有较长的半衰期。如果配体的功能活性在体内的持续时间比对延长半衰期的分子不具有特异性的类似配体更长的话，则配体半衰期延长。因此，将对HSA和靶分子具有特异性的配体，与对HAS无特异性且不结合HAS、而结合别的分子的相同配体进行比较。例如，它能结合靶分子上的第二表位。通常，半衰期延长10%、20%、30%、40%、50%以上。半衰期延长范围在2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x以上是可能的。或者，另外，半衰期延长范围高达30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x也是可能的。"均质免疫测定(homogeneousimmunoassay)"，无需分离结合和未结合试剂的步骤就可检测被分析物的免疫测定。"基本相同(或"基本同源")"，第一氨基酸或核苷酸序列与第二氨基酸或核苷酸序列含有足够数量的相同或相当(例如具有相似侧链，例如保守氨基酸取代)氨基酸残基或核苷酸，以使第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似活性。就抗体而言，第二抗体与第16一抗体具有相同的结合特异性并且具有第一抗体亲和力的至少50%。本文所用的术语"低严格性"、"中等严格性"、"高严格性"或"极高严格性条件"描述了核酸杂交和洗涤条件。进行杂交反应的指南可参见CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley和Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，所述文献通过引用全部结合到本文中。该参考文献中描述了含水方法和无水方法，都可以采用。本文所用的具体杂交条件如下(l)低严格性杂交条件在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约45t:，再在0.2XSSC、0.1%SDS中，在至少50°C(对于低严格性条件，洗涤温度可升高至55°C)洗涤两次；(2)中等严格性杂交条件在6XSSC中，在约45t:，再在0.2XSSC、0.1%SDS中，在6(TC洗涤一次或多次；(3)高严格性杂交条件在6XSSC中，在约45t:，再在0.2XSSC、0.1%SDS中在65t:洗涤一次或多次；和优选(4)极高严格性杂交条件是O.5M磷酸钠、7XSDS中，在65。C，再在0.2XSSC、l^SDS中，在65t:洗涤一次或多次。极高严格性条件(4)是优选的条件，除非另有说明，否则应采用该条件。本文所用的术语"闭合构象"(多特异性配体)是指配体的表位结合域彼此连接或结合，任选通过蛋白质支架的方式，使得通过一个表位结合域的表位结合，与通过另一个表位结合域的表位结合发生竞争。也就是说，关联表位可以通过各自的表位结合域单独结合，而不是同时结合。采用本文所述的方法，可得到配体的闭合构象。"开放构象(openconformation)"，是指配体的表位结合域彼此连接或结合，任选通过蛋白质支架的方式，使得通过一个表位结合域的表位结合，与通过另一个表位结合域的表位结合不发生竞争。本文所用的术语"竞争"是指当第二表位与其关联表位结合域结合时，第一表位与其关联表位结合域的结合受到抑制。例如，结合可以是空间上受到抑制，例如通过结合域的物理阻断或通过改变结合域的结构或环境，使其对表位的亲和力(affinity)或亲合力(avidity)降低。术语"免疫球蛋白单可变区"，是指能独立于其它V区(Vregion,Vdomain)而特异性结合抗原或表位的抗体可变区(VH、VHH、、)；然而，本文所用的术语免疫球蛋白单可变区可以与其它可变区(variableregion，variabledomain)呈现例如同型多聚体或异型多聚体的形式，其中其它区(region,domain)不是免疫球蛋白单可变区的抗原结合所必需的(即其中免疫球蛋白单可变区与抗原的结合独立于另外的可变区)。"免疫球蛋白单可变区"不仅包括分离的抗体单可变区多肽，而且包括含有抗体单可变区多肽序列的一个或多个单体的较大多肽。本文所用的术语"域抗体"或"dAb"与本文所用的术语"免疫球蛋白单可变区"多肽同义。本文所用的免疫球蛋白单可变区多肽是指哺乳动物(优选人，但也包括啮齿动物)免疫球蛋白单可变区多肽(例如公开于W000/29004，所述文献的内容通过引用全部结合到本文中)或骆驼科动物(camelid，包括骆驼、骆马及相关种系)vhhdAb。骆驼科动物dAb是免疫球蛋白单可变区多肽，它来自骆驼(camel)、美洲驼(llama)、羊驼(alpaca)、单峰骆驼(dromedary)和栗色骆马(guanaco)等物种，并且包含天然缺乏轻链的重链抗体Vhh。Vhh分子要比IgG分子小约lO倍，作为单一多肽，它们非常稳定，能耐受极端pH和温度条件。本文所用的术语"月中瘤坏死因子受体1(TumorNecrosisFactorRec印tor1，TNFR1)拮抗剂"是指一种能结合TNFR1并能抑制TNFR1的一个或多个功能的药物(例如分子、化合物)。例如，TNFR1拮抗剂可抑制TNFa与TNFR1的结合和/或抑制通过TNFR1介导的信号转导。因此，TNFR1介导的过程和细胞应答(例如在标准L929细胞毒性测定中TNFa诱导的细胞死亡)可以被TNFR1拮抗剂所抑制。TNFR1拮抗剂可以是例如有机小分子、天然产物、蛋白质、肽或肽模拟物(p印tidomimetic)。可以通过筛选本文所述的文库或分子集合(例如ChemicalR印ositoryoftheNationalCancerInstitute)或采用其它合适方法，鉴定TNFR1拮抗剂。优选的TNFR1拮抗剂是本文所述的抗体、抗体的抗原结合片段、配体和dAb单体。与本文所公开的序列相似或同源(例如至少约70%序列同一性)的序列也是本发明的组成部分。在某些实施方案中，氨基酸水平上的序列同一性可以约为80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上。在核酸水平上，序列同一性可以约为70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上。或者，当核酸区段在所选杂交条件(例如极高严格性杂交条件)下与互补链杂交时，则存在基本的同一性。核酸可以存在于完整细胞中，存在于细胞裂解物中，或者呈部分纯化或基本纯化的形式。两序列间"同源性"或"序列同一性"或"相似性"(这些术语在本文可互换使用)的计算如下进行。为了优化比较目的，将序列比对(例如为了比较目的，对于最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中引入空位，非同源序列可以忽略不计)。在一个优选的实施方案中，为了比较目的，所比对的参考序列长度占参考序列总长度的至少30%、优选至少40%、更优选至少50%、甚至更优选至少60%、甚至更优选至少70%、80%、90%、100%。然后，对相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的某个位置被与第二序列相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，那么分子在该位置上是相同的(本文所用的氨基酸或核酸"同源性"等同于氨基酸或核酸"同一性")。两序列间的％同一性是考虑到空位数和各空位长度后的两序列共享的相同位置数的函数，需要引入这些空位以进行两序列的最佳比对。最好采用BLAST算法(2.0版)进行序列比对，参数设定到默认值。BLAST算法在美国政府(".gov")的国立健康研究院("nih")国立生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,",ncbi，，)的万维网("www")上、在"/Blast〃，目录下、在"blastjielp.html"文件内有详细介绍。检索参数定义如下，最好是设定在已定好的默认参数。BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)是blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx程序所采用的启发式检索算法；这些程序都主要归功于采用Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(6):2264-8(参见如上所述的"blast_help.html"文件)的统计学方法的发现，只有很少的强化。BLAST程序专门用于序列相似性检索，例如鉴定查询序列的同源物。这些程序一般不用于基序风格的检索。有关序列数据库相似性检索的基本问题的讨论，参见Altschul等(1994)。在美国国立生物技术信息中心网站可获得的5个BLAST程序来完成以下任务"blastp"比较氨基酸查询序列和蛋白质序列数据库；"blastn"比较核苷酸查询序列和核苷酸序列数据库；"blastx"比较核苷酸查询序列(两条链)的六个框概念翻译产物和蛋白质序列数据库；"tblastn"比较蛋白质查询序列和所有六个读框(两条链)动态翻译的核苷酸序列数据库。"tblastx"比较核苷酸查询序列的六个读框翻译和核苷酸序列数据库的六个读框翻译。BLAST采用下列检索参数HISTOGRAM显示每次检索得分的直方图；默认为yes(是)。(参见BLAST手册中的参数H)。DESCRIPTIONS限制对指定数量报告的匹配序列简短描述的数量；默认限制为100个描述。(参见手册的参数V)。另见EXPECT和CUTOFF。ALIGNMENTS将数据库序列限定在报告高打分区段对(high-scoringsegmentpairs,HSP)的指定数量；默认限制为50。如果数据库序列比这更多，为了满足统计显著性的报告阈值(参见以下EXPECT和CUTOFF)，仅报告归于最大统计显著性的匹配。(参见BLAST手册的参数B)。EXPECT针对数据库序列报告的匹配的统计显著性的阈值；默认值为IO，使得预期仅偶然找到10个匹配，按照Karlin和Altschu1(1990)的随机模型。如果归于匹配的统计显著性大于EXPECT阈值，则将不报告匹配。EXPECT阈值越低，严格性越高，导致报告的匹配机会越少。分数值是可接受的。(参见BLAST手册的参数E)。CUTOFF用于报告高打分区段对的截止(Cutoff)分值。默认值从EXPECT值(参见上文)求出。HSP是为数据库序列而报告的，仅当归于它们的统计显著性至少与具有等于CUTOFF值的分值的孤立HSP—样高时。CUTOFF值越高，严格性越高，导致报告的匹配机会越小。(参见BLAST手册的参数S)。通常，显著性阈值可以用EXPECT更直观地控制。MATRIX指定替代打分矩阵，用于BLASTP、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX。默认矩阵是BL0SUM62(Henikoff和Henikoff，1992，Proc.Natl.Aacad.Sci.USA89(22):10915-9)。有效替代选择包括PAM40、PAM120、PAM250禾PIDENTITY。替代打分矩阵不适用于BLASTN;指定MATRIX在BLASTN请求中的方向返回错误响应。STRAND将TBLASTN检索正好限制在数据库序列的顶链或底链；或将BLASTN、BLASTX或TBLASTX检索正好限制在查询序列的顶链或底链的读框。FILTER掩蔽具有低成分复杂性的查询序列区段(通过Wootton和Federhen(1993)ComputersandChemistry17:149-163的SEG程序来确定)，或由短周期性内部重复序列组成的区段(通过Claverie禾口States,1993，ComputersandChemistry17:191-201的XNU程序来确定，或者对于BLASTN，通过Tatusov和Lipman的DUST程序来确定(参见NCBI的互联网站点))。过滤可从blast输出中消除具有统计学显著性但没有生物学意义的报告(例如针对常见富含酸性、碱性或脯氨酸区的命中)，留下更具生物学意义的查询序列区，适用于针对数据库序列的特定匹配。过滤程序中发现的低复杂性序列在核苷酸序列中用字母"N"替代(例如"N"重复13次)，在蛋白质序列中用字母"X"替代(例如"X"重复9次)。过滤仅适用于查询序列(或其翻译产物)，而不适于数据库序列。对于BLASTN，默认过滤是DUST，而对于其它程序是SEG。当用于SWISS-PROT中的序列时，SEG、XNU或这两者完全没有掩蔽什么，这并非是不常见的，所以不应当希望过滤总会有结果。此外，在某些情况下，序列完全被掩蔽，这表明任何针对未过滤查询序列而报告的匹配的统计学显著性应当受到怀疑。NCBI-giCausesNCBIgi标识符在输出中显示，除了检索号和/或位置名称之外。最优选采用上述NCBI网址的"/BLAST"目录下所提供的简单BLAST检索算法，进行序列比较。除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语都具有本领域(例如细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学)普通技术人员公知的相同含义。标准技术用于分子、遗传和生化方法(一般参见Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2片反(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.禾PAusubel等，ShortProtocolsinMolecularBiology(1999)第4版，JohnWiley&Sons,Inc.，所述文献通过引用结合到本文中)和化学方法。TNFR1是跨膜受体，它含有胞外区和胞内区，其中胞外区能结合配体，胞内区缺乏内在信号转导活性、但能结合信号转导分子。具有结合TNF的TNFR1复合物含有3条TNFR1链和3条TNF链。(Ba皿er等，Cell,73(3)431-445(1993))。TNF配体以三聚体形式存在，它与3条TNFR1链结合(出处同上)。这3条TNFR1链在受体-配体复合物中紧密簇集在一起，这种簇集是TNFR1介导的信号转导的先决条件。事实上，在TNF不存在时，结合TNFR1的多价物质(例如抗TNFR1抗体)可诱导TNFR1成簇和信号转导，并且通常用作TNFR1激动剂。(参见例如Belka等，EMB0，14(6):1156-1165(1995);Mandik-Nayak等，J.Immunol.，167:1920-1928(2001))。因此，与TNFR1结合的多价物质通常并非有效的TNFR1拮抗剂，甚至当它们阻断TNFa与TNFRl的结合时。TNFR1的胞外区包含13个氨基酸的氨基端区段(SEQIDNO:603(人)的氨基酸1-13;SEQIDN0:604(小鼠)的氨基酸1-13)、域1(SEQIDN0:603(人)的氨基酸14-53;SEQIDN0:604(小鼠)的氨基酸14-53)、域2(SEQIDN0:603(人)的氨基酸54-97;SEQIDN0:604(小鼠)的氨基酸54-97)、域3(SEQIDN0:603(人)的氨基酸98-138;SEQEDNO:604(小鼠)的氨基酸98-138)和域4(SEQIDNO:603(人)的氨基酸139-167;SEQIDN0:604(小鼠)的氨基酸139-167)，其后接着是膜近端区(SEQIDN0:603(人)的氨基酸168-182;SEQIDNO:604(小鼠)的氨基酸168-183)。(参见Banner等，Cell73(3)431-445(1993)和Loetscher等，Cell61(2)351—359(1990))。域2和域3接触结合配体(TNFP、TNFa)。(Banner等，Cell,73(3)431-445(1993))。TNFR1胞外区也含有一个称为前配体结合装配区或PLAD区的区(SEQIDN0:603(人)的氨基酸1_53;SEQIDNO:604(小鼠)的氨基酸1-53)(美国政府，WO01/58953;Deng等，NatureMedicine,doi:10.1038/nml304(2005))。TNFR1通过蛋白水解等过程在体内从细胞表面脱落，产生可溶性形式的TNFRl，所述过程包括TNFR1在域4或在膜近端区(SEQIDNO:603的氨基酸168-182;SEQIDNO:604的氨基酸168-183)的蛋白水解。可溶性TNFRl保留了结合TNFa的能力，因此起到TNFa活性的内源抑制剂的作用。本发明涉及抗体或其抗原结合片段(例如dAb)或配体，其结合TNFRl，但不与TNF竞争性结合TNFR1。例如，抗体或其抗原结合片段(例如dAb)或配体能结合TNFR1的域1或TNFRl的域4。这样的抗体或其抗原结合片段(例如dAb)或配体具有作为诊断试剂的优势，因此可用于结合和检测、量化或测定样品中的TNFRl，但是不与样品中的TNF竞争性结合TNFR1。因此，可以准确测定样品中是否存在TNFRl以及样品中有多少TNFR1。在某些实施方案中，结合TNFRl、但不与TNF竞争性结合TNFRl的抗体或其抗原结合片段(例如dAb)或配体，就是本文所述的TNFRl拮抗剂。本发明也涉及一种诊断试剂盒和使用说明书(例如测定样品中TNFRl的存在和/或数量)，用于确定样品中是否存在TNFRl以及样品中有多少TNFRl，所述试剂盒包括结合TNFRl、但不与TNF竞争性结合TNFRl的抗体或其抗原结合片段(例如dAb)或配体。在某些实施方案中，试剂盒还包括一种或多种辅助试剂，例如合适的缓冲剂或合适的检测试剂(例如可检测标记抗体或其抗原结合片段，其结合能结合TNFR1、但不与TNF竞争性结合TNFRl的抗体或其抗原结合片段(例如dAb)或配体)。本发明也涉及一种装置，所述装置包括固体表面，其中把能结合TNFR1、但不与TNF竞争性结合TNFRl的抗体或其抗原结合片段(例如dAb)或配体固定在所述固体表面上，使得固定化抗体或其抗原结合片段(例如dAb)或配体能结合TNTR1。可以使用抗体或其抗原结合片段(例如dAb)或配体可固定在其上的任何合适固体表面，例如玻璃、塑料、碳水化合物(例如琼脂糖珠)。如有必要，支持物可含有所需官能团或者经过修饰以含有所需官能团，以便固定抗体或其抗原结合片段(例如dAb)或配体。装置和/或支持物可具有任何合适形状，例如片、小杆、带、板、玻片、小珠、小丸、盘、凝胶、试管、球、芯片、板或皿等。在某些实施方案中，装置是浸棒(dipstick)。本发明涉及对肿瘤坏死因子受体1(TNFRl;p55;CD120a)具有结合特异性的TNFRl拮抗剂(例如本文所述的配体)。优选本发明的拮抗剂对肿瘤坏死因子2(TNFR2)不具有结合特异性，或者基本上不拮抗TNFR2。在标准细胞测定中，当拮抗剂(lnM、10nM、100nM、liiM、10iiM或100iiM)导致不超过约5%的针对由TNFa(100pg/ml)诱导的TNFR2介导的活性的抑制时，TNFR1拮抗剂基本上不拮抗TNFR2。特别优选的TNFR1拮抗剂是用于治疗慢性炎性疾病的有效治疗药物(是有效的，具有疗效)。例如，在某些实施方案中，TNFR1拮抗剂在例如以下的慢性炎性疾病模型中有效小鼠胶原诱发的关节炎模型、小鼠关节炎AARE模型、小鼠葡聚糖硫酸钠诱发的炎性肠病模型、小鼠炎性肠病AARE模型、小鼠吸烟所致慢性阻塞性肺病模型或合适的灵长类模型(例如灵长类胶原诱发的关节炎)。TNFR1拮抗剂可以是单价或多价的。在某些实施方案中，所述拮抗剂是单价的，含有一个与TNFR1相互作用的结合位点。单价拮抗剂能结合一个TNFR1，而且不诱导细胞表面TNFR1的交联或成簇，这样的交联或成簇能导致受体活化和信号转导。在具体的实施方案中，TNFR1单价拮抗剂结合TNFR1的域1。在更具体的实施方案中，TNFR1单价拮抗剂结合TNFR1的域1，并与TAR2m-21-23竞争性结合小鼠TNFR1或与TAR2h-205竞争性结合人TNFR1。在其它实施方案中，TNFR1拮抗剂是多价的。TNFR1多价拮抗剂可含有两个或更多个拷贝的针对TNFR1的特定结合位点或者含有两个或更多个能结合TNFR1的不同结合位点。例如，本文所述的TNFR1拮抗剂可以是二聚体、三聚体或多聚体，其包含两个或更多个拷贝的能结合TNFR1的特定dAb或者两个或更多个能结合TNFR1的不同dAb。在标准细胞测定中，优选TNFR1多价拮抗剂基本上不激动TNFR1(起到TNFR1激动剂的作用)(即在测21定中，当浓度为lnM、10nM、100nM、1iiM、10iiM、100iiM、1000iiM或5，000iiM时，导致不超过约5%的由TNFa(lOOpg/ml)诱导的TNPR1介导的活性)。在某些实施方案中，TNFRl多价拮抗剂含有两个或更多个针对TNFRl的所需表位或结构域的结合位点。例如，TNFRl多价拮抗剂可包含两个或更多个能结合TNFRl的域1中同一表位的结合位点。在其它实施方案中，TNFRl多价拮抗剂含有两个或更多个能结合TNFRl的不同表位或结构域的结合位点。在一个实例中，TNFRl多价拮抗剂包含第一结合位点和第二结合位点，其中第一结合位点能结合TNFRl的域1中的第一表位，第二结合位点能结合域1中不同的第二表位。在其它实例中，TNFRl多价拮抗剂可包含能结合TNFRl的两个或更多个所需表位或结构域的结合位点。例如，TNFRl多价拮抗剂可包含针对以下TNFRl的结构域的结合位点域1和域2、域1和域3、域1和域4、域2和域3、域2和域4、或域3和域4。例如，TNFRl多价拮抗剂可包含针对TNFRl的域1、域2和域3的结合位点，针对TNFRl的域1、域2和域4的结合位点，或针对TNFRl的域1、域3和域4的结合位点。在某些实施方案中，TNFR1拮抗剂是双特异性配体，其包含能结合TNFR1的域1的dAb以及能结合TNFR1的域3的dAb。在本文所述的标准L929细胞毒性测定或标准HeLaIL-8测定中，优选所述多价拮抗剂当浓度为约lnM、或约10nM、或约100nM、或约1yM、或约10yM时，不激动TNFR1。—些TNFR1拮抗剂能结合TNFR1并抑制TNFa与TNFRl的结合。在某些实施方案中，这样的TNFRl拮抗剂能结合TNFRl的域2和/或域3。在具体的实施方案中，所述拮抗剂与TAR2h-10-27、TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-10或TAR2h-185-25竞争性结合TNFR1。其它配体(其中优选的实施方案是TNFR1拮抗剂)不抑制TNFa与TNFR1的结合。这类配体(和拮抗剂)具有作为诊断试剂的优势，因为它们可用于结合和检测、量化或测定样品中的TNFR1，但是不与样品中的TNF竞争性结合TNFR1。因此，可以准确测定样品中是否存在TNFR1以及有多少TNFR1。—些TNFRl拮抗剂不抑制TNFa与TNFR1的结合，但却抑制通过TNFR1介导的信号转导。例如，TNFR1拮抗剂可抑制TNFa诱导的TNFR1成簇，而这是通过TNFR1的信号转导之前的步骤。这类拮抗剂具有若干优势。例如，在这样的拮抗剂存在下，TNFa能结合在细胞表面表达的并离开细胞环境的TNFR1，但是不会激活TNFR1介导的信号转导。因此，TNFR1信号诱导的额外TNFa和其它炎症介质的产生将会被抑制。同样，能结合TNFR1并抑制通过TNFR1介导的信号转导、但却不抑制TNFa与TNFR1结合的TNFR1拮抗剂，将不抑制内源产生的可溶性TNFR1的TNFa的结合及抑制活性。因此，将这样的拮抗剂给予有需要的哺乳动物，可补充内源调节途径，所述途径在体内抑制TNFa的活性和TNFR1的活性。本发明也涉及配体，所述配体(i)能结合TNFR1(例如在域1)，(ii)不拮抗TNFR1介导的信号转导的活化，和(iii)不抑制TNFa与TNFR1的结合。这类配体能结合可溶性TNFR1，但不阻止可溶性受体结合TNFa，因此将这样的拮抗剂给予有需要的哺乳动物，可补充内源调节途径，所述途径在体内通过延长血清中可溶性受体的半衰期而抑制TNFa的活性。这些优势尤其与这样的配体有关所述配体被精制成为具有较大流体动力学尺寸(hydrodynamicsize)，例如通过连接PEG基团、血清白蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或者至少其转铁蛋白结合部分、抗体Fc区，或者通过与抗体区缀合。例如，可以把具有以下特性的物质(例如多肽)精制成为具有较大的抗体的抗原结合片段或成为抗体(例如精制成为Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、IgG、SCFv):(i)能结合TNFR1(即在域1)，(ii)不拮抗TNFR1介导的信号转导的活化，和(iii)不抑制TNFa与TNFR1(例如dAb单体)的结合。也可以通过将TNFR1结合剂与能结合本文所述的能延长体内半衰期的抗原或表位的结合域(例如抗体或抗体片段)缀合或连接，从而增加配体的流体动力学尺寸及其血清半衰期(参见附录l)。例如，TNFRl结合剂(例如多肽)可以与抗血清白蛋白或抗新生动物Fc受体抗体或抗体片段(例如抗SA或抗新生动物Fc受体dAb、Fab、Fab'或scFv)或与抗SA亲和体或抗新生动物Fc受体亲和体缀合或连接。用于本发明的TNFR1结合配体的合适白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变异体的实例参见W02005/077042A2，所述文献通过引用全部结合到本文中。具体地讲，下面的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变异体可用于本发明SEQIDNO:1(公开于WO2005/077042A2,该序列通过引用明确地结合到本说明书中)；'白蛋白片段或变异体，其包含WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸1-387或由其组成；白蛋白或其片段或变异体，其包含选自以下的氨基酸序列(a)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸54-61;(b)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸76-89;(c)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸92-100;(d)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸170-176;(e)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸247-252;(f)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸266-277;(g)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸280-288;(h)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸362-368;(i)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸439-447;(j)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸462-475;(k)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸478-486;禾口(l)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸560-566。用于本发明的TNFR1结合配体的合适白蛋白、其片段和变异体的其它实例参见WO03/076567A2,所述文献通过引用全部结合到本文中。具体地讲，下面的白蛋白、片段或变异体可用于本发明"人血清白蛋白，参见WO03/076567A2，例如在图3中(该序列信息通过引用明确地结合到本说明书中)；人血清白蛋白(HA)，它由585个氨基酸的单一非糖基化多肽链组成，分子量为66，500(参见Meloun等，FEBSLetters58:136(1975);Behrens等，Fed.Proc.34:591(1975);Lawn等，NucleicAcidsResearch9:6102-6114(1981);Minghetti等，J.Biol.Chem.261:6747(1986));白蛋白多态变异体或其类似物或片段，参见Weitkamp等，Ann.Hum.Genet.37:219(1973);白蛋白片段或变异体，参见EP322094，例如HA(1-373)、HA(1-388)、HA(1-389)、HA(1-369)和HA(1-419)以及1-369和1-419间的片段;，白蛋白片段或变异体，参见EP399666，例如HA(1-177)和HA(1-200)和HA(1-X)之间的片段，其中X为178-199间的任意数字。当一个或多个半衰期延长部分(例如白蛋白、转铁蛋白及其片段和类似物)用于本发明的TNFRl结合配体时，可以用任何合适方法将其缀合，例如通过与TNFRl结合部分(例如抗TNFRldAb或抗体片段)直接融合，例如通过使用编码融合蛋白的单个核苷酸构建体，其中融合蛋白编码成为单一多肽链和半衰期延长部分(位于TNFRl结合部分的N端或C端)。或者，可以通过使用各部分间的肽接头(例如WO03/076567A2或WO2004/003019所述的肽接头(这些接头的全部公开内容通过引用结合到本说明书中，以提供用于本发明的实例))，来完成缀合反应。在更具体的实施方案中，能结合TNFRl并抑制通过TNFRl介导的信号转导、但却不抑制TNFa与TNFRl结合的TNFRl拮抗剂，能结合TNFRl的域1或TNFRl的域4。在某些实施方案中，这种TNFRl拮抗剂是能结合TNFRl的域1或TNFRl的域4的dAb单体或配体。在一个具体实施方案中，TNFRl拮抗剂(例如dAb单体或配体)能结合TNFRl的域l，并且一旦结合TNFa后能抑制通过TNFRl介导的信号转导。这样的拮抗剂可抑制通过TNFRl的信号转导，但不抑制TNFa与TNFRl的结合和/或TNFRl的脱落，以产生可溶性TNFR1。因此，将这样的拮抗剂给予有需要的哺乳动物，可补充内源调节途径，所述途径在体内抑制TNFa的活性和TNFRl的活性。其它TNFRl拮抗剂能结合TNFR1，但不结合域4。这类拮抗剂可抑制TNFRl的功能，但不抑制可溶性TNFR1的脱落。因此，将这样的拮抗剂给予有需要的哺乳动物，可补充内源调节途径，所述途径在体内抑制TNFa的活性和TNFRl的活性。在某些实施方案中，所述拮抗剂(例如化合物，新型化学实体、dAb单体、配体)能结合TNFRl的域1并与TAR2m-21-23竞争性结合小鼠TNFRl或与TAR2h-205竞争性结合人TNFR1。在其它实施方案中，所述拮抗剂(例如化合物，新型化学实体、dAb单体、配体)能结合TNFRl的域2或域4。在其它实施方案中，所述拮抗剂(例如化合物、新型化学实体、dAb单体、配体)能结合TNFRl的域3并与TAR2h_131_8、TAR2h_15_8、TAR2h_35_4、TAR2h-154-7、TAR2h-154_10、TAR2h_185_25或TAR2h-27-10竞争性结合TNFRl(例如人和/或小鼠TNFRl)。—些配体(在优选的实施方案中为TNFRl拮抗剂)能结合人TNFRl和小鼠TNFRl。这类配体(例如拮抗剂、dAb单体)提供了这样的优势可用相同配体进行临床前和临床研究，而不需要用合适替代配体来进行临床前研究。在其它实施方案中，所述拮抗剂或配体是对TNFRl或其抗原结合片段(例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段或Fv片段(例如scFV))具有结合特异性的抗体。在其它实施方案中，所述拮抗剂或配体是单价的，例如dAb或抗体的单价抗原结合片段，例如Fab片段、Fab'片段或Fv片段。在本说明书中所述的本发明的其它实施方案中，在本发明的拮抗剂或配体中不使用"dAb"，是考虑技术人员可使用包含能结合TNFRl的dAb的CDR的结构域(例如移植到合适蛋白质支架或骨架上的CDR，例如亲和体、SpA支架、LDL受体A类区或EGF区)或者可以是包含针对TNFRl的结合位点的蛋白质结构域，例如其中所述结构域选自亲和体、SpA区、LDL受体A类区或EGF区。因此，总的来说，本发明的公开内容应视为提供了拮抗剂、配体以及使用所述结构域替代dAb的方法。优选的TNFRl拮抗剂是本文所述的配体。配体包含对TNFRl具有结合特异性的免疫球蛋白单可变区或域抗体(dAb)或所述dAb的合适形式的互补决定区。配体可以是由这样的dAb组成或基本上由这样的dAb组成的多肽。配体也可以是包含合适形式(例如抗体形式(例如IgG样形式、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2))的dAb(或dAb的CDR)的多肽，包含能结合TNFR1的dAb以及能结合另一靶蛋白、抗原或表位(例如血清白蛋白)的第二dAb的双特异性配体，或者本文所述的多特异性配体。TNFR1拮抗剂，包括本发明任何方面的配体、以及用于构建所述配体的dAb单体，都可有利地从它们的关联靶上解离下来，根据表面等离子共振的测定，&为300nM5pM(即3X10—7M5X10—12M)、优选50nM20pM、或5nM200pM或InM100pM，1X10—7M以下、1X10—8M以下、1X10—9M以下、1X10—1QM以下、1X10—"M以下；和/或K解离速率常数为5X10—V1X10—7s—1、优选1X10—2s—11X10—6s—1、或5X10—3s—11X10—S—1、或5X10—S—1以下、或1X10—2s—1以下、或1X10—3s—1以下、或1X10—4s—1以下、或1X10—5s—1以下、或1X10—6s—1以下。Kd速率常数定义为K解离/K缔合。在其它实施方案中，所述拮抗剂结合TNFR1并抑制TNFR1的一个或多个功能(例如受体成簇、受体信号传导或TNFa与TNFR1的结合)，而且也结合TNF受体超家族的另一成员。优选该类拮抗剂也抑制TNF受体超家族其它成员的功能(例如成员簇集、信号转导或该成员与其关联配体的结合)。TNF受体超家族是本领域公知的一组蛋白质，它们包括TNFR1(p55、CD120a、p60、TNF受体超家族成员1A、TNFRSF1A)、TNFR2(p75、p80、CD120b、TNF受体超家族成员1B、TNFRSF1B)、表位结合多肽(例如常规抗体)更经济。例如，用于体内应用的抗原或表位结合多肽的制备通常包括除去聚集多肽的过程(例如凝胶过滤)。如果不能除去这样的聚集物，会使制剂不适用于体内应用，例如，因为希望起到拮抗剂作用的抗原结合多肽如果聚集的话，可通过诱导靶抗原的交联或成簇而起到激动剂的作用。聚集蛋白也可通过在接受它们的患者体内诱导免疫应答而降低治疗性多肽的功效。相比之下，可以制备本发明的抗聚集配体或dAb单体，用于体内应用，而无需包括除去聚集物的过程，并且可用于体内应用，而没有聚集多肽所引起的上述缺点。在某些实施方案中，所述配体或dAb单体当加热到温度(Ts)和冷却到温度(Tc)时能可逆地解折叠，其中Ts高于dAb的解链温度(Tm)，而Tc低于dAb的解链温度。例如，dAb单体当加热到8(TC和冷却到约室温时能可逆地解折叠。可逆地解折叠的多肽在解折叠时会丧失功能，而一旦重折叠后又会恢复功能。这类多肽不同于在解折叠时聚集或不适当重折叠(即不能恢复功能)的多肽(错折叠的多肽)。可以采用任何合适方法，通过直接或间接测定多肽结构来评价多肽解折叠和重折叠。例如，可以通过圆二色性(CD)(例如远UVCD、近UVCD)、荧光(例如色氨酸侧链的荧光)、对蛋白酶解的敏感性、核磁共振(NMR)，或者通过检测或测定依赖于合适折叠的多肽功能(例如与靶配体的结合、与通用配体的结合)，来测定多肽结构。在一个实例中，采用功能测定，评价多肽解折叠，其中结合功能(例如结合通用配体和/或靶配体，结合底物)的丧失，表明该多肽是解折叠的。可以采用解折叠或变性曲线，测定配体或dAb单体的解折叠和重折叠的程度。可通过纵坐标为温度与横坐标为折叠多肽相对浓度作图，绘制解折叠曲线。可以采用任何合适的方法(例如CD、荧光、结合测定)，直接或间接测定折叠配体或dAb单体的相对浓度。例如，可以制备配体或dAb单体溶液，然后通过CD测定溶液的椭圆率。CD18(TNFRSF3，LTBR，TNFR2-RP，TNFR-RP，TNFCR，TNF-R-I11)，0X40(TNFRSF4，ACT35，TXGP1U，CD40(TNFRSF5，p50，Bp50)，Fas(CD95，TNFRSF6，AP0-1，APTI)，DcR3(T腦SF6B)，CD27(T訓SF7，Tp55，S152)，CD30(T訓SF8，Ki_l，D1S166E)，CD137(TNFRSF9，4-1BB，ILA)，TRAILR-1(TNFRSF10A，DR4，Apo2)，TRAIL-R2(TNFRSF10B，DR5，KILLER，TRICK2A，TRICKB)，TRAILR3(TNFRSF10C，DcRl，LIT，TRID)，TRAILR4(TNFRSFIOD，DcR2，TRU誦)，RANK(TNFRSF11A)，OPG(TNFRSF11B，OCIF，TR1)，DR3(TNFRSF12，T應P，WSL-1，LARD，WSL-LR，DDR3，TR3，AP0-3)，DR3"TNFRSF12U，TAC1(TNFRSF13B)，BAFFR(TNFRSF13C)，HVEM(TNFRSF14，ATAR，TR2，LIGHTR，HVEA)，NGFR(TNFRSF16)，BCMA(TNFRSF17，BCM)，AITR(TNFRSF18，GITR)，TNFRSF19，FLJ14993(TNFRSF19L，RELT)，DR6(TNFRSF21)，SOBa(TNFRSF22，Tnfrh2，2810028K06Rik)，mSOB(THFRSF23，Tnfrhl)在某些实施方案中，所述拮抗剂包含能结合TNFR1并抑制TNFR1功能的第一dAb以及能结合TNF受体超家族另一成员的第二dAb，所述另一成员例如以上列举的TNFR2(CD120b)、0X40、CD40、Fas(CD95)、TRAILR-1、TRAILR-2、TAC1、BCMA等。在另一个实施方案中，所述拮抗剂包含能结合TNFR1并抑制TNFR1功能、并且也能结合TNF受体超家族另一成员的dAb单体(所述功能例如受体成簇、受体信号传导或TNFa与TNFR1的结合)，所述另一成员例如以上列举的TNFR2(CD120b)、0X40、CD40、Fas(CD95)、TRAILR-1、TRAILR-2、TAC1、BCMA等。