专利名称：靶向crkl的肽的制作方法
靶向CRKL的肽本申请要求2008年6月20日提交的美国申请号61/074，423的优先权，其全部公 开内容无所放弃地特别通过弓I用方式全文并入本文。本发明是在美国政府的支持下在国家健康研究所和国防部的基金PC050442下作 出的。政府享有本发明的一些权利。
背景技术：
1.发明领域本发明涉及分子医学和治疗及检测试剂的靶向输送的领域。更具体地，本发明涉 及选择性靶向癌症以治疗并检测癌症的新的肽序列的鉴定。2.相关领域的描述很多人类疾病状态的治疗性处理受到所用的治疗剂的全身性毒性的限制。癌症治 疗剂尤其显示出非常低的治疗指数，并且在试剂浓度不比用于杀死肿瘤细胞的浓度高很多 时，迅速生长的正常组织例如皮肤和骨髓通常会受到影响。通过开发用于向癌细胞靶向输 送的组合物和方法，更具体而言，就是通过使用与存在于癌细胞表面但不存在于正常组织 中的靶标结合的抗体或肿瘤归巢肽(tumor-homingp印tide)，可以极大地促进癌症的治疗 和诊断。此类靶标必须与其它细胞表面分子具有最小的同源性，其是难以被发现的。最近，使用噬菌体显示文库开发了一种体内选择系统，以鉴定小鼠模型系统中 的器官或组织靶向肽。此类文库可以这样产生将随机寡核苷酸插入编码噬菌体表面蛋 白的cDNA中，产生以多达IO9个排列显示独特肽的噬菌体颗粒的集合(Pasqualini and Ruoslahti, 1996, Arap等人，1998 ；Pasqualini等人，2001)。向携带肿瘤的小鼠静脉内施用 噬菌体显示文库之后，从肿瘤异种移植物中回收噬菌体，并且表征能够选择性向肿瘤归巢 的靶向肿瘤的肽。基于噬菌体外表面表达的特异性靶向肽的序列，回收能够选择性地向不 同小鼠器官或组织的血管床归巢的噬菌体(Pasqualini and Ruoslahti，1996)。那些肿瘤 归巢肽中的每一个都结合至在肿瘤细胞表面选择性表达或上调的受体。治疗剂与靶向肽的连接引起该试剂选择性地输送到小鼠模型系统中的想要的器 官或组织。化疗剂和促调亡肽向位于肿瘤血管形成性脉管系统中的受体的靶向输送引起治 疗功效的显著升高和携带肿瘤的小鼠模型中全身性毒性的下降(Arap等人，1998a, 1998b ； Ellerby 等人，1999)。CRKL (激酶样蛋白的鸡肿瘤病毒10号调节剂)是一种衔接蛋白(adapter protein)，其是癌基因v_crk的同源物。其包含1个SH2结构域和2个串联的SH3结构域。 细胞内的CRKL参与MAP激酶和整联蛋白介导的途径(Li等人，2003⑴emura等人，1999)。 此外，CRKL具有致癌的潜在性。目前，使用全身性化疗和放疗法常规治疗癌症患者。但是，此类疗法经常受到众所 周知的副作用和有限的功效的困扰。显然需要用于靶向输送治疗和诊断剂的新的组合物和 方法。
发明内容
本发明通过使用靶向肽提供了用于选择性地靶向分泌的CRKL的方法和组合物， 从而克服了现有技术中的缺陷。通过使用靶向肽选择性靶向分泌的CRKL可用于例如癌症 的治疗，以便向癌细胞或组织输送化疗化合物、融合蛋白或融合构建体。为了获得关于癌症中跨细胞膜信号传导机理方面的认识，本发明人开始揭示肿瘤 异种移植模型中的功能蛋白相互作用。本发明人推论组合方法(Hajitou等人，2006 ；Arap 等人，2002 ；Arap 等人，1998 ；Arap 等人，2004 ；Pasqualini and Ruoslahti, 1996)，例如在 体内从噬菌体显示随机肽文库连续选择可能提供线索，这通过仿效肿瘤微环境情况下的无 偏差的配体-受体结合来进行。如以下实施例中所示，观察到细胞内信号传导蛋白CRKL和 调节性(而不是配体结合性)β工整联蛋白细胞外结构域之间的特异性相互作用。令人惊奇 的是，本发明人发现CRKL靶向β i整联蛋白的位于细胞外的丛状蛋白-脑信号蛋白-整联 蛋白(plexin-semaphorin-integrin，PSI)结构域，激发MAP激酶并促进细胞生长和存活。 不希望被任何理论束缚，这些结果支持以下观点在激活MAP激酶途径的过程中，对于细胞 内调节剂(例如含SH3的蛋白质)，存在尚未认识的整联蛋白介导的由外至内的功能。本发明的一个方面涉及包含CRKL结合基序的分离的靶向肿瘤的肽，所述基序定 义为长度为6-20个氨基酸，与β 1整联蛋白(SEQ IDNO 47)的相应最佳拟合序列比对的相 似性程度为至少25% ；并且其中所述靶向肽的长度是100个氨基酸或更少的氨基酸，并且 在生理条件下结合至表达CRKL的细胞。