专利名称：：用于靶向病毒感染的dsRNA的制作方法
技术领域：
：本发明涉及靶向人磷脂酰肌醇4-激酶的双链核糖核酸UsRNA),尤其涉及乾向人磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽(PIK4CB;NM—002651)和/或人磷脂酰肌醇4-激酶a多肽(PIK4CA;NM_002650)的双链核糖核酸，并涉及其在治疗由正链RNA病毒如丙型肝炎病毒(HCV)感染介导的病理过程中的用途。
背景技术：
：RNA依赖的RNA聚合酶正链RNA病毒形成了由许多不同亚家族组成的大的病毒超家族。这些病毒涵盖植物界和动物界两界，引起的病理学范围从轻微的表型到严重的衰弱疾病。正链RNA病毒聚合酶超群的构成如下。I.小RNA病毒组(HAV、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒)、诺达病毒(nodaviruses)、虹豆花叶病毒属(comoviruses)、线虫传多面体病毒组(nepoviruses)、马铃薯Y病毒组(potyviruses)、大麦花叶病毒组(bymoviruses)、南方菜豆花叶病毒组(sobemoviruses)和黄症病毒组(Luteovimses)(黄化病毒、黄矮病毒和巻叶病毒)。II.香石竹斑驳病毒组(Carmoviruses)、番痴丛矮病毒纟且(tombusviruses)、香石々个环斑病毒纟且(dianthoviruses)、痘病毒属(pestiviruses)、披膜病毒(togaviruses)、伊科病毒(echoviruses)、登革病毒、丙型肝炎病毒、黄病毒属(flavivimses)。III.烟草花叶病毒组(Tobamoviruses)、烟草脆裂病毒组(tobraviruses)、大麦病毒组(hordeiviruses)、tricornaviruses、甲病毒、风渗病毒属(rubiviruses)、真菌传杆状病毒组(furoviruses)、戊型肝炎病毒、马铃薯X病毒组(potexviruses)、香石竹潜病毒组(carlaviruses)、芜青黄花叶病毒组(tymoviruses)和苹果褪绿叶斑病毒。正链RNA病毒的基因组编码RNA依赖的RNA聚合酶，所述RNA聚合酶是唯一含有这类病毒中保守基序的病毒蛋白。由于这类病毒含有显著的系统发育变异性，所以该保守性是意义重大的，人们预计存在病毒感染细胞和维持稳定复制的多种方式。除许多不同之外，该类中的所有病毒都依赖RNA依赖的正链RNA转录这一单个基本步骤。由于该步骤对病毒生活周期是必需的，所以病毒使用许多宿主蛋白质来启动和维持RNA依赖的RNA聚合酶活性。不与宿主因子相互作用，则病毒不能存活。因此，可用于抑制病毒感染的治疗介入将是阻断病毒宿主的相互作用。如果宿主因子对病毒是必需的，但对宿主不是必需的，那么可操纵这些宿主因子，便可实现阻断病毒感染的能力。已经证实，靶向宿主蛋白质是干扰HIV、HCV、天花病毒等病毒感染和复制的有效方法。正链RNA病毒的重要性是对人类健康和生存力的影响。几种正链RNA病毒感染人类，并在许多情况下导致使人虚弱的疾病和/或病态。几种对人类健康造成特别的负担的病毒是登革病毒(出血热)、HCV(慢性肝病、肝功能衰竭、纤维样变性和癌)和HEV(暴发性肝功能衰竭)。由这些病毒引起的肝脏和血液疾病导致全世界数以百万的死亡，并且花费医疗工业数十亿美元用于肝脏相关的疾病。找到控制病毒感染的治疗方法的意义重大，并且可改善全世界人类健康。因此，存在有效治疗由HCV和其它正链RNA病毒(以上所列)引起的感染这一未满足的需求。该说明书也涉及双链RNA分子(dsRNA)。已经表明，dsRNA以已知为RNA干扰(RNAi)的高度保守性调节机制来阻断基因的表达。WO99/32619(Fire等人)公开了至少长25个核苷酸的dsRNA在秀丽线虫(C.elegans)中抑制基因表达的用途。也已经表明，dsRNA在其它生物体包括植物(参见例如WO99/53050，Waterhouse等人；和WO99/61631，Heifetz等人)、果蝇(参见例如Yang，D等人，Curr.Biol,(2000)10:1191-1200)和哺乳动物(参见WO00/44895,Limmer;和DE10100586.5，Kreutzer等人)中降解草巴RNA。现在，这种天然机制已经成为研发治疗由于基因异常或不想要的调节引起的病症的新型药剂的焦点。PCT公开号WO2003016572、WO2003070750和WO2005028650中公开了先前研发治疗由HCV感染引发的疾病的、基于核酸的RNAi药物的努力。PCT公开号WO2006074346中公开了使用RNAi药物治疗RSV感染的先前的努力。尽管在RNAi领域有显著进步，并且在治疗由病毒感染介导的病理过程中有进展，但仍然需要能够抑制病毒感染进程、并且能够治疗与病毒感染相关的疾病的药剂。本发明公开了满足这种需要的化合物、组合物和方法，并提供了其它益处。发明概述本发明提供了用于治疗正链RNA病毒(如HCV、HPV、登革病毒和脊髓灰质炎病毒)感染的组合物和方法，所述组合物和方法通过降低细胞中(其中这类病毒可复制，如肝脏)人宿主因子磷脂酰肌醇4-激酶催化性(5多肽(P1K4CB;NM—002651)和/或磷脂酰肌醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA;NM—002650)的活性的水平。本文么、开了正链RNA病毒的增殖可通过4吏用双链核净唐核酸(dsRNA)来抑制，从而沉默对病毒增殖必需的人宿主细胞基因PIK4CB和/或P1K4CA的表达。本发明提供了多种实施方案，尤其包括用于抑制细胞中磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)水平表达或活性的双链核糖核酸(dsRNA),其中所述dsRNA包含至少两个彼此互补的序列，且其中有义链包含第一序列和反义链包含第二序列，所述第二序列包含基本互补于编码PI4K的至少部分mRNA的互补区域，并且其中所述互补区域长度低于30个核苷酸和其中所述dsRNA与表达所述PI4K基因的细胞接触后，抑制所述PIK4基因表达。这些dsRNA可具有化学修饰，且可与其它部分缀合。此外，这些dsRNA可提供于药物组合物中。一个实施方案方法是用于抑制细胞中磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽(PIK4CB)基因或磷脂酰肌醇4-激酶催化性P多肽(PIK4CA)基因的方法，所述方法包括下列步骤(a)向细胞中引入双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少两个彼此互补的序列，且其中有义链包含第一序列和反义链包含第二序列，所述第二序列包含基本互补于编码PIK4CB或PIK4CA的至少部分mRNA的互补区域，并且其中所述互补区域长度低于30个核苷酸；和(b)将步骤(a)中产生的细胞维持足够时间以获得PIK4CB基因(或PIK4CA，根据选择)的mRNA转录物的降解，从而抑制PIK4CB基因(或PIK4CA,根据选择)在细胞中的表达或活性。备选地，本发明涉及治疗由正链RNA病毒感染介导的病理学过程的方法，所述方法包括向需要此种治疗的患者施用本发明的dsRNA。正链RNA病毒可选自丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)和登革病毒。备选的实施方案包括用于抑制PIK4CB或PIK4CA在细胞中表达的载体；和包含这类载体的细胞。一个备选的实施方案包括治疗HCV感染的方法，所述方法包括向需要此种治疗的患者施用治疗有效量的包含本发明dsRNA的药物组合物。附图简述图l.HCV构建体的结构。A.完整的HCV基因组。B.亚基因组HCV复制子，用于克隆A(亚基因组复制子)细胞。将结构蛋白用5，UTR下游的新霉素抗性基因和荄火虫萤光素酶报告基因替代。C.移除了HCV蛋白质的报告构建体用于克隆Ar细胞(缺少亚基因组复制子的细胞)。图2.命中目标的siRNA的表型确认。重新分析来自大规模激酶组siRNA篩选的命中目标的siRNA。A.测试dsRNA为分别的双链体PIK4CA1-PIK4CA4(柱1-4)、为PIK4CASmartPool(柱5)、为分别的双链体PIK4CB1-PIK4CB4(柱6画9)或为PIK4CBSmartPool(柱10)的结果。结果相对于GAPDH(对照；柱11)来测量。使用每孔25nM的dsRNA、用克隆A细胞进行测定；Bright-Glo活性在转染后72小时进行测量。靶向GAPDH的dsRNA(柱11)用作阴性对照，且靶向pGL2的dsRNA(柱12)是阳性对照。图3.PIK4CA和PIK4CB的RTPCR。使用siRNA转染Huh7复制子细胞72小时，分离mRNA并用Taqman进行RTPCR分析。结果归一化为GAPDH转染的细胞。A.PIK4CAsiRNA的转染，使用PIK4CA引物的TaqmanRTPCR。B.PIK4CAsiRNA的转染，使用PIK4CB引物的TaqmanRTPCR。C.PIK4CBsiRNA的转染，4吏用PIK4CB引物的TaqmanRTPCR。D.PIK4CBsiRNA的转染，使用PIK4CA引物的TaqmanRTPCR。GOI=目的基因。PIK4CAsp=PIK4CASmartPool;PIK4CBsp-PIK4CBSmartPool。图4.A)由所示的靼向PIK4CAsiRNA(25nM)处理后的PIK4CA(浅条)或PIK4CB(黑条)的mRNA表达。B)通过所示的把向PIK4CBsiRNA(25nM)处理后的PIK4CA(浅条)或PIK4CB(黑条)的mRNA表达。图5.蛋白质印迹结果显示PI4KAsiRNA(行l-行3分别对应于表2中的PI4KA1;PIK4A2和PIK4A3)或PI4KBsiRNA(行4-行6分别对应于表1中的PI4KB1;PIK4B2和PIK4B3)处理后PI4KB、NS3或肌动蛋白(如所标示)的蛋白质表达水平。GAPDHsiRNA处理显示为对照。图6.草巴向PIK4CA和PIK4CB的shRNA序列。A)使用所示的shRNA构建体处理克隆A细胞的结果。浅条表示萤光素酶活性；黑条表示细胞生存力。