与TNFR1结合的配体和dAb单体本发明提供包含抗TNFR1dAb单体的配体(例如包含这种dAb的双特异性配体)，根据表面等离子共振的测定，所述单体与TNF受体I结合的Kd为300nM5pM(即3X10—7M5X10—12M)、优选50nM20pM、更优选5nM200pM、最优选lnM100pM，例如1X10—7M以下、优选1X10—8M以下、更优选1X10—9M以下、有利的是1X10—1QM以下、最优选1X10—"M以下；和/或K解离速率常数为5X10—S—11X10—7s—'、优选1X10—2s—11X10—6s入更优选5X10—3s—11X10—5s—1例如5X10—S—1以下、优选1X10—2s—1以下、有利的是1X10—3s—1以下、更优选1X10—4s—1以下、还更优选1X10—5s—1以下、最优选1X10—6s—1以下。优选配体或dAb单体抑制TNFa与TNFa受体1(p55受体)的结合，其抑制浓度50(IC5。)为500nM50pM、优选100nM50pM、更优选10nM100pM、有利的是lnM100pM;例如50nM以下、优选5nM以下、更优选500pM以下、有利的是200pM以下、最优选100pM以下。优选TNF受体1的靶是人TNFa。优选配体或dAb结合人TNFR1并抑制人TNFa与人TNFR1的结合，或者抑制因响应TNFa结合而通过TNFR1的信号传导。例如，在某些实施方案中，所述配体或dAb单体能结合TNFRl并抑制TNFRl介导的信号传导，但基本上不抑制TNFa与TNFR1的结合。在某些实施方案中，所述配体或dAb单体抑制由TNFa诱导的细胞表面上TNFR1的交联或成簇。这类配体或dAb(例如本文所述的TAR2m-21-23)是有利的，因为它们可拮抗细胞表面的TNFR1，但基本上不降低内源可溶性TNFR1的抑制活性。例如，在受体结合测定中，所述配体或dAb能结合TNFR1，但抑制TNFa与TNFR1的结合不超过约10%、不超过约5%、不超过约4%、不超过约3%、不超过约2%或不超过约1%。并且，在这些实施方案中，在标准细胞测定中，所述配体或dAb抑制TNFa诱导的TNFR1交联和/或TNFR1介导的信号转导至少26约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%。如本文所述，配体可以是单价的(例如dAb单体)或多价的(例如双特异性、多特异性)。在具体的实施方案中，所述配体是能结合TNFR1的域l的dAb单体。相对于其它结合形式(例如单克隆抗体)来说，能结合TNFR1的域1的域抗体单体具有小足迹(smallfootprint)。因此，这样的dAb单体可选择性阻断域l，但不干扰TNFR1其它结构域的功能。例如，能结合TNFRI的域1的dAb单体可拮抗TNFR1，但不抑制TNFa与TNPR1的结合或TNFR1的脱落。在更具体的实施方案中，所述配体是能结合TNFR1的域1并与TAR2m-21-23竞争性结合小鼠TNFR1或与TAR2h-205竞争性结合人TNFR1的dAb单体。在其它实施方案中，所述配体是多价的，包含两个或更多个能结合TNFR1的dAb单体。多价配体可含有两个或更多个拷贝的能结合TNFR1的特定dAb，或者含有两个或更多个能结合TNFR1的dAb。例如，本文所述的配体可以是二聚体、三聚体或多聚体，其包含两个或更多个拷贝的能结合TNFR1的特定dAb，或者两个或更多个能结合TNFRl的不同dAb。在一些实例种，配体是同型二聚体或同型三聚体，它们分别包含两个或三个拷贝的能结合TNFR1的特定dAb。在标准细胞测定中，优选的多价配体基本上不激动TNFR1(作为TNFR1激动剂)(即在测定中，当浓度为lnM、10nM、100nM、1iiM、10iiM、100iiM、1000iiM或5，000ii匪时，导致不超过约5%的由TNFa(100pg/ml)诱导的TNFR1介导的活性)。在某些实施方案中，多价配体含有两个或更多个能结合TNFR1所需表位或结构域的dAb。例如，多价配体可包含两个或更多个拷贝的能结合TNFR1的域1所需表位的dAb。在其它实施方案中，多价配体含有两个或更多个能结合TNFR1不同表位或结构域的dAb。在一个实例中，多价配体包含第一dAb和第二dAb，其中第一dAb能结合TNFR1的域1中的第一表位，第二dAb能结合TNFR1的域1中不同的第二表位。在其它实例中，多价配体包含能结合TNFR1的两个或更多个所需表位或结构域的dAb。例如，多价配体可包含结合以下TNFR1的结构域的dAb:域1和域2、域1和域3、域1和域4、域2和域3、域2和域4、或域3和域4。在某些实施方案中，多价配体是双特异性配体，所述配体包含能结合TNFR1的域1的dAb，以及能结合TNFR1的域3的dAb。该类配体可以高亲和力结合TNFR1，并且比起其它配体形式(例如dAb单体)来说，对于在其表面高密度过量表达TNFR1或表达TNFR1的细胞的结合选择性更高。在其它具体的实施方案中，多价配体包含两个或更多个能结合TNFR1的域l的dAb或者两个或更多个拷贝的特定dAb。该类多价配体可以低亲和力结合TNFR1单体，但却以高亲合力结合受体多聚体(例如在受体配体复合物中所观察到的三聚体)。因此，可以将该形式的配体给予有效靶向受体，所述受体已彼此成簇或缔合和/或与TNFR1介导的信号转导所需的配体(例如TNFa)簇集或缔合。—些配体或dAb单体结合TNFR1并抑制TNFa与TNFR1的结合。在某些实施方案中，这样的配体或dAb单体能结合TNFR1的域2和/或域3。在具体的实施方案中，所述配体或dAb单体能结合TNFR1的域3。在更具体的实施方案中，所述配体或dAb单体能结合TNFR1的域3并与TAR2h-10-27、TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-10或TAR2h_185_25竞争性结合TNFRl。其它配体或dAb单体不抑制TNFa与TNFRl的结合。这类拮抗剂具有作为诊断试剂的优势，因为它们可用于结合和检测、量化或测定样品中的TNFRl，但是不与样品中的TNF竞争性结合TNFRl。因此，可以准确测定样品中是否存在TNFRl以及有多少TNFRl。—些配体和dAb单体不抑制TNFa与TNFRl的结合，但却抑制通过TNFRl介导的信号转导。例如，配体或dAb单体可抑制TNFa诱导的TNFRl成簇，而这是在通过TNFRl的信号转导之前的步骤。这类配体或dAb单体具有若干优势，正如本文所讨论的有关具有这些特性的拮抗剂。在具体的实施方案中，该类配体或dAb单体能结合TNFRl的域1或TNFRl的域4。在某些实施方案中，所述配体是能结合TNFRl的域1或TNFRl的域4的dAb单体。在一个具体的实施方案中，所述配体或dAb单体能结合TNFRl的域1，并且一旦结合TNFa后就能抑制通过TNFRl介导的信号转导。这类配体或dAb单体可抑制通过TNFRl的信号转导，但不抑制TNFa与TNFRl的结合和/或TNFRl的脱落产生可溶性TNFRl。因此，将这样的配体或dAb单体给予有需要的哺乳动物，可补充内源调节途径，所述途径在体内抑制TNFa的活性和TNFRl的活性。其它配体或dAb单体能结合TNFRl，但不结合域4。这类配体或dAb单体可抑制TNFRl的功能，但不抑制可溶性TNFRl的脱落。因此，将这样的拮抗剂给予有需要的哺乳动物，可补充内源调节途径，所述途径在体内抑制TNFa的活性和TNFRl的活性。在标准测定(例如本文所述的标准L929或标准HeLaIL_8测定)中，优选的配体或dAb单体中和TNFa或TNFRl(抑制其活性)，其中和剂量50(ND5。)为500nM50pM、优选lOOnM50pM、更优选10nM100pM、有利的是InMlOOpM;例如50nM以下、优选5nM以下、更优选500pM以下、有利的是200pM以下、最优选100pM以下。在某些实施方案中，所述配体或dAb单体特异性结合人肿瘤坏死因子受体1(TNFR1;p55)，根据表面等离子共振的测定，所述配体或dAb单体从人TNFR1上解离下来的解离常数(Kd)为50nM20pM，K解离速率常数为5X10—、—1IX10—7s—、在其它实施方案中，所述配体或dAb单体特异性结合TNFRl(其Kd如本文所述)并且在标准小鼠LPS/D-半乳糖胺诱发的脓毒性休克模型中抑制致死率(即与合适对照相比，其预防致死或减少致死率至少约10%)。在标准小鼠LPS/D-半乳糖胺诱发的脓毒性休克模型中，与合适对照相比，当给予约5mg/kg或更优选约lmg/kg的dAb单体时，优选的dAb单体抑制致死率至少约25%或至少约50%。在其它实施方案中，在标准细胞测定中，所述配体或dAb单体结合TNFRl并拮抗TNFR1活性的ND5。《100nM，在浓度《10yM时，dAb激动TNFR1的活性《5%。在具体的实施方案中，在标准细胞测定中，所述配体或dAb单体基本上不激动TNFR1(起至IJTNFR1激动剂的作用)(即在测定中，当浓度为lnM、10nM、100nM、1iiM、10iiM、100iiM、1000iiM或5，000iiM时，导致不超过约5%的由TNFa(100pg/ml)i秀导的TNPR1介导的活性)。在某些实施方案中，所述配体或dAb单体基本上能抵抗聚集。例如，在某些实施方案中，当将l-5mg/ml、5-10mg/ml、10-20mg/ml、20-50mg/ml、50-100mg/ml、100-200mg/ml或200-500mg/ml配体或dAb溶液溶于药物配制常用溶剂(例如盐水、缓冲盐水、柠檬酸缓冲盐水、水、乳化剂和任何这些含有可接受的赋形剂的溶剂，所述赋形剂例如由FDA批准的赋形剂)时，将小于约10%、小于约9%、小于约8%、小于约7%、小于约6%、小于约5%、小于约4%、小于约3%、小于约2%或小于约1%的配体或dAb单体聚集物，在约22°C、22-25°C、25-30°C、30-37°C、37-40°C、40-50°C、50-60°C、60-70°C、70-80°C、15-20°C、10-15。C、5-10°C、2-5。C、0-2。C、-10°C至0°C、-20°C至-10°C、-40°C至-20°C、-60°C至-40°C或-80°C至-60°C的温度下，保持一段时间，例如10分钟、1小时、8小时、24小时、2天、3天、4天、1周、2周、3周、1月、2月、3月、4月、6月、1年或2年。可采用显微镜检、通过目测或分光镜检测定溶液浊度等任何合适方法，对聚集进行评价。优选通过动态光散射来评价聚集。抗聚集的配体或dAb单体具有若干优势。例如，通过采用合适的生物生产系统(例如大肠杆菌)进行表达，容易以可溶性蛋白质的形式产生这类配体或dAb单体并且收率高，然后可以比常规多肽更高的浓度来配制和/或贮存，同时聚集和活性的损失较低。另外，生产抗聚集的配体或dAb单体，可以比生产其它抗原或所得椭圆率值表示折叠配体或dAb单体的相对浓度为100%。再通过逐渐升高溶液温度，使溶液中的配体或dAb单体解折叠，然后以合适增量(例如温度每升高一度后)测定椭圆率。然后通过逐渐降低溶液温度，使溶液中配体或dAb单体重折叠，再以合适增量测定椭圆率。可以对数据作图，绘制解折叠曲线和重折叠曲线。解折叠曲线和重折叠曲线具有特征性的S形，它包括配体或dAb单体分子折叠部分，配体或dAb单体分子解折叠到不同程度时的解折叠/重折叠转换部分，以及配体或dAb单体分子解折叠部分。重折叠曲线的Y轴截距是恢复的重折叠配体或dAb单体的相对数量。至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约75%、或至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%的恢复，表明配体或dAb单体可逆地解折叠。在一个优选的实施方案中，通过制备配体或dAb单体溶液并绘制加热解折叠和重折叠曲线，测定配体或dAb单体解折叠的可逆性。可以在任何合适溶剂中制备配体或dAb单体溶液，所述溶剂例如含水缓冲液，其pH适于让配体或dAb单体溶解(例如pH比等电点(pl)约高或低3个单位)。配体或dAb单体溶液足够浓，以便可检测出解折叠/折叠。例如，配体或dAb单体溶液可以是约0.1iiM至约100iiM、或优选约1iiM至约10yM。如果配体或dAb单体的解链温度(Tm)是已知的，则可将溶液加热至比Tm低约10度(Tm-10)，然后通过椭圆率或荧光(例如远-UVCD可从200nm至250nm，固定波长CD为235nm或225nm;色氨酸荧光发射光谱为300-450nm，激发为29gnm)进行评价折叠，以提供100%的相对折叠配体或dAb单体。再按预定增量(例如约0.1度至约1度的增加)，将溶液加热至比Tm高至少10度(Tm+10)，在每次增量时测定椭圆率或荧光。然后，按预定增量，通过冷却到至少Tm-lO，使配体或dAb单体重折叠，在每次增量时测定椭圆率或荧光。如果不知道配体或dAb单体的解链温度，可以通过从约25t:至约IO(TC逐渐增量加热，使溶液解折叠，再逐渐增量冷却到至少约25t:使其重折叠，在每次加热和冷却增量时测定椭圆率或荧光。可以对所得数据作图，绘制解折叠曲线和重折叠曲线，其中重折叠曲线的Y轴截距是恢复的重折叠蛋白质的相对数量。在某些实施方案中，本发明的配体或dAb单体当以有效量给予时，在慢性炎性疾病模型中有效。通常有效量为约lmg/kg至约10mg/kg(例如约lmg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg)。本文所述的慢性炎性疾病模型是本领域技术人员公知的，用于预测在人体内的疗效。现有技术没有给出在这些模型中使用TNFR1拮抗剂(例如本文所述的单价拮抗剂、配体)的启示，也没有给出它们是否有效的启示。在具体的实施方案中，所述配体或dAb单体在标准小鼠胶原诱发的关节炎模型(实施例15A)中是有效的。例如与合适对照相比，在标准小鼠胶原诱发的关节炎模型中，给予有效量的配体可降低四肢平均关节炎评分总和例如约1至约16、约3至约16、约6至约16、约9至约16或约12至约16。在另一实例中，与合适对照相比，在标准小鼠胶原诱发的关节炎模型中，给予有效量的配体可延迟关节炎症状发作例如达约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约10天、约14天、约21天或约28天。在另一实例中，在标准小鼠胶原诱发的关节炎模型中，给予有效量的配体可导致四肢平均关节炎评分总和为0至约3、约3至约5、约5至约7、约7至约15、约9至约15、约10至约15、约12至约15或约14至约15。在其它实施方案中，所述配体或dAb单体在小鼠关节炎AARE模型中是有效的(实施例15B)。例如，与合适对照相比，在小鼠关节炎AARE模型中，给予有效量的配体可降低平均关节炎评分例如达约0.1至约2.5、约0.5至约2.5、约1至约2.5、约1.5至约2.5、或约2至约2.5。在另一实例中，与合适对照相比，在小鼠关节炎AARE模型中，给予有效量的配体可延迟关节炎症状发作例如达约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约10天、约14天、约21天或约28天。在另一实例中，在小鼠关节炎AARE模型中，给予有效量的配体可导致平均关节炎评分为0至约0.5、约0.5至约1、约1至约1.5、约1.5至约2、或约2至约2.5。在其它实施方案中，所述配体或dAb单体在小鼠炎性肠病(IBD)AARE模型(实施例15B)中是有效的。例如，与合适对照相比，在小鼠IBDAARE模型中，给予有效量的配体可降低平均急性和/或慢性炎症评分例如达约0.1至约2.5、约0.5至约2.5、约1至约2.5、约1.5至约2.5、或约2至约2.5。在另一实例中，与合适对照相比，在小鼠IBDAARE模型中，给予有效量的配体可延迟IBD症状发作例如达约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约10天、约14天、约21天或约28天。在另一实例中，在小鼠IBDAARE模型中，给予有效量的配体可导致平均急性和/或慢性炎症评分为0至约0.5、约0.5至约1、约1至约1.5、约1.5至约2或约2至约2.5。在其它实施方案中，所述配体或dAb单体在小鼠葡聚糖硫酸钠(DSS)诱发的IBD模型中是有效的(实施例15C)。例如，与合适对照相比，在小鼠DSSIBD模型中，给予有效量的配体可降低平均严重性评分例如达约0.1至约2.5、约0.5至约2.5、约1至约2.5、约1.5至约2.5、或约2至约2.5。在另一实例中，与合适对照相比，在小鼠DSSIBD模型中，给予有效量的配体可延迟IBD症状发作例如达约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约10天、约14天、约21天或约28天。在另一实例中，在小鼠DSSIBD模型中，给予有效量的配体可导致平均严重性评分为0至约0.5、约0.5至约1、约1至约1.5、约1.5至约2或约2至约2.5。在具体实施方案中，所述配体或dAb单体在小鼠吸烟所致慢性阻塞性肺病(COPD)模型中是有效的(实施例15D)。例如，与合适对照相比，给予有效量的配体可降低或延迟COPD症状发作。在具体实施方案中，所述配体或dab单体特异性结合TNFI~I并且包含TAI~2—10的氨基酸序列(SEQ工DN。31)或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的序列。在具体的实施方案中，所述配体或dab单体特异性结合TNFI~I并包含TAI~2—5的氨基酸序列(SEQ工DNO195)或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的序列。在其它实施方案中，所述配体包含域抗体(dab)单体，所述dab单体与肿瘤坏死因子受体l(／NFI~I，i055，CDl20a)特异性结合的K．为300HM一5ioM，并且所述dab单体的氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列或dab具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同源性／AI~2h一12(SEQ工DN。32)、TAI~2h一13(SEQIDNO33)、TAI~2h—14(SEQIDNO34)、TAI~2h—16(SEQ工DNO35)、TAI~2h—17(SEQ工DNO36)、TAI~2h—18(SEQ工DNO37)、TAI~2h—19(SEQ工DNO38)、TAI~2h一20(SEQIDNO39)、TAI~2h一2l(SEQ工DNO40)、TAI~2h一22(SEQ工DNO41)、TAI~2h一23(SEQIDNO42)、TAI~2h一24(SEQIDNO43)、TAI~2h一25(SEQ工DNO44)、TAI~2h一26(SEQ工DNO45)、TAI~2h一27(SEQ工DNO46)、TAI~2h一29(SEQIDNO47)、TAI~2h一30(SEQ工DNO48)、TAI~2h一32(SEQIDNO49)、TAI~2h一33(SEQIDNO50)、TAI~2h—10一l(SEQIDNO51)、TAI~2h一10—2(SEQ工DNO52)、TAI~2h一10—3(SEQ工DNO53)、TAI~2h一10—4(SEQ工DNO54)、TAI~2h一10—5(SEQ工DNO55)、TAI~2h一10—6(SEQ工DNO56)、TAI~2h一10—7(SEQ工DNO57)、TAI~2h一10—8(SEQ工DNO58)、TAI~2h一10—9(SEQ工DNO59)、TAI~2h一10—10(SEQ工DNO60)、TAI~2h一10一ll(SEQ工DNO61)、TAI~2h一10一12(SEQ工DNO62)、TAI~2h一10一13(SEQ工DNO63)、TAI~2h一10—14(SEQ工DNO64)、TAI~2h一10一15(SEQ工DNO65)、TAI~2h一10—16(SEQ工DNO66)、TAI~2h一10一17(SEQ工DNO67)、TAI~2h一10—18(SEQ工DNO68)、TAI~2h一10—19(SEQIDNO69)、TAI~2h一10—20(SEQ工DNO70)、TAI~2h一10—2l(SEQ工DNO71)、TAI~2h一10—22(SEQ工DNO72)、TAI~2h一10—27(SEQ工DNO73)、TAI~2h一10—29(SEQ工DNO74)、TAI~2h一10—3l(SEQ工DNO75)、TAI~2h一10—35(SEQ工DNO76)、TAI~2h一10—36(SEQ工DNO77)、TAI~2h一10—37(SEQIDNO78)、TAI~2h一10—38(SEQ工DNO79)、TAI~2h一10—45(SEQ工DNO80)、TAI~2h一10—47(SEQ工DNO81)、TAI~2h一10—48(SEQ工DNO82)、TAI~2h一10—57(SEQ工DNO83)、TAI~2h一10—56(SEQ工DNO84)、TAI~2h一10—58(SEQ工DNO85)、TAI~2h一10—66(SEQ工DNO86)、TAI~2h一10—64(SEQ工DNO87)、TAI~2h一10—65(SEQ工DNO88)、TAI~2h一10—68(SEQ工DNO89)、TAI~2h一10—69(SEQ工DNO90)、TAI~2h一10—67(SEQ工DNO91)、TAI~2h一10—6l(SEQ工DNO92)、TAI~2h一10—62(SEQ工DNO93)、TAI~2h一10—63(SEQ工DNO94)、TAI~2h一10—60(SEQ工DNO95)、TAI~2h一10—55(SEQ工DNO96)、TAI~2h一10—59(SEQ工DNO97)、TAI~2h一10—70(SEQ工DNO98)、TAI~2h一34(SEQ工DNO373)、TAI~2h一35(SEQ工DNO374)、TAI~2h一36(SEQ工DNO375)、TAI~2h一37(SEQ工DNO376)、TAI~2h一38(SEQ工DNO377)、TAI~2h一39(SEQ工DNO378)、TAI~2h一40(SEOIDNO379)、TAI~2h一4l(SEQIDNO380)、TAI~2h一42(SEQIDNO381)、TAI~2h一43(SEQIDNO382)、TAI~2h一44(SEQIDNO383)、TAI~2h一45(SEQIDNO384)、TAI~2h一47(SEQ工DNOONdQ3S)0T,T-戰V丄、(9TS:ONaiQ3S)SZ_S8T-、(WS:、(ns:、(80S:、(SOS:、(ZOS:、(66，:、(96，:、(歸:、歸:、(膨、(柳:、(W、、(W、,:、(69，:、(99，:、(冊:、、、(柳:ONONONONONONONONONONONONONONONONONaiaiaiaiaiaiaiaiaiaiaiaiaiaiaiaiaiQ3S)soz-ONaiQ3S)66-3V丄、(STS:ONaiQ3S)柳-戰v丄、(ns:onaiQ3s)u訊、,onaiQ3s)toz-UIV丄、(OTS:ONaiQ3S)9丄T-q^IV丄、(60S:ONaiQ3S)，丄T-UIV丄、(丄OS:ONaiQ3S)Z丄T-q^IV丄、(90S:ONaiQ3S)T丄T-UIV丄、(W)S:ONaiQ3S)99T-MW丄、(SOS:ONaiQ3S)S9T-戰V丄、(TOS:ONaiQ3S)，ST-MW丄、(OOS:ONaiQ3S)SST-UIV丄、(86，ONaiQ3S)TST-qZW丄、U6，ONaiQ3S)SH--戰v丄、(卿onaiQ3s)in-戰v丄、(柳onaiQas)on-UIV丄、(Z6，ONaiQ3S)8ZT-q^IV丄、(T6，ONaiQ3SnZT-UIV丄、(68，ONaiQ3S)SZT-MW丄、(88，ONaiQ3S)招T-UIV丄、(98，ONaiQ3S)MT-q^V丄、(S8，ONaiQ3S)TZT-uiv丄、(s針ONaiQ3S)6n-q^iv丄、(Z8，ONaiQ3S)8n-uiv丄、(o針onaiQ3S)9n-q^iv丄、(6丄，onaiQas)sn-戰v丄、U丄，onaiQ3s)sn-戰v丄、(9丄，onaiQas)zn-uiv丄、(w，onaiQ3s)on-qzw丄、(s丄，onaiQ3S)60t--戰V丄、(湯ONaiQ3SU0T-柳V丄、(O丄，ONaiQ3S)90T--戰V丄、(89，ONaiQ3S)柳-戰V丄、(册ONaiQ3S)S0T--MW丄、(S9，ONaiQ3S)TOT-qZW丄、(的，ONaiQ3S)00T-UIV丄、(Z9WONaiQ3S)丄6—q^IV丄、(T9，ONaiG3S)96—:ONaiQ3S)S6-柳V丄、(6S，ON(IIQ3S)，6-柳V丄ONaiQ3S)Z6-q^IV丄、(9S，ONaiQ3S)T6-q^IV丄、ONaiQ3S)68-悩V丄、(，ON(IIQ3S)88-悩V丄、ONaiQ3S)98-qMV丄、(OS，ONaiQ3S)S8-q^IV丄、(6种ONdlQ3S)，8-qMV丄、(8种:ONaiQ3S)S8-q^IV丄、U种ONaiQ3S)Z8-q^IV丄、(9种ONaiQ3S)T8-q^IV丄、(S种ONaiQ3S)08-戰V丄、(附ONaiQ3Sn,T-柳V丄、(附ONaiQ3S)，U服、(附:ONaiQ3Sn-ZST-戰V丄、(WONaiQ3S)8-TST-戰V丄、,ONaiQ3S)Z-W-戰V丄、(6S，ONCOQ3S)S—0T—，ST—qzaV丄、(8S，ON(IIQ3S)SZ—S8T—qzaV丄、(丄S，ONaiQ3S)Z-8-ST-qMV丄、(9^:ONaiQ3ST-8-ST-qMV丄、(SS，ONaiQ3S)8-ST-qMV丄、(WWONaiQ3S)HH-戰V丄、(WONaiQ3S)8-in-q^IV丄莉'激留％66據<7丟腔、％86、％丄6據<7丟、％96據<7丟、％%據<7丟、％，6據<7丟、％^6據<7丟、％26據<7丟、％16據《丟、％06據《丟、^;s8據《丟、％08據《丟阜wqvp腔「《sfef鍋奪篤胡土ra目黎封「l^fe/鍋奪篤胡斜亩qVP彩巡百浙'WdSWUOOS《P)！胡导薛躲丝執(BOZT(D'SSd'TMN丄)T斜吝^図誕鬼题抓封斜亩qvp彩巡'斜亩(qvp)斜躲將琴每斜s彩巡'^奪《躯笼:^楚承"ozo]。(WONaiQ3S)ST-戰V丄胜(潘ONaiQ3S)6丄-戰V丄、,ONaiQ3S)8丄-柳V丄、(66S:ON(IIQ3S)U-柳V丄、(86S:ONaiQ3S)9丄-柳V丄、U6S:ONdlQ3S)S丄-柳V丄、(96S:ONaiQ3S)，丄-柳V丄、(％S:ONaiQ3S)S丄-柳V丄、(，6S:ONaiQ3S)Z丄-q^IV丄、(S6S:ONaiQ3S)T丄-q^IV丄、(Z6S:ONaiQ3S)0丄-q^IV丄、(T6S:ONaiQ3S)89-q^IV丄、(06S:ONaiQ3S)丄9-q^IV丄、(68S:ON(IIQ3S)99-qMV丄、(88S:ONaiQ3S)TS-q^IV丄、U8S:ONaiQ3S)OS-qMV丄、(98S:ONaiQ3S)8卜qMV丄、(S8S(柳ONaiQ3S)S6-靴ONaiQ3S)06-ONaiQ3S)丄8-戰V丄戰V丄戰V丄戰V丄戰V丄戰V丄戰V丄戰V丄戰v丄戰v丄戰v丄戰v丄戰v丄戰v丄戰v丄-戰v丄-戰v丄-戰v丄柳v丄柳v丄柳v丄柳v丄517)和TAR2h-205(SEQIDNO:627)。在优选的实施方案中，所述配体或dAb的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%同源性:TAR2h-10-27(SEQIDNO:73)、TAR2h-10-57(SEQIDNO:83)、TAR2h-10_56(SEQIDNO:84)、TAR2h-10_58(SEQIDNO:85)、TAR2h-10-66(SEQIDNO:86)、TAR2h-10-64(SEQIDNO:87)、TAR2h-10_65(SEQIDNO:88)、TAR2h-10-68(SEQIDNO:89)、TAR2h-10_69(SEQIDNO:90)、TAR2h-10-67(SEQIDNO:91)、TAR2h-10-61(SEQIDNO:92)、TAR2h-10_62(SEQIDNO:93)、TAR2h-10_63(SEQIDNO:94)、TAR2h-10-60(SEQIDNO:95)、TAR2h-10_55(SEQIDNO:96)、TAR2h-10_59(SEQIDNO:97)和TAR2H0-70(SEQIDNO:98)。特别优选的配体或dAb的氨基酸序列与SEQIDNO:73的氨基酸序列具有至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%同源性。在其它实施方案中，所述配体包含域抗体(dAb)单体，所述dAb单体与肿瘤坏死因子受体1(TNFR1，p55，CD120a)特异性结合的Kd为300nM5pM，并且所述dAb单体的氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列或dAb具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或至少约99%同源性TAR2m-14(SEQIDNO:167)、TAR2m-15(SEQIDNO:168)、TAR2m-19(SEQIDNO:169)、TAR2m-20(SEQIDNO:170)、TAR2m-21(SEQIDNO:171)、TAR2m-24(SEQIDNO:172)、TAR2m-21_23(SEQIDNO:173)、TAR2m-21_07(SEQIDNO:174)、TAR2m-21-43(SEQIDNO:175)、TAR2m-21_48(SEQIDNO:176)、TAR2m-21_10(SEQIDNO:177)、TAR2m-21-06(SEQIDNO:178)、TAR2m-21_17(SEQIDNO:179)。在某些实施方案中，所述配体包含dAb单体，所述dAb单体能结合TNFR1并与本文所公开的任何dAb竞争性结合TNFR1(例如小鼠TNFR1和/或人TNFR1)。优选的配体或dAb单体当在大肠杆菌或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达时，其分泌量至少约为0.5mg/L。在其它优选的实施方案中，当在大肠杆菌或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达时，dAb单体的分泌量至少约O.75mg/L、至少约lmg/L、至少约4mg/L、至少约5mg/L、至少约10mg/L、至少约15mg/L、至少约20mg/L、至少约25mg/L、至少约30mg/L、至少约35mg/L、至少约40mg/L、至少约45mg/L、或至少约50mg/L、或至少约100mg/L、或至少约200mg/L、或至少约300mg/L、或至少约400mg/L、或至少约500mg/L、或至少约600mg/L、或至少约700mg/L、或至少约800mg/L、至少约900mg/L、或至少约lg/L。在其它优选的实施方案中，当在大肠杆菌或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达时，dAb单体的分泌量至少约lmg/L到至少约lg/L、至少约lmg/L到至少约750mg/L、至少约100mg/L到至少约lgL、至少约200mg/L到至少约lg/L、至少约300mg/L到至少约lg/L、至少约400mg/L到至少约lg/L、至少约500mg/L到至少约lg/L、至少约600mg/L到至少约lg/L、至少约700mg/L到至少约lg/L、至少约800mg/L到至少约lg/L、或至少约900mg/L到至少约lg/L。尽管在大肠杆菌或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达时，本文所述的配体和dAb单体可以分泌，但是它们也可以采用任何其它合适方法来制备，例如不需要用大肠杆菌或毕赤酵母的合成化学方法或生物学制备方法。dAb单体可包含任何合适的免疫球蛋白可变区、优选包含人可变区或包含人构架区的可变区。在某些实施方案中，dAb单体包含本文所述的通用构架。通用构架可以是、构架(VA或Vk)，例如包含由人种系DPK1、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPKIO、DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPK18、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、DPK26或DPK28免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列的构架。如有必要，、构架还可包含由人种系Jk1、Jk2、Jk3、Jk4、或Jk5免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列。在其它实施方案中，通用构架可以是VH构架，例如包含由人种系DP4、DP7、DP8、DP9、DPIO、DP31、DP33、DP38、DP45、DP46、DP47、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68或DP69免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列的构架。如有必要，VH构架还可包含由人种系JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5和JH6免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列。在具体的实施方案中，dAb单体配体包含DPK9、构架或选自DP47、DP45和DP38的Vh枸架。dAb单体可包含通用配体的结合位点，所述通用配体例如蛋白A、蛋白L和蛋白G。在某些实施方案中，dAb单体包含一个或多个构架区，所述架构区的氨基酸序列与人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序列相同，或者一个或多个所述构架区的氨基酸序列共同包含最多5个与人种系抗体基因区段所编码的所述相应构架区的氨基酸序列不同的氨基酸。在其它实施方案中，dAb单体的FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列与人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序列相同，或者FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列共同包含最多10个与所述人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序列不同的氨基酸。在其它实施方案中，dAb单体包含FW1、FW2和FW3区，而且所述FW1、FW2和FW3区的氨基酸序列与人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序列相同。在某些实施方案中，dAb单体不含骆驼科动物免疫球蛋白可变区，或者不含骆驼科动物种系抗体基因区段所编码的免疫球蛋白可变区所特有的一个或多个构架氨基酸。与血清白蛋白结合的配体和dAb单体本发明提供配体或dAb单体(例如包含这样的dAb的双特异性配体)，其与血清白蛋白(SA)结合的Kd为lnM500iiM(艮卩1X10—95X10—4)、优选100nM10iiM。优选对于含有第一抗SAdAb和针对另一靶标的第二dAb的双特异性配体来说，第二dAb对其靶标的亲和力(例如经采用BiaCore进行表面等离子共振测定的Kd和/或K^s)为第一dAb对SA的亲和力的1-100000倍(优选100-100000倍、更优选1000-100000倍、或10000-100000倍)。例如，第一dAb结合SA的亲和力约为10iiM，第二dAb结合其靶标的亲和力为100pM。优选的血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。在一个实施方案中，第一dAb(或dAb单体)与SA(例如HSA)结合的Kd约为50nM、优选70nM、更优选100nM、150nM或200nM。在某些实施方案中，对SA具有特异性的dAb单体包含MSA-16的氨基酸序列(SEQIDNO:28)或与其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同源性的序列。在其它实施方案中，对SA具有特异性的dab单体包含MSA一26的氨基酸序列(SEQ工DN。30)或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同源性的序列。在某些实施方案中，与SA结合的dab单体能抵抗聚集、可逆地解折叠和／或包含如上所述的构架区，该架构区用于能结合TNFI~I的dab单体。核酸分子、载体和宿主细胞本发明也提供分离和／或重组的核酸分子，所述分子编码本文所述的配体和dab单体。在某些实施方案中，分离和／或重组的核酸包含的核苷酸序列编码能特异性结合肿瘤坏死因子受体l(／NFI~)的域抗体(dab)单体，其中所述核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同源性／AI~2h一12(SEQ工DN。32)、TAI~2h一13(SEQ工DN。33)、TAI~2h一14(SEQIDNO34)、TAI~2h—16(SEQIDNO35)、TAI~2h—17(SEQIDNO36)、TAI~2h—18(SEQ工DNO37)、TAI~2h一19(SEQIDNO38)、TAI~2h一20(SEQ工DNO39)、TAI~2h一2l(SEQ工DNO40)、TAI~2h一22(SEQIDNO41)、TAI~2h一23(SEQ工DNO42)、TAI~2h一24(SEQ工DNO43)、TAI~2h一25(SEQ工DNO44)、TAI~2h一26(SEQ工DNO45)、TAI~2h一27(SEQ工DNO46)、TAI~2h一29(SEQ工DNO47)、TAI~2h一30(SEQ工DNO48)、TAI~2h一32(SEQ工DNO49)、TAI~2h一33(SEQIDNO50)、TAI~2h—10一l(SEQIDNO51)、TAI~2h一10—2(SEQ工DNO52)、TAI~2h一10—3(SEQ工DNO53)、TAI~2h一10—4(SEQ工DNO54)、TAI~2h一10—5(SEQ工DNO55)、TAI~2h一10—6(SEQ工DNO56)、TAI~2h一10—7(SEQ工DNO57)、TAI~2h一10—8(SEQ工DNO58)、TAI~2h一10—9(SEQ工DNO59)、TAI~2h一10—10(SEQ工DNO60)、TAI~2h一10一ll(SEQ工DN。