所述CRKL结合基序与β ！整联蛋白(SEQ ID NO 47)的最佳拟合序列比对的相似性程度可以是至少40%、至少50%或至少60%。在一些实 施方式中，所述肽具有不同于与β 整联蛋白(SEQ ID NO 47)的最佳拟合序列比对的序列。 在一些实施方式中，所述CRKL结合基序可以具有与β 1整联蛋白(SEQ IDNO :47)PSI结构域 区域的最佳拟合序列比对。所述CRKL结合基序可以具有与^整联蛋白(SEQ ID NO 47) PSI结构域区域的最佳拟合序列比对，所述PSI结构域区域选自氨基酸6至10 ； 10至四；15 至；34 ;18 至 37 ；36 至 55 ；39 至 58 ；45 至 64 ；94 至 113 ；196 至 215 ； 198 至 213 ；203 至 222 ； 244 至 263 ；330 至 349 ；377 至 396 ；379 至 398 ；380 至 399 ；398 至 417 ；400 至 419 ；413 至 432 ；447 至 466 ；460 至 479 ；460 至 479 ；464 至 483 ；469 至 488 ；474 至 493 ；475 至 494 ；512 至 533 ；519 至 538 ；551 至 570 ；574 至 593 ；577 至 596 ；579 至 598 ；590 至 609 ；596 至 615 ； 613 至 632 ；615 至 634 ；616 至 635 ；644 至 663 ；648 至 667 ；663 至 682 ；674 至 693 ；682 至 701 ；721至740 ；727至746 ；和779至798。在一些实施方式中，CRKL结合基序具有选自 SEQ ID NO :1 至 SEQ ID NO 46 的序列。在一些实施方式中，分离的肽可以进一步定义为能够以环状形式制备的环肽，例 如在两个末端具有半胱氨酸残基(“C”)的肽，当需要时，可以通过例如形成二-半胱氨酸 (即胱氨酸)而以环状形式提供所述肽。此类环肽可以具有特别重要的意义肽中的二硫 键使其对于化学、热或酶促降解具有显著稳定性。此类环肽在治疗和诊断应用中可能具有 特别重要的意义，其中涉及到可利用性差、易于发生蛋白水解和体内半衰期短的问题。所述肽可以连接至分子；例如，所述分子可以是蛋白，并且所述肽可以缀合或融 合至所述蛋白以形成蛋白缀合物，其中所述蛋白缀合物不是天然存在的蛋白。肽可以位于 蛋白的末端。所述分子可以是促细胞调亡试剂、抗血管生成剂、细胞因子、细胞毒性试剂、 药物、化疗剂、激素、生长因子、抗生素、抗体或其片段或单链、存活因子、抗细胞调亡剂、激素拮抗剂、抗原、肽、蛋白、诊断剂、放射性同位素或成像剂。所述分子可以是选自下列的促 细胞调亡剂短杆菌肽、爪蟾抗菌肽(magaininhmellitin、防御素、天蚕素(cecropin)、 (KLAKLAK) 2 (SEQ ID NO :48)、(KLAKKLA) 2 (SEQ ID NO :49)、(KAAKKAA) 2 (SEQ ID NO :50)、 (KLGKKLG) 3(SEQ ID NO :51)、Bcl_2、Bad、Bak、Bax 和 Bik。在一些实施方式中，所述促细胞 调亡剂是(KLAKLAK)2 (SEQ ID NO :48)。SEQ ID NO :48可以由D氨基酸组成。在其它实施方式中，所述分子可以是选自下列的抗血管生成试剂血小板反应素、 血管抑素、色素上皮衍生的因子、血管紧缩素、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活 剂抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白细胞介素12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、 血小板反应素、2-甲氧基雌甾二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧胺三唑、CM101、马立马司他、戊 聚糖多硫酸盐、血管生成素2、除莠霉素A、PNU145156E、16K促乳素片段、三羧氨基喹啉 (Linomide)、萨立多胺、己酮可可碱、染料木黄酮、ΤΝΡ-470、内皮抑素、紫杉醇、多烯紫杉醇、 聚胺、蛋白酶体抑制剂、激酶抑制剂、信号传导肽、accutin、西多福韦、长春新碱、博来霉素、 AGM-1470、血小板因子4、二甲胺四环素、内皮抑素XVIII、内皮抑素XV、基质金属蛋白酶-2 的C-末端血红素结合蛋白结构域、人类纤溶酶原的kringle 5结构域、内皮抑素和血管抑 素的融合蛋白、内皮抑素和人类纤溶酶原的kringle 5结构域的融合蛋白、干扰素-γ诱生 的单核因子(Mig)、Mig与IPlO的融合蛋白、可溶性FLT-I (fins样酪氨酸激酶1受体)、或激 酶插入子结构域受体(KDR)。