所有结果都与对照GAPDH处理的细胞比较；B)使用所示的shRNA处理对PI4KA表达的影响(GFP归一化的)；C)使用所示的shRNA处理对PI4KB表达的影响(GFP归一化的)；D)蛋白质印迹结果显示经耙向PI4KA的shRNA(行l-行5分别对应shAl-shA5)或靶向PI4KB的shRNA(行6-行10分别对应shBl-shB5)处理后PI4KB、NS3或肌动蛋白(如所标示)的蛋白质表达水平。GFPshRNA处理显示为对照，所有结果获取于经所示shRNA处理后96小时；E)蛋白质印迹测量shA2和shBl对蛋白质表达的影响，shRNA转导后3周(GFP对照)。图7.HCV复制的抑制(活病毒)。用所示的siRNA处理时，HCV复制的剂量依赖。细胞在HCV感染前用针对PIK4CA或PIK4CB的所示siRNA处理。A)25nM(灰条；)；1.5nM(白条)；0.1nM(黑条)。结果归一化为GAPDHsiRNA处理时的HCV复制。海肾(Renilla)siRNA是阳性对照。B)在感染细胞中靶mRNA的表达。图8.HCV复制的抑制(活病毒)。用所示的siRNA处理时，HCV复制的剂量依赖。细胞在HCV感染后用针对PIK4CA或PIK4CB的所示siRNA处理。A)用所示的siRNA(25nM)处理后24小时对病毒复制的影响。黑条一病毒萤光素酶(活性)；浅条一细胞生存力。结果归一化为GAPDHsiRNA处理时的HCV复制。海肾siRNA是阳性对照。B)用所示的siRNA处理后HCV复制的时间依赖。黑(第一)条一24小时；浅(第二)条一48小时；白(第三)条一72小时；灰(第四)条一96小时。发明详述本发明提供了治疗与受正链RNA病毒(如HCV、HPV、登革病毒和脊髓灰质炎病毒)感染相关的疾病这一问题的解决方案，所述解决方案通过降低这类病毒可复制的细胞中人宿主因子磷脂酰肌醇4-激酶催化性j3多肽(PIK4CB;NM—002651)和/或磷脂酰肌醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA;NM—002650)的水平。本文z〉开了可通过^[吏用双链核糖核酸(dsRNA)沉增殖，其中所述人宿主细胞基因PIK4CB和/或P1K4CA对正链RNA病毒的增殖是必需的。此外，本文首次公开了对这些dsRNA的所选化学修饰是高度优选的实施方案，所述实施方案提供了惊人的降低的毒性、降低的免疫原性、改善的药学特性和其它益处。本发明提供了双链核糖核酸(dsRNA)、以及在细胞或哺乳动物中使用所述dsRNA抑制正链RNA病毒繁殖的组合物、药物组合物和方法。本发明也提供了用于在哺乳动物中使用dsRNA治疗由正链RNA病毒感染所14引起的病理学病症和疾病的组合物和方法。本发明的dsRNA包含具有这样的区域的RNA链(反义链)，所述区域长度低于30个核苷酸、通常长19-24个核苷酸、并且基本互补于人磷脂酰月几醇4-激酶催化性p亚基多肽(PIK4CB;NM—002651)和/或人磷脂酰肌醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA;NM—002650)的至少部分的基因产物(前mRNA或成熟mRNA)转录物。这些dsRNA的4吏用4吏得参与哺乳动物中正链RNA感染的复制和/或维持的基因的mRNA靶向降解或失活。使用基于细胞的测试法和动物测试法，本发明人证实，非常低剂量的这些dsRNA就可以特异并且有效地介导RNAi，导致复制和感染的显著抑制。因此，包含这些dsRNA的本发明方法和组合物能用于治疗由正链RNA病毒感染介导的病理过程。人磷脂酰肌醇4-激酶催化性p亚基多肽(PIK4CB;NMJ)02651;有时也称为PI4KB;PIK4B;pi4K92;PI4K卩;PI4K-卩;PI4KIII卩),和人磷脂酰月几醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA;NM—002650;有时也称为PI4KA;PIK4A;pi4K230;FLJ16556;和PI4K-a)是磷脂酰肌醇4-激酶。在文献中裤脂酰肌醇4-激酶备选地称为PI4K、PI4-激酶或PIK4。除非文中指出特定选择，本说明书可交换地使用这类术语。哺乳动物细胞中存在4种PI4K酶，所述PI4K酶分成两类。第一类是从酵母到人都保守的III型PI4Ks，包括PIK4CA和PIK4CB。酵母直向同源物Stt4p和Piklp分别都是具有无重叠功能的必需基因。II型PI4Ks(PI4KlIa和PI4Kllp)区别于III类酶，也具有作为非必需基因的酵母同源物LSB6。PIK4CB是已最佳表征的哺乳动物基因，所述PIK4CB定位于高尔基体、在与小GTP酶腺苷二磷酸-核糖基化因子(ARF)形成的复合体中发挥功能、并且认为能调节高尔基体到质膜的分泌。已经表明，II类a和p酶参与高尔基体/反面高尔基体运输。III类a同工型似乎在质膜和内质网而不是高尔基体中发挥作用。除了PI4Ks的亚细胞定位之夕卜，还有就是在各自区室中酶的独特功能。PIK4CB参与磷脂酰肌醇4磷酸(Ptdlns4P)和磷脂酰肌醇4,5二磷酸(Ptdlns4，5P2)库的产生，参与神经酰胺从内质网到高尔基体的调节性运输，所述调节性运输导致鞘磷脂的合成，并且通过维持允许AP-1结构体停靠的富含磷脂酰肌醇4磷酸(PI(4)P)结构域而参与高尔基体的结构完整性。PIK4CB的破坏造成高尔基复合体结构的改变，造成极化细胞的分泌缺陷，并抑制蛋白质转运到质膜。II类和III类PI4Ka和p酶产生磷脂酰肌醇4磷酸(Ptdlns4-phosphate)，所述磷脂酰肌醇4磷酸是几种调节性磷酸肌醇的前体。这些磷酸肌醇通过招募调节性蛋白质到有组织的信号复合体中来控制多种细胞信号和运输过程。磷脂酰肌醇4磷酸[Ptdlns4P产生自磷脂酰肌醇(Ptdlns)，第一步是磷脂酰肌醇4，5二磷酸和磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸(Ptdlns(3，4，5)P3)的形成。磷脂酰肌醇4,5二磷酸是磷脂酶C(PLC)酶类主要的底物，所述磷脂酰肌醇4,5二磷酸在磷脂酶C的作用下产生肌醇1，4，5-三磷酸[Ins(l，4，5)P3和参与〔32+信号传导的二酰甘油(DAG)。磷脂酰肌醇4，5二磷酸也控制几种类型的离子通道和酶类如磷脂酶D(PLD),并同连接膜至肌动蛋白细胞骨架蛋白3和5的蛋白质相互作用。通过I类磷脂酰肌醇3激酶的作用产生自磷脂酰肌醇4,5二磷酸的磷脂酰肌醇3,4,5三裤酸调节一系列的过程，例如调节细胞代谢和通过丝氨酸/苏氨酸激酶Akt调节抗凋亡途径，并且也调控酪氨酸激酶例如Btk和用于小GTP结合蛋白质的鸟嘌呤交换因子。这些传导信号的磷酸肌醇的产生依赖于其合成酶的活性和其前体供给这二者，因此，磷脂酰肌醇4激酶在细胞调节中发挥作用。认为依赖于人PIK4CB和PIK4CA来复制的正链RNA病毒包括I.小RNA病毒组(HAV、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒)、诺达病毒、豇豆花叶病毒属、线虫传多面体病毒组、马铃薯Y病毒组、大麦花叶病毒组、南方菜豆花叶病毒组和黄症病毒组(黄化病毒、黄矮病毒和巻叶病毒)。II.香石竹斑驳病毒组、番茄丛矮病毒组、香石竹环斑病毒组、痘病毒属、披膜病毒、伊科病毒、登革病毒、丙型肝炎病毒、黄病毒属。III.烟草花叶病毒组、烟草脆裂病毒组、大麦病毒组、tricornaviruses、甲病毒、风渗病毒16属、真菌传杆状病毒组、戊型肝炎病毒、马铃薯x病毒组、香石竹潜病毒组、芜菁黄花叶病毒组和苹果褪绿叶斑病毒。下列详细描述公开了如何制备和4吏用dsRNA以及含有dsRNA的组合物来抑制正链RNA病毒的表达，以及治疗由正链RNA病毒感染引发的疾病和病症例如肝脏疾病、肝功能衰竭、纤维样变性、癌、肺疾病和它的并发症的组合物和方法(下文进一步描述)。本发明的药物组合物包含具有反义链的dsRNA和可药用载体，其中所述的反义链包含长度低于30个核苷酸、通常长19-24个核苷酸、并且基本互补于PIK4CB和/或PIK4CA的至少部分RNA转录物的互补区域。本发明的一个实施方案采用在药物制剂中组合的多于一种的任选地靶向PIK4CBRNA转录物和/或PIK4CARNA转录物的不同区段的dsRNA。因此，本发明的某些方面提供了包含本发明的dsRNA和可药用载体的药物组合物，提供了使用组合物来抑制PIK4CB和/或PIK4CA的表达的方法，和提供了使用药物组合物来治疗由正链RNA病毒感染引起的疾病的方法。定义为了方便，下文提供说明书、实施例和所附权利要求中使用的一些术的定义之间存在明显差异，那么以本部分的定义为准。"G"、"C"、"A"和"U"各自通常分别代表含有鸟噪呤、胞嘧啶、腺噤呤和尿嘧咬作为碱基的核苷酸。然而，应当理解，术语"核糖核普酸"或"核苷酸"也指如下文进一步详述的经修饰的核苷酸、或者替代的置换部分。技术人员熟知，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以用其它部分进行置换而基本不会改变寡核苷酸的碱基配对特性，其中所述的寡核苷酸包含具有此种置换部分的核苷酸。例如，不作限制地，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧咬或尿嘧啶的核苷酸形成碱基对。因此，含有尿嘧咬、鸟17如肌苷的核苷酸替换。包含此类置换部分的序列为本发明的实施方案。如本文所用，"乾序列"指在PIK4CB的转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。如本文所用，术语"包含序列的链"指的是包含一连串核苷酸的寡核苷酸，其中所述的一连串核苷酸通过使用标准核苷酸命名法指代的序列进行描述。如本文所用，并且除非另外说明，否则术语"互补的"当用于相对于笫二核苷酸序列描述第一核苷酸序列时，其指的是包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或者多核苷酸杂交、并形成双链体结构的能力，这一点为技术人员所理解。此类条件可以是例如严格条件，其中所述的严格条件可以包括400mMNaCl、40mMPIPESpH6.4、1mMEDTA50。C或70°C12-16小时，然后洗涤。也可以应用其它条件，例如在生物体内可能遇到的生理相关条件。技术人员能够根据杂交核苷酸的最终应用来确定最适合两个序列互补性测试的条件设置。