61)、TAI~2h一10一12(SEQ工DNO62)、TAI~2h一10一13(SEQ工DNO63)、TAI~2h一10—14(SEQ工DNO64)、TAI~2h一10一15(SEQ工DNO65)、TAI~2h一10—16(SEQ工DNO66)、TAI~2h一10一17(SEQ工DNO67)、TAI~2h一10—18(SEQ工DNO68)、TAI~2h一10—19(SEQ工DNO69)、TAI~2h一10—20(SEQIDNO70)、TAI~2h一10—2l(SEQ工DNO71)、TAI~2h一10—22(SEQ工DNO72)、TAI~2h一10—27(SEQ工DNO73)、TAI~2h一10—29(SEQ工DNO74)、TAI~2h一10—3l(SEQ工DNO75)、TAI~2h一10—35(SEQ工DNO76)、TAI~2h一10—36(SEQ工DNO77)、TAI~2h一10—37(SEQ工DNO78)、TAI~2h一10—38(SEQ工DNO79)、TAI~2h一10—45(SEQ工DNO80)、TAI~2h一10—47(SEQ工DNO81)、TAI~2h一10—48(SEQ工DNO82)、TAI~2h一10—57(SEQ工DNO83)、TAI~2h一10—56(SEQ工DNO84)、TAI~2h一10—58(SEQ工DNO85)、TAI~2h一10—66(SEQ工DNO86)、TAI~2h一10—64(SEQ工DNO87)、TAI~2h一10—65(SEQ工DNO88)、TAI~2h一10—68(SEQ工DNO89)、TAI~2h一10—69(SEQ工DNO90)、TAI~2h一10—67(SEQ工DNO91)、TAI~2h一10—6l(SEQ工DNO92)、TAI~2h一10—62(SEQ工DNO93)、TAI~2h一10—63(SEQ工DNO94)、TAI~2h一10—60(SEQ工DNO95)、TAI~2h一10—55(SEQ工DNO96)、TAI~2h一10—59(SEQIDNO97)、TAI~2h—10—70(SEQIDNO98)、TAI~2h一34(SEQIDNO402)、TAI~2h一35(SEQ工DNO403)、TAI~2h一36(SEQ工DNO404)、TAI~2h一37(SEQ工DNO405)、TAI~2h一38(SEQ工DNO406)、TAI~2h一39(SEOIDNO407)、TAI~2h一40(SEQ工DNO408)、TAI~2h一4l(SEQ工DNO409)、TAI~2h一42(SEQ工DNO410)、TAI~2h一43(SEQIDNO4l1)、TAI~2h一44(SEQIDNO412)、TAI~2h一45(SEQ工DNO413)、TAI~2h一47(SEQIDNO414)、TAI~2h一48(SEQIDNO415)、TAI~2h一50(SEOIDNO416)、TAI~2h一5l(SEQ工DNO417)、TAI~2h一66(SEQ工DNO418)、TAR2h-67(SEQIDNO:419)、TAR2h-68(SEQIDNO:420)、TAR2h-70(SEQIDNO:421)、TAR2h_71(SEQIDNO:422)、TAR2h_72(SEQIDNO:423)、TAR2h_73(SEQIDNO:424)、TAR2h_74(SEQIDNO:425)、TAR2h_75(SEQIDNO:426)、TAR2h_76(SEQIDNO:427)、TAR2h-77(SEQIDNO:428)、TAR2h_78(SEQIDNO:429)、TAR2h_79(SEQIDNO:430)和TAR2h-15(SEQIDNO:432)。在其它实施方案中，分离和/或重组的核酸包含的核苷酸序列编码能特异性结合肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)的域抗体(dAb)单体，其中所述核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或至少约99%同源性TAR2h-131-8(SEQIDNO:518)、TAR2h-131-24(SEQIDNO:519)、TAR2h-15-8(SEQIDNO:520)、TAR2h_15_8_lSEQIDNO:521)、TAR2h_15_8_2(SEQIDNO:522)、TAR2H85-23(SEQIDNO:523)、TAR2H54-10-5(SEQIDNO:524)、TAR2H4-2(SEQIDNO:525)、TAR2h-151-8(SEQIDNO:526)、TAR2h_152_7(SEQIDNO:527)、TAR2h_35_4(SEQIDNO:528)、TAR2h-154-7(SEQIDNO:529)、TAR2h_80(SEQIDNO:530)、TAR2h_81(SEQIDNO:531)、TAR2h-82(SEQIDNO:532)、TAR2h_83(SEQIDNO:533)、TAR2h_84(SEQIDNO:534)、TAR2h-85(SEQIDNO:535)、TAR2h_86(SEQIDNO:536)、TAR2h_87(SEQIDNO:537)、TAR2h-88(SEQIDNO:538)、TAR2h-89(SEQIDNO:539)、TAR2h-90(SEQIDNO:540)、TAR2h--91(SEQIDNO541)、TAR2h-92(SEQIDNO542)、TAR2h-93(SEQIDNO543)、TAR2h--94(SEQIDNO544)、TAR2h-95(SEQIDNO:545)、TAR2h-96(SEQIDNO:546)、TAR2h-97(SEQIDNO:547)、TAR2h-99(SEQIDNO:548)、TAR2h-100(SEQIDNO:549)、TAR2h--101(SEQIDNO:550:、TAR2H02(SEQIDNO:551)、TAR2h--103(SEQIDNO:552)、TAR2h--104(SEQIDNO:553:、TAR2H05(SEQIDNO:554)、TAR2h--106(SEQIDNO:555)、TAR2h--107(SEQIDNO:556:、TAR2H08(SEQIDNO:557)、TAR2h--109(SEQIDNO:558)、TAR2h--110(SEQIDNO:559:、TAR2h-lll(SEQIDNO:560)、TAR2h--112(SEQIDNO:561)、TAR2h--113(SEQIDNO:562〕、TAR2h-114(SEQIDNO:563)、TAR2h--115(SEQIDNO:564)、TAR2h--116(SEQIDNO:565〕、TAR2h-117(SEQIDNO:566)、TAR2h--118(SEQIDNO:567)、TAR2h--119(SEQIDNO:568〕、TAR2h-120(SEQIDNO:569)、TAR2h--121(SEQIDNO:570)、TAR2h--122(SEQIDNO:571〕、TAR2h-123(SEQIDNO:572)、TAR2h--124(SEQIDNO:573)、TAR2h--125(SEQIDNO:574〕、TAR2h-126(SEQIDNO:575)、TAR2h--127(SEQIDNO:576)、TAR2h--128(SEQIDNO:577〕、TAR2h-129(SEQIDNO:578)、TAR2h--130(SEQIDNO:579)、TAR2h--131(SEQIDNO:580〕、TAR2h-132(SEQIDNO:581)、TAR2h--133(SEQIDNO:582)、TAR2h--151(SEQIDNO:583〕、TAR2h-152(SEQIDNO:584)、TAR2h--153(SEQIDNO:585)、TAR2h--154(SEQIDNO:586〕、TAR2h-159(SEQIDNO:587)、TAR2h--165(SEQIDNO:588)、TAR2h--166(SEQIDNO:589〕、TAR2h-168(SEQIDNO:590)、TAR2h--171(SEQIDNO:591)、TAR2h--172(SEQIDNO:592〕、TAR2h-173(SEQIDNO:593)、TAR2h--174(SEQIDNO:594)、TAR2h--176(SEQIDNO:595〕、TAR2h-178(SEQIDNO:596)、TAR2h--201(SEQIDNO:597)、TAR2h--202(SEQIDNO:598〕、TAR2h-203(SEQIDNO:599)、TAR2h--204(SEQIDNO:600)、TAR2H85-25(SEQIDNO:601)、TAR2h-154_10(SEQIDNO:602)和TAR2h_205(SEQIDNO:628)。在一个优选的实施方案中，分离和/或重组的核酸包含的核苷酸序列与选自以下的核苷酸具有至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或至少约99%同源性TAR2m-10-27(SEQIDNO:141)、TAR2m-10-57(SEQIDNO:151)、TAR2m-10-56(SEQIDNO:152)、TAR2m-10-58(SEQIDNO:153)、TAR2m_10_66(SEQIDNO:154)、TAR2m_10_64(SEQIDNO:155)、TAR2m-10-65(SEQIDNO:156)、TAR2m-10_68(SEQIDNO:157)、TAR2m-10_69(SEQIDNO:158)、TAR2m-10-67(SEQIDNO:159)、TAR2m-10-61(SEQIDNO:160)、TAR2m-10_62(SEQIDNO:161)、TAR2m-10-63(SEQIDNO:162)、TAR2m-10_60(SEQIDNO:163)、TAR2m-10_55(SEQIDNO:164)、TAR2m-10-59(SEQIDNO:165)和TAR2m-10_70(SEQIDNO:166)。在其它实施方案中，分离和/或重组的核酸包含的核苷酸序列编码能特异性结合肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)的域抗体(dAb)单体，其中所述核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或至少约99%同源性:TAR2m-14(SEQIDNO:180)、TAR2m-15(SEQIDNO:181)、TAR2m-19(SEQIDNO:182)、TAR2m-20(SEQIDNO:183)、TAR2m-21(SEQIDNO:184)、TAR2m-24(SEQIDNO:185)、TAR2m-21-23(SEQIDNO:186)、TAR2m-21_07(SEQIDNO:187)、TAR2m-21_43(SEQIDNO:188)、TAR2m-21-48(SEQIDNO:189)、TAR2m-21_10(SEQIDNO:190)、TAR2m-21_06(SEQIDNO:191)和TAR2m-21-17(SEQIDNO:192)和TAR2m-21_23a(SEQIDNO:626)。本发明也提供包含本发明重组核酸分子的载体。在某些实施方案中，载体是包含一个或多个与本发明重组核酸操作性连接的表达控制元件或序列的表达载体。合适的载体(例如质粒、噬菌粒)和表达控制元件进一步描述如下。本发明也提供重组宿主细胞，所述细胞包含本发明的重组核酸分子或载体。合适的宿主细胞以及用于制备本发明重组宿主细胞的方法进一步描述如下。本发明也提供制备本发明的配体(例如dAb单体、双特异性配体、多特异性配体)的方法，该方法包括在适于所述重组核酸表达的条件下维持包含本发明重组核酸的重组宿主细胞，由此表达重组核酸并产生配体。在某些实施方案中，该方法还包括分离出配体。配体形式本发明的配体可以精制成为单特异性或多特异性抗体或抗体片段或者单特异性或多特异性非免疫球蛋白结构。合适的形式包括任何合适的多肽结构，其中抗体可变区或其CDR可以结合起来，以便在结构上赋予对抗原的结合特异性。各种合适的抗体形式是本领域已知的，例如IgG样形式、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同型二聚体和异型二聚体、任何前述抗原结合片段(例如Fv片段(例如单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段)、单可变区(例如VH、、)、dAb和任何前述的修饰形式(例如通过共价连接聚烷二醇(例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其它合适的聚合物)而修饰)。参见PCT/GB03/002804(2003年6月30日申请，指定国为美国，公布号为WO2004/081026)有关单可变区和dAb的PEG化、其合适的制备方法、PEG化单可变区和dAb单体和多聚体的延长的体内半衰期、合适的PEG、优选的流体动力学尺寸的PEG和优选的流体动力学尺寸的PEG化单可变区和dAb单体和多聚体。PCT/GB03/002804(W02004/081026)的全部公开内容，包括上面提及的部分，全都通过引用结合到本文中。在具体的实施方案中，所述配体(例如dAb单体、二聚体或多聚体、双特异性形式、多特异性形式)是PEG化配体，并且能结合TNFR1的域1和任选抑制TNFR1功能。优选的PEG化配体抑制通过TNFR1的信号转导。优选的PEG化配体与TNFR1的域1结合的亲和力与未PEG化的相同配体的亲和力相同。例如，在一个实施方案中，所述配体是能结合TNFR1的域1并抑制通过TNFR1的信号转导的PEG化dAb单体，其中PEG化dAb单体与TNFR1的域1结合的亲和力与非PEG化形式的dAb的亲和力之间的差异不超过约1000倍、优选不超过约IOO倍，更优选不超过约IO倍，或者前者的亲和力相对于未PEG化形式的亲和力来说基本不变。结合TNFR1的膜结合(跨膜)和可溶性形式的域1、但不抑制TNFa与受体形式结合的本发明配体，可用于阻断膜结合受体上的域1(例如以抑制受体成簇和/或抑制信号转导)并且也结合可溶性形式，以延长半衰期，特别是当与PEG连接或按照上述其它方法时。在一个优选的实施方案中，所述配体不结合TNFR1的膜结合(跨膜)和可溶性形式的域2。在另一优选的实施方案中，所述配体不结合TNFR1的膜结合(跨膜)和可溶性形式的域3。在另一优选的实施方案中，所述配体不结合TNFR1的膜结合(跨膜)和可溶性形式的域2或域3。在某些实施方案中，所述配体是IgG样形式。这类形式具有常规IgG分子的4条链结构(2条重链和2条轻链)，其中一个或多个可变区(VH和/或、)已经被具有所需特异性的dAb即单可变区取代。优选各可变区(2个VH区和2个、区)被dAb即单可变区取代。包括在IgG样形式中的dAb即单可变区可具有相同特异性或不同特异性。在某些实施方案中，IgG样形式是四价的，并且可具有1、2、3或4种特异性。例如，IgG样形式可以是单特异性的，并且包含4个具有相同特异性的dAb;可以是双特异性的，并且包含3个具有相同特异性的dAb和另一具有不同特异性的dAb;可以是双特异性的，并且包含2个具有相同特异性的dAb和两个具有共同、却不同特异性的dAb;可以是三特异性的，并且包含具有相同特异性的第一和第二dAb，具有不同特异性的第三dAb，具有不同于第一、第二和第三dAb的特异性的第四dAb;或者可以是四特异性的，并且包含4个各自具有不同特异性的dAb。可以制备IgG样形式的抗原结合片段(例如Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、scFy)。优选的IgG样形式或其抗原结合片段不交联TNFR1。本发明的配体，包括dAb单体、二聚体和三聚体，可以连接抗体Fc区，该区包含CH2和CH3区的一个或两个，以及任选的铰链区。例如，编码将单核苷酸序列连接Fc区的配体的载体，可用于制备所述多肽。按照本发明的以下方面，本发明还提供前述dAb单体的二聚体、三聚体和多聚体。本发明的配体可以结合和/或制成非免疫球蛋白多配体结构的形式，以形成多价复合物，其结合具有相同抗原的靶分子，因而提供较高亲合力。在某些实施方案中，至少一个可变区结合抗原，以延长多聚体的半衰期。例如天然细菌受体(例如SpA)已经用作移植CDR的支架，以产生能特异性结合一个或多个表位的配体。该方法的细节参见US5，831，012。其它合适的支架包括基于纤连蛋白和亲和体的支架。合适方法的细节参见WO98/58965。其它合适的支架包括脂质运载蛋白和CTLA4(参见vandenBeuken等，J.Mol.Biol.(2001)310,591-601)以及例如描述于WO00/69907(MedicalResearchCouncil)的支架，所述支架是基于例如细菌GroEL的环状结构或其它陪伴分子多肽。蛋白质支架可以进行组合；例如，CDR可以移植到CTLA4支架上并且与免疫球蛋白VH区或、区一起使用，以构成配体。同样，纤连蛋白、脂质运载蛋白和其它支架也可以进行组合。双特异性配体和多特异性配体本发明人在其同时待审的国际专利申请WO03/002609以及同时待审的未公布的UK专利申请0230203.2中，已经描述了双特异性免疫球蛋白配体，所述配体包含各自具有不同特异性的免疫球蛋白单可变区。这些结构域可以彼此竞争性或独立地结合靶分子上的抗原或表位。本发明的双特异性配体优选包含重链区和轻链区的组合。例如，双特异性配体可包含VH区和、区，这两区可以连接在一起呈scFv的形式。另外，配体可包含一个或多个CH区或C^区。例如，配体可包含CH1区、Q2区或Q3区和/或&区、Cii1、Cii2、Cii3或Cii4区、或其任何组合。铰链区也可包含在其中。这样的各区组合可以是例如模拟天然抗体，例如IgG或IgM或其片段，例如Fv、scFv、Fab或F(ab')2分子。也考虑了其它结构，例如包含VH、Vl、Ch1和CL区的IgG分子的单臂。在本发明的一个优选的实施方案中，可变区选自单域V基因库。通常，单域抗体库都展示在丝状噬菌体表面上。在一个优选的实施方案中，通过噬菌体库与抗原的结合，来选择各单域抗体。在本发明的一个优选的实施方案中，在互补可变区不存在时，可以通过与其靶抗原或表位的结合来选择各单可变区。在一个替代实施方案中，在互补可变区存在时，可以通过与其靶抗原或表位的结合来选择单可变区。因此，在第三互补可变区存在时，可以选择第一单可变区，在第四互补可变区存在时，可以选择第二可变区。互补的第三或第四可变区可以是天然关联可变区(它们具有与待测单域相同的特异性)或非关联互补区-例如"dummy"可变区。优选本发明的双特异性配体仅包含两个可变区，尽管几个这样的配体也能结合在一起成为同一蛋白质，例如两个这样的配体可以结合成IgG或多聚体形式的免疫球蛋白，例如IgM。或者，在另一实施方案中，多个双特异性配体结合形成多聚体。例如，两个不同双特异性配体结合在一起，以产生四特异性分子。本领域技术人员可以理解，本发明方法所产生的双特异性配体的轻链可变区和重链可变区，可以在同一多肽链上或者在不同多肽链上。就可变区在不同多肽链上而言，它们可以通过接头、通常是柔性接头(例如多肽链)、化学连接基团而连接，或者通过本领域已知的任何其它方法而连接。在第一格局中，本发明提供双特异性配体的进一步改进，该改进是由本发明人开发的，其中配体的一个特异性针对生物体内存在的蛋白质或多肽，它们通过与其结合而起到延长配体半衰期的作用。因此，第一方面，提供双特异性配体，所述配体包含对第一抗原或表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白单可变区以及对第二抗原或表位具有结合活性的第二互补免疫球蛋白单可变区，其中所述抗原或表位的一个或两个起到延长配体体内半衰期的作用，而且其中所述第一和第二区缺乏共享相同特异性的互补区，前提条件是所述双特异性配体不由抗HSAVh区和抗13半乳糖苷酶VK区组成。优选的第一或第二可变区都不结合人血清白蛋白(HSA)。延长本文所述配体的半衰期的抗原或表位最好位于生物体内存在的蛋白质或多肽上。实例包括胞外基质蛋白、血蛋白和生物体不同组织中存在的蛋白质。蛋白质例如通过作为膨胀剂(bulkingagent)，或者通过将配体锚定在所需作用位点上，而起到降低配体从血液中清除的速率。延长体内半衰期的抗原/表位的实例在以下附录l中给出。延长的半衰期可用于免疫球蛋白、尤其是抗体、最尤其是小体积的抗体片段的体内应用。这类片段(Fv、二硫键连接的Fv、Fab、scFv、dAb)会从体内快速清除掉；因此，尽管它们能快速到达身体的大部分部位，并且也能够快速生产和容易操作，但是它们在体内的短持续性限制了它们在体内的应用。本发明解决了这一问题，即通过使配体在体内半衰期延长，继而延长配体功能活性在体内的持续时间。药代动力学分析方法和配体半衰期的测定方法是本领域技术人员熟知的。有关细节可参见Kenneth,A等，ChemicalStabilityofPharmaceuticals:AHandbookforPharmacists禾口Peters等，Pharmacokinetcanalysis:APracticalApproach(1996)。参考文献也可参见"Pharmacokinetics，，，MGibaldi&DPerron,MarcelDekker出版，2ndRev.exedition(1982)，该文献介绍了药代动力学参数，例如ta和tP半衰期和曲线下面积(AUC)。半衰期(tl/2a和tl/2|3)禾PAUC可以根据配体血清浓度与时间的曲线而确定。WinNonlin分析包(可得自PharsightCorp.，MountainView,CA94040,USA)可用于例如曲线建模。在第一相(a相)，配体主要是在患者体内分布，同时有一些消除。第二相(13相)是终末相，当配体已经分布且血清浓度随配体从患者体内消除而下降。ta半衰期是第一相的半衰期，tP半衰期则是第二相的半衰期。因此，最好本发明提供本发明配体或包含本发明配体的组合物，所述配体的ta半衰期范围为15分钟或更长时间。在一个实施方案中，范围的下限是30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时或12小时。另外，或者，本发明的配体或组合物的ta半衰期范围为最多12小时且包括12小时。在一个实施方案中，范围的上限是11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时或5小时。合适范围的实例为1-6小时、2-5小时或3-4小时。最好本发明提供本发明配体或包含本发明配体的组合物，所述配体的tP半衰期范围为2.5小时或更长时间。在一个实施方案中，范围的下限是3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时或12小时。另外，或者，本发明的配体或组合物的tl3半衰期范围为最多21天且包括21天。在一个实施方案中，范围的上限是12小时、24小时、2天、3天、5天、10天、15天或20天。最好本发明的配体或组合物的tP半衰期范围为12-60小时。在另一实施方案中，范围为12-48小时。在再一实施方案中，范围为12-26小时。另外，除了以上标准之外，本发明提供配体或包含本发明配体的组合物，其AUC值(曲线下面积)范围为lmg.min/ml以上。在一个实施方案中，范围的下限是5、10、15、20、30、100、200或300，单位为mg.min/ml。另外，或者，本发明配体或组合物的AUC范围高达600mg.min/ml。在一个实施方案中，范围的上限是500、400、300、200、150、100、75或50，单位为mg.min/ml。最好本发明配体的AUC范围选自以下15-150mg.min/ml、15-100mg.min/ml、15—75mg.min/ml禾口15_50mg.min/ml。在第一个实施方案中，双特异性配体包含两个互补可变区，即两个可变区，它们在其天然环境下能结合在一起成为关联对或关联组，甚至在本发明的情况下，它们分别结合其关联表位。例如，互补可变区可以是免疫球蛋白重链和轻链可变区(Vh和、)。Vh区和、区最好由scFv或Fab抗体片段提供。可变区可连接在一起形成多价配体，例如通过在各V区的C-端提供铰链区并在铰链区的半胱氨酸间提供二硫键；或提供在结构域C-端带有半胱氨酸的dAb，这些半胱氨酸是通过二硫键连接在一起；或者通过产生V-CH和V-CL，以产生Fab形式；或者使用肽接头(例如下文所述的Gly4Ser接头)，以产生二聚体、三聚体和多聚体。本发明人已经知道，使用互补可变区可以让两个结构域表面包装在一起并从溶剂中隐退(sequestered)。而且，互补区可彼此稳定。另外，它允许产生双特异性IgG抗体，但没有现有技术所用的杂种杂交瘤的缺点，或者不需要在亚单位界面改造重链或轻链。本发明第一方面的双特异性配体具有至少一个^/、对。因此，本发明的双特异性IgG包含两个这样的配对，在Y形分子每个臂上各有一对。因此，不同于常规双特异性抗体或双链抗体(其中所用链的比率决定其制剂是否成功并导致实践的困难)，本发明的双特异性配体没有链平衡的问题。常规双特异性抗体中的链不平衡是由两个不同、链与两个不同VJ连连接所致，其中、链1与VH链1一起能结合抗原或表位1，、链2与VH链2—起能结合抗原或表位2，两个正确的配对以某种方式彼此连接。因此，在一个分子中仅当Vj连1与VJ连1配对、Vj连2与Vj连2配对时，才产生双特异性。这样的双特异性分子可以两种不同方式产生。第一种，它们可以通过两个各自连接不同抗原或表位的现有V/、配对连接而产生(例如在双特异性IgG中)。在这种情况下，VH/、配对必需以1:1的比例混合在一起，以便产生所有分子都为双特异性分子群体。这决不会(甚至当互补CH区通过"杵臼结构(knobsintoholes)"工程而强化时)导致双特异性分子和仅能结合一个抗原或表位、但不结合另一个抗原或表位的分子的混合物。第二种产生双特异性抗体的方式是通过将两个不同Vj连与两个不同、链同时结合(例如在双特异性双链抗体)。在这种情况下，尽管倾向于优先让VJ连1与VH链1配对、VJ连2与VH链2配对(这可以通过、和VH区的"杵臼结构"改造而强化)，但是不会在所有分子中都得到该配对，导致混合制剂，其中发生不正确的配对，使其不能结合抗原或表位。按照本发明第一方面的双特异性配体方法构建的双特异性抗体克服了所有这些问题，因为与抗原或表位1的结合存在于VH区或、区，与抗原或表位2的结合存在于互补、或VH区。因为VH区和、区配对以1:1比例，所有VH/、配对都是双特异性的，因此采用这些VH/、配对构建的所有形式(Fv、scFv、Fab、微型抗体、IgG等)都具有100%双特异性活性。在本发明的情况下，第一和第二"表位"被认为是这样的表位所述表位不同，而且不结合单个单特异性配体。在本发明的第一格局中，它们最好在不同抗原上，其中一个起到延长配体体内半衰期的作用。同样，第一和第二抗原最好是不同的。本发明的双特异性配体不包含WO02/02773所述的配体。因此，本发明的配体不包含互补VH/X对，其协同结合任何一个或多个抗原或表位。相反，本发明第一方面的配体包含VH/、互补对，其中V区具有不同特异性。此外，本发明第一方面的配体包含V/、互补对，其对非结构相关表位或抗原具有不同特异性。结构相关的表位或抗原是这样的表位或抗原其具有足够的结构相似性，可以与常规VH/X互补对结合，其以协同方式结合抗原或表位；就结构相关的表位而言，表位在结构上是足够相似的，使得它们"适合"于VH/\二聚体的抗原结合位点上形成的同一结合口袋(pocket)。第二方面，本发明提供配体，所述配体包含具有第一抗原或表位结合特异性的第一免疫球蛋白可变区以及具有第二抗原或表位结合特异性的第二免疫球蛋白可变区，其中延长配体体内半衰期的所述第一和第二可变区的一个或两个结合抗原，可变区彼此并不互补。在一个实施方案中，通过一个可变区的结合调节了配体通过第二可变区的结合。在该实施方案中，可变区可以是例如VH区对或、区对。在第一位点的抗原结合可调节、例如增强或抑制在第二位点的抗原结合。例如，在第一位点的结合至少部分抑制在第二位点的抗原结合。在这样的实施方案中，配体可以例如通过与延长配体半衰期的蛋白质结合而在患者生物体内得以维持，直到它结合第二靶抗原并从延长半衰期的蛋白质上解离下来。在上述情况下，达到对结合的调节是抗原结合位点彼此结构接近的结果。可以通过连接两个或更多个抗原结合位点的结构组分的特性，达到这样的结构接近，例如通过提供具有相对刚性结构的配体，这样的刚性结构能保持非常接近的抗原结合位点。最好两个或更多个抗原结合位点彼此是物理上非常接近的，通过涉及免疫球蛋白分子内位阻和/或构象变化的过程，使得一个位点能调节另一位点的抗原结合。第一和第二抗原结合域可以共价或非共价结合。在结构域是共价结合的情况下，可以通过例如二硫键或者通过多肽接头例如(Gly^er)n而介导结合，其中n二l-8，例如2、3、4、5或7。在采用例如本文所述的噬菌体展示技术从V基因库中选出可变区的情况下，这些可变区可包含通用构架区，使得它们可以被本文所述的特异性通用配体所识别。有关通用构架、通用配体等的使用参见WO99/20749。在本发明中，有关的噬菌体展示包括噬菌体和/或噬菌粒的使用。当使用V基因库时，多肽序列中的变异优选位于可变区结构环内。各可变区的多肽序列可以通过DNA改组或通过突变而改变，以便增强各可变区与其互补对的相互作用。DNA改组是本领域已知的，参见例如Stemmer，Nature370:389-391(1994)和美国专利第6，297，053号，所述文献都通过弓I用结合到本文中。其它诱变方法是本领域技术人员众所周知的。在本发明的一个优选实施方案中，"双特异性配体"是单链Fv片段。在本发明的一个替代实施方案中，"双特异性配体"由抗体Fab区组成。术语"Fab区"包括Fab样区，其中使用两个VH区或两个、区。可变区可来自针对靶抗原或表位的抗体。或者它们可来自单域抗体库，例如在丝状噬菌体表面表达的那些。可以按照下文所述进行选择。另一方面，本发明提供一种或多种核酸分子，所述核酸至少编码本文所述的双特异性配体。双特异性配体可以由一个核酸分子编码；或者，各结构域可以由各自的核酸分子编码。当配体由一个核酸分子编码时，各结构域可表达为scFv分子形式的融合多肽，或者可以分别表达，再随后连接在一起，例如使用化学连接剂。各自的核酸所表达的配体可通过合适方法连接在一起。核酸还可编码信号序列，用于在表达后将多肽从宿主细胞中输出，而且在表达后还可与丝状噬菌体颗粒的表面组分(或选择展示系统的其它组分)融合。另一方面，本发明提供载体，所述载体包含编码本发明的双特异性配体的核酸。又一方面，本发明提供用载体转染的宿主细胞，所述载体编码本发明的双特异性配体。用这样的载体进行表达，可以例如在噬菌体颗粒表面产生可变区，用于选择。这允许选择所展示的可变区，因此用本发明的方法能选择出"双特异性配体"。本发明还提供试剂盒，所述试剂盒至少包括本发明的双特异性配体。第三方面，本发明提供制备配体的方法，所述配体包含具有第一结合特异性的第一免疫球蛋白单可变区以及具有第二(不同)结合特异性的第二单免疫球蛋白单可变区，结合特异性的一个或两个对在体内延长配体半衰期的抗原具有特异性，该方法包括以下步骤a)选择能够结合第一表位的第一可变区，b)选择能够结合第二表位的第二可变区，c)连接可变区；禾口d)选择能够结合所述第一表位和所述第二表位的配体。配体可同时结合第一和第二表位，或者当结合域之间对表位结合具有竞争性时，一个区的结合可阻碍另一区与其关联表位的结合。因此在一个实施方案中，以上步骤(d)需要同时结合第一和第二(可能的话更多)表位；在另一个实施方案中，与第一和第二表位的结合不同时。表位优选在各自抗原上。配体最好包含如上所述的免疫球蛋白可变区的VH/、组合、或VH/VH或Vy、组合。配体还可包含骆驼科动物VHH区，前提条件是对在体内能延长配体半衰期的抗原具有特异性的V皿区不结合鸡卵清溶菌酶(HEL)、猪胰腺a-淀粉酶或NmC-A;hcg、BSA-连接的RR6偶氮染料或变异链球菌(S.mutans)HG982细胞，参见Conrath等(2001)JBC276:7346-7350和W099/23221，这两篇文献都没有介绍针对在体内能延长配体半衰期的抗原特异性用途。在一个实施方案中，在互补可变区不存在的情况下，选择所述第一可变区用于结合所述第一表位。在另一实施方案中，在第三可变区存在的情况下，选择所述第一可变区用于结合所述第一表位/抗原，其中所述第三可变区不同于所述第二可变区并且与第一区互补。同样，可以在互补可变区存在或不存在的情况下，选择第二区。除了延长半衰期的蛋白质之外，本发明配体所靶向的抗原或表位可以是任何抗原或表位，但最好是具有治疗益处的抗原或表位。本发明提供配体，包括开放构象、闭合构象和分离的dAb单体配体，它们对任何所述靶标、尤其是本文进一步鉴定的那些靶标具有特异性。所述靶标可以是天然存在或合成的多肽、蛋白质或核酸、或其部分。在该方面，本发明的配体能结合表位或抗原并起到拮抗剂或激动剂(例如EPO受体激动剂)的作用。本领域技术人员将会理解，选择是庞大的而不同的。它们可以是例如人或动物蛋白、细胞因子、细胞因子受体、酶的辅因子或DNA结合蛋白。合适的细胞因子和生长因子包括但不限于ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌营养蛋白-1、EGF、EGF受体、ENA-78、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、Exodus-2、EpoR、FGF(酸性)、FGF(碱性)、成纤维细胞生长因子-10、FLT3配体、CXXXC趋化因子(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-P1、胰岛素、IFN-y、IGF-I、IGF-II、IL-1a、IL_1P、IL_2、IL_3、IL_4、IL_5、IL_6、IL_7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a.)、IL_9、IL-IO、IL-ll、IL_12、IL_13、IL_15、IL_16、IL_17、IL-18(IGIF)、抑制素a、抑制素P、IP-10、角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)、KGF、瘦素、LIF、淋巴细胞趋化因子、米勒管(Mullerian)抑制物质、单核细胞集落抑制因子、单核细胞趋化蛋白、M-CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-la、MIP-1P、MIP-3a、MIP-3P、MDP-4、髓性祖细胞抑制因子_1(MPIF-1)、NAP-2、神经营养因子、神经生长因子、P-NGF、NT-3、NT-4、抑瘤素M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、廳TES、SDF1a、SDF1P、SCF、SCGF、干细胞因子(SCF)、TARC、TGF_a、TGF-P、TGF-P2、TGF-P3、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-a、TNF-P、TNF受体I、TNF受体II、TNIL-1、TP0、VEGF、VEGF受体1、VEGF受体2、VEGF受体3、GCP_2、GR0/MGSA、GR0-P、GR0-y、HCC1、1-309、HER1、HER2、HER3和HER4。细胞因子受体包含前述细胞因子的受体。可以理解，该名单并非是详尽而无遗漏的。在本发明的一个实施方案中，可变区来自针对抗原或表位的相应抗体。在一个优选的实施方案中，可变区来自抗体单可变区库。在第二格局中，本发明提供多特异性配体。根据本发明，术语"多特异性配体"是指具有不止一个本文所定义的表位结合特异性的配体。通常，多特异性配体包含两个或更多个表位结合域。本发明的表位结合域包含蛋白质支架和表位相互作用位点(它们最好在蛋白质支架表面)。根据本发明，最好各表位结合域具有不同表位结合特异性。在本发明的情况下，认为第一和第二"表位"是不同表位且不结合一个单特异性配体的表位。它们可以在不同抗原上，或在同一抗原上、但是有足够距离隔开，使它们不会形成一个这样的实体所述实体与常规抗体的一个单特异性VH/\结合对结合。从实验上看，如果单链抗体形式中的单个可变区的两个(域抗体或dAb)各自被针对两个表位的单特异性VH/\配体竞争的话，则这两个表位间的距离不够远，不能认为是本发明的分离的表位。根据本发明，有利的是，每个表位结合域都包含免疫球蛋白可变区。更有利的是，每个免疫球蛋白都可变区可以是轻链可变区(、)或重链可变区V^在本发明的第二格局中，免疫球蛋白结构域当存在于本发明配体中时，是非互补的，也就是说，它们不结合形成V/、抗原结合位点。因此，本发明第二格局中定义的多特异性配体包含相同亚型的免疫球蛋白结构域，它可以是轻链可变区(VJ或重链可变区(VH)。此外，当本发明的配体呈闭合构象时，免疫球蛋白结构域可以是骆驼科动物型。在一个替代实施方案中，本发明的配体不包含骆驼科动物区。更具体地讲，与人VH区相比，本发明的配体不含对骆驼科动物VHH区具有特异性的一个或多个氨基酸残基。最好单可变区来自抗体，所述抗体是通过针对不同抗原或表位的结合活性而选择出来的。例如，可以通过人免疫，至少部分分离可变区。替代方法是本领域已知的，包括从人类抗体文库中分离和人工抗体基因的合成。可变区最好结合超抗原，例如蛋白A或蛋白L。与超抗原的结合是正确折叠的抗体可变区的特性，允许这样的结构域从例如重组或突变区的文库中分离出来。表位结合域也可以基于并非免疫球蛋白结构域的蛋白质支架或骨架。例如天然细菌受体(例如SpA)已经用作移植CDR的支架，以产生能特异性结合一个或多个表位的配体。该方法的细节参见US5，831，012。其它合适的支架包括基于纤连蛋白和亲和体的支架。合适方法的细节参见WO98/58965。其它合适的支架包括脂质运载蛋白和CTLA4(参见vandenBeuken等，J.Mol.Biol.(2001)310,591-601)以及例如描述于W00069907(MedicalResearchCouncil)的支架，所述支架是基于例如细菌GroEL的环状结构或其它多肽陪伴分子。蛋白质支架可以进行组合；例如，CDR可以移植到CTLA4支架上并且与免疫球蛋白VH区或、区一起使用，以构成多价配体。同样，纤连蛋白、脂质运载蛋白和其它支架也可以进行组合。在一个实施方案中，多特异性配体包含表位结合域，它包含结合本文所述的TNFR1的免疫球蛋白单域(dAb)的CDR，所述CDR移植到合适的蛋白质支架或骨架上。本领域技术人员可以理解，本发明方法所产生的闭合构象多特异性配体的表位结合域，可以在相同多肽链上或者在不同多肽链上。就可变区在不同多肽链上而言，它们可以通过接头、最好是柔性接头(例如多肽链)、化学连接基团而连接，或者通过本领域已知的任何其它方法而连接。第一和第二表位结合域可以共价或非共价结合。在结构域是共价结合的情况下，可以通过例如二硫键介导结合。在本发明的第二格局的某些实施方案中，表位可以彼此替代而结合。例如，第一表位可以存在于抗原上，在所述抗原与其关联第一结合域结合时，引起第二结合域的位阻或其构象变化，从而替代了与第二结合域结合的表位。最好结合下降达25%以上、最好是40%、50%、60%、70%、80%、90%以上、优选高达100%或接近100%，使得结合完全被抑制。可以通过常规抗原结合测定(例如ELISA)、基于荧光的技术(包括FRET)或通过例如测定分子量的表面等离子共振等技术来测定表位的结合。此外，本发明提供闭合构象多特异性配体，所述配体包含具有第一表位结合特异性的第一表位结合域以及具有第二表位结合特异性的非互补的第二表位结合域，其中第一和第二结合特异性竞争表位结合，使得闭合构象多特异性配体不同时结合这两个表位。本发明的闭合构象多特异性配体不包含WO02/02773所述的配体。