所述分子可以是选自下列的细胞因子白细胞介素l(IL-l)、 IL-2、IL-5、IL-10、IL-11、IL-12、IL-18、干扰素-γ (IF- Y )、IF- α、IF-β、肿瘤坏死因子、 GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)。所述肽可以连接至大分子复合物，例如病毒、噬菌体、细菌、脂质体、微颗粒、磁性 珠子、酵母细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述肽连接至病毒，例如慢病毒、乳多 空病毒、腺病毒、逆转录病毒、AAV、痘苗病毒或疱疹病毒。所述肽可以连接至固体载体，例如 微量滴定皿或微芯片。本发明的另一个方面涉及制备构建体的方法，其包括获得本发明的肽，并将所述 肽连接至分子以制备所述构建体。本发明的另一个方面涉及将肽、分子或蛋白的递送靶向表达CRKL的细胞的方法， 所述方法包括以下步骤获得或通过上述方法制备根据本发明的肽，并将所述肽施用至细 胞群体，其中所述群体包括表达CRKL的细胞，从而将分子或蛋白输送至所述细胞。表达 CRKL的细胞可以在受试者中，肽或蛋白融合构建体可以配制在药学上可接受的组合物中， 所述组合物可以施用至受试者。所述受试者可以人类受试者。在一些实施方式中，该方法进 一步定义为检测方法，所述方法还包括检测已经被输送至细胞的肽、分子或蛋白。所述受试 者可以患有疾病或病症，所述方法可以进一步定义为治疗方法。所述受试者可以具有癌症， 例如前列腺癌、乳腺癌、肉瘤、牙龈癌、舌癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、肾癌、眼癌、脑癌、白血病、 间皮瘤、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、胰腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、宫颈癌、胃 肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌和膀胱癌。在本发明的方法和/或组合物的上下文中讨论的实施方式可以应用于本文描述 的任何其它方法或组合物。因此，涉及一种方法或组合物实施方式也可应用于本发明的其 它方法和组合物。在本文的说明书中，“一个(a)“或〃 一个(an)“可以指一个或多个。在本文的权利要求中，当与单词"包含(comprising)“ —起使用时，单词"一个(a)“或"一个 (an)“可以指一个或一个以上。除非明确说明是仅指替代物或者替代物互不相容，否则权利要求中使用的术语 “或”用于指“和/或”，虽然本公开支持仅指替代物和“和/或”的定义。本文使用的“另一 个”可以指至少另外一个或多个。在本申请中，术语“大约”用于表示数值，包括设备、用于测定该数值的方法的误差 的固有差异，或存在于研究受试者中的差异。本发明的其它目标、特征和优点将通过以下详细描述变得明显。但是，应该理解，虽 然指明本发明的优选实施方式，但是仅以解释方式给出详细描述和具体实施例，因为从该详 细描述出发，本发明精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员将是明显的。
以下附图是本说明书的一部分，包括这些附图是为了进一步说明本发明的某些方 面。可以通过参照附图并结合本文提供的具体实施方式