这包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在全长的第一和第二核苷酸序列上的碱基配对。在本文，此类序列可以称为彼此"完全互补的"。然而，在本文，当其中第一序列称为与第二序列"基本互补的，，时，这两个序列可以完全互补，或者它们于与其最终应用最相关的条件下保留杂交能力的同时，可以在杂交后形成一个或多个，但通常不多于4个、3个或2个错配碱基对。然而，在将两条寡核苷酸设计为在杂交后形成一个或多个单链突出时，根据互补性的测定，此类突出并不视为错配。例如，包含一条长21个核苷酸的寡核苷酸和另一长23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA,其中较长的寡核苷酸包含与较短寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，对于本发明的目的，仍可以称为"完全互补的"。如本文所用，"互补的"序列也可包括非Watson-Crick碱基对、和/或形成，只要所述序列实现其对杂交能力的上述需求。在本文，术语"互补的"、"完全互补的"和"基本互补的"可以用于dsRNA有义链和反义链之间、或者dsRNA反义链和革S序列之间的碱基配对，正如其在本文的用途所理解的。如本文所用，与信使RNA(mRNA)的"至少部分基本互补"的多核苷酸指的是与目的mRNA(例如PIK4CB的mRNA或PIK4CA的mRNA)的连续部分基本互补的多核苷酸。例如，如果寡核苷酸序列与编码PIK4CB的mRNA的非间断部分基本互补，那么寡核苷酸至少与部分PIK4CBmRNA互补。同样地，如果寡核苷酸序列与编码PIK4CA的mRNA的非间断部分基本互补，那么寡核苷酸至少与部分PIK4CAmRNA互补。如本文所用，术语"双链RNA"或"dsRNA"指的是具有包含两条反向平行、并且基本互补(如上文定义)的核酸链的双链体结构的核糖核酸分子复合体。形成双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或者是分开的RNA分子。当为分开的RNA分子时，此类dsRNA在文献中通常称为siRNA("短干扰RNA")。当两条链是一个较大分子的部分、并因此通过形成双链体结构的一条链的3，末端和另一链的5，末端之间不间断的一连串核苷酸连接，连接的RNA链称为"发夹环"、"短发夹RNA"或"shRNA"。当两条链不是通过形成双链体结构的一条链的3，末端和另一链的5，末端之间不间断的一连串核苷酸而共价连接时，连接结构称为"接头"。RNA链可以具有相同或不同数量的核苷酸。碱基对的最大数目为减去了双链体结构中存在的任意突出的最短dsRNA链的核苷酸数目。除了双链体结构外，dsRNA可以包含一个或多个核苷酸突出。此外，如本说明书所用，"dsRNA"可以包括对核糖核苷酸、核苷间键合、末端基团、帽以及缀合部分的化学修饰，其中包括在多个核苷酸处的实质修饰、并且包括本文公开或本领域已知的所有类型的修饰。为了本说明书和权利要求的目的，"dsRNA，，包含任何在siRNA类型的分子中使用的此类修饰。如本文所用，"核苷酸突出"指的是当dsRNA—条链的3'末端延伸至超出另一条链的5，末端时从dsRNA的双链体结构突出的未配对的核苷酸，或者反之亦然。"平的"或"平端"表示在dsRNA的所述末端没有不配对的核普酸，即没有核普酸突出。"平末端的"dsRNA为在其全长上均是双链的dsRNA,即在分子的两末端都没有核苷酸突出。应当清楚，在测定siRNA是否具有突出或者是否为平末端时，不考虑结合siRNA3，末端或5'末端连接的化学帽或者非核苷酸的化学部分。术语"反义链"指的是dsRNA的包括与靶序列基本互补的区域的链。该链也称为"指导"序列，并用于在功能RISC复合物中指导该复合物对正确的mRNA进行切割。如本文所用，术语"互补的区域"指的是反义链上与序列例如本文定义的靼序列基本互补的区域。当互补区域与靶序列不完全互补时，最耐受在末端区域的错配，并且如果存在的话，通常在末端区域或者例如在5，和/或3'末端的6、5、4、3或2个核苷酸内的区域中。由于"反义，，的使用与RNA复合物有关，所以"反义，，的使用不同于反义DNA化合物，其中所述的反义DNA化合物在核酸治疗的相关领域中是不同的。如本文所用，术语"有义链"指的是dsRNA的包括与反义链的区域基本互补的区域的链。该链也称为"反指导"序列，因为它含有与革巴序列相同的核苷酸序列，且因此特异地与指导序列结合。如本领域技术人员理解地，当谈及dsRNA时，"向细胞中引入"表示促进细月包才聂取或吸收。dsRNA的吸收或4聂取可以通过自主扩散或主动的细胞过程、或者通过辅助性试剂或装置来进行。这个术语的含义不限于体外的细胞，当细胞为活的生物体的部分时，dsRNA也可以"引入细胞"。在该情况中，向细胞的引入包括向生物体的递送。例如，可以将dsRNA注射入组织部位或者全身施用来进行体内递送。在体外向细胞的引入包括本领域已知的方法例如电穿孔法和脂质转染法。在本文，只要术语"沉默，，和"抑制表达，，涉及PIK4CB或PIK4CA，那么其指的是在用靶向PIK4CB或PIK4CA的dsRNA处理的细胞中，至少部分抑制PIK4CB或PIK4CA的表达，这通过与正常(未处理)细胞比较，转录的或可得到的mRNA量的减少来显示。该测量法可通过比较处理细胞(其可从进4亍了处理使PIK4CB或PIK4CA的表达受到抑制的笫一细胞或第一组细胞分离)中的mRNA水平来检测，并且其中所述的mRNA量减少为和与第一细胞或第一组细胞基本相同、但未进行如此治疗的第二细胞或第二组细胞(对照细胞)相比较的结果。抑制程度通常以下列方式表示(对照细胞中的mRNA)-(经处理细胞中的mRNA)柳。,。(对照细胞中的mRNA)0备选地，抑制程度可以以与基因转录功能相关的参数下降的方式来给出，其中所述的参数例如多肽的量、或者显示特定表型例如特异地与PIK4CB或PIK4CA相关的激酶活性、或感染的易感性的细胞数目。在原则上，基因沉默可以在任何表达目的基因(组成型表达或者通过基因工程技术表达)的细胞中、并且可以通过任意合适的测试法来检测。然而，当需要参考来确定特定dsRNA是否在一定程度上抑制PIK4CB或PIK4CA的表达、并因此包含于本发明时，下文实施例提供的测试法将用作此种参考。例如，在一些情况中，通过施用本发明的双链RNA抑制至少大约20%、25%、35%或50%的PIK4CB或PIK4CA基因表达。在一些实施方案中，通过施用本发明的双链寡核苷酸抑制至少大约60%、70%或80%的PIK4CB或PIK4CA基因。在一些实施方案中，通过施用本发明的双链寡核苷酸抑制至少大约85%、卯％或95%的PIK4CB或PIK4CA基因。图2中的结果显示在HCV复制子测试法中每一受检测的靶向PIK4CB(或PIK4CA)的dsRNA有效地减少了10%至90%的表达产物的相对水平。图3中的结果显示每一受检测的耙向PIK4CB(或PIK4CA)的dsRNA有效地减少了细胞中10%至90%P1K4CB(或PIK4CA)mRNA水平。如在本文正链RNA病毒感染的上下文中所用，术语"治疗"、"疗法"等指的是緩解或者减緩正链RNA病毒感染介导的病理过程。该描述包括使用本发明的治疗剂预防或防止正链RNA病毒感染、以及緩解正链RNA21病毒感染引发的症状或病症。在本发明上下文中，在涉及下文所述的任何其它病症(不同于正链RNA病毒感染介导的病理过程)的情况下，术语"治疗"、"疗法"等表示緩解或者减轻至少一种与所述疾病相关的症状、或者减慢或逆转所述疾病的进程。如本文所用，短语"治疗有效量"和"预防有效量"指的是在治疗、预防或者管理由正链RNA病毒感染介导的病理过程或正链RNA病毒感染介导的病理过程的明显症状中提供治疗益处的数量。治疗有效的特定量可以由普通医生轻易确定，并且依赖于本领域公知的因素而不同，其中所述因素例如由正链RNA病毒感染介导的病理过程的类型、患者的病史和年龄、由正链RNA病毒感染介导的病理过程的阶段、以及其它抗病理剂的施用。如本文所用，"药物组合物"包含药学有效量的dsRNA和可药用载体。如本文所用，"药学有效量"、"治疗有效量"或者仅有"有效量"指的是有效产生预期的药学效果、治疗效果或者预防效果的dsRNA剂量。例如，如果当与疾病或病症相关的可测量参数中存在至少25%的减少时就认为给定的临床疗法是有效的，那么治疗这种疾病或病症的药物的治疗有效量是使上述参数减少至少25%所需的量。术语"可药用载体"指的是施用治疗剂的栽体。此类载体包括但不限于盐水、緩沖盐水、葡萄糖、水、丙三醇、乙醇、和它们的组合。术语明确排除细胞培养基。对于经口施用的药物，可药用载体包括但不限于可药用赋形剂，例如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。适当的惰性稀释剂包括钠和钙的碳酸盐、钠和钙的磷酸盐、以及乳糖，而玉米淀粉和褐藻酸则是适当的崩解剂。粘合剂可以包括淀粉和明胶，而润滑剂(如果存在的话)通常为硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。如果需要的话，片剂可以用例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的材料包衣来延迟在胃肠道的吸收。如本文所用，"经转化的细胞"为引入了表达dsRNA分子的载体的细胞。双链核糖核酸(dsRNA)22在一个实施方案中，本发明提供了在细胞或哺乳动物中抑制PIK4CB和/或PIK4CA表达的双链核糖核酸分子(dsRNA)，且因此抑制正链RNA病毒复制或繁殖，其中所述的dsRNA包含反义链，所述反义链包含与在表达PIK4CB或PIK4CA时形成的至少部分mRNA互补的互补区域，并且其中互补区域在长度上低于30个核苷酸、通常长19-24个核苷酸，并且其中所述的dsRNA与表达所述PIK4CB或PIK4CA基因的细胞接触后，至少10%、25%或40%抑制所述PIK4CB或PIK4CA基因表达。dsRNA包含两条充分互补以便杂交形成双链体结构的RNA链。dsRNA的一条链(反义链)包含与耙序列基本互补、并且通常完全互补的互补区域，所述耙序列来自PIK4CB或PIK4CA基因的基因产物的序列，另一条链(有义链)包含与反义链互补、以便两条链在适当条件下结合时杂交并形成双链体结构的区域。一般而言，双链体结构长度在15-30个碱基对之间、更通常在18-25个碱基对之间、进一步更加通常地在19-24个碱基对之间、最通常地在19-21个碱基对之间。