因此，本发明的配体不包含互补VH/、对，其协同结合任何一个或多个抗原或表位。相反，本发明的配体优选包含非互补的VH_VH或Vf、对。最好各VH_VH或Vf、对中的各VH区或、区具有不同表位结合特异性，而且表位结合位点是这样排列的使得在一个位点上的表位结合与另一位点上的表位的结合发生竞争。最好闭合构象多特异性配体可包含能够结合靶分子的第一区和能够结合延长配体半衰期的分子或基团的第二区。例如，分子或基团可以是膨胀剂(bulkyagent)，例如HSA或细胞基质蛋白。本文所用的术语"延长配体半衰期的分子或基团"是指这样的分子或化学基团当给予动物时，相对于不结合分子或基因的配体来说，当所述分子或化学基团结合本文所述的双特异性配体时，它们延长所述双特异性配体的体内半衰期。延长配体半衰期的分子或基团的实例描述如下。在一个优选的实施方案中，仅在半衰期延长分子或基团被置换时，闭合构象多特异性配体能够结合靶分子。因此，例如，闭合构象多特异性配体可以通过大体积的分子(例如HSA)而在患者血液循环中得以保持。当遇到靶分子时，闭合构象多特异性配体的结合域之间的竞争导致HAS的替代和靶的结合。在本发明第二格局的一个优选的实施方案中，表位结合域是免疫球蛋白可变区并选自单域V基因库。通常，单域抗体库都展示在丝状噬菌体表面上。在一个优选的实施方案中，通过噬菌体库与抗原的结合，来选择各单域抗体。在本发明的第二格局的一个优选的实施方案中，表位结合域是免疫球蛋白可变区并选自单域V基因库。通常，单域抗体库都展示在丝状噬菌体表面上。在一个优选的实施方案中，通过噬菌体库与抗原的结合，来选择各单域抗体。—方面，多特异性配体包含至少两个非互补可变区。例如，配体可包含一对VH区或一对、区。最好这些结构域并非骆驼科动物来源；优选它们是人结构域或者包含人构架区(FW)和一个或多个异源CDR。CDR和构架区是免疫球蛋白可变区的结构域，正如Kabat的SequencesofProteinofImmunologicalInterest数据库所定义的。优选的人构架区是种系基因区段DP47和DPK9所编码的结构域。最好VH区或、区的FW1、FW2和FW3具有来自DP47或DPK9的FW1、FW2或FW3序列。人构架可任选含有突变，例如在本发明配体所用的人构架中共同含有最多约5个氨基酸变化或至多约10个氨基酸变化。根据本发明的第二格局，多特异性配体中的可变区可排列成开放或闭合构象；也就是说，它们可以这样排列使得可变区可独立和同时结合其关联配体，或者使得仅一个可变区可在任何时候结合其关联配体。本发明人知道，在某些结构条件下，非互补的可变区(例如两个轻链可变区或两个重链可变区)可以存在于配体中，使得第一表位与第一可变区的结合抑制第二表位与第二可变区的结合，甚至这样的非互补区不作为关联对一起作用。最好配体包含两对或更多对可变区；也就是说，它包含至少4个可变区。最好这4个可变区都包含人源构架。在一个优选的实施方案中，人构架和人种系序列的构架相同。本发明人认为，这样的抗体可特别用于配体结合测定，用于治疗用途和其它用途。在本发明的第二格局的一个实施方案中，可变区来自针对第一和/或第二抗原或表位的抗体。在一个优选的实施方案中，可变区来自抗体单可变区库。在一个实例中，库是在动物或合成库中不会产生的库。在另一实例中，单可变区没有通过动物免疫而分离(至少部分)。因此，单域可以从天然文库中分离出来。另一方面，本发明的第二格局提供多特异性配体，它包含具有第一表位结合特异性的第一表位结合域和具有第二表位结合特异性的非互补第二表位结合域。第一和第二结合特异性可以相同或不同。另一方面，本发明提供闭合构象多特异性配体，它包含具有第一表位结合特异性的第一表位结合域和具有第二表位结合特异性的非互补第二表位结合域，其中第一和第二结合特异性能够竞争表位结合，使得闭合构象多特异性配体不能同时结合两个表位。又一方面，本发明提供包含非互补结合域的开放构象配体，其中所述结构域对同46一靶标上的不同表位具有特异性。所述配体与靶标的结合具有增加的亲合力。同样，本发明提供包含非互补结合域的多价配体，所述结合域对相同表位具有特异性并针对包含所述表位的多拷贝耙标，所述表位例如IL-5、PDGF-AA、PDGF-BB、TGFP、TGFP2、TGFP3禾PTNFa，例如人TNF受体1和人TNFa。在类似方面，本发明的配体可以低亲和力结合单个表位，使得与单个表位的结合没有治疗意义；但是与两个表位结合而导致的亲合力可提供治疗益处。在一个具体实例中，可以针对单独存在于正常细胞类型中、但却一起存在于异常或患病细胞(例如肿瘤细胞)中的表位。在这样的情况下，仅异常或患病细胞是本发明双特异性配体的有效靶标。对同一靶上多拷贝的相同表位或相邻表位具有特异性的配体(称为螯合dAb)，也可以是三聚体或多聚体(四聚体或更高聚集体)的配体，其包含3、4或更多个非互补结合域。例如，可以构建包含3或4个VH区或、区的配体。此外，提供能结合多个亚单位耙标的配体，其中每个结合域对所述耙标亚单位具有特异性。配体可以是二聚体、三聚体或多聚体。优选本发明以上方面的多特异性配体是通过本发明第一方面的方法而得到。根据本发明第二格局的以上方面，最好第一表位结合域和第二表位结合域是本文所述的非互补免疫球蛋白可变区。也就是说，可以是VH_VH或Vf、可变区。具体地讲，可以按照本发明优选方面制备螯合dAb，即采用锚定dAb，其中采用载体来构建二聚体、三聚体或多聚体dAb的文库，所述载体包含接头序列上游或下游的恒定dAb，其具有插入到接头另一侧的第二、第三和更多dAb的库。例如，锚定或导向dAb可以是TAR1-5(Vk)、TAR1-27(Vk)、TAR2h-5(VH)或TAR2h-6(Vk)。在替代方法中，可以避免采用接头，例如通过使用结合域例如VH和VK之间的非共价键或天然亲和力。因此，本发明提供制备螯合多聚体配体的方法，该方法包括以下步骤(a)提供载体，该载体包含编码对靶标上的第一表位具有特异性的单结合域的核酸序列；(b)提供载体，该载体编码包含对所述靶标上的第二表位具有特异性的第二结合域的库，所述表位可以与第一表位相同或不同，所述第二表位与所述第一表位相邻；禾口(c)表达所述第一和第二结合域；禾口(d)分离结合在一起的第一和第二结合域的组合，得到结合靶标的二聚体。第一和第二表位相邻，使得多聚体配体能同时结合这两个表位。这提供了在结合时具有增加亲合力优势的配体。当表位相同时，可通过靶标上存在的多拷贝表位，而得到增加的亲合力，允许同时结合至少两个拷贝，以便亲和力效果增加。结合域可通过若干方法并采用接头而结合。例如，结合域可包含cys残基、抗生物素蛋白和链霉抗生物素基团或其它在合成后用于非共价连接的方式；有效结合靶标的这些组合可以被分离出来。或者，接头可存在于第一和第二结合域之间，它们可以作为一条多肽从一个载体上表达，例如，如上所述，该多肽包含第一结合域、接头和第二结合域库。在一个优选的方面，当与抗原结合时，第一和第二结合域就天然连接在一起；例如，Vh区和Vk区，当结合相邻表位时，以三种相互作用方式天然连接，形成稳定二聚体。这样的连接蛋白在靶结合测定中可以被分离出来。该方法的一个优势就是只有以正确构象47结合紧相邻表位的结合域才可以连接，并可因其对靶标的亲合力增加而分离。在本发明的第二格局的以上方面的一个替代实施方案中，至少一个表位结合域包含本文所述的非免疫球蛋白"蛋白质支架"或"蛋白质骨架"。合适的非免疫球蛋白蛋白质支架包括但不限于选自以下的任何以上列出的支架SpA、纤连蛋白、GroEL和其它陪伴分子、脂质运载蛋白、CCTLA4和亲和体。按照本发明的第二格局的以上方面，最好表位结合域结合蛋白质骨架。最好本发明的蛋白质骨架是免疫球蛋白骨架。按照本发明，术语"免疫球蛋白骨架"是指如上所述的包含至少一个免疫球蛋白折叠并起到一个或多个表位结合域核心作用的蛋白质。本文所述的优选免疫球蛋白骨架包括任何一个或多个选自以下的骨架至少包含以下部分的免疫球蛋白分子(i)抗体的CL(k或A亚类)区；或(ii)抗体重链的CH1区；包含抗体重链CH1区和CH2区的免疫球蛋白分子；包含抗体重链CH1区、CH2区和CH3区的免疫球蛋白分子；或任何(ii)亚类以及抗体的CL(k或A亚类)区。铰链区也可包含在其中。这样的各区组合可以是例如例如模拟天然抗体，例如IgG或IgM或其片段，例如Fy、scFv、Fab或F(ab')2分子。本领域技术人员知道，该名单并非是详尽而无遗漏的。本文所述的骨架与表位结合域的连接可在多肽水平上得到，是在编码骨架和/或表位结合域的核酸表达之后。或者，连接步骤可以在核酸水平上进行。本发明的蛋白质骨架与一个或多个表位结合域的连接方法包括采用蛋白质化学和/或分子生物学技术，这些技术是本领域技术人员熟知的并在本文中有描述。最好闭合构象多特异性配体可包含能够结合靶分子的第一区和能够结合延长配体半衰期的分子或基团的第二区。例如，分子或基团可以是膨胀剂(bulkyagent)，例如HSA或细胞基质蛋白。本文所用的术语"延长配体半衰期的分子或基团"是指这样的分子或化学基团当给予动物时，相对于不结合分子或基团的配体来说，当所述分子或化学基团结合本文所述的双特异性配体时，它们延长所述双特异性配体的体内半衰期。延长配体半衰期的分子或基团描述如下。在一个优选的实施方案中，仅在半衰期延长分子或基团替代时，闭合构象多特异性配体能够结合靶分子。因此，例如，闭合构象多特异性配体可以通过大体积的分子(例如HSA)而在患者血液循环中得以保持。当遇到靶分子时，闭合构象多特异性配体的结合域之间的竞争导致HAS的替代和靶的结合。在本发明的第二格局的另一方面，本发明提供一种或多种核酸分子，所述核酸至少编码本文所述的多特异性配体。在一个实施方案中，所述配体是闭合构象配体。在另一个实施方案中，它是开放构象配体。多特异性配体可以由一条核酸分子编码；或者，各表位结合域可以由各自的核酸分子编码。当配体由一条核酸分子编码时，各区可表达为融合多肽，或者可以分别表达，再随后连接在一起，例如使用化学连接剂。各自的核酸所表达的配体可通过合适方法连接在一起。核酸还可编码信号序列，用于在表达后将多肽从宿主细胞中输出，而且在表达后还可与丝状噬菌体颗粒的表面组分(或选择展示系统的其它组分)融合。可用于细菌表达和/或噬菌体或噬菌粒展示的前导序列包括pelB、stlI、ompA、phoA、bla和pelA。在本发明的第二格局的另一方面，本发明提供包含本发明核酸的载体。再一方面，本发明提供用本发明载体转染的宿主细胞。从这样的载体表达，可以例如在噬菌体颗粒表面产生表位结合域，用于选择。这允许选择所展示的结构域，因此用本发明的方法选择"多特异性配体"。本发明还提供试剂盒，所述试剂盒至少包括本发明的多特异性配体，所述配体可以是开放构象或闭合构象配体。本发明的试剂盒可以是例如诊断试剂盒、治疗用试剂盒、化学或生物标本的检测试剂盒等。本发明提供制备多特异性配体的方法，该方法包括以下步骤a)选择能够结合第一表位的第一表位结合域，b)选择能够结合第二表位的第二表位结合域，c)连接表位结合域；禾口d)选择能够结合所述第一第二表位和所述第二表位的闭合构象多特异性配体。在第二格局的另一方面，本发明提供制备闭合构象多特异性配体的方法，所述配体包含具有第一表位结合特异性的第一表位结合域和具有第二表位结合特异性的非互补第二表位结合域，其中第一和第二结合特异性竞争表位结合，使得闭合构象多特异性配体不同时结合这两个表位；该方法包括以下步骤a)选择能够结合第一表位的第一表位结合域，b)选择能够结合第二表位的第二表位结合域，c)连接表位结合域，使得各结构域呈闭合构象；禾口d)选择能够结合所述第一第二表位和所述第二表位、但不同时结合所述第一和第二表位的闭合构象多特异性配体。本发明的第二格局的以上方面的一个替代实施方案任选还包括步骤(bl)，该步骤包括选择第三或更多表位结合域。这样，所产生的多特异性配体(无论是开放还是闭合构象)包含不止两个表位结合特异性。在本发明的第二格局的优选方面，当多特异性配体包含不止两个表位结合域时，至少两个所述结构域呈闭合构象并竞争结合；其它区可竞争结合或者可以独立于其关联表位而任意连接。在本发明的第二格局中，优选第一和第二表位是不同的。它们可以是天然存在或合成的多肽、蛋白质或核酸、或其部分。在该方面，本发明的配体能结合表位或抗原并起到拮抗剂或激动剂(例如EPO受体激动剂)的作用。在一个实施方案中，所述配体的表位结合域具有相同表位特异性，并且可以例如同时结合其表位，当多拷贝的表位存在于同一抗原上时。在另一个实施方案中，在不同抗原上提供这些表位，使得配体能结合表位并连接抗原。本领域技术人员将会理解，表位和抗原的选择是庞大的而不同的。它们可以是例如人或动物蛋白、细胞因子、细胞因子受体、酶的辅因子或DNA结合蛋白。合适的细胞因子和生长因子包括但不限于ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌营养蛋白-1、EGF、EGF受体、ENA-78、嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子_2、Exodus-2、EpoR、FGF(酸性)、FGF(碱性)、成纤维细胞生长因子-10、FLT3配体、CXXXC趋化因子(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-P1、胰岛素、IFN-y、IGF-I、IGF-II、IL-1a、IL-1P、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a.)、IL_9、IL-IO、IL-ll、IL_12、IL_13、IL_15、IL_16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素a、抑制素P、EP-10、角质形成细胞生长因子_2(KGF-2)、KGF、瘦素、LIF、淋巴细胞趋化因子、米勒管(Mullerian)抑制物质、单核细胞集落抑制因子、单核细胞趋化蛋白、M-CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-1a、MIP-1P、MIP-3a、MIP-3P、MIP-4、髓性祖细胞抑制因子-1(MPIF-1)、NAP-2、神经营养因子、神经生长因子、P-NGF、NT-3、NT-4、抑瘤素M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF_4、RANTES、SDF1a、SDF1P、SCF、SCGF、干细胞因子(SCF)、TARC、TGF-a、TGF-P、TGF_P2、TGF_P3、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-a、TNF_P、TNF受体I、TNF受体II、TNIL-1、TP0、VEGF、VEGF受体1、VEGF受体2、VEGF受体3、GCP_2、GR0/MGSA、GRO-P、GR0-y、HCC1、1-309、HER1、HER2、HER3、HER4、TACE识别位点、TNFBP-1禾PTNFBP-II、以及公开于附录2或附录3的任何耙标，无论是以附录中列出的组合、不同组合形式还是单独形式。细胞因子受体包含前述细胞因子的受体，例如IL-1R1;IL-6R;IL-10R;IL-18R，以及附录2或附录3中列出的细胞因子的受体以及附录2和附录3中公开的受体。可以理解，该名单并非是详尽而无遗漏的。当多特异性配体结合两个表位(在相同或不同抗原上)时，抗原可以从该名单中选出。在具体的实施方案中，所述配体包含能结合TNFR1的dAb和能结合任一这样的抗原的第二dAb或表位结合域。在这样的实施方案中，多特异性配体可包括免疫球蛋白可变区的任何组合(例如VHVH、VHV。W)。基于免疫球蛋白的多特异性配体的制备本发明的双特异性配体，在本发明所需格局的构象上无论是开放的还是闭合的，都可以按照用于抗体工程领域的先前建立的技术来制备，用于制备scFv、"噬菌体"抗体和其它改造的抗体分子。抗体、尤其是双特异性抗体的制备技术例如参见以下综述及其中所引用的参考文献Winter和Milstein，(1991)Nature349:293-299;Pluckthun(1992)ImmunologicalReviews130:151-188;Wright等(1992)Crti.Rev.Immunol.，12:125-168;Holligcr，P.禾PWinter,G.(1993)Curr.Op.Biotechn.，4,446—449;Carter等(1995)J.Hernatother，4，463-470;Chester，K.A.和Hawkins,R.E.(1995)TrendsBiotechn.，13，294-300;Hoogenboom，H.R.(1997)NatureBiotechnol.，15，125-126;Fearon，D.(1997)NatureBiotechnol.，15，618_619;Pliickthun，A.禾口Pack,P.(1997)I匪notechnology3，83-105;Carter，P.禾口Merchant,A.M.(1997)Curr.Opin.Biotechnol.，8，449-454;Holliger，P.禾口Winter,G.(1997)Cancerlmm皿ol.Imm皿other.，45，128-130。本发明提供用于针对两个不同抗原或表位的可变区选择和随后的可变区组合。可变区选择所用的技术采用的是本领域已知的文库和选择方法。采用从人B细胞收获的重排V基因的天然文库(Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222:581;Vaughan等(1996)NatureBiotech.，14:309)是本领域技术人员众所周知的。合成文库(Hoogenboom和Winter(1992)J.Mol.Biol.，227:381;Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89:4457;Nissim等(1994)EMB0J.，13:692;Griffiths等(1994)EMB0J.，13:3245;DeKruif等(1995)J.Mol.Biol.，248:97)则是通常采用PCR、通过克隆免疫球蛋白V基因而制备的。PCR过程中出现的错误可导致高度随机化。可以分别针对靶抗原或表位选择VH和/或、文库，在这种情况下，直接选择或一起选择单域结合。本发明双特异性配体的优选制备方法包括采用选择系统，其中选择结合第一抗原或表位的可变区库，并选择结合第二抗原或表位的可变区库。再将所选的第一和第二可变区结合在一起并选择结合第一和第二抗原或表位的双特异性配体。选择单独、而非同时结合第一和第二抗原或表位的闭合构象配体。A.文库载体系统各种选择系统是本领域已知的，适用于本发明。这些系统的实例如下所述。可以直接筛选噬菌体A表达系统的噬菌斑或溶原体的菌落，这两者先前都有描述(Huse等(1989)Science,246:1275;Caton和Koprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87;Mullinax等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87:8095;Persson等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88:2432)并且用于本发明。尽管这样的表达系统可以用于筛选多达106个不同文库成员，但是它们不适合筛选更大数量(大于106个成员)。文库构建中特别有用的是选择展示系统，所述系统使核酸连接到它所表达的多肽上。本文所用的选择展示系统是允许通过单个文库成员结合通用配体和/或靶配体的合适展示方法而选择的系统。在大文库中分离出所需成员的选择方案是本领域已知的，以噬菌体展示技术为代表。这种将多样化肽序列展示在丝状噬菌体表面的系统(Scott和Smith(1990)Science,249:386)，已经证明可用于产生抗体片段(及其编码它们的核苷酸序列)文库，用于体外选择和结合靶抗原的特异性抗体片段的扩增(McCafferty等，WO92/01047)。编码VH区和、区的核苷酸序列连接到编码前导信号的基因片段上，这样的信号可指导它们到达大肠杆菌细胞的壁膜间隙，结果所得抗体片段可展示在噬菌体表面，通常是与噬菌体外壳蛋白(例如pIII或pVIII)融合。或者，抗体片段向外展示在A噬菌体衣壳(噬菌体)上。基于噬菌体的展示系统的一个优点就是因为它们是生物系统，所以可以将含有所选文库成员的噬菌体在细菌细胞中进行培养，而简单扩增所选文库成员。此外，因为编码多肽文库成员的核苷酸序列被噬菌体或噬菌粒载体所包含，所以测序、表达和其后的遗传操作相对直接。噬菌体抗体展示文库和A噬菌体表达文库的构建方法是本领域众所周知的(McCafferty等(1990)Nature,348:552;Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，g8:4363;Clackson等(1991)Nature,352:624;Lowman等(1991)Biochemistry,30:10832;Burton等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88:10134;Hoogenboom等(1991)NucleicAcidsRes.，19:4133;Chang等(1991)J.Immunol.，147:3610;Breitling等(1991)Gene，104:147;Marks等(1991)，出处同上；Barbas等(1992)，出处同上；Hawkins禾口Winter(1992)J.Immunol.，22:867;Marks等，1992，J.Biol.Chem.，267:16007;Lerner等(1992)Science,258:1313，所述文献通过引用结合到本文中)。—个特别具有优势的方法是使用scFv噬菌体-文库(Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85:5879-5883;Chaudhary等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87:1066-1070;McCafferty等(1990)，出处同上;Clackson等(1991)Nature,352:624;Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222:581;Chiswell等(1992)TrendsBiotech.，10:80;Marks等(1992)J.Biol.Chem.，267)。在噬菌体外壳蛋白上展示的scFv文库的各种实施方案已有描述。噬菌体展示方法的改进也是已知的，例如参见W096/06213和W092/01047(MedicalResearchCouncil等)和W097/08320(Morphosys)，所述文献通过引用结合到本文中。产生多肽文库的其它系统包括使用无细胞酶促机制，用于体外合成文库成员。在一个方法中，通过针对靶配体的多轮选择和PCR扩增来选择RNA分子(Tuerk和Gold(1990)Science,249:505;Ellington和Szostak(1990)Nature,346:818)。一项类似技术可用于鉴定结合预定人转录因子的DNA序列(Thiesen和Bach(1990)NucleicAcidsRes.，18:3203;Beaudry和Joyce(1992)Science,257:635;W092/05258和W092/14843)。以类似方式，体外翻译可用于合成多肽，这作为产生大文库的方法。这些通常包括稳定的多核糖体复合物的方法进一步参见W088/08453、W090/05785、W090/07003、W091/02076、W091/05058和W092/02536。并非基于噬菌体的替代展示系统例如那些公开于W095/22625和W095/11922(Affymax)的系统，采用多核糖体来展示多肽，用于选择。还有一项技术包括对人工区室中的库的选择，这允许将基因与其基因产物结合起来。例如，通过在油包水乳剂形成的微胶囊中选择编码所需基因产物的核酸的选择系统，参见W099/02671、W000/40712;Tawfik和Griffiths(1998)NatureBiotechnol16(7)，652-6。将编码具有所需活性的基因产物的遗传元件在微胶囊中区室化，然后在微胶囊内转录和/或翻译以产生它们相应的基因产物(RNA或蛋白质)。随后再分选产生具有所需活性的基因产物的遗传元件。该方法通过各种方法检测所需活性而选择目标基因产物。B.文库构建可以采用本领域已知技术，构建例如以上提出的文库用于选择，或者从商业来源购买。可用于本发明的文库参见例如W099/20749。一旦选择载体系统并将一个或多个编码目标多肽的核酸序列克隆到文库载体中，通过在表达前进行诱变，就可以在克隆分子内产生多样性；或者，可以在如上所述的诱变和多轮选择进行之前，表达并选择所编码的蛋白质。按照标准分子方法，对编码结构优化多肽的核酸序列进行诱变。特别有用的是聚合酶链式反应即PCR(Mullis和Faloona(1987)MethodsEnzymol，155:335，所述文献通过引用结合到本文中)。PCR是本领域众所周知的，它是采用由热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶催化的多轮DNA复制，以扩增目标耙序列。各种抗体文库的构建参见Winter等(1994)Arm.Rev.Immunology,12,433-55及其中引用的参考文献。用模板DNA(至少lfg;更有用的为l-1000ng)和至少25pmol寡核苷酸引物，进行PCR;当引物库(primerpool)非常不均一时，最好采用较大量引物，因为各序列仅有少量引物库分子作为代表，而且数量在随后的扩增循环中成为限制。通常反应混合物包括2ii1DNA、25pmo1寡核苷酸引物、2.5ii110XPCR缓冲液1(Perkin-Elmer，FosterCity，CA)，0.4ii11.25iiMdNTP、0.15ii1(或2.5单位)TaqDNA聚合酶(PerkinElmer，FosterCity，CA)和去离子水加至总体积为25iU。覆盖矿物油，进行PCR，用程序加热循环仪。PCR循环中各步骤的长度和温度以及循环次数，按照结果所需的严格性来调整。退火温度和时间由引物预计与模板退火的效率和可耐受的错配程度而定；显然，当核酸分子同时扩增和诱变的话，错配是必需的，至少在合成的第一轮。优化引物退火条件的严格性的能力是本领域普通技术人员的知识范围之内。采用的退火温度在3(TC和72t:之间。模板分子开始变性通常发生在92t:和99t:之间达4分钟，再是20-40次循环，循环是由变性(94_99°C15秒至1分钟)、退火(按照上述温度；1-2分钟)和延伸(72°C1-5分钟，取决于扩增产物的长度)组成。最终延伸通常72°C4分钟，再接着是不确定(0-24小时)步骤，在4°C。C.结合单可变区本发明所用的结构域，一旦选出就可以通过本领域已知的各种方法连接，包括共价和非共价方法。优选的方法包括采用如上所述的多肽接头，例如连接scFv分子(Bird等(1988)52Science242:423-426)。有关合适接头的讨论参见Bird等，Science242,423-426;Hudson等，JournalImmunolMethods231(1999)177-189;Hudson等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85,5879-5883。接头优选是柔性的，允许两个单域相互作用。一个接头的实例是(Gly4Ser)n接头，其中n二l-8，例如2、3、4、5或7。也可采用双链抗体中使用的接头(其柔性较差)(Holliger等(1993)PNAS(USA)90:6444-6448)。在一个实施方案中，所用的接头不是免疫球蛋白铰链区。可变区可采用不用接头的方法而结合。例如，可以开发二硫桥的用途(所述二硫桥是通过天然存在的或改造的半胱氨酸残基而提供的)，以便稳定VH_VH、Vf、或VH_、二聚体(Reiter等(1994)ProteinEng.，7:697-704)或者通过可变区间界面的重构以改善"适合性(fit)"，因而稳定相互作用(Ridgeway等(1996)ProteinEng.7:617-621;Zhu等(1997)ProteinScience6:781-788)。如果适当的话，可以使用用于连接或稳定免疫球蛋白可变区、尤其是抗体^区的其它技术。根据本发明，双特异性配体在溶液中可以呈"闭合"构象。"闭合"构型是指其中两个区(例如VH和、)以连接形式存在，例如连接的VH_、对形成抗体结合位点。例如，scFv可以呈闭合构象，这取决于用于连接VH区和、区的接头的排列。如果它具有足够柔性让这两区连接，或者刚性地将它们保持在连接位置上，则这两区可能采取闭合构象。同样，VH区对和、区对可存在闭合构象。通常，这将随配体分子中的两区通过例如刚性接头紧密连接而变。闭合构象中的配体不能同时结合延长配体的半衰期的分子和第二靶分子。因此，配体通常只结合从延长配体半衰期的分于上解离下来的第二靶分子。此外，无需接头的VH/VH、、/\或VH/\二聚体的构建为两区之间带来竞争。而且，本发明的配体也可以呈开放构象。在这样的构象中，所述配体能同时结合延长配体的半衰期的分子和第二靶分子。通常，开放构型中的可变区(就Vf、对而言)与以下结构域保持足够远的距离所述结构域不会相互作用而形成抗体结合位点、而且也不会竞争性结合它们各自的表位。就VH/VH或、/\二聚体而言，这些结构域并不通过刚性接头结合在一起。当然，这样的结构域配对也不竞争抗原结合或形成抗体结合位点。Fab片段和完整抗体将会主要以闭合构象存在，尽管可以理解，开放和闭合双特异性配体在不同情况下可能以各种均衡存在。配体与靶的结合可能会改变开放构型均衡的平衡。因此，本发明的某些配体在溶液中可存在两种构象，其一(开放形式)可独立结合两个抗原或表位，同时另一构象(闭合形式)仅能结合一个抗原或表位；因此，在该构象中，抗原或表位竞争性结合配体。尽管双特异性配体的开放形式因此在溶液中存在具有闭合形式的均衡，但是考虑到均衡将有利于闭合形式；此外，开放形式可以被靶向闭合构象的结合而掩蔽。因此，优选本发明的某些双特异性配体存在两个(开放和闭合)构象间的平衡。可以对本发明的双特异性配体进行修饰，以便有利于开放或闭合构象。例如，Vf、的相互关系因二硫键而稳定，从而稳定了闭合构象。此外，可以构建用于结合各区(包括Vh区和、区对)的接头，以有利于开放形式；例如，接头可在空间上阻碍各区的结合，例如通过在合适位置上结合大的氨基酸残基，或者设计能物理性分离各区的合适的刚性结构。D.双特异性配体的表征53双特异性配体与其特异性抗原或表位的结合可以用本领域技术人员熟知的方法来测定，该方法包括ELISA。在本发明的一个优选的实施方案中，采用单克隆噬菌体ELISA来测定结合。可以按照任何合适方法，进行噬菌体ELISA:示例性方案如下。可以通过ELISA筛选每轮选择中产生的、与所选抗原或表位结合的噬菌体群体，以鉴定"多克隆"噬菌体抗体。然后可通过ELISA筛选来自单个受感染细菌菌落的这些群体的噬菌体，以鉴定"单克隆"噬菌体抗体。最好也筛选结合抗原或表位的可溶性抗体片段，这也可通过ELISA、采用针对C-端或N-端标记等试剂来进行(参见例如Winter等(1994)Ann.Rev.Immunology12，433-55及其中引用的参考文献。可以通过PCR产物的凝胶电泳(Marks等1991，出处同上；Nissim等1994，出处同上)、探测(Tomlinson等，1992)J.Mol.Biol.227，776)或通过载体DNA测序，来评价所选噬菌体单克隆抗体的多样性。E.双特异性配体的结构如上所述，在本文中，抗体定义为抗体(例如IgG、IgM、IgA、IgA、IgE)或其片段(Fab、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双链抗体)，它包含至少一个重链和轻链可变区、至少两个重链可变区或至少两个轻链可变区。它可以至少部分来源于任何物种天然产生的抗体，或通过重组DNA技术产生的抗体；无论是从下列哪种样品中分离的血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌。在本发明的一个优选实施方案中，双特异性配体包含抗体的至少一个单重链可变区和抗体的一个单轻链可变区、或两个单重链可变区或轻链可变区。例如，配体可包含一对V/V。一对VH区或一对入区。所述配体的第一和第二可变区可以在同一多肽链上。或者它们可在不同多肽链上。就它们在同一多肽链上而言，它们可以通过接头而连接，所述接头优选为如上所述的肽序列。第一和第二可变区可以共价或非共价结合。在它们是共价结合的情况下，共价键可以是二硫键。在采用例如本文所述的噬菌体展示技术从V基因库中选出可变区的情况下，这些可变区可包含通用构架区，使得它们可以被本文所述的特异性通用配体所识别。有关通用构架、通用配体等的用途参见W099/20749。当使用V基因库时，多肽序列中的变异优选位于可变区结构环内。各可变区的多肽序列可以通过DNA改组或通过突变而改变，以便增强各可变区与其互补对的相互作用。DNA改组是本领域已知的，参见例如Stemmer，Nature370:389-391(1994)和美国专利第6，297，053号，所述文献都通过弓I用结合到本文中。其它诱变方法是本领域技术人员众所周知的。在本发明的一个优选实施方案中，"双特异性配体"是单链Fv片段。在本发明的一个替代实施方案中，"双特异性配体"由Fab形式组成。另一方面，本发明提供核酸分子，所述核酸至少编码本文所述的"双特异性配体"。本领域技术人员应该理解，根据本发明该方面，抗原或表位可同时结合同一抗体分子。或者，它们可以竞争性结合同一抗体分子。例如，当两个表位同时结合时，双特异性配体的两个可变区能独立结合它们的靶表位。当这些结构域竞争时，一个可变区能结合其靶标，但是不在其它可变区结合其关联靶标的同时；或者第一可变区能结合其靶标，但不在第二可变区结合其关联靶标的同时。可变区可来自针对靶抗原或表位的抗体。或者，它们可来自单域抗体库，例如在丝状噬菌体表面表达的那些。可以如下所述进行选择。—般而言，可以按照例如以下标准实验室手册的方法，构建并操作实现本发明所需的核酸分子和载体构建体Sambrook等(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual，ColdSpringHarbor,USA。本发明所用的核酸的操作通常在重组载体中进行。因此，另一方面，本发明提供载体，所述载体包含至少编码本文所述的"双特异性配体"的核酸。本文所用的载体是指这样的分离的元件所述元件用于将异源DNA引入细胞，用于表达和/或复制异源DNA。所述载体的选择或构建以及随后的使用方法是本领域技术人员众所周知的。大量载体是公众可得的，包括细菌质粒、噬菌体、人工染色体和附加型载体。这类载体可用于简单克隆和诱变；或者采用基因表达载体。可以选择本发明所用的载体，以适应所需大小的多肽编码序列，长度通常为0.25千碱基对(kb)至40kb或更大。体外克隆操作后，用载体转化合适的宿主细胞。各载体含有不同的功能性组件，通常包括克隆(或"多接头")位点、复制起点和至少一个选择标记基因。如果给定的载体是表达载体，它还可具有一个或多个以下元件增强子元件、启动子、转录终止和信号序列，每个都位于克隆位点附近，使得它们与编码本发明配体的基因有效连接。克隆载体和表达载体一般都含有使载体在一种或多种所选宿主细胞中能复制的核酸序列。通常在克隆载体中，该序列使载体独立于宿主染色体DNA而复制，并且还包含复制起点或自主复制序列。这类序列众所周知可用于多种多样的细菌、酵母和病毒。质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性菌，2ii质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(例如SV40、腺病毒)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，复制起点对哺乳动物表达载体而言是不需要的，除非这些起点用于能高水平复制DNA的哺乳动物细胞，例如C0S细胞。最好克隆载体或表达载体可含有选择基因，也称为选择标记。该基因编码转化宿主细胞在选择培养基中存活或生长所需的蛋白质。因此，没有被含有选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在培养基中存活。典型的选择基因编码这样的蛋白质所述蛋白质赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)和其它毒素抗性、补充生长培养基中所没有的营养缺陷或补充关键性营养物。因为编码本发明配体的载体的复制是在大肠杆菌中常规进行的，所以采用大肠杆菌选择标记，例如赋予抗生素氨苄青霉素抗性的e-内酰胺酶基因。这些可以得自大肠杆菌质粒，例如pBR322或pUC质粒，例如pUC18或pUC19。表达载体通常含有宿主生物可识别的启动子，并且该启动子与目标编码序列操作性连接。这样的启动子可以是诱导型或组成型的。术语"操作性连接"是指并置方式使所述组件的关系允许它们以既定方式起作用。控制序列与编码序列"操作性连接"是指连接方式使得在控制序列相容的条件可进行编码序列的表达。55适用于原核宿主的启动子包括例如13-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子(例如tac启动子)。用于细菌系统的启动子一般还含有与编码序列操作性连接的Shine-Delgarno序列。优选的载体是能表达对应于多肽文库成员的核苷酸序列的表达载体。因此，可以通过表达多肽文库成员的单克隆的单独增殖和表达或者通过使用任何选择展示系统，用第一和/或第二抗原或表位进行选择。如上所述，优选的选择展示系统是噬菌体展示。因此，可以使用噬菌体或噬菌粒载体，例如pITl或pIT2。用于本发明的前导序列包括pelB、stl1、ompA、phoA、bla和pelA。一个实例是具有大肠杆菌复制起点(用于双链复制)以及噬菌体复制起点(用于产生单链DNA)的噬菌粒载体。这类载体的操作和表达是本领域众所周知的(Hoogenboom和Winter(1992)，出处同上；Nissim等(1994)，出处同上)。简而言之，载体含有P-内酰胺酶基因(以便在噬菌粒上赋予选择性)和表达盒上游的lac启动子，后者由以下部分组成(N端一C端)pelB前导序列(指导表达多肽到壁膜间隙)、多克隆位点(用于核苷酸形式的克隆文库成员)、任选一个或多个肽标记(用于检测)、任选一个或多个TAG终止密码子和噬菌体蛋白pIII。因此，使用大肠杆菌的不同抑制菌株和非抑制菌株，并且添加葡萄糖、异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)或辅助噬菌体(例如VCSM13)，载体能够作为质粒进行复制，但却不表达，仅产生大量多肽文库成员或产生噬菌体，它们中的一些在其表面含有至少一个拷贝的多肽-pIII融合体。编码本发明配体的载体的构建采用常规连接技术。