的详细描述更好地理解本发明。图IA-C 癌细胞中肽的靶向和内在化。图1A，噬菌体肽 YRCTLNSPFFffEDMTHECHA(SEQ ID NO 1)结合至 DU145 细胞的细胞表面。显示序列 RGD-4C 的噬菌体克隆(Arap等人，1998)用作阳性对照；fd_tet (无插入子)用作阴性对照。条柱 代表一式三份涂板的平均值士标准偏差。图1B，非通透化的KS1767细胞的细胞表面上 肿瘤归巢噬菌体的免疫定位。图IC和D，合成肽YRCTLNSPFFWEDMTHECHAGG(SEQ ID NO: 67)-D(KLAKLAK)2使得在DU145细胞内发生内在化，如使用WST-I试剂和抗-annexin-VFITC 抗体通过细胞存活性所测图2A-C 肿瘤归巢肽和β ！整联蛋白(SEQ ID NO 13)的序列比对。图2Α，肿瘤归 巢肽YRCTLNSPFFWEDMTHECHA(SEQ IDNO 1)与丛状蛋白-脑信号蛋白-整联蛋白(PSI)结 构域(序列区域26-78残基)(SEQ ID NO 12)匹配。图2B，所有8个β整联蛋白-亚基 (SEQ IDNO :14-21) % YRCTLNSPFFffEDMTHECHA (SEQ ID NO 1)肽序列的序列比对。图 2C，所 有肿瘤归巢肽(表1)与、整联蛋白(SEQ IDNO 13)的序列比对。图3A-D 肽与受体的结合。图 3A，重组 His-标签 CRKL (rCRKL)、rCRKL_SH3 (N)结 构域和 rCRKL-SH3 (C)结构域结合至肿瘤归巢肽-TOCTLNSPFFWEDMTHECHA (SEQ ID NO :1)。 图3B，重组His-标签rCRKL、rCRKL_SH3 (N)结构域和rCRKL_SH3 (C)结构域结合至对应于 PSI结构域中的区域的合成肽NSTFLQEGMPTSA(SEQ ID NO :23)。图3C，制备了整个PSI结构 域(残基 22-82. SEQ ID NO 71-CLKANAKSCGECIQAGPNCGffCTNSTFLQE GMPTSARCDDLEALKKKGC) 的重组 gst 融合蛋白、线性 gst-PSI (残基 48-62，SEQ ID NO :72_TNSTFLQEGMPTSAR)、环式 gst-PSI (残基洸-74，SEQ ID NO :72_CTNSTFLQEGMPTSARC)，以用于结合测定。线性和环式 PSI衍生的区域都结合至CRKL。图3D，肿瘤归巢肽与rCRKL-SH3(C)结构域的结合活性被肿 瘤归巢肽(YRCTLNSPFFWEDMTHECHA ;SEQ ID NO :1)、PSI 衍生的肽(NSTFLQEGMPTSA ；SEQ ID NO 23)或显示SEQ ID NO :1的肿瘤归巢噬菌体抑制。条柱代表来自一式三份孔的平均值 士标准偏差。图4A-D =CRKL和结合肽之间的相互作用。图4A，rCRKL_SH3 (C)与肿瘤归巢肽的结 合特性。SEQ ID NO :1中的Pro-> Ala表示为SEQ ID NO :25。CRKL SH3 (C)结构域的突变分析。图4B，肿瘤归巢噬菌体(其显示TOCTLNSPFFWEDMTHECHA ；SEQ ID NO 1)和PSI衍 生的噬菌体(其显示CNSTFLQEGMPTSA C ；SEQ ID NO 23)结合至重组的CRKL。条柱代表来 自一式三份孔的平均值士标准偏差。图4C，CRKL SH3 (C)结构域(SEQ ID NO 24)和作为 His-标签化重组蛋白产生的对照删除突变体的图示。制备并测试了 4种突变体Δ 1 (删除 残基236-256)、Δ 2 (删除残基257-277)、Δ 3 (删除残基278-293)和Δ SH3 (C)(删除残基 236-293) 0图4D，结合区域位于SH3(C)结构域的残基236-277之间。图5 :CRKL和β 1整联蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用。重组gst_PSI蛋白以浓 度依赖性方式抑制CRKL与、整联蛋白的结合(直至800nm)。整联蛋白ανβ3*ανβ5 用作对照。显示了来自一式三份孔的平均值的标准偏差。图6Α-Β :CRKL的细胞表面定位。图6A，DU145细胞上的CRKL的流式细胞术分析。 使用单克隆抗-CRKL(M)、抗整联蛋白(*)和抗_AHSG抗体(c，对照)进行免疫标记。 图6B，CRKL的透射电镜(TEM)分析显示了细胞表面上的单个CRKL-金颗粒(箭头)。将用 于研究的DU145细胞固定但不通透化。研究中使用抗-CRKL多克隆抗体。标明了比例尺。图7A-C =CRKL的分泌。图7A，在无血清培养基(SFM)中培养的各种类型的癌细胞 分泌未磷酸化形式的CRKL。图B和C，CRKL抗体中和培养基中细胞外形式的CRKL并影响 细胞增殖和迁移。使用的对照抗体如下抗-ILll受体、抗-AHSG、抗_grt2、抗α 6整联蛋 白和预免疫的抗体。条柱代表来自一式两份孔的平均值士标准偏差。图8A-D =SiRNA敲低CRKL的效应。显示了细胞增殖(图8Α)、粘附(图8Β)和迁 移(图8C)。显示了来自一式三份孔的平均值的标准偏差。