类似地，与靶序列互补的区域长度在15-30个核苷酸之间，更通常地在18-25个核苷酸之间，进一步更加通常地在19-24个核苷酸之间，最通常地在19-21个核苷酸之间。本发明的dsRNA可以是平末端的(如每一任何链中的核苷酸具有与其它链合适的碱基配对的核苷酸)，或也可包含一个或多个单链核苷酸突出(一般在3，末端)。dsRNA可以如下文进一步讨论地通过本领域公知的标准方法来合成，其中所述的方法例如通过使用例如Biosearch，AppliedBiosystems，Inc.商品化的自动DNA合成仪。在特定的实施方案中，用于靶向P1K4CB的dsRNA包含选自表l的有义序列的链和选自表1的反义序列的第二序列。靶向PIK4CB靶序列的其它地方的备选试剂(如位于表l中鉴定的试剂的稍上游或下游)可以轻易地使用表l中所列的序列和侧翼的mRNA或NCBI登录号NM—002651中发现的基因组序列来确定。在特定的实施方案中，用于靶向PIK4CA的dsRNA包含选自表2的有义序列的链和选自表2的反义序列的第二序列。靶向PIK4CA靶序列的其它地方的备选试剂(如位于表2中鉴定的试剂的稍上游或下游)可以轻易地使用表2中所列的序列和侧翼的mRNA或NCBI登录号NM—002650下发现的基因组序列来确定。在进一步的实施方案中，dsRNA包含至少一个选自表1或表2提供的双链序列的双链序列。在其它实施方案中，治疗剂可包含两个或多个选自表1和/或表2的双链序列。一般而言，每一dsRNA包含两个寡核苷酸链，其中的一个寡核苷酸描述为表中的有义链，并且第二个寡核苷酸描述为同一表中的反义链。每张表都提供了每一优选的dsRNA的双链体名称。核苷酸碱基使用标准的核苷酸符号表示。表1耙向PIK4CB的双链体siRNA(dsRNA)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表1靶向PIK4CB的双链体siRNA(dsRNA)(续上页)PIK4CB27UUGCCGAUCGCCMJCAGGGACTT26CCCUGMJGGCGAUCGGCAATT130PIK4CB28UGGAUCAUCUAGGCAACGGATTT27CCGUUGCCUAGAUGAUCCATT131PIK4CB29UUCCCAAAUGGACUGCAGUTGTT28ACUGCAGUCCAUUUGGGAATT132PIK4CB30UCCACUACUGUAUCUCCCATGTT29UGGGAGAUACAGUAGUGGATT133PIK4CB31UAGGAAGUAAUCGAGCAAGGATT30CUUGCUCGAUUACUUCCUATT134PIK4CB32AAGAAUCUCAUUCAAUUUCCATT31GAAMJUGAAUGAGAUUCUUTT135PIK4C已33UAGCUUGGUCCCACGGGAGTGTT32CUCCCGUGGGACCAAGCUATT136PIK4CB34UUGAACAUGUCGCCAUCCAGGTT33UGGAUGGCGACAUGUUCAATT137PIK4CB35UCAAGUCCUAAGUACCGAGAATT34CUCGGUACUUAGGACUUGATT138PIK4CB36AUGACUGACAGGAGCCGCCWTT35GGCGGCUCCUGUCAGUCAUTT139PIK4CB37UGUUCAUCCCUCUUAGUGGCTTT36CCACUAAGAGGGAUGAACATT140PIK4CB38UUGGAGUUGAGGACAACAGCCTT37CUGUUGUCCUCAACUCCAATT141PIK4CB39AAUAAGAGGAUGGCCUGUGGATT38CACAGGCCAUCCUCUUAUUTT142PIK4CB40UGAUCCGCCGUACUUUCUCCTTT39GAGAAAGUACGGCGGAUCATT143PIK4CB41AAUUCCACAUGGCUAGGCCAGTT40GGCCUAGCCAUGUGGAAUUTT144PIK4CB42AUCUGACUUAGAGCGCUGGTGTT41(XAGCGCUCUAAGUCAGAUTT145PIK4C已43CUCAGUGGUGUAACUGCCGTGTT42CGGCAGUUACACCACUGAGTT146PIK4CB44UCAGCUUAAAGGCUGACGUCTTT43ACGUCAGCCUUUAAGCUGATT147PIK4CB45AAGCCGUCAUAGAGUUUGGTGTT44CCAAACUCUAUGACGGCUUTT148PIK4CB46UCCGUGAUGACACUUAGCAGGTT45UGCUAAGUGUCAUCACGGATT149P1K4CB47UCGCCUM3GUCAUCCACCGACTT46CGGUGGAUGACAUAGGCGATT150PIK4CB48UGGAAGGCCCGCCCUUCUCAGTT47GAGAAGGGCGGGCCUUCCATT151PIK4C已49AACUGGGAGAUGUUGUCACAGTT48GUGACAACAUCUCCCAGUUTT152PIK4CB50UAGAGACUGCCACGCCUCCATTT49GGAGGCGUGGCAGUCUCUATT153PIK4CB51UUGACCACUGGUUCAAUCATGTT50UGAUUGAACCAGUGGUCAATT154PIK4CB52UUAGGGUUGCUGGCUGUUCGTTT51GAACAGCCAGCAACCCUAATT155PIK4CB53UCUGUGGUCAGCUUAAAGGCTTT52CCUUUAAGCUGACCACAGATT156PIK4CB54AUUMJCAMJACUCUCGGUGCTTT53CACCGAGAGUAUUGM3AMJTT157PIK4CB55UUGGUGAGGUACUGGAAGCCGTT54GCUUCCAGUACCUCACCAATT158P1K4CB56UGUMJGGCUUGAUCCAAAGGGTT55CUUUGGAUCAAGCCAUACATT159PIK4CB57UUGGAGUUAUACAGGUAUGAATT56CAUACCUGUAUAACUCCAATT鄉PIK4CB58UCGAGCUUCCAAGAAUCUCATTT57GAGAUUCUUGGAAGCUCGATT161PlK4C巳59AAAGUUAAUGCUCUGGCGGCATT58CCGCCAGAGCAUUAACUUUTT162PIK4CB60UAUCAGCCGAAAUCACAAGAATT59CUUGUGAUUUCGGCUGAUATT163P1K4CB61UUGUCAUAGUUGGGCACAGTGTT60CUGUGCCCAACUAUGACAATT164PIK4C已62UCCGUAGCUUGGUCCCACGGGTT61CGUGGGACCAAGCUACGGATT165PIK4CB63UGAGGUUUCGAAUGGUGCUGGTT62AGCACCAUUCGAAACCUCATT166PIK4CB64UUGUAUGGCUUGAUCCAAAGGTT63UUUGGAUCAAGCCAUACAATT167PIK4CB65UAAGUACCGAGAACCUACUCTTT64AGUAGGUUCUCGGUACUUATT168PIK4CB66UUUCCGAGCGGCAAUCAGCCCTT65GCUGAUUGCCGCUCGGAAATT■169PIK4CB67UGAGGUACUGGAAGCCGUCATTT66GACGGCUUCCAGUACCUCATT17025表1靶向PIK4CB的双链体siRNA(dsRNA)(续上页)PIK4CB68UCUCAGACAAGGGCCCUCUAGTT67AGAGGGCCCUUGUCUGAGATT171PIK4CB69UGUAGGCUUGUACUCCAGGCTTT68CCUGGAGUACAAGCCUACATT172PIK4CB70UUAAUGCUCUGGCGGCAACGGTT69GUUGCCGCCAGAGCAUUAATT173PIK4CB71GAAUUAUCAAUACUCUCGGTGTT70CCGAGAGUAUUGAUAAUUCTT174PIK4CB72UUCCACAUGGCUAGGCCAGTATT71CUGGCCUAGCCAUGUGGAATT175PIK4CB73UGAGGCAUCCGUUCAUACCTCTT72GGUAUGAACGGAUGCCUCATT176PIK4CB74UUGCUGGCUGUUCGUUUCAGGTT73UGAAACGAACAGCCAGCAATT177PIK4CB75AACAUGUCGCCAUCCAGGCCGTT74GCCUGGAUGGCGACAUGUUTT178PIK4CB76UGCUCCGGAGUAGUCAACCAATT75GGUUGACUACUCCGGAGCATT179PIK4CB77ACUGGUUCAAUCAUGCCACTATT76GUGGCAUGAUUGAACCAGUTT180P歸CB78DAGACCGCAUACUGCCA13CCATT77GAUGGCAGUAUGCGGUCUATT181PIK4CB79UGGAGUUGAGGACAACAGCCTTT78GCUGUUGUCCUCAACUCCATT182PIK4CB80UAGUUGGGCACAGUGCUGAAGTT79UCAGCACUGUGCCCAACUATT183PIK4CB81UCAAUACUCUCGGUGCUGGAGTT80CCAGCACCGAGAGUAUUGATT184PIK4CB82UACUCCGAAUUCGGUUCUCGGTT81GAGAACCGAAUUCGGAGUATT185PIK4CB83UUACCACAUGAUCCUUCGUGTTT82ACGAAGGAUCAUGUGGUAATT186PIK4CB84UGGCUAGGCCAGUACCCUCAGTT83GAGGGUACUGGCCUAGCCATT187PIK4CB85UUCUACGGACCUCGUACUCCGTT84GAGUACGAGGUCCGUAGAATT188PIK4CB86UGACAGGAGCCGCCAAUUGGGTT85CAAUUGGCGGCUCCUGUCMT189PIK4C已87UCAGACAAGGGCCCUCUAGGGTT86CUAGAGGGCCCUUGUCUGATT190PIK4CB88AUUGACCACUGGUUCAAUCATTT87GAUUGAACCAGUGGUCAAUTT191PIK4CB89UCCGGAGUAGUCAACCAAGTGTT88CUUGGUUGACUACUCCGGATT192PIK4C日90UCAUGGGUAAUACCACAUUCGTT89AAUGUGGUAUUACCCAUGATT193PIK4CB91UUCAAUCAUGCCACUAUCAGCTT90UGAUAGUGGCAUGAUUGAATT194PIK4CB92UCUAGGCAACGGAUCCJCACTGTT91GUGAGAUCCGUUGCCUAGATT195PIK4CB93UGAUCUGGGCAGGUGGAUCATTT92GAUCCACCUGCCCAGAUCATT196PIK4CB94UAUCAAUACUCUCGGUGCUGGTT93AGCACCGAGAGUAUUGAUATT197PIK4CB95AAUGCUCUGGCGGCAACGGTGTT94CCGUUGCCGCCAGAGCAUUTT198PIK4C已96UCCCACGGGAGUGUCGUUGAGTT95CAACGACACUCCCGUGGGATT199PIK4C已97UUUCUCAGACAAGGGCCCUCTTT96AGGGCCCUUGUCUGAGAAATT200PIK4CB98AUCUUCUGGGUCUCGUUUGAATT97CAAACGAGACCCAGAAGAUTT201PIK4C已99UCGUACUCCGAAUUCGGUUCTTT98AACCGAAUUCGGAGUACGATT202P1K4CB100UUUAGGGUUGCUGGCUGUUCGTT99AACAGCCAGCAACCCUAAATT203PIK4CB101CUCCUGUAGGAAGUAAUCGAGTT100CGAUUACUUCCUACAGGAGTT204PIK4CB102UGGUGAGGUACUGGAAGCCGTTT101GGCUUCCAGUACCUCACCATT205PIK4CB103UCMJCCACCGACCAGGCCUCATT102AGGCCUGGUCGGUGGAUGATT206PIK4CB104ACUCCGAMJUCGGUUCUCGGGTT103CGAGAACCGAAUUCGGAGUTT207PIK4C已105UCAGGUAGGGAGCC(JUGUCCTTT察GACAAGGCUCCCUACCUGATT20826表2靶向PIK4CA的双链体siRNA(dsRNA)<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表2靶向PIK4CA的双链体siRNA(dsRNA)(续上页)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>技术人员熟知包含20至23个之间、特别是21个碱基对的双链体结构的dsRNA在诱导RNA干扰中特别有效(Elbashir等人，EMBO2001，20:6877-6888)。然而，其它人发现，更短或更长的dsRNA也有效。在上述实施方案中，通过在表1或表2中提供的寡核苷酸序列的性质，本发明的dsRNA可以包含至少一条长度最低为21nt的链。可以合理期望，包含表1或表2中的一个序列、仅在一个或两个末端减去几个核苷酸的较短dsRNA可以具有与上述dsRAN相比类似的效果。因此，本发明考虑了包含表l或表2的序列之一中的至少15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸的部分序列的、并且在本文所述的FACS测试法或其它测试法中抑制PIK4CB或PIK4CA基因表达的能力比包含全序列的dsRNA的抑制作用低不超过5、10、15、20、25或30%的dsRNA。在表1或表2提供的靶序列中切割的其它dsRNA可以使用提供的参考序列和靶序列轻易生成。此外，在表1或表2中提供的RNAi试剂在PIK4CB或PIK4CAmRNA中确定了有用的位点，其对基于RNAi的切割敏感。如此地，本发明进一步包括靶向本发明试剂之一靶向的序列中的RNAi试剂。如本文所用，如果第二种RNAi试剂切割与第一种RNAi试剂反义链互补的mRNA内任意位置，那么第二种RNAi试剂就称为耙向第一种RNAi试剂的序列。这种第二种试剂通常由表1或表2提供的序列之一的至少15个连续核苷酸组成，其中所述的核苷酸与源自靶基因中的所选序列邻近区域的额外核苷酸序列偶联。例如，SEQIDNO:5的最后15个核苷酸与PIK4CB基因的邻近6个核苷酸組合来产生基于表1提供的序列之一的21个核苷酸的单链试剂。基于该单链，互补的有义链可轻易的产生。其可在与最初的SEQIDNO:5双链体相同的敏感区域切割靶mRNA。基于表2提供的序列可以相同的方式来完成对PIK4CA的切割。本发明的dsRNA可以含有对靶序列的一个或多个错配。在优选的实施方案中，本发明的dsRNA含有不超过3个的错配。如果dsRNA的反义链含有对靶序列的错配，那么错配区域优选不定位在互补区域的中心。如果dsRNA的反义链含有对靶序列的错配，那么错配优选限制在任一末端30的5个核苷酸，例如互补区域的5，或3，末端的5、4、3、2或1个核苷酸。例如，对于与PIK4CB靶基因的区域互补的23个核苷酸的dsRNA链，dsRNA在中心的13个核苷酸内通常不含有任何错配。本发明所述的方法可以用于测定包含对靶序列的错配的dsRNA是否有效降低细胞中PIK4CB的表达。考虑具有错配的dsRNA在抑制PIK4CB表达中的有效性是重要的，尤其是如果已知在PIK4CB中的特定互补区域在人群内具有多态性的序列差异。相同的分析可用于靶向PIK4CA的dsRNA。在一个实施方案中，dsRNA的至少一个末端具有l-4个、通常l个或2个核苷酸的单链核苷酸突出。具有至少一个核苷酸突出的dsRNA比它们平末端的dsRNA对应物具有出乎意料的高抑制特性。此外，仅存在一个核苷酸突出加强了dsRNA的干扰活性，而不影响其整体稳定性。已经证实，仅具有一个突出的dsRNA在体内、以及多种细胞、细胞培养基、血液和血清中尤其稳定和有效。一般而言，单链的突出定位在反义链的3，末端，或者备选地在有义链的3，末端。dsRNA也可以具有平末端，其通常定位在反义链的5，端。此类dsRNA具有改善的稳定性和抑制活性，因此允许以低剂量施用，即每天每千克受试者体重少于5mg。一般而言，dsRNA的反义链在3，端具有核苷酸突出。在另一实施方案中，用核苷硫代磷酸替代突出中的一个或多个核苷酸。在表l和表2中，RNA链的匹配对显示出在3，末端具有两个胸腺嘧啶核苷DNA核苷酸。阐述这种T-T基序是因为它是一种常用的趋向于增加siRNA的稳定性或其它所希望有的特性的基序。因此，T-T是本发明的一个合适实施方案。尽管如此，由本领域技术人员熟知的核苷酸的其它排列，任选地具有修饰的核苷间键合、化学修饰或保护帽可使用于siRNA链的3，末端。本领域技术人员知道此类修饰导致改善的功能等效分子，因为mRNA的耙序列保持不变，但是改变的突出的核苷酸可有利的影响其它药物特性。又在另一实施方案中，对dsRNA进行化学修饰来增强稳定性或提供其它治疗益处。本发明的核酸可以通过本领域已建立好的方法合成和/或修饰，其中所述的方法例如"Currentprotocolsinnucleicacidchemistry",Beaucage，S.L等人(编著)，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,NY,USA中所述的方法，所述文献在此处引入作为参考。化学修饰可以包括但不限于2，修饰、在寡核苷酸的糖或碱基的其它位点上的修饰、将非天然碱基引入寡核苷酸链、共价连接至配体或化学部分，和用备选键例如硫代磷酸酯替换核苷酸间磷酸酯键。可以采用多于一种的此类修饰。dsRNA两条分开的链的化学连接可以通过多种众所周知的技术来实现，例如通过引入共价键、离子键或氢键、疏水相互作用、范德华相互作用或者堆积相互作用、通过金属离子配位、或者通过使用噤呤类似物。一般而言，可以用来修饰dsRNA的化学基团包括但不限于亚甲蓝；双官能基团，通常为二-(2-氯乙基)胺；N-乙酰基-N，-(对乙醛酰苯曱酰基)胱胺；4-硫尿嘧啶和补骨脂素。在一个实施方案中，接头为六甘醇接头。在这种情况中，dsRNA通过固相合成法产生，并才艮据标准方法(例如，Williams,D.J和K.B.Hall,Biochem.(1996)35:14665-14670)引入六甘醇接头。在一个特定的实施方案中，反义链的5，端和有义链的3，端通过六甘醇接头进行化学连接。在另一实施方案中，dsRNA至少一个核苷酸包含硫代磷酸酯基团或二硫代磷酸酯基团。dsRNA末端的化学键一般通过三链螺旋键形成。表1和表2提供了根据这些技术能够被修饰的dsRNA序列的实例。又在另一实施方案中，可以修饰两条单链中的一条或两条链上的核苷酸来预防或抑制细胞酶活性的降解，其中所述的酶例如但不限于某些核酸酶。本领域已知抑制细胞酶降解核酸的活性的技术，其中包括但不限于2，-氨基修饰、2，-氨基糖修饰、2，-F糖修饰、2，-F修饰、2，-烷基糖修饰、不带电的主链修饰、吗啉基修饰、2'-0-甲基修饰和氨基磷酸酯(参见例如，Wagner,Nat.Med.(1995)1:1116-8)。因此，dsRNA上核苷酸的至少一个2，-羟基基团用化学基团、通常用2，-氨基或2，-曱基基团替代。并且，可以修饰至少一个核苦酸来形成锁核苷酸。该锁核苷酸含有连接核糖的2'-0和核糖的4，-C的亚甲基桥。含有锁核苷酸的寡核苷酸在Koshkin，A.A等人，32Tetrahedron(1998)，54:3607-3630)和Obika，S等人，TetrahedronLett,(1998)，39:5401-5404)中进行了描述。将锁核普酸引入寡核苷酸在一定程度上改善了对互补序列的亲和性、并提高了解链温度(Braasch，D.A和D.R.Corey，Chem.Biol.(2001)，8:1-7)。将配体缀合至dsRNA可以促进其细胞内的吸收、以及促进其革巴向于特定组织、或者促进其被特定类型的细胞摄取。在一些情况下，将疏水配体缀合至dsRNA来促进细胞膜的直接渗透。备选地，缀合至dsRNA的配体为用于受体介导的胞吞作用的底物。这些方法已经用于促进反义寡核苷酸、以及dsRNA试剂的细胞渗透。例如，已经将胆固醇缀合至多种反义寡核苷酸，从而产生比其未缀合的类似物实质上更有效的化合物。参见M.ManoharanAntisense&NucleicAcidDrugDevelopment2002，12，103。其它已缀合至寡核苷酸的亲脂性化合物包括l-芘丁酸、1，3-二-0-(十六烷基)丙三醇和薄荷醇。