分离的载体或DNA片段被切割、剪裁并重新连接成产生所需载体的理想形式。如有必要，可以用已知方式进行分析，证实所构建的载体中存在正确序列。用于构建表达载体、制备体外转录物、将DNA引入宿主细胞、以及进行评价表达和功能的分析所用的合适方法，是本领域技术人员已知的。通过常规方法，检测样品中存在的基因序列、或其扩增和/或表达量，所述常规方法例如例如DNA印迹分析或RNA印迹分析、蛋白质印迹、DNA、RNA或蛋白质斑点印迹、原位杂交、免疫细胞化学或者核酸或蛋白质分子的测序分析。如有必要，本领域技术人员会容易地知道如何改进这些方法。闭合构象多特异性配体的结构根据本发明第二格局的一方面，将两个或更多个非互补表位结合域连接在一起，使它们呈现本文所述的闭合构象。最好除了本文所述的接头之外，它们还可以连接骨架，以便形成和/或维持表位结合位点彼此的闭合构象。(I)骨架骨架可以基于免疫球蛋白分子或者可以是如上所述来源的非免疫球蛋白。本文所述的优选免疫球蛋白骨架包括任何一个或多个选自以下的骨架至少包含以下部分的免疫球蛋白分子(i)抗体的CL(K或A亚类)区；或(ii)抗体重链的CH1区；包含抗体重链CH1区和CH2区的免疫球蛋白分子；包含抗体重链CH1区、CH2区和CH3区的免疫球蛋白分子；或任何(ii)亚类以及抗体的CL(K或A亚类)区。也可以包含铰链区域。这样的各区组合可以是例如例如模拟天然抗体，例如IgG或IgM或其片段，例如Fv、scFv、Fab或F(ab')2分子。本领域技术人员知道，该名单并非是详尽而无遗漏的。(II)蛋白质支架各表位结合域包含蛋白质支架和一个或多个CDR，它们参与结构域与一个或多个56表位的特异性相互作用。最好本发明的表位结合域包含3个CDR。合适的蛋白质支架包括选自以下的任何支架基于免疫球蛋白结构域的支架、基于纤连蛋白的支架、基于亲和体的支架、基于CTLA4的支架、基于陪伴分子例如GroEL的支架、基于脂质运载蛋白的支架和基于细菌Fc受体SpA和SpD的支架。本领域技术人员可以理解，该名单并非是详尽而无遗漏的。F:用于构建双特异性配体的支架i.主链构象的选择免疫球蛋白超家族成员都共享其多肽链的类似折叠。例如，尽管抗体在其一级序列上具有高度多样性，但是序列比较和晶体结构表明，与预期相反，抗体的6个抗原结合环中有5个(H1、H2、L1、L2、L3)采用数目有限的主链构象或正则结构(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196:901;Chothia等(1989)Nature,342:877)。因此，对环长度和关键残基进行分析，能够预测在大多数人抗体中存在的H1、H2、L1、L2和L3的主链构象(Chothia等(1992)J.Mol.Bio1.，227:799;Tomlinson等(1995)EMB0J.，14:4628;Williams等(1996)J.Mol.Biol.，264:220)。尽管H3区在序列、长度和结构上更具多样性(因为使用D区段)，但是它也构成数目有限的短环长度的主链构象，这取决于环及抗体构架的关键位置上特定残基的长度和存在与否，或残基种类(Martin等(1996)J.Mol.Biol.，263:800;Shirai等(1996)FEBSLetters,399:1)。本发明的双特异性配体最好从结构域文库中装配，例如VH区文库和/或、区文库。此外，本发明的双特异性配体本身可以以文库形式提供。在本发明的一方面，设计双特异性配体和/或结构域文库，其中可以选择出某些环长度和关键残基，以保证各成员的主链构象是已知的。如上所述，最好这些是天然存在的免疫球蛋白超家族分子的真实构象，以将它们是非功能性的机会降至最低。种系V基因区段起到一个合适的基本构架的作用，用于构建抗体或T细胞受体文库；也可使用其它序列。可以低频率发生变异，使得少量功能性成员具有改变的主链构象，这样的改变并不影响其功能。正则结构理论也用于评价配体所编码的不同主链构象的数目，以预测基于主链构象的配体序列并选择用于多样化的残基，同时又不影响正则结构。已经知道，在人VK区中，Ll环可采用4种正则结构之一，L2环具有一种正则结构，而且90%的人Vk区的L3环采用4或5种正则结构之一(Tomlinson等(1995)，出处同上)；因此，仅在VK区，不同正则结构可组合产生大量的不同主链构象。假定VA区为L1、L2和L3环编码各种不同正则结构，Vk区和VA区可与任何VH区(其可为HI和H2环编码几种正则结构)配对，则这5个环所观察到的正则结构的组合数量将会非常庞大。这表明主链构象多样性的产生对产生各种结合特异性来说是必不可少的。然而，通过构建基于抗体文库的一种已知主链构象，已经发现，与预期相反，主链构象的多样性并非产生足够的针对几乎所有抗原的多样性所必需的。甚至更令人吃惊的是，一种主链构象不一定是共有结构-一种天然存在的构象可以用作整个文库的基础。因此，在优选的方面，本发明的双特异性配体具有一种已知主链构象。所选的一种主链构象优选在所述免疫球蛋白超家族类型的分子中是常见的。当观察到大量天然存在的分子采用该构象时，该构象是常见的。因此，在本发明的优选方面，单独考虑免疫球蛋白结构域的各结合环的不同主链构象的天然发生率，然后选择具有不同环57的主链构象所需组合的天然存在的可变区。如果没有可用的，就可选择最接近的等同物。优选不同环的主链构象的所需组合是由所选种系基因区段(其编码所需主链构象)产生的。更优选所选种系基因区段在自然界频繁表达，最优选它们在所有天然种系基因区段中是最频繁表达的。在设计双特异性配体或其文库过程中，可以单独考虑6个抗原结合环中每一个的不同主链构象的发生率。对于H1、H2、Ll、L2和L3，选择被20X和100%的天然分子抗原结合环所采用的给定构象。通常，所观察到的它的发生率35%以上(即介于35%和100%之间)、更理想的是50%以上或甚至65%以上。因为绝大多数H3环没有正则结构，所以优先选择在可展示正则结构的环中常见的主链构象。因此，对于每个环来说，选择天然库中最常见的构象。在人抗体中，各环最常见的正则结构(CS)如下H1-CS1(79%表达库)、H2-CS3(46%)、Vk的L1-CS2(39%)、L2_CS1(100%)、Vk的L3-CS1(36%)(计算假定k!入的比例为70:30，Hood等(1967)ColdSpringHarborS卿.Quant.Biol.，48:133)。对于具有正则结构的H3环而言，具有从残基94到残基101的盐桥的7个残基的CDR3长度(Kabat等(1991)SequencesofProteinsofimmunologicalinterest,美国健康禾口人类服务部)看来是最常见的。EMBL数据文库中有至少16个人类抗体序列具有所需H3长度和关键残基，构成该构象，并且在蛋白质数据库中至少有两个晶体结构可用作抗体建模的基础(2cgr和ltet)。最常表达的种系基因区段的正则结构组合是^区段3-23(DP-47)、JH区段JH4b、vk区段02/012(DPK9)和Jk区段Jk1。vh区段DP45和DP38也是合适的。因此，这些区段可用于组合，作为构建具有所需单一主链构象的文库的基础。或者，并非根据分离的各结合环的不同主链构象的天然发生率来选择单一主链构象，而是采用主链构象组合的天然发生率作为选择单一主链构象的基础。就抗体而言，例如，可以确定任何2、3、4、5或所有6个抗原结合环的正则结构组合的天然发生率。在此，优选所选构象在天然存在的抗体中是常见的，最优选它是天然库中所观察到的最常见的。因此，在人抗体中，例如当考虑H1、H2、Ll、L2和L3五个抗原结合环的天然组合时，确定最常见的正则结构的组合，然后结合最常见的H3环构象，作为选择单一主链构象的基础。ii.正则序列的多样化如果具有所选几种已知的主链构象、或者优选单一已知主链构象，可以通过改变分子的结合位点，构建本发明的双特异性配体或本发明所用的文库，以便产生具有结构和/或功能性多样性的库。这表明，产生变异体，使得它们在其结构和/或功能上具有足够的多样性，使得它们能够提供各种活性。所需多样性通常是通过在一个或多个位置上改变所选分子而产生的。可以随机或优选选择所改变的位置。然后，可以通过以下方式达到变异通过随机化(其间残余氨基酸被任何氨基酸或其类似物(天然或合成的)所取代)，产生非常大数量的变异体；或者通过用一个或多个氨基酸的限定亚类来取代残余氨基酸，产生更数目有限的变异体。已经报道了各种方法，用于引入这样的多样性。易错PCR(Hawkins等(1992)J.Mol.Biol.，226:889)、化学诱变(Deng等(1994)J.Biol.Chem.，269:9533)或细菌突变菌株(Low等(1996)J.Mol.Biol.，260:359)可用于将随机突变引入编码分子的基因内。使所选位置发生突变的方法也是本领域众所周知的，它包括使用错配寡核苷酸或简并寡核苷酸，使用或不使用PCR。例如，通过抗原结合环的定向突变，已经产生了一些合成抗体文库。使人破伤风类毒素结合Fab的H3区随机化，以便产生各种新的结合特异性(Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89:4457)。随机或半随机H3和L3区已经附加到种系V基因区段上，产生具有未突变构架区的大文库(Hoogenboom和Winter(1992)J.Mol.Biol.，227:381;Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89:4457;Nissim等(1994)EMBOJ.，13:692;Griffiths等(1994)EMBOJ.，13:3245;DeKruif等(1995)J.Mol.Biol.，248:97)。这样的多样化可以延伸至包括某些或所有其它抗原结合环(Crameri等(1996)NatureMed.，2:100;Riechmann等(1995)Bio/Technology，13:475;Morphosys，W097/08320,出处同上)。因为环随机化仅对H3就具有产生约超过1015种结构的潜力，而对其它5个环也具有产生类似的大数量变异体的潜力，所以不能通过使用现有的转化技术或使用无细胞系统来产生代表所有可能组合的文库。例如，在迄今为止所构建的最大文库之一中，产生6X1(T个不同抗体，这仅仅是该设计文库的潜在多样性的一部分(Griffiths等(1994)，出处同上)。在一个优选的实施方案中，只有直接参与产生或修饰分子所需功能的残基，才被多样化。对于许多分子而言，功能是结合靶标，因此，多样性应该集中在靶结合位点中，而避免改变那些对分子总体包装或保持所选主链构象来说必不可少的残基。正则序列的多样化，当它用于抗体区时就抗体双特异性配体而言，耙结合位点是最常见的抗原结合位点。因此，在高度优选的方面，本发明提供抗体双特异性配体的文库或用于装配它们的文库，其中只有在抗原结合位点的残基才改变。在人抗体库中，这些残基极端多样性，已知让其接触高分辨率抗体/抗原复合物。例如，在L2中，已知位置50和53在天然存在的抗体中是不同的，并且观察到它们与抗原接触。相比之下，常规方法已经改变了相应互补决定区(CDR1)中的所有残基(定义参见Kabat等，1991，出处同上)、本发明所用的文库中多样化的两个相比的某七个残基。这显示了产生各种抗原结合特异性所需的功能多样性的显著改善。在自然界，抗体多样性是两个过程的结果种系V、D和J基因区段的体细胞重组，产生首次用于实验(naive)初级库(所谓的种系和连接多样性)；以及所得重排V基因的体细胞高变。对人类抗体序列进行分析表明，初级库中的多样性集中在抗原结合位点的中心，而体细胞高变则将多样性扩散到抗原结合位点周围区，而这些区在初级库中是高度保守的(参见Tomlinson等(1996)J.Mol.Biol.，256:813)。这一互补性可能逐渐成为检索序列空间的有效策略，而且，尽管显然是抗体所特有的，但是它也可容易地用于其它多肽库。改变的残基是构成靶的结合位点的残基的亚类。如有必要，在选择期间的不同时期，可以改变靶结合位点中残基的不同(包括重叠)亚类。就抗体库而言，产生起始"幼稚"库(initial"naive"r印ertoire)，其中改变抗原结合位点的某些、而不是全部的残基。在这种情况下，本文所用的术语"幼稚(naive)"是指没有预定靶标的抗体分子。这些分子类似于没有经历免疫多样化的个体(例如在胎儿和新生儿个体的情况下)的免疫球蛋白基因所编码的那些分子，所述个体的免疫系统尚未受到各种抗原性剌激的攻击。然后，针对各种抗原或表位来选择该库。如有必要，还可在起始库改变的结构域之外引入更多多样性。可以选择具有修饰功能、特异性或亲和力的这种成熟的库。本发明提供两个不同的幼稚结合域库，用于构建双特异性配体或双特异性配体的幼稚文库，其中改变了抗原结合位点中的某些或所有残基。"初级"文库模拟天然初级库，其多样性限制在抗原结合位点中心的残基，它们在种系V基因区段中具有多样性(种系多样性)，或者在重组过程中被赋予多样性(连接多样性)。这些多样化的残基包括但不限于H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、L94和L96。在"体细胞"文库中，多样性局限于重组过程中改变的残基(连接多样性)或者是高度体细胞突变的)。这些多样化的残基包括但不限于H31、H33、H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34和L96。已知让适于这些文库多样性的以上列出的所有残基接触一个或多个抗体-抗原复合物。因为在这两种文库中，抗原结合位点中并非所有残基都改变，在选择中，通过改变剩余残基而结合另外的多样性，如果需要这样的话。本领域技术人员显而易见的是，任何这些残基(或者包括抗原结合位点的其它残基)的任何亚类都可以用于抗原结合位点的起始和/或后来的多样化。在用于本发明的文库构建中，所选位置的多样化通常是在核酸水平上进行，即通过改变指定多肽序列的编码序列，使得许多可能的氨基酸(所有20种或其亚类)可以结合在该位置。采用IUPAC命名法，最通用的密码子是NNK，它编码所有氨基酸以及TAG终止密码子。NNK密码子优选用于引入所需多样性。也可以使用达到相同末端的其它密码子，包括NNN密码子，该密码子导致产生额外的终止密码子TGA和TAA。人抗体抗原结合位点中侧链多样性的特征明显对某些氨基酸残基有偏倚。如果统计每个V^VK和VA区中的10个最多变的位置的氨基酸组成的话，超过76%的侧链多样性来自仅7个不同残基，它们是丝氨酸(24%)、酪氨酸(14%)、天冬酰胺(11%)、甘氨酸(9%)、丙氨酸(7%)、天冬氨酸(6%)和苏氨酸(6%)。这种倾向于可提供主链柔性的亲水性残基和小残基的偏倚，可能反应了表面进化，该进化倾向于结合各种抗原或表位，并且有助于解释初级库中抗体的所需混杂。因为优选模拟这样的氨基酸分布，所以在有待改变位置上的氨基酸分布优选模拟在抗体的抗原结合位点所见到的那些。这种允许针对各种靶抗原来选择某些多肽(不仅是抗体多肽)的氨基酸取代中的偏倚，易于用于任何多肽库。有各种方法，用于在有待改变的位置上使氨基酸分布发生偏倚(包括使用三核苷酸诱变，参见W097/08320)，其中优选的方法，由于容易合成，是采用常规简并密码子。通过比较由简并密码子所有组合所编码的氨基酸分布型(在各位置上具有等比例的单、双、三和四重简并性)与天然氨基酸的使用，可以计算出最具代表性的密码子。密码子(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)C和(AGT)(AGC)(CT)，也就是说，分别用IUPAC命名法命名的DVT、DVC和DVY-就是最接近所需氨基酸分布型的密码子它们编码22%丝氨酸和11%酪氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸。因此，优选的文库是在各多样化位置上用DVT、DVC或DVY密码子构建的。G:能够延长配体半衰期的抗原本发明的双特异性配体(呈现它的一个格局)能够结合一个或多个在体内延长配体半衰期的分子。通常，这类分子是体内天然存在的多肽，它抵抗通过内源机制所致的降解和/或清除，所述机制能够从生物体中除去不想要的物质。例如，可从以下物质中选出延长生物体半衰期的分子来自胞外基质的蛋白质；例如胶原、层粘连蛋白、整联蛋白和纤连蛋白。胶原是胞60外基质的主要蛋白质。目前已经知道约15种胶原分子，在身体的不同部位发现，例如I型胶原(占身体总胶原的90%)在骨、皮肤、腱、韧带、角膜、内脏中发现，而II型胶原在软骨、椎间盘(invertebraldisc)、脊索、眼睛的玻璃体中发现。血液中发现的蛋白质，包括血浆蛋白，例如血纤蛋白、a-2巨球蛋白、血清白蛋白、血纤蛋白原A、血纤蛋白原B、血清淀粉样蛋白A、珠蛋白、抑制蛋白、泛蛋白、子宫球蛋白和P-2-微球蛋白；酶和抑制剂，例如血纤蛋白溶解酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、a-l-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂。血纤蛋白溶解酶原是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶纤溶酶的无活性前体。它通常在血流循环中存在。当血纤蛋白溶解酶原活化时，就转化成纤溶酶，它打开强效酶促区，溶解血凝块中缠住血细胞的血纤蛋白原纤维。这称为血纤蛋白溶解。免疫系统蛋白质，例如IgE、IgG、IgM。转运蛋白，例如视黄醇结合蛋白、a-1微球蛋白。防卫素，例如13-防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素1、2和3。血脑屏障或神经组织中发现的蛋白质，例如黑皮质素受体、髓磷脂、抗坏血酸转运蛋白。转铁蛋白受体特异性配体-神经药物(neuropharmaceuticalagent)融合蛋白(参见US5977307);脑毛细血管内皮细胞受体、转铁蛋白、转铁蛋白受体、胰岛素、胰岛素样生长因子l(IGF1)受体、胰岛素样生长因子2(IGF2)受体、胰岛素受体。局限于肾脏中的蛋白质，例如多囊蛋白、IV型胶原、有机阴离子转运蛋白K1、Heyma皿抗原。局限于肝脏中的蛋白质，例如醇脱氢酶、G250。血液凝固X因子al抗胰蛋白酶HNFla局限于肺部的蛋白质，例如分泌成分(结合IgA)。局限于心脏中的蛋白质，例如HSP27。它与扩张型心肌病相关。局限于皮肤的蛋白质，例如角蛋白。骨特异性蛋白，例如骨形态发生蛋白质(BMP)，它们是表现出成骨活性(osteogenicactivity)的转化生长因子P超家族亚类。实例包括BMP_2、BMP_4、BMP-5、BMP-6、BMP-7(也称为成骨蛋白(0P-1)和成骨蛋白-8(0P-2)。肿瘤特异性蛋白，包括人滋养层抗原、herc印tin受体、雌激素受体、组织蛋白酶例如组织蛋白酶B(在肝和脾中发现)。疾病特异性蛋白，例如仅在活化T细胞上表达的抗原包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)、护骨蛋白(osteoprotegerin)配体(0PGL)，参见Nature402,304-309;1999，0X40(TNF受体家族成员，在活化T细胞上表达，已知只有共剌激T细胞分子在人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)产生细胞中被特异性上调)。参见J.Immunol.2000年7月1日；165(1):263-70;金属蛋白酶(与关节炎/癌症有关)，包括CG6512果蝇(Drosophila)、人截瘫蛋白、人FtsH、人AFG3L2、鼠ftsH;血管生成生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、血管内皮生长因子/血管通透因子(VE-GF/VPF)、转化生长因子-a(TGFa)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、血管生成素、白介素_3(IL-3)、白介素-8(IL-8)、血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(P1GF)、中期因子(midkine)血小板衍生生长因子-BB(PDGF)、CXXXC趋化因子。应激蛋白(热激蛋白)HSP通常在胞内发现。当在胞外发现它们时，就表明细胞已经死亡并溢出其内容物。这样的非程序性细胞死亡(坏死)仅当作为创伤、疾病或损伤的结果时才发生，因此，在体内，胞外HSP触发免疫系统对抗感染和疾病的反应。结合胞外HSP的双特异性蛋白可以局限于疾病部位。参与Fc转运的蛋白质Brambell受体(也称为FcRB)该Fc受体具有两个功能，这两者可潜在用于递送。其功能是跨越胎盘将IgG从母亲转运给孩子保护IgG免遭降解，因而延长IgG的血清半衰期。认为受体从核内体中再循环IgG。参见Holliger等，NatBiotechnol1997年7月;15(7):632-6。可以设计本发明的配体，使它对以上靶标具有特异性，而不需要延长体内半衰期。例如，本发明的配体可以对选自前述的组织特异性靶标具有特异性，因此使结合组织特异性治疗相关靶标的双特异性配体或dAb单体具有组织特异性，无论半衰期怎么延长，尽管这可导致半衰期的延长。此外，当配体或dAb单体耙向肾脏或肝脏时，这可使配体或dAb单体改变体内替代清除途径(例如，配体可从肝脏清除改为肾脏清除)。H:本发明第二格局的多特异性配体的用途本发明第二格局的多特异性配体可用于体内治疗和预防用途、体外和体内诊断用途、体外测定和试剂用途等。例如，按照本领域技术人员已知的方法，抗体分子可用于基于抗体的测定技术，例如ELISA技术。如上所述，本发明的多特异性配体可用于诊断、预防和治疗方法。本发明的多特异性抗体在诊断中可用于蛋白质印迹分析和通过标准免疫组织化学方法进行的原位蛋白质检测；对于这些用途而言，可以采用本领域已知技术，对配体进行标记。另外，这类抗体多肽可制备性地用于亲和色谱方法，当与色谱支持物例如树脂结合时。所有这些方法都是本领域技术人员众所周知的。本发明的闭合构象多特异性配体的诊断应用包括均质测定，用于测定这样的分析物所述分析物能利用闭合构象多特异性配体与两个靶标竞争性结合的能力，使得两个靶标不能同时结合(闭合构象)，或者它们能够同时结合两个靶标(开放构象)。在本发明第二格局的又一方面，本发明提供均质免疫测定，采用本发明的配体。诊断试剂和研究测定系统制造商一直在热切寻找真正的均质免疫测定形式，用于药物发现和开发。主要的诊断试剂市场包括在医院、医生办公室和诊所、商业参考实验室、血库和家庭中进行的人体检测，非人体诊断(例如食品检验、水质化验、环境监测、生物防制(bio-defence)和兽医检查)，以及最终研究(包括药物开发；基础研究和学术研究)。目前，所有这些市场都采用免疫测定系统，这些都是围绕化学发光、ELISA、荧光或(在很少的情况下)放免测定技术而建立起来的。这些测定形式的每一种都需要分离步骤(将结合物与未结合物分开)。在某些情况下，需要几个分离步骤。添加这些附加步骤增加了试剂和自动化仪器、花费时间并且影响最终的测定结果。在人体诊断中，分离步骤可以是自动化的，这掩盖了问题、但并未消除问题。机器人技术、额外的试剂、额外的孵育时间等等都增加了相当大的成本和复杂性。在药物开发例如高通量筛选中，当同时检测数百万份样品且待测分子水平非常低时，增加额外的分离步骤可消除进行筛选的能力。然而，避免分离则在读出时产生太多噪声。因此，需要真正的均质形式，所述形式在现有检测形式所得范围内提供灵敏度。最好测定具有完整定量读出，并具有高灵敏度和大的动态范围。灵敏度是重要要求，因为降低了所需样品数量。这些特征都是均质系统提供的。在样品非常珍贵的医学检验(caretesting)和药物开发中，这一点非常重要。本领域目前采用的异质系统需要大量样品和昂贵试剂。均质测定的应用包括癌症检查，其中最大的测定是前列腺特异性抗原，用于筛选男人的前列腺癌。其它应用包括生育检查，它为想怀孕的妇女提供一系列检查，包括a-hcg，用于妊娠。感染性疾病的检测，包括肝炎、HIV、风疹和其它病毒和微生物和性传播疾病。检测可用于血库，特别是检测HIV、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、非甲非乙型肝炎。治疗药物监控试验包括监控处方药在患者体内的水平，以便达到功效和避免毒性，例如地高辛对心律失常的功效、以及精神病患者体内的苯巴比妥水平；茶碱对哮喘的功效。诊断测定还可用于药物滥用测定，例如测定可卡因、大麻等。代谢测定用于测定甲状腺功能、贫血和其它生理性障碍和功能。均质免疫测定形式还用于标准临床化学测定的制造。免疫测定和化学测定都在同一仪器上进行，对诊断测定是非常有利的。合适的化学测定包括葡萄糖、胆固醇、钾等测定。均质免疫测定的另一个主要用途就是药物发现和开发高通量筛选包括以超大体积、针对靶标测定组合化学文库。检测信号，再将阳性组分为更小的组，最终在细胞中、继而在动物体内进行测定。均质测定可用于所有这些类型的测定。在药物开发、尤其是动物研究和临床试验中，大量采用免疫测定。均质测定极大地促进和简化了这些方法。其它应用还包括食品饮料检测检测肉类和其它食品中的大肠杆菌、沙门氏菌(salmonella)等；水质化验，包括在水厂检测所有类型的污染物，包括大肠杆菌；和兽医检验。在一个广泛的实施方案中，本发明提供包含检测试剂的结合测定，所述试剂结合本发明的闭合构象多特异性配体，其检测特性因分析物与所述闭合构象多特异性配体的结合而改变。这样的测定可以几种不同方式进行，每种方式采用闭合构象多特异性配体的以上特性。测定依赖于试剂直接或间接地被分析物取代，导致试剂的检测特性发生变化。例如，当试剂是能够催化反应(所述反应具有可检测终点)的酶，而配体可以结合所述酶，以阻碍例如其活性部位，从而使酶失活。闭合构象多特异性配体也可以结合分析物，以取代酶，通过释放活性部位而使它活化。然后，酶与底物反应，引起可检测事件。在一个替代实施方案中，所述配体可在活性部位之外与酶结合，影响酶的构象，因而改变其活性。例如，活性部位的结构可因结合配体而受到限制，或者可以阻止活性所必需的辅因子的结合。测定的实际操作可以采用本领域任何已知形式。例如，可以在测试条上提供闭合构象多特异性配体/酶复合物；可以在测试条的不同区提供底物，并提供含有分析物的溶剂，允许分析物通过配体/酶复合物而迁移，取代酶，并携带它到达底物区，产生信号。或者，可在测试棒或其它固相上提供配体/酶复合物，再浸泡到分析物/底物溶液中，使酶释放到溶液中，以响应存在的分析物。因为每个分析物分子潜在释放一个酶分子，所以测定是定量的，在给定时间内产生的其信号强度依赖于溶液中分析物浓度。采用闭合构象的分析物的其它格局也是可能的。例如，闭合构象多特异性配体可以在变构位点结合酶，由此活化酶。在这样的实施方案中，在分析物不存在时，酶是有活性的。加入分析物取代酶，去除变构激活作用，从而使酶失活。就使用酶活性作为分析物浓度的度量的以上实施方案而论，酶的活化或失活是指酶活性的增加或降低，是以酶催化产生信号的反应的能力而定。例如，酶可催化无法检测的底物转化成为其可检测形式。例如，辣根过氧化物酶与显色底物或化学发光底物一起广泛用于本领域，它们都是市售可得的。酶活性的增加或下降水平可以介于10%和100%之间，例如20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%;在活性增加的情况下，增加可超过100%，即200%、300%、500%以上，或者，如果抑制酶的基线活性无法检测的话，就不能测定其增加百分比。在另一格局，闭合构象多特异性配体能结合酶/底物对中的底物、而不是酶。因此，底物不能利用酶，直到通过分析物结合而使酶从闭合构象多特异性配体中释放出来。这一格局的实施与结合酶的格局是一样的。此外，可以使测定结合荧光分子，例如荧光素或别的荧光团，其构象使得在结合配体后荧光被猝灭。在这种情况下，分析物与配体的结合将取代荧光分子，从而产生信号。本发明所用的荧光分子的替代物包括冷光试剂(例如萤光素/萤光素酶)和显色试剂(包括免疫测定中常用的试剂，例如HRP)。治疗和诊断组合物及其用途本发明提供组合物以及使用本发明配体或组合物的治疗和诊断方法，所述组合物包含本发明的TNFR1拮抗剂(例如配体)(例如双特异性配体、多特异性配体、dAb单体)和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本发明方法的拮抗剂和配体(例如双特异性配体、多特异性配体、dAb单体)可用于体内治疗和预防用途、体内诊断用途等。本发明拮抗剂和配体(例如多特异性配体、双特异性配体、dAb单体)的治疗和预防用途包括将本发明拮抗剂和/或配体给予哺乳动物受体，例如人。双特异性和多特异性配体(例如双特异性抗体形式)以高亲和力结合多聚体抗原。双特异性或多特异性配体可使两个抗原交联，例如在募集的细胞毒T细胞中，从而介导肿瘤细胞系的杀伤。优选将至少90-95%同质性(homogeneity)的基本纯化的配体或其结合蛋白(例如dAb单体)给予哺乳动物，最优选98-99%以上同质性供药用，尤其是当哺乳动物是人时。一旦部分纯化或纯化至所需同质性时，配体可用于诊断或治疗(包括离体)或用于开发和实施测定方法、免疫荧光染色等(Lefkovite和Pernis，(1979和1981)Imm皿ologicalMethods，第I禾口II巻，AcademicPress,NY)。例如，本发明的配体或其结合蛋白，例如dAb单体，通常可用于预防、抑制或治疗炎性状态，包括急性及慢性炎性疾病。例如，可以给予拮抗剂和/或配体，以治疗、抑制或预64防慢性炎性疾病、变应性超敏反应、癌症、细菌性或病毒性感染、自身免疫性疾病(包括但不限于I型糖尿病、哮喘、多发性硬化、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、脊椎关节病(spondylarthr叩athy)(例如关节强硬性脊椎炎)、系统性红斑狼疮、炎性肠病(例如节段性回肠炎(Crohn'sdisease)、溃疡性结肠炎)、重症肌无力和Behcet氏综合征)、银屑病、子宫内膜异位症和腹部粘连(例如腹部手术后)。能结合参与胞吞作用的胞外靶标(例如网格蛋白(Clathrin))的本发明拮抗剂(例如配体)(例如双特异性配体、多特异性配体、dAb单体)可以被胞吞，使它们能接近胞内靶标。此外，双特异性或多特异性配体可提供这样的方法通过该方法将特异性结合胞内靶标的结合域(例如dAb单体)递送到胞内环境。该策略需要例如这样的双特异性配体其物理特性能让它在细胞内保留功能性。或者，如果最终目的地的胞内区室是氧化态的，良好折叠的配体可能不需要游离二硫化物。在本发明的应用中，术语"预防"包括在疾病诱发之前给予保护性组合物。"抑制"是指在诱导事件之后、而在临床上出现疾病之前给予组合物。"治疗"包括在疾病症状出现后给予保护性组合物。最好双特异性或多特异性配体可用于针对在生物体内治疗环境中协同作用的细胞因子和其它分子。因此，本发明提供协同能结合细胞因子或其它分子的两个或更多个结合域(例如dAb)活性的方法，该方法包括给予能够结合所述两个或更多个分子(例如细胞因子)的双特异性或多特异性配体。在本发明的这一方面，双特异性或多特异性配体可以是任何双特异性或多特异性配体，包括由互补和/或非互补区组成的配体、开放构象的配体和闭合构象的配体。例如，本发明的这一方面涉及VH区和、区的组合、仅有VH区的组合和仅有、区的组合。在治疗中可以多种方式达到协同。例如，仅当配体同时针对两个靶标时，耙标组合才具有治疗活性，而仅针对一个靶标则没有疗效。在另一个实施方案中，仅一个靶标可提供稍低或最小疗效，但是与第二靶标一起的组合协同性地增加了疗效。优选在本发明这一方面的双特异性或多特异性配体所结合的细胞因子选自附录2所示的列表。此外，双特异性或多特异性配体可用于肿瘤学用途，所述配体的一个特异性是针对CD89(它是由细胞毒细胞表达的)，而其它特异性则是肿瘤特异性的。所针对的肿瘤抗原的实例见附录3。可以采用动物模型系统，用于在保护机体免遭疾病或治疗疾病中筛选TNFR1拮抗剂(例如配体、抗体或其结合蛋白)的有效性。在易感小鼠中检测系统性红斑狼疮(SLE)的方法是本领域已知的(Knight等(1978)J.Exp.Med.，147:1653;Reinersten等(1978)NewEng.J.Med.，299:515)。在SJL/J雌性小鼠中，通过用来自另一物种的可溶性AchR蛋白诱发疾病，检测重症肌无力(MG)(Lindstrom等(1988)Adv.Immunol.，42:233)。在易感的小鼠品系中，通过注射II型胶原诱发关节炎(Stuart等(1984)Ann.Rev.Immunol.，42:233)。在易感大鼠中通过注射分枝杆菌热激蛋白而诱发佐剂关节炎的模型已有描述(VanEden等(1988)Nature,331:171)。描述了通过给予甲状腺球蛋白，在小鼠中诱发甲状腺(Maron等(1980)J.E邓.Med.，152:1115)。在某些品系的小鼠中，胰岛素依赖型糖尿病(腦)可自然发生或者可以诱发产生，所述小鼠例如Kanasawa等(1984)Diabetologia，27:113描述的那些。小鼠和大鼠的EAE可作为模型，用于人类的MS。在该模型中，脱髓鞘疾病可以通过给予髓磷脂碱性蛋白而诱发(参见Paterson(1986)TextbookofImmunopathology，Mischer等(主编)，Grune和Stratton，NewYork，第179-213页；McFarlin等(1973)Science,179:478;Satoh等(1987)J.Immunol.，138:179)。通常，纯化形式的本发明拮抗剂(例如配体)可与药理学上合适的载体一起使周。通常，这些载体包括水性或醇/水溶液剂、乳剂或混悬剂，任意包括盐水和/或缓冲介质。胃肠外溶媒包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠和乳酸化林格液。可以从增稠剂中选出合适的生理上可接受的辅料，如果需要在混悬剂中维持多肽复合物的话，这些增稠剂例如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。静脉内溶媒包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的那些。也可含有防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版)。各种合适制剂都可采用，包括延长释放的制剂。可以单独给予的组合物形式使用本发明的拮抗剂(例如配体)，或者将其与其它药物联用。这些药物可包括各种免疫治疗药，例如环孢菌素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂和免疫毒素。药物组合物可包含各种细胞毒剂或其它药物以及本发明拮抗剂(例如配体)、或者甚至是具有不同特异性的本发明配体(例如用不同靶抗原或表位所选择的配体)的组合的"合剂"，无论它们是否在给药之前混合。本发明药物组合物的给药途径可以是本领域普通技术人员公知的任何途径。对于治疗(包括但不限于免疫治疗)来说，可以采用标准技术，将本发明所选配体给予任何患者。可通过任何合适方式给予，包括胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、经皮、通过肺部途径，或者合适的是，通过导管直接输注。给药剂量和频次将取决于患者年龄、性别和状况、同时给予的其它药物、对抗适应症(counterindication)和临床医生要考虑的其它参数。按照指示，可以局部给药(例如局部给予肺部，通过肺部给药，例如鼻内给药)或系统给药。可将本发明配体冻干后贮存备用，使用前重配在合适载体中。已知该技术对常规免疫球蛋白来说是有效的，可以采用本领域已知的冻干和重配技术。本领域技术人员可以理解，冻干和重配可导致不同程度的抗体活性丧失(例如对于常规免疫球蛋白，IgM抗体要比IgG抗体活性损失更高)，因此使用水平应调高以便进行补偿。可以给予含有本发明拮抗剂(例如配体)或其合剂的组合物，用于预防和/或治疗性治疗。在某些治疗应用中，达到至少部分抑制、遏制、调节、杀伤或某些其它可检测参数的所选细胞群体的足够用量，定义为"治疗有效量"。尽管达到该剂量所需的用量将取决于疾病严重程度和患者自身免疫系统的一般状态，但是通常范围为每千克体重O.005-5.0mg配体(例如抗体、受体(例如T细胞受体)或其结合蛋白)，更常用的剂量为0.05-2.0mg/kg/剂量。对于预防应用而言，也可以类似或稍低剂量给予含有本发明配体或其合剂的组合物，以预防、抑制或延迟疾病发作(例如维持缓解或静止状态，或者预防急性期)。熟练的临床医生能够确定合适的给药间隔，以便治疗、抑制或预防疾病。当给予TNFR1拮抗剂(例如配体)以治疗、抑制或预防慢性炎性疾病时，可以给予最多4次/天，每周两次，每周一次，每两周一次，每月一次，每两月一次，其剂量例如为约10iig/kg至约80mg/kg、约100iig/kg至约80mg/kg、约lmg/kg至约80mg/kg、约lmg/kg至约70mg/kg、约lmg/kg至约60mg/kg、约lmg/kg至约50mg/kg、约lmg/kg至约40mg/kg、约lmg/kg至约30mg/kg、约lmg/kg至约20mg/kg、约lmg/kg至约10mg/kg、约10ug/kg至约10mg/kg、约10ug/kg至约5mg/kg、约10lig/kg至约2.5mg/kg、约lmg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg。在具体的实施方案中，给予TNFR1拮抗剂(例如配体)以治疗、抑制或预防慢性炎性疾病，每两周一次或每月一次，剂量为约10i!g/kg至约10mg/kg(例如约10iig/kg、约100iig/kg、约lmg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg)。相对于治疗前所具有的所述症状、或者相对于未用所述组合物或其它合适对照治疗的个体(人或模型动物)的所述症状而言，当一种或多种症状减少(例如达至少10%或在临床评价量表中达至少一个点)时，就认为用本文所述的组合物进行的治疗是"有效"的。尽管症状明显不同，取决于所针对的疾病或障碍，但是可以由普通有技术的临床医生或技术人员进行测定。这些症状可以通过例如以下方法来测定通过监测疾病或障碍的一种或多种生化指标水平(例如疾病相关的酶或代谢物水平，受累细胞数量等)、通过监测身体表现(例如炎症、肿瘤大小等)、或者通过可接受的临床评价量表(例如扩大失能状态量表(ExpandedDisabilityStatusScale)(用于多发性硬化)、Irvine炎性肠病问巻调查表(32点评价表，评价有关肠功能、全身症状、社交功能和情感状态的生活质量-评分范围为32-224，评分越高表明生活质量越好)、类风湿性关节炎生活质量量表、或本领域已知的其它可接受的临床评价量表。疾病或障碍症状持续(例如一天以上，优选超过一天)下降达至少10%或者在给定临床量表上下降达一个点或多个点，就表明是"有效"治疗。同样，相对于未经组合物治疗的类似个体(人或动物模型)的所述症状而言，当一种或多种症状的发作或严重程度被延迟、减少或消除时，用本文所述的组合物进行预防就是"有效"的。