图8D，在细胞增殖测定中，重组 CRKL挽救CRKL siRNA敲低的细胞。使用CRKL siRNA转染DU145细胞48小时，然后向孔中 外源地加入重组CRKL。使用WST-I试剂测定细胞增殖。图9A-D:肿瘤靶向和机械模型。图9A，肿瘤归巢噬菌体或对照噬菌体(无 插入子，突变体(YRCTLNSAFFWEDMTHECHA ；SEQ IDNO 25),或混杂的噬菌体(#1 YRFCTSPFHEffHLENTDMCA ；SEQID NO :26，#2 :YRECTDSPHEFHLWNTMCAF ;SEQ ID NO :27))在 rCRKL上的体外结合。图9B-D，靶向噬菌体或对照噬菌体构建体在携带不同类型肿瘤小鼠 中的体内归巢。当与对照比较时，肿瘤归巢噬菌体优先定位于肿瘤。显示了来自两个独立 实验的代表性数据。图10 携带肿瘤的小鼠中的靶向抑制。使用对照gst或重组gst-CRKL预先温育 肿瘤归巢噬菌体，然后向携带尺寸匹配的人类肿瘤(衍生自DU145)的裸鼠施用。观察到重 组CRKL对于预处理的肿瘤归巢噬菌体的抑制。显示了来自两个独立实验的结果。图11 以合成的肿瘤归巢促细胞调亡肽处理肿瘤异种移植物。使用携带人 类前列腺癌异种移植物(衍生自DU145)的尺寸匹配的裸鼠的队列。在使用合成的肿 瘤归巢促细胞调亡肽 YRCTLNSPFFffEDMTHECHAGG (SEQ ID NO 67) -D (KLAKLAK) 2 处理的 携带肿瘤的小鼠中观察到显著减少的肿瘤生长。与未经处理的动物相比，等摩尔量的 YRCTLNSPFFffEDMTHECHA (SEQ IDNO 1)或D (KLAKLAK) 2没有显示出肿瘤体积上的差异 (Student t_ 检验，ρ < 0. 001)。
具体实施例方式本发明提供了支持关于细胞内信号传导蛋白CRKL的重要性和功能的证据，还提供了靶向CRKL的肽。细胞膜已经进化为在细胞内物质和细胞外环境之间行成紧密的和间 隔化的控制(Conner andSchmid, 2003 ；Cho and Stahelin，200 。为了保持这种动态平衡， 跨膜受体家族通过转导级联的复杂的空间和时间架构而介导跨越细胞表面的双方向的信 号传导(Martin等人，2002 ；Manning等人，2002)。因此，参与信号转导的蛋白的定位对于提 供细胞应答的特异性具有关键意义(Cho and Stahelin, 2005 ；Mochly-Rosen，1995)。例如， 在典型的机械转导的环境下，通过配体的结合引发细胞表面受体例如整联蛋白发生构象变 化，从而实现与信号转导级联例如有丝分裂原激活的蛋白(MAP)激酶途径的交互通讯；常 规的整联蛋白配体包括针对其细胞外结构域的细胞外基质(ECM)蛋白以及针对其细胞内 结构域的细胞骨架蛋白(Martin 等人，2002 ；Manning 等人，2002 ；Hunter, 2000 ；Pawsonand Scott, 1997 ；Blume-Jensen and Hunter,2001)。为了获得关于癌症中跨细胞膜信号转导机理方面的认识，本发明人开始揭示肿瘤 异种移植物模型中的功能蛋白相互作用。本发明人推论组合方法(Hajitou等人，2006; Arap ^A, 2002 ；Arap 等)κ, 1998 ；Arap ^A, 2004 ；Pasqualini and Ruoslahti, 1996) ,M 如在体内从噬菌体显示随机肽文库连续选择可能提供线索，这通过仿效肿瘤微环境情况下 的无偏差的配体-受体结合来进行。以下数据表明，在细胞内的信号传导蛋白CRKL和调节 性(而不是配体结合性)β ！整联蛋白细胞外结构域之间存在特异性相互作用。令人惊奇 的是，本发明人发现CRKL靶向β i整联蛋白的位于细胞外的丛状蛋白-脑信号蛋白-整联 蛋白(plexin-semaphorin-integrin，PSI)结构域，激发MAP激酶并促进细胞生长和存活。 这些结果提示了细胞内的调节剂(例如含SH3的蛋白质)在激活MAP激酶途径中的尚未认 识到的整联蛋白介导的由外至内的功能。与本工作中呈现的累积的功能数据一致，细胞外的CRKL有可能在肿瘤微环境中 具有尚未被揭示的作用其通过引发细胞增殖和迁移而发挥此作用。由于CRKL的细胞内部 分本身也被添加的外源rCRKL磷酸化，所以人们可以推论细胞外的CRKL(分泌的和/或释 放的)可能可以作为肿瘤内的自分泌或旁分泌因子发挥作用。这些结果建立了信号传导分 子和细胞粘附受体之间的不寻常的新型关联，其中它们在细胞表面的关系可以引发来自细 胞外环境的信号传导事件。