用于受体介导的胞吞作用的配体的一个实例为叶酸。叶酸通过叶酸受体介导的胞吞作用进入细胞。带有叶酸的dsRNA化合物通过叶酸受体介导的胞吞作用有效运输入细胞。李及其合作者报导，将叶酸连接至寡核苷酸的3，-末端导致细胞内寡核苷酸的摄取增加8倍。Li，S.;Deshmukh，H.M.;Huang,LPharm.Res.1998,15,1540。其它已缀合至寡核苷酸的配体包括聚乙二醇、糖簇、交联剂、卟啉缀合物和递送肽。在某些情况下，阳离子配体与寡核苷酸的缀合导致对核酸酶改善的抗性。阳离子配体的代表实例为丙基铵和二甲基丙基铵。有趣的是，据报导，当阳离子配体散布在寡核苷酸中时，反义寡核苷酸保持其对mRNA的高结合亲和力。参见M.ManoharanAntisense&NucleicAcidDrugDevelopment2002，12，103和其中的参考文献。本发明配体缀合的dsRNA可以通过使用具悬垂的反应官能性的dsRNA,例如将连接分子连接于dsRNA上而获得。这种反应性的寡核普酸可以直接与商品化的配体、合成为具有多种保护基团的配体、或者具有连接于其上的连接部分的配体反应。在一些优选的实施方案中，本发明的方法通过使用适当缀合了配体、并可能进一步连接至固相支持材料的核苷单体来促进配体缀合的dsRNA的合成。根据本发明方法的一些优选实施方案，此类任选连接至固相支持材料的配体-核苷缀合物通过所选的血清结合配体与定位在核苷或寡核苷酸5，位置的连接部分反应来制备。在一些情况下，具有连接至dsRNA3，-末端的芳烷基配体的dsRNA通过将单体结构单元通过长链氨烷基基团首先共价连接至可控多孔玻璃支持体来制备。然后，核苷酸通过标准的固相合成技术键合至与固相支持体缀合的单体结构单元。单体结构单元可以是与固相合成法兼容的核苷或者其它有机化合物。用于本发明缀合物中的dsRNA可以方便并且常井见地由众所周知的固相合成技术来制备。此种合成的设备由一些卖主销售，其中包括例如AppliedBiosystems(FosterCity，CA)的。额外地或备选地，可以采用本领域已知用于此种合成的任何其它方法。也已知使用类似技术来制备其它寡核普酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。关于特定修饰的寡核苷酸的合成的教导可以在下列美国专利中找到关于缀合多胺的寡核苷酸，见美国专利号5,138,045和5,218,105;关于用于制备具有手性磷键的寡核苷酸的单体，见美国专利号5,212,295;关于具经修饰主链的寡核苷酸，见美国专利号5,378,825和5,541,307;关于经修饰主链的寡核苷酸和其通过还原偶联的制备，见美国专利号5,386,023;关于基于3-脱氮噤呤环系统的经修饰核酸碱基及其合成方法，见美国专利号5,457,191;关于基于N-2取代嘌呤的经修饰的核酸碱基，见美国专利号5,459,255;关于制备具有手性磷键的寡核苷酸的方法，见美国专利号5,521,302;关于肽核酸的美国专利号5,539,082;关于具有(5-内酰胺主链的寡核苷酸，见美国专利号5,554,746;关于合成寡核苷酸的方法和材料，见美国专利号5,571,902;关于具有烷硫基基团的核苷，见美国专利号5,578,718,其中所述的此类基团可以用作与连接在核苷的任何多个位置的其它部分的接头；关于具有高手性纯度的硫代磷酸酯键的寡核苷酸，见美国专利号5，587，361和5,599,797;关于制备2'-0-烷基鸟苷和相关化合物的34方法，见美国专利号5,506,351，其中包括2,6-二氨基嘌呤化合物；关于具有N-2替代的嘌呤的寡核苷酸，见美国专利号5,587,469;关于具有3-脱氮嘌呤的寡核苷酸，见美国专利号5,587,470;关于缀合了4，-去甲基核苷类似物，见美国专利号5,223,168和5,608,046这两者；关于经^"饰主链的寡核苷酸类似物，见美国专利号5,602,240和5,610,289;关于合成2，-氟代-寡核苷酸的方法，尤其见美国专利号6,262,241和5，459，255。其它有利的修饰示于US6670486、PCT公开号WO2003082255和WO2005021749中。在具连接有本发明序列特异性核苷的配体缀合的dsRNA和配体-分子中，寡核苷酸和寡核苷可以在适当DNA合成仪上利用标准核苷酸或核苷前体、或已经含有连接部分的核苷酸或核苷缀合物前体、已经含有配体分子的配体-核苷酸或核苷缀合物前体、或者含有结构单元的非核苷配体来组装。当使用已含有连接部分的核苷酸-缀合物前体时，一般完成序列特异性连接的核苷的合成，并且随后将配体分子与连接部分反应来形成配体缀合的寡核苷酸。含有多种分子例如类固醇、维生素、脂类和报告分子的寡核苷酸缀合物先前已有描述(参见Manoharan等人，PCT申请WO93/07883)。在一个优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸或连接的核苷通过自动化合成仪使用来自配体-核苷缀合物的亚磷酰胺(phosphoramidite)、以及在寡核香酸合成中常规使用的商品化的标准亚磷酰胺和非标准亚磷酰胺合成。在寡核苷酸的核苷中掺入2'-0-甲基、2，-0-乙基、2，-0-丙基、2，-0-烯丙基、2，-0-氨烷基、2，-0-甲氧基乙氧基或2，-脱氧-2，-氟代基团可赋予寡核苷酸增强的治疗特性，如增强的杂交动力学。进一步地，含有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸具有增强的核酸酶稳定性。因此，本发明官能化的连接的核苷可以通过包括硫代磷酸酯主链或包括2，-0-甲基、2，-0-乙基、2，-0-丙基、2，-0-氨烷基、2'-0-烯丙基、2，-0-甲氧基乙氧基或2，-脱氧-2，-氟代基团，或者包括这两者来增强。本领域已知的一些寡核苷酸修饰的概括列表可以在例如PCT公开WO200370918中找到。基基团的官能化核苷序列使用DNA合成仪制备，并随后与所选配体的活性酯衍生物反应。活性酯衍生物为本领域4支术人员所熟知。代表性的活性酯包括N-羟基琥珀酰亚胺酯、四氟酚酯、五氟酚酯和五氯酚酯。氨基基团与活性酯的反应生成寡核苷酸，其中所选配体通过连接基团连接至5M立置。5，-末端的氨基基团可以利用5，-氨基修饰物C6试剂制备。在一个实施方案中，配体分子可以通过使用配体-核苷亚磷酰胺而缀合于寡核苷酸的5，-位置，其中所述的配体直接或间接通过接头连接于5，-羟基基团。此类配体-核苷亚磷酰胺通常用在自动化合成步骤的最后来提供在5，-末端具有配体的配体缀合的寡核苷酸。修饰的核苷间键或主链的实例包括，例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯和包括3，-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯的其它烷基膦酸酯、次膦酸酯、包括3，-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯(thionophosphoramidates)、硫羰基烷基膦酸酉旨(thio,lkylphosphoiiates)、硫羰基烷基磷酸三酉旨(thionoalkylphosphotriesters)和具有常规3，-5，键的硼烷磷酸酯(boranophosphates)、这些物质的2，-5，连接的类似物、以及那些具有相反极性、其中相邻核苷单元对为3，-5，至5，-3，或者2，-5，至5，-2，连接的物质。也包括多种盐、混合盐和游离酸形式。涉及制备上述含有磷原子键的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5，264，423、5,276,019、5，278，302、5，286，717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,625,050和5,697,248，其中每一专利都在此处引入作为参考。其中不包括磷原子的修饰的核苷间键合或主链(即寡核苷)的实例具有由短链烷基或环烷基糖间键、混合的杂原子和烷基或环烷基糖间键合、或者一种或多种短链杂原子或杂环的糖间键合形成的主链。这些包括具有吗啉基键(部分由核苷的糖部分形成)、珪氧烷主链、硫醚、亚砜和砜主链、氧基亚曱基氧基(formacetyl)和硫基亚甲基氧基(thioformacetyl)主链、亚甲基氧基亚甲基氧基和亚甲基硫基亚甲基氧基主链、含有链烯烃的主链；氨基磺酸酯主链、亚甲亚胺基和亚甲肼基主链、磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链、以及其它具有混合的N、O、S和CH2组分部分的主链。如在表1和表2中提及的，dT-dT对可添加到dsRNA的任何一条(或两条)链的3，末端。在这些情况中添加的dT-dT对通常与靶序列不互补。添加这些可含有硫代磷酸酯(硫)核苷间键合的dT-dT对来增强稳定性。涉及制备上述寡核苷酸的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5，677，437和5,677,439,其中各专利都在此处引用作为参考。在一些情况中，寡核苷酸可以通过非配体基团修^饰。许多非配体分子缀合至寡核苷酸以增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取，并且在科学文献中有进行此类缀合的方法。此类非配体部分包括脂类部分，例如胆固醇(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989，86:6553)、胆酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett"1994,4:1053)、硫醚，例如己基-S画三苯曱基硫醇(tritylthiol)(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad争Sci.,1992，660:306;Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let"1993，3:2765)、硫代胆固醇(Oberhauser等人，Nucl.AcidsRes"1992，20:533)、脂肪族链，例如十二烷二醇或者十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人，EMBOJ.