含有本发明的拮抗剂(例如配体)或其合剂的组合物可用于预防和治疗装置，以帮助改变、钝化、杀伤或去除哺乳动物的所选靶细胞群体。另外，本文所述的所选多肽库可用于离体或体外选择性杀伤、耗尽或从异质细胞群体中有效去除靶细胞群体。可以按照标准技术，将来自哺乳动物的血在离体情况下与配体(例如抗体、细胞表面受体或其结合蛋白)混合，由此杀伤或从血液中除去不想要的细胞，再回输到哺乳动物体内。含有本发明的拮抗剂(例如配体)的组合物可用于预防和治疗装置，以帮助改变、钝化、杀伤或去除哺乳动物的所选靶细胞。可以给予TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb单体)和/或与一种或多种其它治疗药或活性药一起配制。当TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb单体)与其它治疗药一起给予时，TNFR1拮抗剂可以在给予其它药物之前、同时或之后给予。通常，TNFR1拮抗剂(例如配体、dAb单体)和其它药物的给予方式能提供重叠疗效。在一个实施方案中，本发明是治疗、抑制或预防慢性炎性疾病的方法，该方法包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的TNFR1拮抗剂(例如包含能结合TNFR1的dAb单体的配体)。在一个实施方案中，本发明是治疗、抑制或预防关节炎(例如类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、关节强硬性脊椎炎、银屑病性关节炎)的方法，该方法包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的TNFR1拮抗剂(例如包含能结合TNFR1的dAb单体的配体)。在另一个实施方案中，本发明是治疗、抑制或预防银屑病的方法，该方法包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的TNFR1拮抗剂(例如包含能结合TNFR1的dAb单体的配67体)。在另一个实施方案中，本发明是治疗、抑制或预防炎性肠病(例如节段性回肠炎、溃疡性结肠炎)的方法，该方法包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的TNFRl拮抗剂(例如包含能结合TNFRl的dAb单体的配体)。在另一个实施方案中，本发明是治疗、抑制或预防慢性阻塞性肺病(例如慢性支气管炎、慢性阻塞性支气管炎、肺气肿)的方法，该方法包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的TNFRl拮抗剂(例如包含能结合TNFRl的dAb单体的配体)。在另一个实施方案中，本发明是治疗、抑制或预防肺炎(例如细菌性肺炎，例如葡萄球菌性肺炎)的方法，该方法包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的TNFRl拮抗剂(例如包含能结合TNFRl的dAb单体的配体)。本发明提供治疗、抑制或预防除了慢性阻塞性肺病以外的其它肺病和肺炎的方法。按照本发明可治疗、抑制或预防的其它肺病包括例如囊性纤维化和哮喘(例如甾体抵抗型哮喘)。因此，在另一个实施方案中，本发明是治疗、抑制或预防肺病(例如囊性纤维化、哮喘)的方法，该方法包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的TNFRl拮抗剂(例如包含能结合TNFRl的dAb单体的配体)。在具体的实施方案中，TNFRl拮抗剂是通过肺部给予，例如通过吸入(例如支气管内、鼻内或口腔吸入、鼻内滴剂)或通过系统给予(例如胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、皮下)。在另一个实施方案中，本发明是治疗、抑制或预防脓毒性休克的方法，该方法包括给予有需要的哺乳动物治疗有效量的TNFRl拮抗剂(例如包含能结合TNFRl的dAb单体的配体)。在本发明的第二格局的再一方面，本发明提供组合物，所述组合物包含闭合构象多特异性配体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述配体是通过本发明的方法获得的。此外，本发明提供用"闭合构象多特异性配体"或本发明的组合物治疗疾病的方法。在本发明的一个优选实施方案中，所述疾病是癌症或炎性疾病，例如类风湿性关节炎、哮喘或节段性回肠炎。在本发明的第二格局的另一方面，本发明提供诊断方法，包括用本发明的闭合构象多特异性配体或组合物诊断疾病。因此，一般而言，可以利用分析物与闭合构象多特异性配体的结合来替代某种试剂(agent)，所述试剂在替代时导致信号产生。例如，分析物(第二抗原)的结合可替代酶(第一抗原)结合抗体，提供了免疫测定的基础，尤其是当酶通过其活性部位保持抗体时。因此，本发明提供检测靶分子存在的方法，该方法包括(a)提供结合某种试剂的闭合构象多特异性配体，所述配体对靶分子和该试剂具有特异性，其中与配体结合的试剂导致可检测信号的产生，当替代配体时；(b)将闭合构象多特异性配体暴露给靶分子；禾口(c)检测试剂替代而产生的信号。根据本发明的第二格局的以上方面，最好试剂是酶，当与闭合构象多特异性配体结合时所述酶是无活性的。或者，试剂可以是选自以下的任何一种或多种物质酶的底物和荧光分子、发光分子或显色分子，所述分子当与配体结合是无活性的或者被猝灭。另外，本文所述的所选多肽库可用于离体或体外选择性杀伤、耗尽或从异质细胞群体中有效去除靶细胞群体。可以按照标准技术，将来自哺乳动物的血在离体情况下与配体(例如抗体、细胞表面受体或其结合蛋白)混合，由此杀伤或从血液中除去不想要的细胞，再回输到哺乳动物体内。实施例下面的实施例进一步描述了本发明，这些实施例仅用于说明目的。为了给dAb命名，本文所用的人TNFa称为TAR1，人TNFa受体1(p55受体)称为TAR2。实施例1.针对人血清白蛋白(HSA)和13-半乳糖苷酶(13-gal)的双特异性scFv抗体(K8)的选择该实施例说明了制备针对13-gal和HAS的双特异性抗体的方法，其中选择了与种系(dummy)Vh区連接的Vk可变区库用于结合P-gal，并且选择了与种系(dummy)Vk区连接的VH可变区库，用于结合HAS。然后将所选的可变VHHSA和VkP-gal区结合在一起，选择结合P-gal和HSA的抗体。HAS是人血中存在的半衰期延长蛋白。本实验中使用了4个人类噬菌体抗体文库。文库1:种系Vk/DVTVH8.46X107文库2:种系Vk/NNKVH9.64X107文库3:种系VH/DVTVk1.47X108文库4:种系VH/NNKVk1.45X108所有文库都基于VH(V3_23/DP47和JH4b)和Vk(012/02/DPK9和Jk1)的单一人构架，其中侧链多样性结合到互补决定区(CDR2和CDR3)中。文库1和文库2含有dummyVk序列，而VH序列在位置H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97和H98(DVT或NNK分别编码)上具有多样性(图1)。文库3和文库4含有dummyVH序列，Vk序列在位置L50、L53、L91、L92、L93、L94和L96(DVT或NNK分别编码)上具有多样性(图1)。文库呈现噬菌粒pIT2/ScFv形式(图2)并且已经预选出了所述文库对蛋白A和蛋白L通用配体的结合性，使得非选择性文库中的大部分克隆都是功能性的。以上所示的文库大小对应于预选后的大小。在针对抗原进行选择前，将文库l和文库2混合，得到单一VH/dummyVk文库，将文库3和文库4混合，形成单一Vk/dummyVH文库。对|3-gal进行3轮选择，使用Vk/DummyVH文库，并对HSA进行3轮选择，使用VH/dummyVk文库。就P-gal而言，噬菌体效价从第一轮的1.1X106到第三轮的2.0X108。就HAS而言，噬菌体效价从第一轮的2X10，j第三轮的1.4X109。按照Griffith等(1993)所述，进行选择，除了使用KM13辅助噬菌体(其含有蛋白酶切位点在D2和D3区的pIII蛋白)而且噬菌体用lmg/ml胰蛋白酶的PBS进行洗脱以外。加入胰蛋白酶，通过在c-myc标记的切割，切割来自辅助噬菌体(而不是来自噬菌粒)的Pi11蛋白，洗脱结合scFV-噬菌体融合体(图2)，因而进一步富集了噬菌体表达的功能性scFvs，并相应减低了背景(Kristensen和Winter,Folding&Design3:321-328，1998年7月9日)。使用浓度100iig/ml的HSA69或P-gal包被的免疫管(Imm皿otube)，进行选择。为了检查结合，用单克隆噬菌体ELISA筛选来自各选择的第三轮的24个菌落。按照Harrison等(MethodsEnzymol.1996;267:83-109)所述，产生噬菌体颗粒。96孔ELISA板用100ill10iig/mlHSA或P-gal的PBS，在4"包被过夜。按照标准ELISA方案(Hoogenboom等，1991)，采用结合噬菌体与抗M13-HRP缀合物的检测。对克隆进行选择，得到50ii1上清液中的ELISA信号大于1.0。然后，采用QIApr印SpinMinipr印试剂盒(Qiagen)，用针对HAS而选择的VH/dummyVk文库以及针对P-gal而选择的Vk/dummyVH文库制备DNA制备物。为了得到大部分多样性，从3轮选择的每一轮制备DNA制备物，再合在一起用于每种抗原。再将DNA制备物用SalI/Notl在37t:消化过夜。接着对片段进行凝胶纯化，将来自针对P-gal而选择的Vk/dummyVH文库的Vk链，连接在针对HAS而选择的VH/dummyVk文库的dummyVk链的位置上，得到3.3Xl(f个克隆的文库。然后，针对HSA(第一轮)和13-gal(第二轮)对该文库进行HSA/P-gal选择，或者针对P-gal(第一轮)和HSA(第二轮)对该文库进行13-gal/HSA选择。如上所述进行选择。在第二轮后的每种情况下，通过单克隆噬菌体ELISA(如上所述)并通过可溶性scFv片段的ELISA，测定48个克隆与HSA和P-gal的结合。按照Harrison等(1996)和标准ELISA方案(Hoogenboom等(1991)NucleicAcidsRes.，19:4133)所述，产生可溶性抗体片段，只是采用2%吐温(Tween)/PBS作为封闭缓冲液，以及用蛋白L-HRP检测结合scFv。来自HSA/P-gal选择的3个克隆(E4、E5和E8)和来自P-gal/HSA选择的2个克隆(K8和K10)能结合这两种抗原。按照Ignatovich等(1999)J.Mol.Biol.，1999年11月26日；294(2):457-65所述，使用引物LMB3和pHENseq，对来自这些克隆的scFv进行PCR扩增并测序。序列分析表明，所有克隆都是相同的。因此，只选择一个编码双特异性抗体的克隆(K8)进行进一步工作(图3)。实施例2.K8抗体结合特性的表征首先，K8抗体的结合特性通过单克隆噬菌体ELISA来表征。96孔板用100lOyg/mlHSA和P-gal以及碱性磷酸酶(APS)、牛血清白蛋白(BSA)、花生凝集素、溶菌酶和细胞色素c(以检查交叉反应)的PBS在4。C包被过夜。按照Harrison等(1996)所述，将来自K8克隆的噬菌粒用KM13拯救，含有噬菌体的上清液(50iU)直接进行测定。按照标准ELISA方案(Hoogenboom等，1991)，用抗M13-HRP缀合物检测结合噬菌体。当在噬菌体表面展示时，发现双特异性K8抗体能结合HSA和P-gal，其吸收信号大于l.O(图4)。也观察到与BSA的强烈结合(图4)。因为HSA和BSA在氨基酸水平上具有76X同源性，所以毫不奇怪，K8抗体能识别这些结构相关的蛋白质。未检出与其它蛋白质的交叉反应性(图4)。其次，在可溶性scFvELISA中检测了K8抗体的结合特性。按照Harrison等(1996)，可溶性scFv片段是由IPTG诱导产生的。为了测定K8scFv的表达水平，按照Harlow禾口Lane(Antibodies:aLaboratoryManual,(1988)ColdSpringHarbor)所述，用蛋白A-琼脂糖S印h柱，从50ml诱导的上清液中纯化出可溶性抗体片段。按照Sambrook等(1989)所述，测定0D，并计算蛋白质浓度。上清液中产生的K8scFv为19mg/L。再用已知浓度的K8抗体片段，进行可溶性scFvELISA。96孔板用100ii1HSA、BSA和P-gal以10iig/ml禾P100蛋白A的1yg/ml浓度包被。采用50y1K8scFv的系列稀释液，结合抗体片段用蛋白L-HRP检测。ELISA结果证实K8抗体的双特异性(图5)。为了证实与P-gal的结合是由Vk区确定，与HSA/BSA的结合是由K8scFv抗体的VH区确定，经Sall/NotI消化，将Vk区从K8scFvDNA上切下，并连接到经Sall/NotI消化的含有dummyVH链的pIT2载体中(图1和2)。所得克隆K8Vk/dummyVH的结合表征通过可溶性scFvELISA进行分析。按照Harrison等(1996)，可溶性scFv片段是由IPTG诱导产生的，含有scFv的上清液(50)直接进行测定。按照实施例1所述，进行可溶性scFvELISA，结合scFv用蛋白L-HRP测定。ELISA结果表明，该克隆仍能结合P-gal，而与BSA的结合已被消除掉(图6)。实施例3.针对抗原A和B的VH单域抗体的选择，以及针对抗原C和D的Vk单域抗体的选择该实施例描述了针对抗原A禾PB的VH单域抗体，以及针对抗原C禾PD的Vk单域抗体的制备方法，即通过在互补可变区不存在时，选择处女(virgin)单抗体可变区库对这些抗原的结合。按照前述方法(参见实施例5，PCT/GB02/003014)，进行结合克隆的选择和表征。选择4个克隆进行进一步工作VH1-抗AVHVH2-抗BVHVK1-抗CVkVK2-抗DVk可以采用以上实施例1-3所述的方法，按照所述类似方式，产生包含VH区组合(即VH_VH配体)和、区组合(Vf、配体)的二聚体分子。实施例4.双特异性ScFv抗体的产生和表征(针对抗原A和B的VH1/VH2以及针对抗原C和D的VK1/VK2)该实施例证明，可以通过将针对ScFv载体中各自抗原而选择的Vk和VH单域结合起来，产生双特异性ScFv抗体(针对抗原A和B的VH1/VH2以及针对抗原C和D的VK1/VK2)。为了产生双特异性抗体VH1/VH2，经Ncol/Xhol消化，从可变区载体1上切下VH1单域(图7)并连接到经Ncol/Xhol消化的可变区载体2上(图7)，产生VH1/可变区载体2。通过PCR，使用引物，从可变区载体l扩增VH2单区，将Sa11限制位点引入5'端并将Notl限制位点引入3'端。再将PCR产物用Sall/NotI消化并连接到经Sall/NotI消化的VHl/可变区载体2上，产生VH1/VH2/可变区载体2。VK1/VK2/可变区载体2以类似方式产生。按照前述可溶性ScFvELISA的方法(参见实施例6，PCT/GB02/003014)，测定所产生的VH1/VH2ScFv和VKl/VK2ScFv的双特异性。按照前述方法(参见实施例8，PCT/GB02/003014)，进行竞争性ELISA。可能结果-VH1/VH2ScFv能同时抗原A和B-VK1/VK2ScFv能同时抗原C和D-VH1/VH2ScFv结合是竞争性的(当结合抗原A时，VHl/VH2ScFv不能结合抗原B)-VK1/VK2ScFv结合是竞争性的(当结合抗原C时，VKl/VK2ScFv不能结合抗原D)。实施例5.双特异性VHl/VH2Fab和VK1/VK2Fab的构建及其结合特性的分析为了产生VHl/VH2Fab，将VH1单域连接到经Ncol/Xhol消化的CH载体上(图8)，产生VH1/CH，再将VH2单域连接到经Sall/NotI消化的CK载体上(图9)，产生VH2/CK。按照前述方法(参见实施例8，PCT/GB02/003014)，用来自VH1/CH和VH2/CK的质粒DNA用于共转化感受态大肠杆菌细胞。按照前述方法(参见实施例8，PCT/GB02/003014)，含有VH1/CH和VH2/CK质粒的克隆再用IPTG诱导，产生可溶性VHl/VH2Fab。VK1/VK2Fab按类似方法产生。按照前述的竞争性ELISA(参见实施例8，PCT/GB02/003014)，测定所产生的Fab的结合特性。可能结果-VH1/VH2Fab能同时抗原A和B-VK1/VK2Fab能同时抗原C和D-VH1/VH2Fab结合是竞争性的(当结合抗原A时，VH1/VH2Fab不能结合抗原B)-VK1/VK2Fab结合是竞争性的(当结合抗原C时，VK1/VK2Fab不能结合抗原D)。实施例6.使dAb二聚体螯合概述用柔性多肽接头，产生dAb-接头-dAb形式的VH和VK同型二聚体。产生dAb接头-dAb形式的载体，其含有不同长度的甘氨酸-丝氨酸接头3U:(GlhSer)3(SEQIDNO:199)、5U:(Gly4Ser)5(SEQIDNO:629)、7U:(Gly4Ser)7(SEQTDNO:630)。用接头的定向dAb上游和接头之后相应第二dAb的文库，产生二聚体文库，所述接头为TAR1-5(VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)或TAR2-6(VK)。采用这一方法，选择新的二聚体dAb。通过ELISA和BIAcore研究，在细胞中和及受体结合测定中，检测二聚化对抗原结合的影响。TAR1-5和TAR1-27的二聚化导致结合亲和力及中和水平得到改善。1.0方法1.1文库的产生1.1.l载体消化pEDA3U、pEDA5U和pEDA7U载体，引入与dAb-接头-dAb形式相容的不同接头长度。对于PEDA3U，使有义和反义的73个碱基对寡聚接头退火，采用缓慢退火程序(95°C-5分钟，8(TC-10分钟，7(TC-15分钟，56。C-15分钟，42。C直到使用)，在含有0.1MNaCl、10mMTris-HCl(pH7.4)的缓冲液中，用Xhol和Notl限制位点进行克隆。接头包含3(Gly4Ser)单元和填充区，其位于Sail和Notl克隆位点之间(方案l)。为了降低单体dAb被噬菌体展示选择的可能性，设计的填充区包含3个终止密码子、Sacl限制位点和移码突变，以便将该区放在读框之外，当第二dAb不存在时。对于pEDA5U和pEDA7U，因为所需接头长度，消化重叠寡聚接头，用于各载体，退火并用Klenow延伸。然后纯化片段，用合适酶消化，再用Xhol和Notl限制位点克隆。接头Nc。l-Xh。l~Sail-隨填充片段l填充片段2方案11.1.2文库的制备用Ncol和Xhol限制位点，将对应于定向dAb的N_端V基因克隆到接头上游。VH基因具有现成的相容性位点，然而，克隆VK基因需要引入合适的限制位点。通过使用修饰的PCR引物(VK-DLIBF:5'cggccatggcgtcaacggacat(SEQIDNO:638);VKXho1R:5'atgtgcgctcgagcgtttgattt3'(SEQIDNO:639))，在30次循环的PCR扩增中，使用SuperTaq(HTBiotechnologyLtd)禾口pfuturbo(Stratagene)的2:1、混合净勿，来达至U这一点。这在5'端保留NcoI位点，同时破坏相邻SalI位点并在3'端引入XhoI位点。将5个定向dAb克隆到3个二聚体载体的每个中TAR1-5(VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)、TAR2-6(VK)和TAR2-7(VK)。所有构建体都经序列分析得以证实。每个载体((pEDA3U、pEDA5U禾口pEDA7U):TAR1-5(VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)或TAR2-6(VK))都具有接头上游的克隆定向dAb，将相应的第二dAb的文库克隆到接头之后。为了达到这一点，经PCR，从经过第一轮选择而回收的噬菌体扩增互补(complimentary)dAb文库，所述噬菌体可以是当TAR1-5或TAR1-27是定向dAb时、针对人TNFa的VK文库的第一轮选择而回收的噬菌体(在第一轮后约1X106多样性)，或者是当TAR2-5或TAR2-6分别是定向dAb时、针对人p55TNF受体的VH或VK文库的第一轮选择而回收的噬菌体(在第一轮后都约为1X105多样性)。对于VK文库，使用引物，在30次循环的PCR扩增中，使用SuperTaq和pfuturbo的2:1混合物，进行PCR扩增。使用引物，对VH文库进行PCR扩增，以便在基因的5'端引入SalI限制位点。dAb文库PCR用合适限制酶消化，连接到相应载体接头下游，使用SalI/Notl限制位点，并经电穿孔进入新鲜制备的感受态TG1细胞中。各文库所得效价如下TAR1-5:pEDA3U=4X108，pEDA5U=8X107，pEDA7U=1X108TAR1-27:pEDA3U=6.2X108，pEDA5U=1X108，pEDA7U=1X109TAR2h-5:pEDA3U=4X107，pEDA5U=2X108，pEDA7U=8X107TAR2h-6:pEDA3U=7.4X108，pEDA5U=1.2X108，pEDA7U=2.2X1081.2选择1.2.1TNFa用被动包被在免疫管上的人TNFa，进行选择。简而言之，免疫管用l_4ml所需抗原包被过夜。免疫管再用PBS洗涤3次，用2%奶粉/PBS封闭1-2小时，然后再用PBS洗涤3次。噬菌体溶液用2%奶粉/PBS稀释，在室温下孵育2小时。这些管再用PBS洗涤，噬菌体用lmg/ml胰蛋白酶-PBS洗脱。对于TARl-5二聚体文库，研究了3种选择策略。第一轮选择在免疫管中进行，用1yg/ml或20iig/ml的人TNFa包被，再用PBS0.1%吐温洗涤20次。TG1细胞用经过洗脱的噬菌体感染，测定效价(例如Marks等，J.Mol.Biol.，1991年1273月5日;222(3):581-97，Richmann等，Biochemistry，1993年8月31日;32(34):8848-55)。回收的效价为pEDA3U=2.8X107(1iig/mlTNF)，1.5X108(20iig/mlTNF)，pEDA5U=1.8X107(1iig/mlTNF)，1.6X108(20iig/mlTNF)，pEDA7U=8X106(1iig/mlTNF)，7X107(20iig/mlTNF)。用下面三种不同的方法进行第二轮选择。1.在免疫管中，20次洗涤并过夜孵育，接着再是IO次洗涤。2.在免疫管中，20次洗涤并在室温下、在洗涤缓冲液中与(1Pg/mlTNFa)孵育1小时，接着再是io次洗涤。3.在链霉抗生物素珠上，使用33pmole生物素化人TNFa进行选择(Henderikx等，2002，Selectionofantibodiesagainstbiotinylatedantigens.AntibodyPhageDisplay:Methodsandprotocols,0'Brien禾口Atkin(主编)，HumanaPress)。挑取来自第二轮选择的单个克隆，接种到96孔板中，以2ml96孔板的形式制备粗上清液制备物。表1.第一轮人TNFa免疫管包被浓度第二轮选择方法l第二轮选择方法2第二轮选择方法3pEDA3U1tig/mllx1091.8xl092.4xl010pEDA3U20tig/ml6xl091.8xl(T8.5xl010pEDA5U1tig/ml9xl081.4xl092.8xl010pEDA5U20tig/ml9.5xl098.5xl092.8xl010pEDA7U1tig/ml7.8xl081.6xl084xl010pEDA7U20tig/mllx10108xl091.5xl010对于TARl-27，按照前述方法并经以下改进，进行选择。在用1Pg/ml或20iig/ml人TNFa包被、并用PBS0.1%吐温洗涤20次的免疫管中，进行第一轮选择。在20次洗涤、过夜孵育并再次20次洗涤的免疫管中，进行第二轮选择。挑取来自第二轮选择的单个克隆，接种到96孔板，以2ml96孔板的形式制备粗上清液制备物。TAR1-27效价如下表2.<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>1.2.2TNF受体1(p55受体;TAR2)仅对于TAR2h-5文库，按照前述方法进行选择。在用1yg/ml人p55TNF受体或10iig/ml人p55TNF受体、并用PBS0.1%吐温洗涤20次、过夜孵育并再次20次洗涤的免疫管中，进行第三轮选择。挑取来自第二轮和第三轮选择的单个克隆，接种到96孔板，以2ml96孔板的形式制备粗上清液制备物。TAR2h-5效价如下表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>1.3筛选从每个3U、5U和7U文库中，适当时用不同选择方法挑取来自第二轮或第三轮选择的单个克隆。在37t:，将克隆在含有100i!g/ml氨苄青霉素和1X葡萄糖的2xTY培养过夜。该培养物的1/100稀释液接种到2ml含有100iig/ml氨苄青霉素和0.1%葡萄糖的2xTY的2ml96孔板形式中，在37t:振荡培养直到0De。。达到约0.9。然后，培养物用ImMIPTG在3(TC诱导过夜。在sorval板式离心机中以4000rpm离心15分钟，使上清液澄清。上清液制备物用于初步筛选。1.3.1ELISA通过蛋白A/LELISA或抗原ELISA，对二聚体重组蛋白质与单体的结合活性进行比较。简而言之，96孔板用抗原或蛋白A/L在4t:包被过夜。该板用O.05X吐温-PBS洗涤，用2X吐温-PBS封闭2小时。将样品加到该板上，在室温下孵育1小时。洗涤该板，与第二试剂在室温下一起孵育1小时。洗涤该板，用TMB底物显色。蛋白A/L-HRP或India-HRP用作第二试剂。对于抗原ELISA，所用抗原浓度为1Pg/ml的PBS，用于人TNFa和人THF受体1。因为大多数情况下存在定向dAb，二聚体给出阳性ELISA信号，因此解离速率经BIAcore检测。1.3.2BIAcore对TAR1-5和TAR2h_5克隆进行BIAcore分析。对于筛选，人TNFa以高密度(约10000RU)偶联到CM5芯片上。50iU人TNFa(50yg/ml)以5y1/分钟的乙酸盐缓冲液(pH5.5)偶联到芯片上。分析后的芯片不能用标准方法再生，因为人TNFa不稳定，因此，每次分析样品之后，芯片用缓冲液洗涤10分钟。对于TARl-5，用BIAcore筛选来自第二轮选择的克隆上清液。采用以下选择方法，从所得每个3U、5U和7U文库中筛选出48个克隆Rl:1iig/ml人TNFa免疫管，R2:1iig/ml人TNFa免疫管，过夜洗涤。Rl:20iig/ml人TNFa免疫管，R2:20/xg/ml人TNFa免疫管，过夜洗涤。Rl:1iig/ml人TNFa免疫管，R2:33pmoles生物素化人TNFa在珠子上。Rl:20iig/ml人TNFA免疫管，R2:33pmoles生物素化人TNFa在珠子上。对于筛选，人p55TNF受体以高密度(约4000RU)偶联到CM5芯片上。100iU人p55TNF受体(lOiig/ml)以5y1/分钟的乙酸盐缓冲液(pH5.5)偶联到芯片上。检查标准再生条件(甘氨酸pH2或pH3)，但是在每种情况下，抗原与TNFa—起从芯片表面除去，因此每次分析样品之后，芯片用缓冲液洗涤10分钟。对于TAR2-5，筛选了来自第二轮选择的克隆上清液。采用以下选择方法，从每个3U、5U和7U文库中筛选出48个克隆Rl:1iig/ml人p55TNF受体免疫管，R2:1iig/ml人p55TNF受体免疫管，过夜洗涤。Rl:10iig/ml人p55TNF受体免疫管，R2:10yg/ml人p55TNF受体免疫管，过夜洗涤。1.3.3受体和细胞测定在受体测定中，二聚体中和能力的测定如下进行受体结合测定抗TNFdAb抑制TNF与重组TNF受体l(p55)结合的能力。简而言之，Maxisorp板与30mg/ml抗人Fc小鼠单克隆抗体(Zymed，SanFrancisco，USA)—起孵育过夜。各孔用含O.05%吐温-20的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，再用1%BSA/PBS封闭，然后与100ng/mlTNF受体lFc融合蛋白(R&D系统，Minne即olis，USA)—起孵育。抗TNFdAb与TNF(其加入到洗涤孔中，终浓度为10ng/ml)混合。TNF结合的测定如下用0.2mg/ml生物素化抗TNF76抗体(HyCultbiotechnology,Uben，Netherlands)，接着用1:500稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素(AmershamBiosciences,UK)，再与TMB底物(KPL，Gaithersburg，USA)—起孵育。加入HC1终止反应，在450nm读出吸光度。抗TNFdAb活性导致TNF结合的降低，因此，与仅用TNF对照相比，导致吸光度下降。L929细胞毒性测定在小鼠L929成纤维细胞上，也测定了抗TNFdAb中和TNF细胞毒活性的能力(Evans，T.(2000)MolecularBiotechnology15,243-248)。简而言之，将接种在微量滴定板上的L929细胞与抗TNFdAb、100pg/mlTNF和lmg/ml放线菌素D(Sigma，Poole，UK)一起孵育过夜。细胞存活率通过在490nm读出吸光度而测定，接着与[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基(carbboxy)甲氧基苯基)_2_(4_磺基苯基)_2H_四唑(Promega，Madison，USA)—起孵育。抗TNFdAb活性导致TNF细胞毒性的降低，因此，与仅用TNF对照相比，导致吸光度增加。在初步筛选中，如上所述，为BIAcore分析而制备的上清液也可用于受体测定。在受体和细胞测定中，使用纯化蛋白质，也可进行所选二聚体的进一步分析。HeLaIL-8测定在HeLa细胞中，测定抗TNFRl或抗TNFadAb中和TNF对IL_8分泌的诱导作用(采用Akeson，L.等(1996)JournalofBiologicalChemistry271，30517-30523所述方法的改进方法，所述文献介绍了在HUVEC中IL-l对IL-8的诱导作用；在此，我们观察了人TNFa的诱导作用，而且我们采用HeLa细胞替代HUVEC细胞系)。简而言之，接种在微量滴定板上的HeLa细胞与dAb和300pg/mlTNF—起孵育过夜。孵育后，吸出上清液，通过夹心ELISA(R&D系统)测定细胞和IL-8浓度。与仅用TNF对照相比，抗TNFRldAb活性导致上清液中IL-8分泌降低。L929测定用于以下实验；然而，优选采用HeLaIL_8测定以检测抗TNF受体1(p55)配体；在L929测定中，小鼠p55的存在对其使用具有某些限制。1.4序列分析对于在BIAcore和受体测定筛选中证明具有目标特性的二聚体进行测序。序列详见序列表。1.5结构形成(formatting)1.5.1TAR1-5-19二聚体在细胞和受体测定中，重新精制并分析具有良好中和特性的TARl-5二聚体。TAR1-5定向dab被亲和力成熟克隆TAR1-5-19取代。为了达到这一点，将该TAR1-5从单个二聚体对中克隆掉(cloneout)，并用经PCR扩增的TARl-5-19取代。另外，在3U、5U和TU载体中构建TARl-5-19同型二聚体。基因的N端拷贝经PCR扩增并如上所述进行克隆，用现有的Sail和Notl限制位点克隆C-端基因片段。1.5.2诱变通过定点诱变，将dAb2中存在的琥珀终止密码子(其中一个在TAR1-5二聚体对C端的dAb)突变成谷氨酰胺。1.5.3Fab将含有TAR1-5或TAR1_5_19的二聚体重新精制到Fab表达载体中。用Sfil和77Notl限制位点，将dAb克隆到含有CK基因或CH基因的表达载体中，通过序列分析而得以证实。CK载体来源于基于pUC的氨苄青霉素抗性载体，CH载体来源于pACYC氯霉素抗性载体。对于Fab表达，将dAb-CH和dAb-CK构建体共转化HB2151细胞，在含0.1%葡萄糖、100iig/ml氨苄青霉素和10iig/ml氯霉素的2xTY中培养。1.5.3铰链二聚化检查了通过形成胱氨酸键的dAb二聚化。将氨基酸EPKSGDKTHTCPPCP(SEQIDNO:15)的短序列(一种修饰形式的人IgGCl铰链)，经过改造连接在dAb的C端区。如上所述，合成编码该序列的寡聚接头并退火。将接头克隆到含有TARl-5-19的pEDA载体中，用Xho1和NotI限制位点。二聚化在周质中原位发生。1.6表达和纯化1.6.1表达如上所述，以2ml，96孔板形式制备上清液，用于初步筛选。初步筛选过程后，对所选二聚体进行进一步分析。二聚体构建体在T0P10F'或HB2151细胞上清液中表达。简而言之，将来自新鲜划线平板的单菌落在37t:、在含100g/ml氨苄青霉素和1%葡萄糖的2xTY中培养过夜。将1/100稀释的该培养物接种到含有100g/ml氨苄青霉素和0.1%葡萄糖的2xTY中，在37t:振荡培养，直到0D6。。达到约0.9。培养物再用lmMIPTG在3(TC诱导过夜。离心除去细胞，上清液用蛋白A或L琼脂糖纯化。在HB2152细胞中，Fab和半胱氨酸铰链二聚体表达为周质蛋白。将1/100稀释的过夜培养物接种到含有0.1%葡萄糖和合适抗生素的2xTY中，在3(TC振荡培养，直到0D6。。达到约0.9。培养物再用lmMIPTG在25tH秀导3_4小时。离心收获细胞，沉淀重悬于周质制备缓冲液(30mMTris-HCl(pH8.0)、lmMEDTA、20X蔗糖)中。离心后，保留上清液，将沉淀重悬于5mMMgS04。再次通过离心收获上清液，合并，然后纯化。1.6.2蛋白A/L纯化从蛋白L琼脂糖(Affitech，Norway)或蛋白A琼脂糖(Sigma，UK)中优化纯化二聚体蛋白，对其进行检测。蛋白质分批洗脱，或者用蠕动泵通过柱洗脱。检查3种缓冲液0.1M磷酸-柠檬酸缓冲液(pH2.6)、0.2M甘氨酸(pH2.5)和0.1M甘氨酸(pH2.5)。确定蠕动泵条件下的优化条件，采用0.1M甘氨酸pH2.5，超过10倍柱体积。从蛋白A纯化，蠕动泵条件采用0.1M甘氨酸pH2.5。1.6.3FPLC纯化通过FPLC分析，在AKTAExplorer100系统(AmershamBiosciencesLtd)上进行进一步纯化。TAR1-5和TAR1-5-19二聚体的分离是通过阳离子交换色谱(lmlResourceS-AmershamBiosciencesLtd)，用0-1MNaCl梯度/50mM乙酸盐缓冲液(pH4)洗脱。铰链二聚体的纯化是通过离子交换(lmlResourceQAmershamBiosciencesLtd)，用0-1MNaCl梯度/25mMTrisHC1(pH8.0)洗脱。Fab的纯化是通过大小排阻层析，用superose12(AmershamBiosciencesLtd)柱，流速0.5ml/分钟的PBS(含0.05%吐温)。纯化后，采用vivaspin5K截止浓縮器(VivascienceLtd)浓縮样品。2.0结果2.lTARl-5二聚体从第二轮选择中挑取6X96个克隆，包括所有文库和选择条件。制备上清液制备物，用抗原和蛋白LELISA、BIAcore和受体测定来分析。在ELISA中，从各选择方法中鉴定出阳性结合克隆，它们分布在3U、5U和7U文库中。然而，因为定向dAb总是存在，所以通过该方法不能区别高和低亲和力结合物，因此进行BIAcore分析。用2ml上清液进行BIAcore分析。BIAcore分析表明，与单体TAR1-5相比，二聚体K解离速率有很大改进。单体K解离速率范围为10—^，二聚体K解离速率范围为10—3-10—4M。选择表现出解离速度很慢的16个克隆，它们来自3U、5U和TU文库，并对其进行测序。此夕卜，在受体测定中，分析上清液中和人TNFa的能力。对在这些测定中具有中和能力的6个先导克隆(以下称dl-d6)进行测序。结果显示所得6个克隆中仅3个具有不同第二dAb(dAbl、dAb2和dAb3)，然而，其中发现第二dAb不止一次连接不同长度的接头。TARl-5dl:3U接头2nddAbTARl-5d2:3U接头2nddAbTARl-5d3:5U接头2nddAbTARl-5d4:5U接头2nddAbTARl-5d5:5U接头2nddAbTARl-5d6:7U接头2nddAbR2:珠进一步检测6个先导克隆。蛋白质从周质和上清液产生，用蛋白L琼脂糖纯化，并在细胞和受体测定中进行检测。中和水平不同(表l)。检测了蛋白质制备的优化条件。从HB2151细胞上清液中得到的蛋白质得到最高收率(约10mg/L培养物)。将上清液与蛋白L琼脂糖一起在室温下孵育2小时或在4t:孵育过夜。珠子用PBS/NaCl洗涤，用蠕动泵装入FPLC柱。珠子用10倍体积的PBS/NaCl洗涤，用0.1M甘氨酸(pH2.5)洗脱。一般而言，二聚体蛋白在单体之后洗脱下来。TARl-5dl-6二聚体用FPLC纯化。FPLC纯化后得到3种，经SDSPAGE鉴定。一种对应于单体，而其它两种对应于不同大小的二聚体。两种中较大的一种可能是因为存在C端标记。在受体测定中检测这些蛋白质。数据见表l，代表了得自两种二聚体的优化结果(图11)将来自二聚体对(即dAbl、dAb2和dAb3)的3种第二dAb，作为单体进行克隆，并通过ELISA以及在细胞和受体测定中进行检测。所有3种dAb都特异性结合TNF(经抗原ELISA)，而且不与塑料或BSA发生交叉反应。作为单体，在细胞或受体测定中，dAb都不中和。2.1.2TAR1-5-19二聚体在6个先导克隆中，用TARl-5-19代替TARl-5。在细胞和受体测定中，对所有TARl-5-19二聚体进行分析，使用总蛋白(仅纯化蛋白L)，除非另有说明(表2)。在细胞测定中，TARl-5-19d4和TARl-5-19d3具有最佳ND5。(5nM)，这与受体测定结果是一致的，并且相比TARl-5-19单体(ND5。30nM)来说得到了改善。尽管纯化TAR1-5二聚体在受体和细胞测定中得到不同结果，但是TARl-5-19二聚体更一致。在蛋白质纯化期间，当使用不同洗脱缓冲液时会有变动。用0.1M磷酸-柠檬酸缓冲液(pH2.6)或0.2M甘氨酸(pH2.5)洗脱，尽管在大多数情况下从蛋白L琼脂糖中除去所有蛋白质，这使它功能更少。=dAbl-liig/mlAg免疫管，过夜洗涤=dAb2-liig/mlAg免疫管，过夜洗涤=dAb2-liig/mlAg免疫管，过夜洗涤=dAb3-20iig/mlAg免疫管，过夜洗涤=dAbl-20iig/mlAg免疫管，过夜洗涤=dAbl-Rl:1iig/mlAg免疫管，过夜洗涤TARl-5-19d4在发酵罐中表达，然后在阳离子交换FPLC中纯化，得到十分纯的二聚体。与TARl-5d4—起，通过FPLC纯化得到3种对应于单体和两种二聚体。对该二聚体进行氨基酸测序。然后，在受体测定中检测TAR1-5-19单体和TARl-5-19d4，单体所得IC5。为30nM，二聚体为8nM。