不希望被任何理论所束缚，基于整联蛋白激活的“弹簧刀(switchblade) ”结构模 型(Takagi等人，200 ，本发明人假设了一种替代性途径，其中细胞外的CRKL能够通过结 合至β 1整联蛋白链的PSI结构域而激活整联蛋白(从无活性的弯曲构象变成有活性的伸 展构象)。在本文呈现的多步模型(图6)中，以下数据证明细胞内的未磷酸化的CRKL被 非经典的活性转运子分泌(可能通过ABC-转运子)，和/或通过细胞死亡被释放到肿瘤微 环境中(步骤1)，其中它的SH3结构域特异性结合肿瘤细胞表面上的β 1整联蛋白的PSI 结构域(步骤2)。结合之后，β 整联蛋白的构象从弯曲变成伸展(活性的)，从而引发 整联蛋白介导的途径中下游的靶蛋白的磷酸化(步骤3和4)和/或MAP激酶途径(步骤 5-7)，并最终影响肿瘤细胞的迁移和增殖(步骤8)。与这些发现一致，最近有数篇关于其 它的也能够在细胞表面被检出的细胞内分子，包括多种核蛋白(Sinclair and O'Brien， 2002 ；Hovanessian等人，2000)、转录因子(Monferran等人，2004)和应激应答伴侣(Arap 等人，2004 ；Siin等人，2003 ；Mintz等人，2003)。除了在以下实施例中显示的一个功能性配 体-受体相互作用之外，在作用于细胞外环境的分泌的和/或释放的信号传导分子与细胞粘附受体之间可能存在其它的功能性配体-受体相互作用，并且可能具有一般的生物学意 义。本发明提供了分离的靶向肿瘤的肽，其包含CRKL结合基序，所述基序定义为，例 如长度为6-20个氨基酸，与^整联蛋白(SEQ IDNO 47)的相应最佳拟合序列比对的相似 性程度为例如至少25% ；并且其中所述靶向肽长度可以是100个氨基酸或更少的氨基酸， 并且在生理条件下结合至表达CRKL的细胞。所述CRKL结合基序与^^整联蛋白(SEQ ID NO 47)的最佳拟合序列比对的相似性程度可以是至少40%、至少50%或至少60%。在一 些实施方式中，所述肽具有不同于与^整联蛋白(SEQ ID NO 47)的最佳拟合序列比对的 序列。在一些实施方式中，所述CRKL结合基序可以具有与^整联蛋白(SEQ IDNO 47)PSI 结构域区域的最佳拟合序列比对。所述CRKL结合基序可以具有与^整联蛋白(SEQ ID NO :47)PSI结构域区域的最佳拟合序列比对，所述PSI结构域区域选自氨基酸10至四；15 至；34 ;18 至 37 ；36 至 55 ；39 至 58 ；45 至 64 ；94 至 113 ； 196 至 215 ； 198 至 213 ；203 至 222 ； 244 至 263 ；330 至 349 ；377 至 396 ；379 至 398 ；380 至 399 ；398 至 417 ；400 至 419 ；413 至 432 ；447 至 466 ；460 至 479 ；460 至 479 ；464 至 483 ；469 至 488 ；474 至 493 ；475 至 494 ；512 至 533 ；519 至 538 ；551 至 570 ；574 至 593 ；577 至 596 ；579 至 598 ；590 至 609 ；596 至 615 ； 613 至 632 ；615 至 634 ；616 至 635 ；644 至 663 ；648 至 667 ；663 至 682 ；674 至 693 ；682 至 701 ；721至740 ；727至746 ；和779至798。在一些实施方式中，CRKL结合基序具有选自 SEQ ID NO :1至SEQ ID N0:46的序列。在一些实施方式中，本发明的分离的肽可以进一步 定义为环肽。本发明可以使用多种CRKL结合肽。以下提供了 CRKL结合肽的非限制性列举(SEQ ID NO 1-46)。表1.与β 1整联蛋白具有相似性的肿瘤归巢肽肽 编 号肽t匕# 的区 域匹配的残基得 分1HTCWGARDVAQPSGTVRCLK10 -29HTrWGARDVAOPSGTVRCTK342TSCVRTGHDENLLKAAYCSS15 -34TSCVRTGHDENLLKAAYC S&613VACDISA VE RLPASARSCKT18 - 37YACDISA VE RLPASARSCKT554GPCAATGVNPGDHGAAVCDQ36-55GPCAATGVKPGDHGAAVCDil425LGCNKGRYWLSTRLSVSCAL39 -58LGCKKGRYWLSXRLSVSCAL416*YRCTLNSPFFWEDMTHECHA45 -64YRCTLKSPffiWEDMTHECHA407KLCYRSSAGSELRPPEKCAY94 -113KLCYRSSAGSELRPPEKCAY4权利要求