，1991，10:111;Kabanov等人，FEBSLett"1990，259:327;Svinarchuk等人，Biochimie，1993，75:49)、磷脂，例如二-十六烷基-夕卜消旋-丙三醇或者三乙基铵1,2-二-0-十六烷基-夕卜消旋-丙三醇-3-H-膦酸酯(Manoharan等人,TetrahedronLett"1995，36:3651;Shea等，Nucl.AcidsRes.，19卯，3718:3777)、多胺或者聚乙二醇链(Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides,1995，14:969)、或者金刚烷乙酸(Manoharan等人，TetrahedronLett"1995，36:3651)、棕榈基部分(Mishra等人，Biochem.Biophys.Acta,l995，I264:229)、或者十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther"1996，277:923)。教导制备此类寡核苷酸缀合物的代表性美国专利已在上文列出。一般的缀合方案涉及合成在序列的一个或多个位置具有氨基接头的寡核苷酸。随后使用适当的偶联剂或活化剂将氨基基团与缀合的分子反应。缀合反应可以用仍然缀合于固相支持体的寡核苷酸或者在切割寡核苷酸在溶液相之后进行。通过HPLC纯化寡核苷酸缀合物通常提供纯净的缀合物。尤其优先使用胆固醇缀合物，因为该分子可以增加对肝细胞(正链RNA病毒如HCV感染的主要部位)的靶向。本公开描述了用于沉默PIK4CB表达、并因此阻止正链RNA病毒增殖和治疗相关病症的dsRNA的多种实施方案。虽然可以釆取多种形式来设计特定治疗剂，但某些功能特征将从其它dsRNA组合物中区分出优选的dsRNA组合物。具体而言，检测本领域技术人员可测定的所有特征例如好的血清稳定性、高效能、不诱导免疫反应、以及好的药物样行为来鉴定本发明优选的dsRNA。在一些情况中，并非所有这些功能方面都出现在优选的dsRNA组合物中。但本领域技术人员能够优化这些变量以及其它变量来选择本发明优选的化合物。本发明者们意识到了趋向于提供显著改善的药理学、免疫学和最终治疗益处的化学修饰模式。研究这些模式以改善siRNA，但不考虑所选择的靶序列。表3给出了优选用于表1或表2中列出的双链体dsRNA的化学修饰模式。这些模式不是相互排斥的。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>F硫代磷酸酯键dT二脱氧胸腺嘧啶核苷2，OMe=RNA的2'-0-甲基修饰Py二嘧t定核苷酸Chol二胆固醇。"exo"指3，末端键，"endo，，意为核苷内部的键。uA或cA二指在UA或CARNA序列处，所述U或C受到所示的修饰。同样情形应用于uG和uU。编码RNAi试剂的栽体本发明的dsRNA也可以由细胞内的重组病毒载体在体内表达。本发明的重组病毒载体包含编码本发明dsRNA的序列和用于表达dsRNA序列的任何适当启动子。适当的启动子包括例如U6或HIRNApolIII启动子序列，以及巨细胞病毒启动子。选择其它适当的启动子属于本领域技术。本发明的重组病毒载体也可以包含在特定组织或者在特定胞内环境中用于表达dsRNA的可诱导或可调节的启动子。使用重组病毒栽体体内向细胞递送本发明的dsRNA将在下文进行更加详细的讨论。本发明的dsRNA可以由重组病毒载体表达为两个分开的互补RNA分子，或者表达为具两个互补区域的单个RNA分子。可以使用任何能够接受待表达的dsRNA分子的编码序列的病毒载体，例如衍生自腺病毒(AV)、腺伴随病毒(AAV)、反转录病毒(例如慢病毒(LV)、弹状病毒、鼠白血病病毒)、疱疹病毒等的载体。病毒载体的向性可以通过用其它病毒的包膜蛋白或其它表面抗原假型化载体、或者根据需要通过替换不同的病毒衣壳蛋白来进行修饰。例如，本发明的慢病毒载体可以用泡状口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃伯拉病毒、莫科拉病毒等的表面蛋白来假型化。可以通过将载体改造成表达不同衣壳蛋白血清型来将本发明的AAV载体制备成靶向不同细胞。例如，在血清型2基因组上表达血清型2衣壳的AAV载体称为AAV2/2。可以将这种在AAV2/2载体中的血清型2衣壳基因替换成血清型5衣壳基因来产生AAV2/5载体。构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV栽体的技术为本领域中的才支术，参见，例如RabinowitzJE等人(2002)，JVirol76:791-801，其在此处以其整体引入作为参考。选择适用于本发明的重组病毒载体、将表达dsRNA的核酸序列插入载体的方法、以及将病毒载体递送至目的细胞的方法都为本领域技术。参见，例如DornburgR(1995),GeneTherap.2:301-310;EglitisMA(1988)，Biotechniques6:608-614;MillerAD(1990),HumGeneTherap.1:5-14;AndersonWF(1998)，Nature392:25-30和RubinsonDA等人，Nat.Genet.33:401-406，所述文献在此处其整体引入作为参考。优选的病毒载体为衍生自AV和AAV的载体。在一个特别优选的实施方案中，本发明的dsRNA由包含例如U6或HIRNA启动子、或者巨细胞病毒(CMV)启动子的重组AAV载体表达为两个分开的互补的单链RNA分子。表达本发明dsRNA的适当AV载体、构建重组AV载体的方法、以及将载体递送入乾细胞的方法在XiaH等人(2002)，Nat.Biotech.20:1006-1010中进行了描述。表达本发明dsRNA的适当AAV载体、构建重组AV载体的方法、以及将载体递送入乾细胞的方法在SamulskiR等人(1987)，丄Virol.61:3096-3101、FisherKJ等人(1996)，J.Virol,70:520-532、SamulskiR等人(1989)，J.Virol.63:3822-3826、美国专利号5，252，479、美国专利号5,139,941、国际专利申请号WO94/13788和国际专利申请号WO93/24641中进行了描述，所有文献在此处以其整体引入作为参考。包含dsRNA的药物组合物在一个实施方案中，本发明提供了包含如本文所述的dsRNA和可药用载体的药物组合物。在另一实施方案中，本发明包含dsRNA与另一活性主要成分的组合。包含dsRNA与活性主要成分的组合的药物组合物用于治疗与由正链RNA病毒感染介导的病理过程相关的疾病或病症。将本发明的药物组合物施用足够抑制PIK4CB或PIK4CA基因的表达或活性的剂量。本发明者们已经确定，包含本发明dsRNA的组合物可以以令人惊讶的低剂量施用。每日每千克受试者体重施用5mg的dsRNA剂量足够抑制或者阻止PIK4CB或PIK4CA基因。一般而言，组合中各dsRNA的适当剂量在每天每千克受试者体重0.01至5.0毫克的范围，通常在每天每千克体重1微克至1毫克的范围。药物组合物可以每天施用一次，或者dsRNA可以在每天以适当间隔施用两次、三次或者更多次的亚剂量、或者甚至通过控制释放制剂连续注入或递送。在那种情况中，每次亚剂量中含有的dsRNA必须相应地更小以便达到总的每日剂量。也可以混合剂量单位来递送若干天，例如使用提供在若干天内持续释放dsRNA的常规持续释放制剂。在这个实施方案中，剂量单位含有相应的多个每日剂量。技术人员理解，一些因素会影响有效治疗受试者所需的剂量和时间过程，其中包括但不限于疾病或病症的严重性、以前的治疗、受试者的整体健康和/或年龄、以及存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的组合物治疗受试者包括单次治疗或系列治疗。对本发明包括的各个dsRNA的有效剂体内测试来进行，如本文其它地方所述。本发明者们认识到，由于多种原因，可能希望用两种或多种dsRNA的组合来治疗正链RNA病毒感染。一种dsRNA选自本发明的dsRNA，另一种dsRNA选自那些已知靶向正链RNA病毒自身的dsRNA。靶向HCV或HPV或其它正链RNA病毒的dsRNA可从现有技术的公开中鉴定。期望包含多于一种类型的dsRNA的本发明药物组合物含有如本文所述的各dsRNA的剂量。dsRNA的组合可以在单个剂型的药物组合物中一起提供。备选地，dsRNA的组合可以以分别的剂型提供，在这种情况下，所述分别的剂型可以同时或在不同时间施用，并且可能通过不同的方式。因此，本发明考虑了包含预期的本发明dsRNA组合的药物组合物，并且其也考虑了旨在作为组合方案的一部分提供的单种dsRNA的药物组合物。在后一种情况中，组合疗法的发明因此为施用方法而非实体的组合物。在小鼠遗传学的进展已经产生了大量研究多种人类疾病例如由HCV感染介导的病理过程的小鼠模型。此类模型用于体内测试dsRNA，以及用于确定治疗有效量，和dsRNA的优选组合。可以使用任何方法来向含有感染了HCV的细胞的哺乳动物施用本发明的dsRNA。例如，施用可以是局部的(例如阴道的、经皮肤的等)、经口的或肠胃外的(例如，通过皮下、心室内、肌内或者腹膜内注射的，或者通过静脉滴注)。施用可以是快速的(例如通过注射)，或者可以发生一段时间(例如通过緩慢输注或者施用緩慢释放制剂)。对于局部施用，可以将dsRNA分子制剂入组合物，所述组合物例如无菌和有菌的含水溶液、在常规溶剂例如醇中的非水溶液、或者在液态或固态油基质中的溶液。此类溶液也可以含有緩沖剂、稀释剂和其它适当的添加剂。用于局部施用的组合物可以制剂成透皮贴剂、软膏、洗剂、乳剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末的形式。凝胶剂和乳剂可以使用本领域已知的多聚物和透化剂来制备。对于肠胃外、鞘内或心室内的施用，可以将dsRNA分子制剂入组合物，例如无菌含水溶液，其也可以含有緩沖剂、稀释剂和其它适当的添加42剂(例如穿透增强剂、载体化合物和其它可药用栽体)。此外，可以使用非病毒方法向含有感染了正链RNA病毒的细胞的哺乳动物施用dsRNA，其中所述的方法例如美国专利号6，271，359中所述的生物学或非生物学方法。