与TAR1-5-19单体、TARl-5-19d4和TARl-5d4相比的受体测定结果见图10。在3U、5U和7U载体中制备TARl-5-19同型二聚体，表达并在蛋白L上纯化。蛋白质在细胞和受体测定中进行检验，测定所得IC5。(对于受体测定)和ND5。(对于细胞测定)(表3，图12)。2.2FabTAR1-5和TAR1_5_19二聚体克隆到Fab形式中，表达并在蛋白L琼脂糖上纯化。Fab在受体测定中进行评价(表4)。结果表明，TARl-5-19和TARl-5二聚体的中和水平都类似于其来源的原Gly4Ser接头二聚体。表达TARl-5-19Fab(其中TAR1-5-19展示在CH和CK上)，经蛋白L纯化，在受体测定中进行评价。所得IG。约为lnM。2.3TAR1-27二聚体从第二轮选择中挑取3X96个克隆，包括所有文库和选择条件。制备2ml上清液制备物，用于在ELISA和生物测定中进行分析。抗原ELISA得到71个阳性克隆。粗上清液的受体测定得到42个具有抑制特性的克隆(TNF结合0-60%)。在大多数情况下，抑制特性与强烈ELISA信号相关。对42个克隆进行测序，其中有39个具有独特的第二dAb序列。对具有最佳抑制特性的12个二聚体进行进一步分析。12个中和克隆在200ml上清液制备物中表达，再在蛋白L上纯化。它们通过蛋白L和抗原ELISA、BIAcore和在受体测定中进行评价。在所有情况下都得到强烈阳性ELISA信号。BIAcore分析表明，所有克隆具有快的缔合和解离速度。与单体TAR1-27相比，改进了解离速率，然而，与先前检测的TARl-5二聚体的速度(K解离范围约为10—3M10—4M)相比，TAR1-27二聚体的解离速度更快(K解离范围约为10—^10—2M)。纯化二聚体的稳定性是个问题，因此为了改进稳定性，在2TAR1-27二聚体(d2和d16)的纯化中加入5%甘油、0.5%TritonX100或0.5%NP40(Sigma)。加入NP40或TritonX100提高纯化产物的收率约2倍。在受体测定中评价这两种二聚体。在所有纯化条件下TARl-27d2的ICs。都约为30nM。当纯化没有使用稳定剂时，TARl-27d16显示出没有中和效应，但当纯化在稳定条件下进行时，得到IG。约为50nM。没有进行进一步分析。2.4TAR2-5二聚体从第二轮选择中挑取3X96个克隆，包括所有文库和选择条件。制备2ml上清液制备物，用于分析。对各板进行蛋白A和抗原ELISA。通过BIAcore鉴定出30个目标克隆，具有良好解离速率(K解离范围介于10—2-10—3M)。对克隆进行测序，通过序列分析鉴定了13个独特的二聚体。表4:TARl-5二聚体<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>*注释二聚体2和二聚体3具有相同的第二dAb(称为dAb2)，但却具有不同接头长度(d2=(Gly4Ser)3、d3=(Gly4Ser)3)。dAbl是二聚体1、5和6的配偶体dAb。dAb3是二聚体4的配偶体dAb。配偶体dAb都不能单独中和。除非另有说明，否则FPLC纯化是通过阳离子交换。在这些测定中，对经FPLC所得的每种二聚体，测定优化二聚体种类。表5:TARl-5-19二聚体<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>表7:TARl-5/TARl-5-19Fab<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>实施例7.通过末端半胱氨酸键的dAb二聚化概述对于dAb二聚化，将游离半胱氨酸拼接到蛋白质的C-端。当表达时，该蛋白形成二聚体，所述二聚体可通过两个步骤的纯化方法而纯化。TAR1-5-19CYS二聚体的PCR构建按照实施例8描述dAb三聚体的方法。三聚体方案得到单体、二聚体和三聚体的混合物。TAR1-5-19CYS二聚体的表达和纯化按照实施例8概述的方法，从培养物上清液中，通过蛋白L琼脂糖捕获而纯化二聚体。TAR1-5-19CYS单体与TARl-5-19CYS二聚体的分离在阳离子交换分离之前，按照制造商的使用说明书，用PD-10柱(AmershamPharmacia)将单体/二聚体混合样品的缓冲液更换成50mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)。再将样品用于预先用50mM乙酸钠(pH4.0)平衡的ImLResourceS阳离子交换柱(AmershamPharmacia)。用以下盐梯度的50mM乙酸钠(pH4.0)分离出单体和二聚体83150-200mM氯化钠超过15倍柱体积200-450mM氯化钠超过10倍柱体积450-1000mM氯化钠超过15倍柱体积仅含二聚体的部分用SDS-PAGE鉴定后合并，加入1/5体积的lMTris(pH8.0)将pH升至8。体外功能性结合测定TNF受体测定和细胞测定。采用TNF受体和细胞测定，测定二聚体对人TNFa的亲和力。受体测定中的1(:5。约为0.3-0.8nM;细胞测定中的ND5。约为3_8nM。其它可能的TARl-5-19CYS二聚体形式PEG二聚体和委托合成的马来酰亚胺二聚体Nektar(Shearwater)提供一系列双马来酰亚胺PEG[mPEG2_(MAL)2或mPEG-(MAL)2]，它们可让单体成为二聚体，其中用小接头隔开dAb，这两者都连接有PEG(大小范围为5-40kDa)。已经知道，5kDamPEG-(MAL)2(即[TAR1-5-19]-Cys-马来酰亚胺-PEGX2，其中马来酰亚胺一起连接在二聚体中)在TNF受体测定中的亲和力为l-3nM。另夕卜，也可用TMEA(三[2-马来酰亚胺乙基]胺)(PierceBiotechnology)或其它双功能接头产生二聚体。通过化学偶联方法，采用2，2'-二硫双吡啶(SigmaAldrich)和还原单体，也可产生二硫化物二聚体。将多肽接头或铰链加到dAb的C-端。或者(Gly^er)n(其中n=l-10，例如l、2、3、4、5、6或7)、或者免疫球蛋白(例如IgG铰链区或随机肽序列(例如选自随机肽序列文库)等小接头，可以添加在dAb和末端半胱氨酸残基之间。这可用于制备如上所述的二聚体。实施例8.dAb三聚化概述对于dAb三聚化，蛋白质C-端需要游离半胱氨酸。半胱氨酸残基，一旦还原得到游离巯基，则可用于将蛋白质特异性偶联到三聚体马来酰亚胺分子上，例如TMEA(三[2-马来酰亚胺乙基]胺)。TAR1-5-19CYS的PCR构建下列寡核苷酸专门用于具有Sail和BamHI位点的PCRTAR1_5_19，用于克隆并引入C-端半胱氨酸残基Salr--------TrpSerAlaSerThrAsp*lieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerVal1TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCTGCATCAGTAACCTCGCGCAGCTGCCTGTAGGTCTACTGGGTCAGAGGTAGGAGAGACAGACGTAGACATGlyAspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinSerlieAspSerTyrLeuHisTrp61GGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAGTTATTTACATTGGCCTCTGGCACAGTGGTAGTGAACGGCCCGTTCAGTCTCGTAACTATCAATAAATGTAACCTyrGinGinLysProGlyLyeAlaProLysLeuLeulieTyrSerAlaSerGluLeuGin121TACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGTGCATCCGAGTTGCAAATGGTCGTCTTTGGTCCCTTTCGGGGATTCGAGGACTAGATATCACGTAGGCTCAACGTTSerGlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlie181AGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCTCACCCCAGGGTAGTGCAAAGTCACCGTCACCTAGACCCTGTCTAAAGTGAGAGTGGTAGSerSerLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinValValTrpArgPro241AGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTCGTCAGACGTTGGACTTCTAAAACGATGCATGATGACAGTTGTCCAACACACCGCAGGABamHIPheThrPheGlyGinGlyThrLysValGlu:lieLysArgCye女女GlySerGly301TTTACGTTCGGCCMGGGACCMGGTGGMATCAMCGGTGCTMTAAGGATCCGGCAMTGCMGCCGGTTCCCTGGTTCCACCTTTAGTTTGCCACGATTATTCCTAGGCCG(*TARl-5-19CYS序列的开始;TARl-5-19CYS氨基酸序列(SEQIDNO:633;TAR1-5-19CYS核苷酸序列(SEQIDNO:634，编码链；SEQIDNO:635，非编码链))正向引物5'-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3，(SEQIDNO:296)反向引物5'-TTAGCAGCCGGATCCTTATTAGCACCGTTTGATTTCCAC-3'(SEQIDNO:297)如下进行PCR反应(50iiL体积)200iiMdNTP、0.4iiM各引物、5iiL10xPfuTurbo缓冲液(Stratagene)U00ng模板质粒(编码TAR1-5-19)、1iiLPfuTurbo酶(Stratagene)并用无菌水将体积调至50yL。采用以下PCR条件起始变性步骤94°C2分钟，再是25次循环(94°C30秒，64°C30秒，72°C30秒)。最终延伸步骤也包括72°C5分钟。纯化PCR产物并用SalI和BamHI消化，再连接到用相同限制酶切割的载体上。正确克隆经DNA测序得以证实。TAR1-5-19CYS的表达和纯化按照制造商的方案，将TAR1-5-19CYS载体转化BL21(DE3)pLysS化学感受态细胞(Novagen)中。用100yg/mL羧苄青霉素和37yg/mL氯霉素选择携带dAb质粒的细胞。在含有500mLterrific肉汤(Sigma-Aldrich)、100yg/mL羧节青霉素和37yg/mL氯霉素的2L带挡板的瓶子中建立培养。培养物在30°C以200rpm振荡培养，直到0.D.600为1-1.5，然后用ImMIPTG(异丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷，MelfordLaboratories)诱导。让dAb的表达在3(TC持续12-16小时。发现大多数dAb存在于培养基中。因此，通过离心(8，000xg30分钟)，从培养基中分离出细胞，上清液用于纯化dAb。每升上清液中加入30mL蛋白L琼脂糖(Affitech)，让dAb分批结合，同时搅拌2小时。然后让树脂在重力下沉降1小时，再吸去上清液。将琼脂糖装入XK50柱(AmershamPhamacia)中，用IO倍体积的PBS洗涤。结合dAb用lOOmM甘氨酸(pH2.0)洗脱，含蛋白部分通过加入1/5体积的1MTris(pH8.0)而中和。每升培养上清液中分离到20mg纯蛋白，其中含有50:50比例的单体与二聚体。TAR1-5-19CYS的三聚化将2.5ml100yMTARl-5-19CYS用5mM二硫苏糖醇还原，在室温下放置20分钟。用PD-10柱(AmershamPharmacia)给样品更换缓冲液。该柱预先用5mMEDTA、50mM磷酸钠(p朋.5)平衡，按照制造商的指南，使用样品并洗脱。将样品放在冰上备用。TMEA(三[2-马来酰亚胺乙基]胺)购自PierceBiotechnology。用100%DMSO(二甲基亚砜)配制20mMTMEA贮液。发现TMEA浓度大于3:1(dAb:TMEA的摩尔比)时，引起快速沉淀和蛋白质交联。当pH增加时也会增加沉淀速率和交联速率。因此，使用100iiM还原TARl-5-19CYS，加入25iiMTMEA使蛋白质三聚化，让反应在室温下进行2小时。发现在偶联反应进行时，加入添加剂(例如甘油或乙二醇)至20%(v/v)，可显著减少三聚体沉淀。偶联后，SDS-PAGE分析表明，溶液中同时存在单体、二聚体和三聚体。三聚体TAR1-5-19CYS的纯化每mLTMEA-TARl-5-19cys反应物中加入40iiL40%冰乙酸，将pH降至4。再将样品力B至IJlmLResourceS阳离子交换柱(AmershamPharmacia)，该柱预先用50mM乙酸钠(pH4.0)平衡。用340-450mM氯化钠的盐梯度、50mM乙酸钠(pH4.0)超过30倍柱体积，部分分离二聚体和三聚体。仅含三聚体的部分用SDS-PAGE鉴定后合并，加入1/5体积的1MTris(pH8.0)将pH升至8。为了在浓縮步骤(采用5K截止Viva离心浓縮器；Vivascience)中防止三聚体沉淀，向样品中加入10%甘油。体外功能性结合测定TNF受体测定和细胞测定采用TNF受体和细胞测定，测定三聚体对人TNFa的亲和力。受体测定中的1。5。约为0.3nM;细胞测定中的ND5。约为3-10nM(例如3nM)。其它可能的TAR1-5-19CYS三聚体形式采用以下试剂，也可将TAR1-5-19CYS制成三聚体PEG三聚体和委托合成的马来酰亚胺三聚体Nektar(Shearwater)提供一系列多臂PEG，它们在PEG末端可以被化学修饰。因此，采用在各臂末端具有马来酰亚胺官能团的PEG三聚体，使dAb三聚体化的方式类似于以上概述的用TMEA的方式。PEG也具有增加三聚体溶解度的优势，因而能防止聚集的问题。因此，可以产生dAb三聚体，其中每个dAb具有与马来酰亚胺官能团连接的C-末端半胱氨酸，所述马来酰亚胺官能团连接在PEG三聚体上。将多肽接头或铰链加到dAb的C-端。或者(Gly4Ser)n(其中n=1-10，例如1、2、3、4、5、6或7)、或者免疫球蛋白(例如IgG铰链区或随机肽序列(例如选自随机肽序列文库)等小接头，可以添加在dAb和末端半胱氨酸残基之间。当用于制备多聚体(例如二聚体或三聚体)时，这又将引入更大程度的柔性和各个单体间的距离，这些会改善与靶标(例如多亚基靶标例如人TNFa)的结合特性。实施例9.针对人血清白蛋白(HSA)和小鼠血清白蛋白(MSA)的一批单域抗体(dAb)的选择该实施例说明了制备针对血清白蛋白的单域抗体(dAb)的方法。描述了针对小鼠血清白蛋白(MSA)和人血清白蛋白(HSA)的dAb的选择。该实验中使用了3个人噬菌体展示抗体文库，它们各自基于VH的单一人构架(参见图13:基于V3-23/DP47和JH4b的dummyVH序列)或Vk(参见图15:基于ol2/o2/DPK9和Jkl的dummyVk序列)，其由NNK密码子编码的侧链多样性结合到互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)中。文库1(VH):在以下位置的多样性H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98。文库大小6.2X109文库2(VH):在以下位置的多样性H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98、H99、HIOO、H100a、H100b。文库大小4.3X109文库3(Vk):在以下位置的多样性L30、L31、L32、L34、L50、L53、L91、L92、L93、L94、L96文库大小2X109预选VH和Vk文库分别对蛋白A和蛋白L通用配体的结合性，使得在未选择文库中的大部分克隆是功能性的。以上所示的文库大小对应于预选后的大小。分别用各文库，针对血清白蛋白进行两轮选择。对于每次选择，将浓度为100i！g/ml的抗原/4mlPBS包被在免疫管(皿nc)上。在第一轮选择中，3个文库中的每一个都分别针对HSA(Sigma)和MSA(Sigma)进行选择。在第二轮选择中，来自第一轮选择的6个噬菌体中的每一个都针对以下抗原进行选择(i)再次用相同抗原(例如第一轮MSA，第二轮MSA)和(ii)针对互换抗原(例如第一轮MSA，第二轮HSA)，产生总共12个第二轮选择。在每种情况下，在第二轮选择后，测定48个克隆与HSA和MSA的结合。按照Harrison等，MethodsEnzymol.1996;267:83-109和标准ELISA方案(Hoogenboom等(1991)NucleicAcidsRes.，19:4133)所述，产生可溶性dAb片段，只是用2%吐温PBS作为封闭缓冲液，以及用蛋白L-HRP(Sigma)(用于Vk)和蛋白A-HRP(AmershamPharmaciaBiotech)(用于VH)检测结合dAb。在ELISA中测定dAb，得到大于背景的信号，表明与MSA、HSA或这两者结合，不溶性形式仅结合塑料，但是所有都对血清白蛋白具有特异性。对克隆进行测序(参见下表)表明，鉴定出了21个独特dAb序列。所选VKdAb克隆之间的最小相似性(在氨基酸水平上)为86.25%((69/80)X100);这是当所有多样化残基都不同(例如克隆24和34)时的结果。所逸VhdAb克隆之间的最小相似性为94X((127/136)X100)。然后，测定血清白蛋白结合dAb从溶液中捕获生物素化抗原的能力。按照ELISA方案(同上)，只是ELISA板用liig/ml蛋白L(対于Vk克隆)和1yg/ml蛋白A(对于VH克隆)包被。按照方案，从溶液中捕获可溶性dAb，再用生物素化MSA或HSA和链霉抗生物素HRP进行检测。生物素化MSA和HAS是按照制造商的使用说明书来制备，其目的是为了获得平均2个生物素/血清白蛋白分子。在ELISA中，鉴定出了24个克隆从溶液中捕获生物素化MSA。这其中有两个(以下克隆2和38)也捕获生物素化HSA。然后，测定dAb对CM5biacore芯片上包被的MSA的结合能力。发现8个克隆能结合biacore上的MSA。表8.<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>实施例10.测定结合MSA的dAbMSA16和MSA26的小鼠亲和力和血清半衰期dAbMSA16和MSA26在大肠杆菌周质中表达，其纯化采用分批吸附到蛋白L_琼脂糖亲和树脂(Affitech，Norway)上，然后用甘氨酸(pH2.2)洗脱。然后，通过抑制biacore分析纯化的dAb，测定Kd。简而言之，对纯化MSA16和MSA26进行测试，以测定在高密度MSA包被的biacoreCM5芯片上达到200RU响应所需的dAb浓度。一旦测出dAb所需浓度，将预期Kd左右的MSA抗原浓度范围与dAb预混合并孵育过夜。然后以30iU/分钟的高流速，测定各预混物中dAb与MSA包被的biacore芯片的结合。用所得曲线绘制Klotz曲线，根据曲线估计对于MSA16的Kd为200nM，而对于MSA26则为70nM(图17A和图17B)。然后，将克隆MSA16和MSA26克隆到表达载体中，所述载体带有HA标记(核酸序列TATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCA(SEQIDNO:631)和氨基酸序列YPYDVPDYA(SEQIDNO:632))，2-10mg量在大肠杆菌中表达，用蛋白L_琼脂糖亲和树脂(Affitech，Norway)并用甘氨酸(PH2.2)洗脱而从上清液中纯化。测定dAb的小鼠血清半衰期。给CDl小鼠单次静脉注射约1.5mg/kg的MSA26和MSA16。通过山羊抗HA(Abcam，UK)捕获和用4%Marvel封闭的蛋白L-HRP(invitrogen)测定ELISA，分析血清水平。用0.05%吐温PBS洗涤。在lx小鼠血清存在下，绘制已知浓度的dAb的标准曲线，以保证与试验样品的可比性。用2区室模型建模，显示MSA26的tl/2a为0.16小时，tl/2P为14.5小时，曲线下面积(AUC)为465小时mg/ml(数据未显示)，MSA16的tl/2a为0.98小时，tl/2P为36.5小时，AUC为913小时mg/m1(图18)。与HEL4(—种抗鸡卵清溶菌酶dAb)相比，这两个抗MSA克隆具有相当长的半衰期，其tl/2a为0.06小时，t1/213为O.34小时。实施例11.VH_VH禾PVk-Vk双特异性Fab样片段的产生该实施例描述了制备VH_VH禾PVk-Vk双特异性抗体(作为Fab样片段)的方法。在构建各种所述Fab样片段之前，按照实施例9所述的类似方法，首先从dAb文库中选出能结合所选靶标的dAb。分离出一种能结合鸡卵溶菌酶(Sigma)的VHdAb即HEL4，也分离出能结合TNFa受体(R和D系统)的第二VHdAb(TAR2h_5)。这些序列在序列表中给出。通过选择和亲和力成熟，分离出能结合TNFa(TAR1-5-19)的VkdAb，其序列也在序列表中给出。实施例9中描述的第二VkdAb(MSA26)(其序列见图17B)也可用于这些实验。将来自含有上述4种dAb的表达载体的DNA用酶Sail和Notl消化，切下dAb的DNA编码区。消化物通过琼脂糖凝胶电泳，纯化出预期大小的条带(300-400bp)，韧下该条带，再用Qiagen凝胶纯化试剂盒(Qiagen，UK)进行凝胶纯化。再将编码dAb的DNA插入到CH载体或Ck载体中(图8和9)，如下表所示。表9.<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>VhCh和VhCk构建体共转化HB32151细胞。另夕卜，VkCH禾PVkCk构建体共转化HB2151细胞。将各共转化细胞系的培养物培养过夜(在含有5^葡萄糖、10iig/ml氯霉素和100g/ml氨苄青霉素的2xTy中，以维持对Q质粒和Ck质粒的抗生素选择)。用过夜培养物接种新鲜培养基(2xTy，10g/ml氯霉素和100yg/ml氨苄青霉素)并培养至ODO.7-0.9，然后加入IPTG进行诱导，以表达它们的CH构建体和Ck构建体。再通过蛋白A纯化(用于共转化的VHCH和VHCk)和MSA亲和树脂纯化(用于共转化的VkCH和VkCk)，对表达的Fab样片段进行纯化。VfVH双特异性通过蛋白质凝胶电泳，测定VHCH禾PVHCk双特异性抗体的表达。将凝胶印迹后，通过myc标记和flag标记，在蛋白质印迹上检测Fab片段期望大小的条带，表明Fab样片段的VhCj^PVhCk部分都存在。然后，为了确定双特异性抗体的两个半边是否存在于同一Fab样片段上，将ELISA板用100y1/孔3mg/ml鸡卵溶菌酶(HEL)的碳酸氢钠缓冲液，在fC包被过夜。该板再用2%吐温PBS封闭(按照实施例1所述)，接着与VHCH/VHCk双特异性Fab样片段一起孵育。通过非关联链，用9el0(—种结合myc标记的单克隆抗体，Roche)和抗小鼠IgG-HRP(AmershamPharmaciaBiotech)，检测双特异性片段与HEL的结合。VHCH/VHCk双特异性Fab样片段的信号为O.154，相比之下，对于单独表达的VHCk链的背景信号为0.069。这证明Fab样片段对靶抗原具有结合特异性。Vk-Vk双特异性在MSA亲和树脂上纯化共转化的VkCH和VkCk双特异性Fab样片段之后，用所得蛋白质探测1yg/mlTNFa包被的ELISA板和10yg/mlMSA包被的ELISA板。不出所料，当在两种ELISA板上用蛋白L-HRP检测时，产生高于背景的信号(数据未显示)。这表明，能够结合MSA的蛋白质部分(并因此而在MSA亲和柱上纯化)也能在随后的ELISA中结合TNFa，这证实了抗体片段的双特异性。这样的蛋白质部分再用于随后的两个实验。第一个，1yg/mlTNFa包被的ELISA板用双特异性VkCH禾PVkCkFab样片段进行探测，同时也用对照即结合TNFa的dAb进行探测，该对照的浓度为经计算在ELISA上得到相似信号的浓度。在2mg/mlMSA存在和不存在时，用双特异性dAb和对照dAb探测ELISA板。双特异性孔的信号降低超过50X，但dAb孔的信号却完全没有降低(参见图19a)。同一蛋白也用于受体测定(有和没有MSA)，也显示出与MSA的竞争性(参见图19c)。这证明MSA竞争性结合双特异性抗体和TNFa。实施例12.对小鼠血清白蛋白和TNFa具有特异性的VkVk双特异性cys键合的双特异性抗体的产生该实施例描述了通过二硫键的化学偶联制备对小鼠血清白蛋白和TNFa都具有特异性的双特异性抗体片段的方法。MSA16(来自实施例1)和TARl-5-19dAb都再克隆到具有C端半胱氨酸和没有标记的基于pET的载体中。两种dAb表达水平均为4-10mg，用蛋白L-琼脂糖亲和树脂(Affitiech，Norway)从上清液中纯化出来。半胱氨酸标记的dAb再用二硫苏糖醇还原。TARl-5-19dAb再与二硫双吡啶偶联，封闭二硫键的再形成，从而形成PEP1-5-19同型二聚体。再将两种不同dAb在pH6.5混合，促进形成二硫键并产生TARl-5-19，MSA16cys键合的异型二聚体。两种不同蛋白质缀合物的这种制备方法最初由King等(KingTP，LiYKochoumianLBiochemistry,1978，第17巻1499-506Pr印arationofProteinConjugatesviaintermoleculardisulfidebondformation)描述的。通过阳离子交换将异型二聚体与单体分开。通过SDS凝胶上存在预期大小的条带来证实分离。所得异型二聚体种类在TNF受体测定中进行测定，发现其中和TNF的IC5。约为18nM。然后，用恒定浓度的异型二聚体(18nM)和系列稀释的MSA和HAS，重复受体测定。适当浓度范围(最多2mg/ml)的HAS的存在，并不引起二聚体抑制TNFa能力的下降。然而，加入MSA，以剂量依赖性方式引起二聚体抑制TNFa能力的下降(图20)。这证明MSA和TNFa竞争性结合cys键合的TARl-5-19、MSA16二聚体。数据汇总上述实施例的实验中所得数据的汇总见附录4。实施例13.抗小鼠TNFRldAb和抗人TNFRldAb的活性表10.抗小鼠TNFRldAb的活性倫L929细胞测定受体结合测定TAR2m-〗S>10一TAR2m-20n/d150nMTAR2m-21400nMn/d丁AR2m-241fiM1.3TAR2m-21-23l:nMn/dTAH2m-2I-07mnMn/dn/dTAR2迈-21486nMn/dTAR2m-21-1030nMTAR2m-21-06100tiMn/dTAR2m-21-17300nMn/dn/d，未检出表11.抗人TNFRldAb的活性94<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>n/d，未检出MRC-5IL-8释放测定在以下MRC-5细胞测定中，评价了某些能结合人TNFR1的dAb的活性。测定是基于在MRC-5细胞中TNF诱导的IL-8分泌，该测定方法是Alceson，L.等，JournalofBiologicalChemistry271:30517-30523(1996)所述方法的改进方法，所述文献介绍了在HUVEC中IL-1对IL-8的诱导作用。用MRC-5细胞代替HUVEC细胞系，通过评价人TNFa对IL-8的诱导，测定了dAb的活性。简而言之，MRC-5细胞接种在微量滴定板上，将这些板与dAb和人TNFa(300pg/ml)—起孵育过夜。孵育后，吸出培养物上清液，通过夹心ELISA(R&D系统)测定上清液中的IL-8浓度。与仅与TNFa—起孵育的对照孔相比，抗TNFRldAb活性导致上清液中IL-8分泌降低。实施例14.小鼠脓毒性休克模型在良好建立的脓毒性休克综合征的实验模型中，评价抗TNFRldAb的体内功效(Rothe等，CirculatoryShock44:51-56，(1995))。在该模型中，LPS诱导的死亡取决于TNFR-l(p55)的活化。在该模型中，用D-半乳糖胺(D-GaIN)使小鼠对LPS毒性敏感。在该项研究中，对野生型动物致死的LPS剂量约为10ng。腹膜内注射LPS(肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)，Sigma，USA)和D_半乳糖胺(D-GaIN，Sigma，USA)。D-GalN-致敏(10mg/小鼠)的对照小鼠在用LPS(10ng)攻击后18小时内死亡。在攻击后超过1天的周期中，记录非致敏小鼠的死亡率。给小鼠腹膜内注射双特异性配体(所述配体能结合小鼠TNFR1和小鼠血清白蛋白(TAR2m-21-233UTAR7m-16;TAR7m-16在本文中也称为MSA16))或ENBREL⑧(entarec印t;ImmunexCorporation)，4小时后给予LPS。(参见表12)。在48小时内以4_6小时的间隔监控存活情况。用存活率证明抗小鼠TNFR1dAb的功效。表12.治疗组药物和剂量LPS剂量/小鼠(ng)动物数量24小时时存活数量1盐水1080/82lOmg/kgENBREL(entarecept;ImmunexCorporation)1088/835,4mg/kgTAR2m-21-233UTAR7m-16104/841mg/kgTAR2m-21-233UTAR7m-1610S2/855.4mg/kgTAR2m-21-233UTAR7m-16022/2TAR2m-21-233UTAR7m-16是含有dAb并能结合小鼠TNFR1的双特异性配体，小鼠TNFR1通过肽接头与能结合小鼠血清白蛋白的dAb结合。编码TAR2m-21-233UTAR7m_16的核苷酸序列和双特异性配体的氨基酸序列分别见下列SEQIDNO:636和SEQIDNO:637。96ACGGGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAAT(SEQIDNO:636)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMGWLRQAPGKGLEWVSRIDSYGRGTYYEDPVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKISQFGSNAFDYWGQQQGARWPQTFGQGTKVEIKRAAAEQKLISEEDLN(SEQIDNO:637)在TAR2m-21-233UTAR7m-16治疗组中有幸存者，这证明抗TNFRldAb对体内抑制受体活性是有效的，其结果证明效果是剂量依赖性的。此外，TAR2m-21-233UTAR7m-16的治疗功效比ENBREL⑧(entarec印t;ImmunexCorporation)的功效更好。仅用TAR2m-21_233UTAR7m-16治疗的动物(第5组，没有LPS攻击)的存活率也证明，TAR2m-21_233UTAR7m-16无毒并且在体内通过受体交联而不激动受体。进一步研究证明，当TNFa不存在时，抗TNFRldAb不激动TNFR1(起到TNFR1激动剂的作用)。将L929细胞在分别含有以下成分之一的培养基中培养不同浓度的TAR2m-21-23单体、与市售抗myc抗体(9E10)交联的TAR2m-21_23单体、TAR2m-21-233UTAR7m-16或TAR2m-21-2340KPEG。就与抗myc抗体交联的TAR2m-21_23单体而言，将dAb和抗体按2:1比例混合，在室温下预孵育1小时，剌激体内免疫交联效应，然后进行培养。浓度为3000nM的TAR2m-21-23单体与L929细胞一起孵育。TAR2m-21_23单体和抗Myc抗体与浓度为3000nM的dAb—起孵育。将浓度为25nM、83.3nM、250nM、833nM和2500nM的TAR2m-21-233UTAR7m-16与细胞一起孵育。将浓度为158.25nM、527.5nM、1582.5nM、5275nM和15825nM的TAR2m-21-2340KPEG与细胞一起孵育。孵育过夜后，按照L929细胞的细胞毒性测定所述，评价细胞存活率。结果表明，与不同数量的dAb—起孵育，不导致培养物中无活力细胞数量的增加。将L929细胞与10nM、lnM和0.lnM市售抗TNFR1IgG抗体一起孵育，导致以剂量依赖方式增加无活力细胞，因此证明了这些细胞对TNFR1介导的激动作用的敏感性(图26)。实施例15.慢性炎性疾病的模型A.小鼠胶原诱发的关节炎模型给DBA/1小鼠注射一次Arthrogen-CIA佐齐U禾PArthrogen-CIA胶原(MD-biosciences)的乳剂。在第21天，从研究中除去具有高关节炎评分的动物，剩下的动物分成10组，雄性和雌性动物数量相等。在第21天，治疗开始用腹膜内注射盐水、ENBREL⑧(entarec印t;I匪nexCorporation)或TAR2m-21-2340kPEG，并持续28天。对动物四肢的每肢都进行临床关节炎评分，分值为0-4，0分代表正常肢，4分代表涉及多关节的最严重的发炎肢。在该模型中，四肢关节炎评分总和从最大的16降至(a)14-15，(b)12_15，(c)10-15，(d)9-15，(e)7-15，(f)5_15，(g)3-15，或(h)1-15是有益结果。可产生的有益结果是四肢关节炎评分总和为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。与未处理的对照组相比，关节炎发作延迟也是有益结果。临床评分清楚表明，与盐水对照相比，用TAR2m-21-2340kPEG进行治疗，对抑制关节炎发展具有非常好的作用，而且TAR2m-21-2340kPEG治疗比用ENBREL(entarec印t;ImmunexCorporation)更好。这首次证明了抑制TNFR1对治疗慢性炎性疾病模型是有效的。B.小鼠IBD和关节炎的AARE模型在TNFmRNA的3'富含AU的元件(ARE)中带有定向缺失的小鼠(称为TnfAAKE小鼠)过量产生TNF并发生炎性肠病，该病与节段性回肠炎在组织病理学上相似。(Kontoyiannis等，J.Exp.Med.196:1563-74(2002))。在这些小鼠中，节段性回肠炎样疾病在4-8周龄时发生，并且这些动物还出现了类风湿性关节炎的临床症状。在TnfAAKE小鼠，评价能结合小鼠TNFR1的dAb抑制节段性回肠炎样病理和关节炎的功效。ENBREL(entarec印t;ImmunexCorporation)用作阳性对照。按照表13所示的给药和剂量方案，将这些药物通过腹膜内注射给予。所研究的dAb包括1)具有一个40kDPEG部分的TAR2m-21_23PEG化；2)能结合小鼠TNFR-l和小鼠血清白蛋白的双特异性TAR2m-21-233UTAR7m_16。表13.98<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>在给药周期结束时，处死小鼠，切下回肠末端和近侧结肠进行分析。对于组织学分析，将组织样品切片并用苏木精和伊红染色，用半定量评分系统对急性和慢性炎症进行评分。评分规定如下急性炎症评分O=0-1多形核(PMN)细胞/高倍视野(PMN/hpf);1=2-10PMN/hpf粘膜内；2=ll_20PMN/hpf粘膜内；3=21_30PMN/hpf粘膜内或ll-20PMN/hpf延伸到粘膜肌层下；4=>30PMN/hpf粘膜内或>20PMN/hpf延伸到粘膜肌层下；慢性炎症评分0=0-10单核白细胞(ML)/hpf(ML/hpf)粘膜内；1=11-20ML/hpf粘膜内；2=21-30ML/hpf粘膜内或ll-20ML/hpf延伸到粘膜肌层下；3=31_40ML/hpf粘膜内或滤泡增生；和4=>40ML/hpf粘膜内或>30ML/hpf延伸到粘膜肌层下或滤泡增生。按照以下系统，每周对关节炎的宏观表型体征进行评分0=没有关节炎(正常外观和屈曲)；1=轻度关节炎(关节变形)；2=中度关节炎(肿胀，关节变形)；3=重度关节炎(严重受损的运动)。在小鼠关节炎AARE模型中，TAR2m-21_23dAb证明有良好的体内功效，与40kDPEG化单体(TAR2m21-2340kDPEG)和双特异性抗TNFR1/抗SA形式(TAR2m-21-233UTAR7m-16)—样。在第9周，TAR2m-21_23和TAR2m-21_233UTAR7m-16治疗组的平均关节炎评分小于0.4。相比之下，盐水对照组的中度至严重关节炎的平均关节炎评分>1.0。与TAR2m-21-23和TAR2m-21-233UTAR7m-16(每周用药2次)相比，用ENBREL(entarec印t;I匪證Corporation)治疗组(每周用药3次)的平均评分为0.5_1.0。这些结果表明，用能结合TNFRl的dAb形式的疗法，是高度有效的抗关节炎疗法，所研究的PEG化dAb和双特异性dAb形式都是对慢性炎性疾病十分有效的药物。而且，这些结果还证明，能结合TNFRl的dAb仅以拮抗方式结合受体。C.小鼠IBDDSS模型给予小鼠溶于饮用水的葡聚糖硫酸钠(DSS)可诱发IBD。(参见例如OkayasuI.等，Gastroenterology98:694-702(1990);PodolskyK.，J.Gasteroenterol.38s聊lXV:63-66(2003))。无幽门螺杆菌(H.pylori)的成年BDF1小鼠笼养2周，稳定它们的昼夜节律。所有小鼠都单独放在带有专门的无病原体(SPF)屏障单元的通风笼子里，在12小时光-暗周期下。让动物随意进食饮水。研究进行7天。饮用水含有5%DSS，用于整个研究阶段中。所有动物在1_7天的早晨(0900-1000)和傍晚(1600-1700)进行治疗。(参见表14)。第1天相当于单次预防剂量。所有动物每天称重，任何腹泻发生率都记录下来。在最后一次治疗后24小时，处死所有动物，在处死前40分钟给予溴脱氧尿苷脉冲。从动物身上切下远侧大肠。将远侧大肠的小样品放在"RNAlater"中，剩余部分在Carnoy氏固定剂中固定，石蜡包埋，切片(非连续切片/每玻片)并用苏木精和伊红染色。切片用目测评价IBD严重程度并给予严重程度评分。进行组织学分析，测定平均损害面积(溃疡面积)、平均上皮面积和平均壁内炎症面积。采用ZeissAxiohome显微镜，大肠H&E横切片可用于记录一系列组织尺寸，这可准确量化面积。对于每个横切片，可以测量上皮加上固有层的面积和结缔组织面积。然后可单独计算出上皮面积，差就是固有层面积。在正常组织中，该组织对面积的相对贡献约为10%，但是它随炎症的增加而上升。因此上皮固有层的相对比例发生改变。随着严重程度增加，该面积的深度变狭窄(由于溃疡)且结肠长度变短。这些现象共同引起内腔横切面面积增加。因此，这一参数可用于确定疾病的严重程度。组织样品可通过显微镜观察并进行严重程度评分，其中0=无炎症；1=隐窝底部周围轻度炎症；2=大量炎症浸润，粘膜结构被破坏；3=大量炎症浸润，粘膜结构被破坏以及溃疡。