1.包含CRKL结合基序的分离的靶向肿瘤的肽，所述基序定义为a)长度为6-20个氨基酸；b)与^整联蛋白(SEQID NO 47)的相应最佳拟合序列比对的相似性程度为至少 25% ；并且其中所述靶向肽的长度是100个氨基酸或更少的氨基酸，并且在生理条件下结合至表 达CRKL的细胞。
2.权利要求1的肽，其中所述CRKL结合基序与^整联蛋白(SEQIDNO 47)的最佳拟 合序列比对的相似性程度是至少40 %。
3.权利要求1的肽，其中所述CRKL结合基序与^整联蛋白(SEQIDNO 47)的最佳拟 合序列比对的相似性程度是至少50%。
4.权利要求1的肽，其中所述CRKL结合基序与^整联蛋白(SEQIDNO :47)的最佳拟 合序列比对的相似性程度是至少60 %。
5.权利要求1的肽，其中所述肽具有不同于与^整联蛋白(SEQIDNO :47)的最佳拟 合序列比对的序列。
6.权利要求1的肽，其中所述CRKL结合基序具有与^整联蛋白(SEQID N0:47)PSI 结构域区域的最佳拟合序列比对。
7.权利要求1的肽，其中所述CRKL结合基序具有与^整联蛋白(SEQID N0:47)PSI 结构域区域的最佳拟合序列比对，所述PSI结构域区域选自氨基酸10至四；15至34 ； 18至 37 ；36 至 55 ；39 至 58 ；45 至 64 ；94 至 113 ； 196 至 215 ；198 至 213 ；203 至 222 ； 244 至 263 ； 330 至 349 ；377 至 396 ；379 至 398 ；380 至 399 ；398 至 417 ；400 至 419 ；413 至 432 ；447 至 466 ；460 至 479 ；460 至 479 ；464 至 483 ；469 至 488 ；474 至 493 ；475 至 494 ；512 至 533 ；519 至 538 ；551 至 570 ；574 至 593 ；577 至 596 ；579 至 598 ；590 至 609 ；596 至 615 ；613 至 632 ； 615 至 634 ；616 至 635 ；644 至 663 ；648 至 667 ；663 至 682 ；674 至 693 ；682 至 701 ；721 至 740 ；727 至 746 ；和 779 至 798。
8.权利要求1的肽，其中所述CRKL结合基序具有选自SEQIDNO :1至SEQ ID NO 46 的序列。
9.权利要求1的分离的肽，其进一步定义为环肽。
10.权利要求1的分离的肽，其中所述肽连接至分子。
11.权利要求10的分离的肽，其中所述分子是蛋白，并且所述肽缀合或融合至所述蛋 白以形成蛋白缀合物，其中所述蛋白缀合物不是天然存在的蛋白。
12.权利要求11的分离的肽，其中所述肽位于所述蛋白的末端。
13.权利要求10的分离的肽，其中所述分子是促细胞调亡剂、抗血管生成剂、细胞因 子、细胞毒性试剂、药物、化疗剂、激素、生长因子、抗生素、抗体或其片段或单链、存活因子、 抗细胞调亡剂、激素拮抗剂、抗原、肽、蛋白、诊断剂、放射性同位素或成像剂。
14.权利要求13的分离的肽，其中所述分子是选自下列的促细胞调亡剂短杆菌肽、爪 蟾抗菌肽、mellitin、防御素、天蚕素、(KLAKLAK)2 (SEQ ID NO :48)、(KLAKKLA) 2 (SEQ ID NO: 49)、(KAAKKAA) 2 (SEQ ID NO :50)、(KLGKKLG) 3 (SEQ ID NO :51)、Bcl_2、Bad、Bak、Bax 和 Bik。
15.权利要求14的分离的肽，其中所述促细胞调亡剂是(KLAKLAK)2(SEQID NO 48)。
16.权利要求15的分离的肽，其中所述SEQID NO 48由D氨基酸组成。
17.权利要求13的分离的肽，其中所述分子是选自下列的抗血管生成剂血小板反 应素、血管抑素、色素上皮衍生的因子、血管紧缩素、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶 原激活剂抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白细胞介素12、血小板因子4、IP-10、 Gro-β、血小板反应素、2-甲氧基雌甾二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧胺三唑、CM101、马立马 司他、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素2、除莠霉素A、PNU145156E、16K促乳素片段、三羧氨 基喹啉、萨立多胺、己酮可可碱、染料木黄酮、ΤΝΡ-470、内皮抑素、紫杉醇、多烯紫杉醇、聚 胺、蛋白酶体抑制剂、激酶抑制剂、信号传导肽、accutin、西多福韦、长春新碱、博来霉素、 AGM-1470、血小板因子4、二甲胺四环素、内皮抑素XVIII、内皮抑素XV、基质金属蛋白酶-2 的C-末端血红素结合蛋白结构域、人类纤溶酶原的kringle 5结构域、内皮抑素和血管抑 素的融合蛋白、内皮抑素和人类纤溶酶原的kringle 5结构域的融合蛋白、干扰素-γ诱生 的单核因子(Mig)、Mig与IPlO的融合蛋白、可溶性FLT-I (fins样酪氨酸激酶1受体)、或 激酶插入子结构域受体(KDR)。
18.权利要求13的分离的肽，其中所述分子是选自下列的细胞因子白细胞介素 1 (IL-I)、IL-2、IL-5、IL-10、IL-IU IL-12、IL-18、干扰素-y (IF- Y )、IF- α、IF-β、肿瘤 坏死因子、或GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)。
19.权利要求10的分离的肽，其中所述肽连接至大分子复合物。
20.权利要求19的分离的肽，其中所述复合物是病毒、噬菌体、细菌、脂质体、微颗粒、 磁性珠子、酵母细胞或哺乳动物细胞。
21.权利要求13的分离的肽，其中所述肽连接至病毒。
22.权利要求14的分离的肽，其中所述病毒是慢病毒、乳多空病毒、腺病毒、逆转录病 毒、AAV、痘苗病毒或疱疹病毒。
23.权利要求19的分离的肽，其中所述肽连接至固体载体。
24.权利要求23的分离的肽，其中所述固体载体是微量滴定皿或微芯片。
25.制备构建体的方法，其包括获得根据权利要求1的肽；和将所述肽连接至分子以 制备构建体。
26.将肽、分子或蛋白的递送靶向表达CRKL的细胞的方法，所述方法包括以下步骤(a)获得根据权利要求1至M任一项的肽或通过权利要求23的方法制备的肽；和(b)将所述肽施用至细胞群体，其中所述群体包括表达CRKL的细胞，从而将分子或蛋 白递送至所述细胞。
27.权利要求沈的方法，其中所述的表达CRKL的细胞是在受试者中，肽或蛋白融合构 建体配制在药学上可接受的组合物中，所述组合物施用至受试者。
28.权利要求27的方法，其中所述受试者是人类受试者。
29.权利要求沈的方法，其中所述方法进一步定义为检测方法，并且所述方法还包括 检测已经被递送至细胞的肽、分子或蛋白。
30.权利要求沈的方法，其中所述受试者具有疾病或病症，并且所述方法进一步定义 为治疗方法。
31.权利要求四或30的方法，其中所述受试者具有癌症。
32.权利要求31的方法，其中所述癌症选自前列腺癌、乳腺癌、肉瘤、牙龈癌、舌癌、肺 癌、皮肤癌、肝癌、肾癌、眼癌、脑癌、白血病、间皮瘤、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、胰腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌和膀胱癌。
33.权利要求32的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
34.权利要求32的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
35.权利要求32的方法，其中所述癌症是肉瘤。
36.权利要求1的方法，其中所述基序进一步定义为长度是6至10个氨基酸。
37.权利要求1的方法，其中所述基序进一步定义为长度是14至20个氨基酸。
全文摘要
本发明通过使用靶向肽提供了用于选择性靶向CRKL的方法和组合物。通过使用靶向肽选择性靶向分泌的CRKL可用于例如癌症的治疗，以将化疗化合物、融合蛋白或融合构建体递送至癌细胞或组织。
文档编号A61K38/10GK102105487SQ200980129254
公开日2011年6月22日 申请日期2009年6月19日 优先权日2008年6月20日
发明者P·J·门茨, R·帕斯夸里尼, W·阿拉普 申请人:得克萨斯大学体系董事会