在该模型中，相对于盐水对照组严重程度评分而言，当治疗导致严重程度评分下降，就表明有效。例如治疗组严重程度评分可以降低O.1至约1、1至约2、或2至约3。评分约2以下、1至约2、或1以下，表明有效。9组(每组6只)动物如下进行治疗表14.组别1DSS/饮用水2DSS/饮用水+ipPEGTAR2m-21-23，10mg/kglx/d3DSS/饮用水+ipPEGTAR2m-21-23，lmg/kglx/d100组别4DSS/饮用水+ip盐水5DSS/饮用水+经口管饲PEGTAR2m-21-23，0.25mg/动物2x/d6DSS/饮用水+经口管饲盐水7DSS/饮用水+ip给予+ve对照，例如固醇8DSS/饮用水+经口管饲+ve对照，例如5'氨基水杨酸或类似物9未治疗动物经口管饲将给予ZANTAC(盐酸雷尼替丁；GlaxoSmithKline)。D.小鼠慢性阻塞性肺病(COPD)模型对抗TNFRldAb在小鼠亚慢性吸烟(TS)模型中疾病发展的功效进行评价。(参见例如WrightJL和ChurgA.，Chest122:306S-309S(2002))。抗小鼠TNFR1dAb经腹膜内注射给予，每48小时一次(在第一次暴露给TS之前24小时开始)并且以血清半衰期延长形式(例如包含抗SAdAb的PEG化、双特异性配体)给予。或者，抗TNFRldAb将通过鼻内给药方式给予，每24小时一次(在第一次暴露给TS之前4小时开始)并且以单体dAb给予。用ENBREL⑧(entarec印t;I匪證Corporation)作为阳性对照。每天都接触TS，研究持续1-2周。(参见例如Vitalis等，Eur.Respir.J.，11:664-669(1998))。最后一次TS暴露之后，分析支气管肺泡灌洗的总细胞计数和细胞分类计数，包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞亚类。将肺叶在10%缓冲福尔马林中固定，分析组织切片中肺泡和肺泡管的增大、小气管壁增厚情况，并进行细胞计数，包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞亚类。因ES暴露而升高的嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和T-淋巴细胞亚类数目的下降，以及TS诱导的肺泡和肺泡管的增大和小气管壁增厚的降低，证明了功效。实施例16.重组嵌合TNFR1分子的构建和表达该实施例说明了由不同鼠TNFR1域和人TNFR1域组成的分子的制备方法(BannerDW等，Cell,75(3):431-45(1993))，使得该分子含有4种已定义的TNFR1胞外区，但是这些在小鼠和人TNFR1蛋白间的衍生差异是不同的。根据不同结构域的作用和功能，所产生的嵌合受体共享人TNFR1和小鼠TNFR1的特性。该分子提供对结合人或小鼠TNFR1的dAb、抗体及其抗原结合片段和其它分子(例如有机化合物、NCE;或蛋白质域，例如亲和体、LDL受体域或EGF域)的结构域特异性的评价方法。方法将人和小鼠TNFR1序列先通过EcoRI和Notl限制性内切核酸酶位点克隆到毕赤101酵母表达载体pPicZa(Invitrogen)中。模板小鼠TNFRIDNA(因此嵌合受体构建体结束于鼠域4)含有3'6x组氨酸标记。人TNFR1(因此嵌合受体构建体结束于人域4)在序列的3'端同时含有Myc和6x组氨酸标记。按照标准PCR条件，采用RubyTaqDNA聚合酶(USBCorporation,Cleveland,Ohio)、lOOng模板DNA(包含全长mTNFRl或hTNFRlDNA相关DNA小量制备物模板)，进行起始PCR。典型的PCR反应如下进行含聚合酶的25ii110XRubyTaqPCR缓冲液；2第一引物(来自10iiM贮液)；2iU第二引物(来自10iiM贮液)；liil(100ng)全长TNFR1模板DNA;20illdH20(至终体积50ill)。反应在薄壁管中进行，并放在热循环仪中，其中按照以下参数进行反应。<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>用于产生嵌合构建体的起始PCR反应的概述<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>*注释H=人结构域；M=小鼠结构域；例如MHHH=小鼠结构域1，人结构域2-4。将这些起始PCR所产生的PCR产物从1X琼脂糖凝胶上切下来，用凝胶纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化，然后洗脱到50yldH20中。用于产生嵌合TNFR1构建体的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>S0EPCR装配PCR(也称为'pull-through'或剪接重叠延伸(S0E)，参见Gene，15:77(1):61-8(1989))使初次PCR产物无需消化或连接而联合在一起，使用初次PCR产物互补末端。在该过程中，初次产物联合在一起并变性，接着在T叫DNA聚合酶和dNTP存在下，让它们的互补末端一起退火。重复退火和延伸多次循环，导致互补链补平，产生全长模板。添加邻接全长构建体盒的引物，进行常规PCR，扩增装配产物。进行S0EPCR，使来自上述起始PCR的不同TNFR1域一起退火并扩增。装配SOEPCR如下进行含MgCl2的4010XPCR缓冲液；2ill(lOOng)起始PCR1的纯化产物；2(100ng)起始PCR2的纯化产物；36ii1dH20(至终体积80ill)。在以下装配步骤后加入SOE引物混合物25'侧翼引物(引物l);2iU3'侧翼引物(引物2);10iU10xPCR缓冲液；6朋20(至终体积20ill)。使用下述程序进行PCR反应。起始装配循环需要约45分钟，然后将热循环仪设置停顿在94t:。20iU引物混合物加入到各反应物中并混合。步骤1装配<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>步骤2扩增(停顿在94°C，然后加入引物混合物)<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>将3-5ii1各反应物在1%琼脂糖凝胶上电泳，检查PCR产物。3)将装配TNFR1嵌合体克隆到毕赤酵母表达载体中pPicZct载体(Invitrogen)依次用EcoRI禾口Notl酶消化，再用ChromaspinTE-1000凝胶过滤柱(Clontech，MountainView,CA)纯化。4)将TNFR1嵌合构建体转化到大肠杆菌中连接后的嵌合构建体转化到HB2151电感受态(electrocompetent)大肠杆菌细胞中，在低盐LB培养基中回收1小时，然后接种在含有0.25iig/ml零霉素(ZE0CIN)、含腐草霉素D的抗生素制剂(Cayla，Toulouse，法国)的低盐LB琼脂上，在37。C培养24小时。单菌落经序列证实，以保证表达载体内嵌合构建体有正确序列，大规模Maxipr印质粒制备物由各嵌合构建体载体组成。所制备的嵌合构建体的核苷酸序列见下文。嵌合构建体根据其结构域来源而命名(从左到右是域1至域4)。例如，HMMM含有人域1和小鼠域2-4。含有小鼠域4的嵌合蛋白仅具有His标记并且缺乏跨膜区和域4之间的间隔区。GAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA(SEQIDNO:623)5)TNFR1嵌合构建体的制备及转化到巴斯德毕赤酵母中将通过各大量制备(maxipr印)产生的质粒DNA用稀有切割限制内切核酸酶Pmel消化，以便使DNA线性化，然后进行毕赤酵母转化。线性化DNA再通过苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀而纯化，然后重悬于30ii1dH20。10ii1线性化DNA溶液与80y1电感受态(electro-competent)KM71H毕赤酵母细胞混合5分钟，然后进行电穿孔(1.5kV，200Q，25F)。细胞立即用YPDS恢复并在3(TC孵育2小时，然后接种在在含有100yg/ml零霉素(ZEOCIN)、含腐草霉素D的抗生素制剂(Cayla，Toulouse，法国)的YPDS琼脂板上培养GAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA(SEQIDNO:622)MHHH1062天。6)构建体在毕赤酵母中的表达挑取各构建体的单个转化菌落，接种到5mlBMGY(作为起子培养物)中，在3(TC培养24小时。用该培养物接种500mlBMGY培养基，在3(TC培养24小时，然后在室温下以1500-3000g离心5分钟收获细胞。将细胞重悬于100mlB匪Y中，培养4天，同时交错增加甲醇浓度(第l天O.5%，第2天1%，第3天1.5%，第4天2%)。表达后，以3300g离心15分钟，回收上清液。7)用Nickel树脂纯化TNFR1嵌合构建体培养上清液先加入lOmM终浓度的咪唑和2xPBS来缓冲。在室温下加入Nickel-NTA树脂，分批吸附His-标记的蛋白质达4小时(振荡)。上清液/树脂混合物再倒入poly-pr印柱(Biorad)。树脂再用10倍体积的2xPBS洗涤，用250mM咪唑lxPBS洗脱。更换缓冲液后，用EndoH脱糖基化酶使嵌合构建体表达脱糖基化，再通过SDS-PAGE得以证实。PCR过程中所用的模板DNA序列人(Homosapiens)TNFR1(胞外区Genbank检索号33991418)GGCACCACA(SEQIDNO:624)所编码的人TNFR1胞外区具有下列氨基酸序列。LVPHLGDREKRDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQIENVKGTEDSGTT(SEQIDNO:603)鼠(小家鼠(Musmusculus))TNFRl(胞外区Genbank检索号31560798)TCAGGTACTGCG(SEQIDNO:625)所编码的鼠(小家鼠(Musmusculus))TNFRl胞外区具有下列氨基酸序列。LVPSLGDREKRDSLCPQGKYVHSKNNSICCTKCHKGTYLVSDCPSPGRDTVCRECEKGTFTASQNYLRQCLSCKTCRKEMSQVEISPCQADKDTVCGCKENQFQRYLSETHFPPLANVTNPQDSGTA(SEQIDNO:604)实施例17.抗TNFRldAb的结构域特异性该实施例描述了用于确定结合TNFR1的dAb的结构域特异性的方法。该方法采用表面等离子共振(SPR)('Detectionofimmimo-complexformationviasurface3(4):211-25.)，以确定抗体与固定在SPR芯片表面的完全人或小鼠生物素化TNFR1结合的能力，当抗体孵育并与过量的实施例16所述的嵌合分子平衡之后。在该测定中，抗TNFR1dAb流过TNFR1表面，产生SPR信号，表示与固定在SPR芯片上的TNFR1结合的dAb量。如果dAb经预孵育并用包含TNFR1域(该结构域尤其可与dAb结合)的嵌合分子平衡，那么与单独的dAb相比，该混合物流过TNFR1表面，将会产生更弱的SPR信号。然而，如果dAb经预孵育并用不包含TNFR1域(该结构域尤其可与dAb结合)的嵌合分子平衡，那么与单独的dAb所得到的信号相比，该混合物流过TNFR1表面，将会产生大致相同的SPR信号。方法1)SPR芯片TNFR1表面的产生TNFR1表面的选择由待测抗TNFRldAb的物种特异性来决定。因此，用人TNFR1包被的表面来评价抗人TNFRldAb,并且用小鼠TNFR1包被的芯片来评价抗小鼠TNFRldAb。生物素化TNFR1在合适SPR缓冲液中稀释，并在BIACORE3000SPR仪器(BiacoreInternationalAB，U卯sala，Sweden)中通过链霉抗生物素(SA)传感器芯片。低流速(5-101/分钟)用于使生物素化TNFR1和链霉抗生物素表面之间的接触时间最大化。持续流速，直到链霉抗生物素表面被生物素化材料饱和，以产生具有最大TNFR1表面的芯片。芯片通常结合几百个到几千个生物素化材料的SPR响应单元。2)SPR芯片上抗TNFR1响应的效价—个成功的竞争实验需要抗TNFRldAb的起始最佳浓度，使得最少量的dAb流过其表面，给出明显的SPR信号。在某些浓度范围内，dAb可以剂量依赖性方式结合表面，使得dAb结合的RU数能反映流过芯片表面的dAb浓度。为了确定这样的剂量依赖性浓度范围，在10倍系列稀释的Biacore缓冲液(范围从l:IO稀释到I:l，OOO，OOO稀释)中滴定抗TNFRldAb。然后将稀释液单独且序贯注射到TNFR1芯片表面，从最稀的样品开始。测定各稀释液所得的最大RU数。必要时，每次注射后，TNFR1表面用合适的SPR再生缓冲液进行再生，以除去结合的抗TNFRldAb。采用该方法，测出产生约IOORU信号所需的抗TNFRldAb的最小浓度。[1001]3)抗TNFRldAb/嵌合体的预平衡plasmonresonanceongold—coateddiffractiongratings-Biosensors.1987_88j108[1002]—旦确定了抗TNFRldAb的最佳浓度，就可建立抗TNFRldAb/嵌合TNFRl混合物。建立混合物，使得抗TNFRldAb的终浓度与先前测定的最佳浓度相同。反应通常在1001体积(含有50微升2x浓縮的抗TNFRldAb、40微升Biacore缓冲液和10微升纯化嵌合蛋白)中进行。最终混合物通常的浓度为约10-100iiM嵌合蛋白和约10-100nM抗TNFRldAb。在室温下让混合物平衡30分钟。[1003]4)竞争性Biacore实验平衡后，各抗TNFRldAb/嵌合TNFRl混合物序贯通过TNFR1SPR表面并测定响应单元数目。各混合物注射后，表面经再生以除去结合的抗TNFRldAb,然后注射下一种混合物。用不同嵌合体所产生的不同响应，可以测出结合特定dAb的TNFRl域。这些研究表明，TAR2m-21-23结合小鼠TNFRl的域1，TAR2h_205结合人TNFRl的域1，TAR2h-10-27、TAR2h_131-8、TAR2h_15-8、TAR2h_35_4、TAR2h_154-7、TAR2h-154-10和TAR2h-185-25结合人TNFRl的域3。实施例18.筛选方法实施例16中描述的这些嵌合受体蛋白质可用于测定或筛选，以分离出能结合TNFRl内特定结构域的物质(例如抗体、dAb、化合物)。简而言之，这些方法描述了将嵌合蛋白加入到粗抗体制备物中，然后通过ELISA或表面等离子共振筛选TNFRl结合。另外，它们描述了在表面(例如ELISA板或SPR芯片)包被的嵌合蛋白的用途并通过测定它们与该表面上嵌合蛋白的结合而筛选抗体。[1008]l)可溶性ELISA筛选该方法可用于从庞大的未知特异性的抗体或抗体片段库中，快速分离出能结合TNFRl特定结构域的抗体或抗体片段(例如dAb)。96孔测定板用100ii1/孔的嵌合TNFRl在4。C包被过夜。各孔用0.1%TPBS(含有浓度0.1%的吐温-20的磷酸缓冲盐溶液)洗涤3次。加入200ii1/孔的1%TPBS封闭该板并将该板在室温下孵育1-2小时。各孔用PBS洗涤3次，然后加入含有可溶性抗体或抗体片段(其含有c-Myc表位标记)/50ill0.2%TPBS的50细菌上清液或peripr印。将该板在室温下孵育1小时。然后，将该板用0.1%TPBS(0.1%吐温-20/PBS)洗涤5次，再向各孔中加入100ill第一抗c-Myc小鼠单克隆抗体/0.1%TPBS，将该板在室温下孵育1小时。弃去这样的第一抗体溶液，再将该板用0.1%TPBS洗涤5次。然后加入来自山羊的1001预稀释的抗小鼠IgG(Fc特异性)HRP缀合物(Sigma产品目录号A016S)，将该板在室温下孵育1小时。弃去第二抗体，将该板用0.1%TPBS洗涤6次，再用PBS洗涤2次。向各孔中加入50ii1TMB过氧化物酶溶液，将该板在室温下放置2-60分钟。加入501M盐酸，终止反应。在加酸后的30分钟之内，在96孔板阅读器上读出该板在450nm处的OD值。粗制细菌上清液或peripr印s中存在的、能结合嵌合蛋白内存在的TNFRl域的这些抗体，将会给出较强烈的ELISA信号，而那些不能结合的则不能给出信号。[1011]2)竞争性ELISA筛选该方法可以用于快速筛选一系列能结合TNFRl的不同粗抗体或抗体片段制备物，以测定它们的结构域结合特异性。96孔测定板用100ii1/孔的鼠或人TNFRl(人或小鼠)在4。C包被过夜。各孔用0.1%TPBS(含有浓度0.1%的吐温-20的磷酸缓冲盐溶液)洗涤3次。加入200y1/孔的1%TPBS(l^吐温-20/PBS)封闭该板，然后将该板在室温下孵育1-2小时。各孔用PBS洗涤3次。同时，细菌上清液或peripr印s用预优化浓度的嵌合TNFR1蛋白/溶液预平衡。将含有可溶性抗体或抗体片段的50i！1该粗制细菌制备物/嵌合蛋白混合物加入到ELISA板中。将该板在室温下孵育1小时。然后，将该板用0.1%TPBS(O.1X吐温-20/PBS)洗涤5次，再向各孔中加入100iil第一检测抗体(或蛋白A-HRP或蛋白LHRP)的0.1%TPBS，将该板在室温下孵育1小时。弃去这样的第一抗体溶液，再将该板用0.1%TPBS洗涤5次。如有必要，加入来自山羊的100iU预稀释的第二抗体-HRP缀合物，将该板在室温下孵育1小时。然后弃去第二抗体，将该板用O.1XTPBS洗涤6次，再用PBS洗涤2次。向各孔中加入50iilTMB过氧化物酶溶液，将该板在室温下放置2-60分钟。加入50yllM盐酸，终止反应。在加酸后的30分钟之内，在96孔板阅读器上读出该板在450nm处的OD值。ELISA信号减少，表明抗体与板上包被的嵌合TNFR1域、而不是完整TNFR1结合，因此，该抗体能结合嵌合蛋白内的一个结构域。3)对与参考抗体或抗体片段竞争性结合TNFR1的抗体和抗体片段的竞争性ELISA筛选该方法可以用于快速筛选一系列能结合TNFR1的不同粗抗体或抗体片段制备物，所述抗体或抗体片段与参考抗体或抗体片段(例如TAR2m-21-23)竞争性结合TNFR1或者结合TNFR1的所需结构域(例如域l)。该方法采用含有不同可检测标记(表位标记)的参考抗体或抗体片段和试验抗体或抗体片段(例如有待筛选的抗体群体)。[1016]96孔测定板用100iil/孔的鼠或人TNFRl在4t:包被过夜。各孔用0.1XTPBS(含有浓度0.1%的吐温-20的磷酸缓冲盐溶液)洗涤3次。加入200ii1/孔的1%TPBS(1%吐温-20/PBS)封闭该板，将该板在室温下孵育1-2小时。各孔用PBS洗涤3次。同时，待测粗抗体制备物与预优化浓度的参考抗体或抗体片段(例如域1-结合抗体；TAR2m-21-23)/溶液混合。正如所述，重要的是该抗体不包含与有待筛选结构域结合特异性的抗体相同的检测标记。将50iil该粗制抗体/参考抗体混合物加入到ELISA板中。将该板在室温下孵育1小时。然后，将该板用0.1%TPBS洗涤5次，向各孔中加入100ii1第一检测抗体(其结合仅存于待筛选的抗体群体中的标记)的O.1%TPBS，将该板在室温下孵育1小时。弃去这样的第一抗体溶液，再将该板用0.1XTPBS洗涤5次。然后，加入能识别第一检测抗体的100iU预稀释的第二抗体-HRP缀合物，将该板在室温下孵育1小时。弃去第二抗体溶液，将该板用0.1%TPBS洗涤6次，再用PBS洗涤2次。向各孔中加入50y1TMB过氧化物酶溶液，将该板在室温下放置2-60分钟。加入50iil1M盐酸，终止反应。在加酸后的30分钟之内，在96孔板阅读器上读出该板在450nm处的OD值。应该平行地进行一个单独而平行的ELISA，采用该方法，但不加参考抗体或抗体片段。与用相同抗体制备物、而没有竞争性参考抗体或抗体片段所得到的ELISA信号相比，在参考抗体或抗体片段存在时ELISA信号减少，表明特定抗体或抗体片段与参考抗体或抗体片段竞争性结合TNFR1域，并且与参考抗体或抗体片段一样结合同一TNFR1域。[1017]4)SPR筛选可以容易地修改上述ELISA方法，以便采用表面等离子共振，例如用BIACORE3000SPR仪器(BiacoreInternationalAB，Uppsala，Sweden)。通常，嵌合蛋白可固定在SPR芯片上，或者嵌合蛋白可用含有抗TNFR1抗体或抗体片段的粗制细菌上清液平衡，所得110混合物流过用全长人TNFRl或鼠TNFRl包被的SPR芯片。实施例19.TAR2m21-23二聚体是高度亲合力的TNFRl拮抗剂采用实施例8描述的方法，通过制备在羧基端含有cys残基的TAR2m21-23形式，制备TAR2m21-23二聚体。蛋白质(TAR2m21-23CYS)在毕赤酵母中表达，并用Streamline蛋白A进行纯化。非还原性SDS-PAGE分析表明，40-50%的蛋白质以二聚体形式存在于溶液中。二聚体用凝胶过滤色谱进一步纯化。2mg蛋白质浓縮至约250ii1并上样到Superdex75HR凝胶过滤柱(AmershamBioscience)上，该柱先前已用PBS进行平衡。该柱运行的流速为0.5ml/分钟，收集0.5ml流分。在280nm处监控从该柱上洗脱的蛋白质，含有二聚体的流分经非还原性SDS-PAGE得以证实。合并含有二聚体、但不含单体TAR2m-21-23CYS的流分。浓縮合并的流分，在L929TNF细胞的细胞毒性测定(实施例6)中测定二聚体dAb的效力。[1022]在L929细胞毒性测定中，将TAR2m21-23二聚体的生物学效力与单体TAR2m-21-23进行比较。在该测定中，测定了TAR2m21-23单体和TAR2m21_23二聚体对由TNF诱导的小鼠L929细胞的细胞毒性的抑制，其结果表示为在测定中抑制50%细胞毒性的dAb单体或二聚体的浓度(中和剂量50，ND50)。在测定中，单体dAb的ND5。约为600pM。在测定中，二聚体dAb(TAR2m21-23二聚体)的ND5。约低10倍(ND5。约60-70pM)。这些结果表明，与dAb单体相比，TAR2m21-23二聚体对细胞表面TNFRl的亲和力具有显著提高。结果表明，TAR2m21-23二聚体同时结合细胞表面上的两个单独的TNFRl分子，针对多聚体的所得亲合力效应导致对TNFRl抑制的改善。然后测定二聚体形式(TAR2m21-23二聚体)，以观察它是否表现出TNFRl激动的任何征兆，所述TNFRl激动意即引起TNFRl交联并促进胞内信号转导和细胞死亡的能力。采用改进L929细胞的细胞毒性测定，可达到这一点，其中未加TNF-a，而是检测抗TNFRl抗体或dAb形式，以观察它们是否激动TNFRl并诱导细胞死亡。在测定中，测定了作为已知TNFRl激动剂的抗TNFRl抗体AF-425-PB(R&D系统)，以及作为已报道的TNFRl、TAR2m-21_23和TAR2m21-23二聚体的拮抗剂的抗TNFRl抗体MAB430(R&D系统)。在测定中，抗体AF-425-PB激活TNFRl并诱导细胞毒性，其ND5。约为100pM。在测定中，甚至已报道的拮抗剂抗体MAB430也引起受体交联和细胞杀伤，其ND5。约为10nM。相比之下，在测定中，TAR2m-21-23二聚体却不引起任何细胞死亡，甚至当以极高浓度存在时(>1yM)。这些结果表明，TAR2m21-23二聚体不是TNFRl激动剂。结果表明，结合TNFRl的dAb的二聚体、三聚体或其它多聚体对细胞表面表达的TNFRl具有高亲合力，而且是有效TNFRl拮抗剂。此外，该研究结果表明，结合TNFRl的域1的dAb多聚体(例如TAR2m21-23二聚体)，能结合两个TNFRl分子(如同测定中作为激动剂的抗体所能结合的一样)，而且与TNFRl的结构域或表位靶(域1)的结合，阻止受体链的紧密结合，而这正是起始TNFRl信号转导所必需的。该特性对二价分子来说是独特的，所述分子能交联细胞表面的TNFRl，但不引起TNFRl信号转导和细胞死亡。[1027]实施例20.结合人TNFRl和小鼠TNFRl的dAb的分离已知序列的dAb在大肠杆菌中表达，并用蛋白A层流(streamline)树脂纯化。洗脱到Tris-甘氨酸中，然后dAb流过SPR芯片，其上已经固定有生物素化人TNFRl(流动池2)和生物素化鼠TNFR1(流动池4)。(该SPR芯片用相同密度的人TNFR1和鼠TNFR1包被)。流动池1和3为空白，作为无抗原参考表面，用于检测并减去非特异性结合。[1029]dAb流过连续的4个流动池(即依次为流动室1、2、3和4)，测定流动室2与流动室1之间的响应差异，也测定流动室4与流动室3之间的响应差异。前者测定的是与人TNFR1的结合，而后者是与鼠TNPR1的结合。记录用于结合人TNFR1和鼠TNFR1的特异性结合曲线，在曲线中注意到，与鼠TNFR1相比，人TNFR1的缔合速率更快。解离速率也大致相似。通过每次结合事件所得到的最大响应单位(RU)数来评价交叉反应。在该实施例中，人生物素化TNFR1表面在流动室2上包含约900RU的TNFR1，而在流动室4包含约1400RU的鼠TNFR1。作为对照，浓度为2微摩尔TAR2h-154-7(—种人特异性dAb)结合人表面的最大响应为385RU，而在小鼠表面的响应仅为4.5RU。2微摩尔TAR2h_205在人表面得到的响应为435RU，而在小鼠表面为266RU。本申请书提到的所有出版物以及所述出版物中引用的参考文献，全都通过引用结合到本文中。本领域技术人员显而易见的是，只要不偏离本发明的范围和精神，可以对本发明描述的方法和系统进行各种的修改和变动。尽管用具体的优选实施方案描述了本发明，但是应该理解，要求保护的发明并不限于这些具体的实施方案。当然，对用于实施本发明的所述方式的各种修改，对于分子生物学或相关领域技术人员来说是显而易见的，这样的修改落入所附权利要求书范围之内。1031]附录l:延长体内半衰期的多肽1032]a-l糖蛋白(血清类粘蛋白(0ros薩coid))(AAG)1033]a-l抗胰凝乳蛋白酶(ACT)1034]a-l抗胰蛋白酶(AAT)1035]a-l微球蛋白(蛋白HC)(AIM)1036]a-2巨球蛋白(A2M)1037]抗凝血酶III(ATIII)1038]载脂蛋白A-l(ApoA-l)1039]载脂蛋白B(ApoB)1040]P-2-微球蛋白(B2M)1041]血浆铜蓝蛋白(Cp)1042]补体成分(C3)1043]补体成分(C4)1044]CI酯酶抑制剂(CIINH)1045]C-反应蛋白(CRP)1046]半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)1047]铁蛋白(PER)1048]血纤蛋白原(FIB)1049]纤连蛋白(FN)1050]触珠蛋白(Hp)1051]血红素结合蛋白(HPX)1052]免疫球蛋白A(IgA)112[1053]免疫球蛋白D(IgD)免疫球蛋白E(IgE)免疫球蛋白G(IgG)免疫球蛋白M(IgM)免疫球蛋白轻链(K/入)脂蛋白(a)[Lp(a)]甘露糖结合蛋白(MBP)肌红蛋白(Myo)血纤蛋白溶解酶原(PSM)前白蛋白(运甲状腺素蛋白(Transthyretin))(PAL)视黄醇结合蛋白(RBP)类风湿因子(RF)血清淀粉样蛋白A(SAA)可溶性转铁蛋白受体(sTfR)转铁蛋白(Tf)附录2<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table>配对治疗相关参考TNFa/IL-3白介素3和肿瘤坏死因子a在剌激急性骨髓性白血病胚细胞克隆生长中的协同作用，是肿瘤坏死因子a诱导第二造血细胞因子的结果。CancerRes.1992年4月15日;52(8):2197-201。TNFa/IL-4IL-4和TNF协同诱导VCAM在内皮细胞的表达。意味着在哮喘中具有作用。在RA中与滑膜相关是相同的。TNF和IL-4协同诱导角质形成细胞中的IL-6表达。在培养的成纤维细胞样滑膜细胞(synoviocyte)中可以实现VCAM-1水平持续上升，即通过TNFa与或者IL-4或者IL-13联用，通过增力口mRNA稳定性。Am.J.Pathol.，1999年4月;154(4):1149-58。TNFa/IL-5在成人及其孩子的支气管过度反应中，肿瘤坏死因子系统与血清白介素_4、白介素-5、白介素_8、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白和免疫球蛋白E水平之间的关系。AllergyAsthmaProc.2003年3-4月;24(2):111-8。TNFa/IL-6TNF和IL-6是0H-2(—种新的人骨髓瘤细胞系)的强效生长因子。Eur.J.Haematol.，1994年7月;53(1):31-7。TNFa/IL-8TNF和IL-5与P丽协同活化血小板。涉及急性呼吸窘迫综合征。参见IL-5/TNF(哮喘)。白介素-8与肿瘤坏死因子_a间的协同作用，用于嗜中性粒细胞介导的血小板活化。EurCytokineNetw.1994年9_10月；5(5):455-60。(成人呼吸窘迫综合征(ARDS))。TNFa/IL-9TNFa/IL-10IL-10诱导并与TNF协同诱导慢性感染的T细胞的HW表达。TNFa/IL-11细胞因子协同诱导破骨细胞分化由无限增殖或正常颅盖细胞支持。Am.J.Physiol.CellPhysiol.，2002年9月；283(3):C679-87。(骨丢失)。114<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>配对治疗相关参考TGF-P/IH成骨细胞合成的前列腺素(Prostaglndin)肠上皮细胞产生的IL-6(炎症模型)在肺成纤维细胞中剌激IL-11和IL-6(炎症模型)在视网膜中产生IL-6和IL-8。TGF-P/IL-6软骨癌(Chondrocarcoma)增殖。IL-l/IL-2B细胞活化LAK细胞活化T细胞活化IL-l与IL-2协同作用产生由TNFa和|3(淋巴毒素)介导的、淋巴因子活化的杀伤细胞。Cytokine,1992年11月；4(6):479-87。IL-l/IL-3IL-l/IL-4B细胞活化在内皮细胞活化中，IL-4诱导IL-l表达。IL-l/IL-5IL-l/TL-6B细胞活化T细胞活化(可替代辅助细胞)IL-li秀导IL-6表达C3和血清淀粉样蛋白的表达(急性期反应)HIV表达软骨胶原分解。IL-l/IL-7IL-7是IL-l诱导的胸腺细胞增殖的必要条件。IL-7与IL-l参与粒细胞_巨噬细胞集落剌激因子或肿瘤坏死因子的协同作用。J.Immunol.，1992年1月1日；148(1):99-105。IL-l/IL-8IL-l/IL-10117<table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table>配对治疗相关参考IL-2/IL-7IL-2/IL-9参见IL-211L-4(NK细胞)IL-2/IL-10B细胞活化IL-2/IL-12在新鲜人NK细胞中，IL-12与IL-2协同诱导淋巴因子活化的细胞毒性和穿孔蛋白和粒酶基因表达。Celllmmunol.1995年10月1日；165(1):33-43。(T细胞活化)IL-2/IL-15参见IL-2/IL-4(NK细胞)(T细胞活化和增殖)IL-15和IL-2:—种用于T细胞在体内生死的物质。NatMed.2001年1月;7(1):114-8。IL-2/IL-16IL-16和IL-2对CD4+T细胞的协同活化。J.Immunol.，1998年3月1日;160(5):2115-20。IL-2/IL-17白介素17早期参与人和实验性肾同种异体移植排斥的证据。J.Pathol.，2002年7月;197(3):322-32。IL-2/IL-18在小鼠间质性肺炎发病机制中，白介素18(IL-18)与IL-2协同诱导小鼠致死性肺损伤一种对细胞因子、趋化因子和自然杀伤细胞的潜在作用。Blood.2002年2月15日；99(4):1289-98。IL-2/TGF-P控制CD4效应物的命运转化生长因子131和白介素2协同阻止细胞凋亡并促进效应物扩充。J.E邓.Med.，1995年9月1日；182(3):699-709。IL-2/IFN-yB细胞分泌的IgIL-2诱导T细胞表达IFN-yIL-2/IFN-a/p.无IL-3/IL-4协同作用与肥大细胞生长IL-4和GM-CSF或IL-3对人单核细胞表达CD23的协同诱导效应IFN-a和IFN-y的调节效应。Cytokine.1994年7月；6(4):407-13。119<table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table>配对治疗相关参考IL-5/IL-13地塞米松对小鼠变应性气管炎症和气管过度反应的抑制嗜酸性粒细胞、IL-5，嗜酸性粒细胞趋化因子和IL-13的作用。J.AllergyClin.Immunol.，2003年5月;111(5):1049-61.IL-5/1L-17在小鼠变应性哮喘模型中，当变应原吸入后，白介素-17促使粒细胞流向气管。Am.J.Respir.CellMol.Biol.，2003年6月；28(1):42-50.IL-5/IL-25摘要在肺部，新IL-17家族成员促进Thl或Th2反应新细胞因子IL-25的体内功能。J.Immunol.，2002年7月1日;169(1):443-53。(变应性炎症)摘要在FceRI介导的活化后，肥大细胞产生白介素-25。Blood.2003年5月1日；101(9):3594-6.Epub2003年6月02日(变应性炎症)IL-5/IFN-yIL-5/GM-CSF细胞因子对人嗜酸性粒细胞IL_3、IL-5和GM-CSF受体a链表达的差异调节IL-3、IL-5和GM-CSF下调IL-5受体a表达(缺乏IL-5反应性)，但上调IL-3受体a表达。J.Immunol.，2003年6月1日;170(11):5359-66。(变应性炎症)IL-6/IL-10IL-6/IL-11IL-6/IL-16白介素16剌激人单核细胞表达和产生促炎细胞因子。Immunology.2000年5月;100(1):63-9。IL-6/IL-17白介素(IL)-17通过IL-6旁分泌/自分泌环剌激气管粘蛋白基因表达。J.Biol.Chem.，2003年5月9日;278(19):17036-43.Epub2003年3月06日(气管炎症、哮喘)IL-6/IL-19摘要IL-19诱导IL-6和TNFa的产生，并通过TNFa导致细胞凋亡。J.Immunol.，2002年10月15日；169(8):4288-97。IL-6/IFN-y122<table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>。<table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table>[1084][1085]附录4[1087]数据汇总[1088]<table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table>[1091]<table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table>序列表<110>DomantisLimitedBrewis，NeilD.Woolven，BenjaminP.Holmes,SteveTomlinson，IanM.〈120〉抗肿瘤坏死因子受体1的单域抗体及其使用方法〈130>P59533L-WO<140>PCT/GB2005/003873〈141>2005-10-07〈150>10/985,847〈151>2004-11-10〈150>PCT/GB2004/004253〈151>2003-10-08〈150>PCT/GB2003/005646〈151>2003-12-24〈150>GB0230202.4〈151>2002-12-27〈150>GB0327706.8〈151>2003-11-28〈150>PCT/GB2003/002804〈151>2003-06-30〈150〉PCT/GB02/03014〈151>2002-06-28〈160>639〈170>FastSEQforWindowsVersion4.0〈210>1〈211>720〈212>DNA〈213〉人(Homosapiens)〈400>1gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctg卿ctc60tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggct120ccagggaaggggctggagtgggtctcagctattagtggtagtggtggtagcacatactac1801126]gcagactccgtgaagggccggttcaccatctCC3g3g3C31127]CtgC3朋tg3acagcctgagagccgaggacacggccgtat1128]ggtgcttttgactactggggccagggaaccctggtcaccg1129]tcaggcggaggtggC3gCggcggtggcgggtcgacggaca1130]tcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatca1131]attagcagctatttaaattggtatcagcag3朋CC3ggg31132]tatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggt1133]acagatttcactctcaccatcagcagtctgc朋cctg朋g1134]C33C3g3gttacagtacccctaatacgttcggCC￡l￡lggg￡l1135]〈210>21136]〈211>2401137]〈212>PRT1138]〈213>人(Homosapiens)1139]〈400>21140]GluValGinLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeu1141]15101142]SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPhe1143]20251144]AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLys1145]35401146]SerAlalieSerGlySerGlyGlySerThrTyr1147]50551148]LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSer1149]6570751150]LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThr1151]85901152]AlaLysSerTyrGlyAlaPheA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