非生物学的递送可以通过多种方法来实现，其中包括但不限于(l)加载具有本文提供的dsRNA酸性分子的脂质体，(2)复合dsRNA分子和脂类或脂质体以形成核酸-脂类或者核酸-脂质体复合体，或(3)提供基于治疗递送系统的多聚物、纳米颗粒或纳米乳剂。这些技术在其它文中一般是本领域熟知的。简要描述如下。脂质体或脂类复合体可以包含通常用于体外转染细胞的阳离子脂和中性脂。阳离子脂可以与负电荷的核酸复合来形成脂质体。阳离子脂质体的实例包括4旦不限于lipofectin、lipofectamine、lipofectace、DOTAP。形成脂质体的过程为本领域熟知。脂质体组合物可以例如由磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油或者二油酰磷脂酰乙醇胺形成。大量亲脂试剂是商品化的，其中包括Lipofectin.RTM.(Invitrogen/LifeTechnologies,Carlsbad,Calif.)和Effectene.TM.(Qiagen，Valencia,Calif.)。此外，全身递送方法可以使用商品化的阳离子脂例如DDAB或DOTAP来优化，其中所述的每种阳离子脂都可以与中性脂例如DOPE或胆固醇混合。在一些情况中，可以使用例如Templeton等人(NatureBiotechnology,15:647-652(1997))描述的那些脂质体。在一些实施方案中，剂量是完全包封入脂质体中的，例如在Morrissey等人，NatBiotechnol.2005年8月；23(8):1002-7.Epub2005年7月24日中描述的在SNALP中。也参见Wheder,J.J.等人，1999.GeneTher.6，271-281。在其它实施方案中，可以使用聚阳离子例如聚乙烯亚胺来完成体内和离体(exvivo)递送(Boletta等人，J.AmSoc.Nephrol.7:1728(1996))。关于使用脂质体递送核酸的额外信息可以在美国专利号6,271,359、PCT7>开WO96/40964和Morrissey,D等人，2005.NatBiotechnol.23(8):1002-7中找到。生物递送可以通过多种方法实现，其中包括但不限于使用病毒载体。43例如，可以使用病毒载体(例如，腺病毒和疱渗病毒载体)将dsRNA递送至皮肤细胞和宫颈细胞。可以使用标准的分子生物学技术将本文提供的一种或多种dsRNA引入到先前研发的用来向细胞递送核酸的许多不同病毒载体之一。这些所得的载体可以用来通过例如感染将一种或多种dsRNA递送至细胞。本发明的dsRNA可以制剂在可药用载体或稀释剂中。"可药用载体"(本文也称为"赋形剂")为可药用溶剂、悬浮剂或者任何其它药学惰性载体。可药用载体可以是液态或固态的，并且可以用计划的施用方法进行选择来提供预期容积、一致性和其它适当的运输和化学性质。一般的可药用载体包括(通过举例但不限于)水、盐水溶液、粘合剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基曱基纤维素)、填充物(例如乳糖和其它糖类、明胶或者硫酸钙)、润滑剂(例如淀粉、聚乙二醇或者醋酸钠)、崩解剂(例如淀粉或淀粉乙醇酸钠)、以及湿润剂(例如十二烷基硫酸钠)。此外，可以将靶向PIK4CB基因表达的dsRNA制剂入含有与其它分子(包括小分子治疗剂)、分子结构或者核酸混合物混合、包被、缀合或者締合的dsRNA的组合物。例如，含有一种或者多种本发明的dsRNA试剂的组合物可以含有其它治疗剂，例如抗炎药物(例如，非留体抗炎药和糖皮质激素)和抗病毒药物(例如利巴韦林(ribivirin)、阿糖腺苷(vidarabine)、阿昔洛维(acyclovir)和更昔洛韦(ganciclovir))。此类化合物的毒性和治疗功效可以在细胞培养物或者实验动物中通过标准药物学方法测定，例如测定LD50(对群体的50%致死的量)和ED50(在50%群体中有效的量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比率为治疗指数，并且其可以表示为LD50/ED50的比率。优选显示高治疗指数的化合物。从细胞培养物测试和动物研究中获得的数据可以用于人类用途的剂量范围的制剂。本发明组合物的剂量通常在循环浓度的范围内，其包括有极小或者没有毒性的ED50。剂量可以在这个范围内根据采用的剂型和使用的给药途径而变化。对于本发明方法中使用的任何化合物，治疗有效量最初都可以用细胞培养物测试来评估。剂量可以在动物模型中配制来实现化合物或者根据需要的靶序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，实现多肽浓度降低)，其中所述的浓度范围包括在细胞培养物中测定的IC50(即达到症状最大抑制作用一半时受试化合物的浓度)。此类信息可以用来更加精确地测定在人中的有益剂量。在血浆中的水平可以例如通过高效液相色i普法测定。本发明的dsRNA除了如上文讨论的单独或者多种施用外，其可以与其它已知的有效治疗由HCV感染介导的病理过程的药剂联合施用。在任何情况中，给药医师可以基于使用本领域已知或者如本文所述的标准功效测定，见察到的结果调整dsRNA的施用剂量和时间过程。dsRNA的联合可以在体外和体内使用鉴定优选的单种dsRNA所采用的相同方法来测试。此类联合可以完全基于生物信息学基础进行选择。备选地，可以基于按照本文所述的用于单种dsRNA试剂的方法进行的体外或体内评估来选择此类联合。测试dsRNA的联合的优选测定法在以下实施例中的测定法中展示。治疗由正链RNA病毒感染引发的疾病的方法本文所述的方法和组合物可以用于治疗由正链RNA病毒感染(如HCV)引发的疾病和病症，其中所述的疾病和病症可能是临床或亚临床感染的结果。总的来说，治疗由正链RNA病毒感染的方法包括给需要其的患者施用选择性抑制磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)的活性的化合物。此类化合物可选自小分子、dsRNA、DNA的反义DNA、核酶、或编码上述化合物的DNA载体。在肝脏中选择PIK4CB和/或PIK4CA的小分子试剂对于治疗正链RNA病毒感染的治疗目的是相当有益的。此类疾病和病症，本文有时称为"由正链RNA病毒感染介导的病理过程"。HCV感染的主要肝病理结果是肝硬化和其并发症，包括出血、肝功能不全和肝细胞癌。纤维样变性是慢性炎症的结果，所述慢性炎症引起胞外基质组分的沉积作用，所述胞外基质组分使得肝的结构不正常，并且阻45断了微循环和肝功能。随着肝硬化发展和纤维样组织聚集，接着就发生严重坏死炎症作用并开始脂肪变性。脂肪变性导致肝外病理学，包括糖尿病、蛋白质营养不足、高血压、细胞毒素、肥胖症和缺氧症。随着纤维样变性和脂肪变性变得严重时，肝脏将最终功能衰竭并需要肝脏移植。在本说明书中，"治疗......的方法，，意指(以客观或主观的水平)治疗、预防(预防性地针对)或降低一个或多个由该短语指定的疾病、失调或病症的症状的方法。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然在本发明的实践中或文描述了适当的方法和材料。本文提到的所有公开、专利申请、专利以及其它参考文献都以其整体引入作为参考。在有争议的情况下，以本说明书包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅用作说明，并不作为限制。实施例实施例1:dsRNA合成试剂来源当本文未特别给出试剂来源时，可以从任意分子生物学试剂供销商处获得应用于分子生物学的质量/纯度标准的该试剂。siRNA合成单链RNA通过固相合成以l微摩尔的规模产生，其中使用Expedite8909合成仪(AppliedBiosystems,AppleraDeutschlandGmbH,Darmstadt,德国)和可控多孔玻璃(CPG，500A，ProligoBiochemieGmbH，Hamburg,德国)作为固相支持物。RNA和含有2'-0-曱基核苷酸的RNA分别采用相应的亚磷酰胺和2'-0-曱基亚磷酰胺通过固相合成产生(ProligoBiochemieGmbH,Hamburg,德国)。这些结构单元使用标准的核苷亚磷酰胺4匕学《列^口^口Currentprotocolsinnucleicacidchemistry,Beaucage，S.L.等人(编著)，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,NY,USA,中所述而掺入寡核糖核苷酸链的序列中的选定位点。硫代磷酸酯键通过用Beaucage试剂(ChruachemLtd,Glasgow,UK)在乙腈(1%)中的溶液替换缺氧化剂溶液来引入。进一步的辅助试剂从MallinckrodtBaker(Griesheim，德国)获得。粗制的寡核糖核苷酸的去保护和纯化根据已建立的方法通过阴离子交换HPLC实施。产量和浓度通过使用分光光度计测定各RNA溶液在波长260nm处的UV^及收来确定(DU640B，BeckmanCoulterGmbH，Unterschleifiheim，德国)。双链RNA通过在退火緩沖液(20mM磷酸钠，pH6.8;100mM氯化钠)中混合等摩尔的互补链溶液、在水浴中85-90°C加热3分钟、并在3-4小时的时间期间冷却至室温来产生。退火的RNA溶液储存在-2(TC直至使用。为了合成3，-胆固醇-缀合的siRNA(本文称为-Chol-3')，使用适当修饰的固体支持物来合成RNA。修饰的固体支持物如下制备2-氮杂丁烷-l,4-二羧酸二乙酯AA将4.7M氢氧化钠水溶液(50mL)加入到经搅拌的冰冷的甘氨酸乙酯盐酸盐(32.19g，0.23mole)在水中的溶液(50mL)。然后，加入丙烯酸乙酯(23.1g,0.23摩尔)，并在室温搅拌混合物直至通过TLC确^人反应完成。19小时之后，用二氯曱烷(3x100mL)分离溶液。有才几层用无水碌^酸钠干燥、并进行过滤和蒸发。蒸馏残余物来提供AA(28.8g，61%)。3-{乙氧基羰基甲基-[6-(9H-芴-9-基曱氧基羰基-氨基)-己酰基卜氨基}-丙酸乙酯AB<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>将Fmoc-6-氨基-己酸(9.12g，25.83mmol)溶解在二氯甲烷(50mL)中，并用冰冷却。在0。C向溶液中加入二异丙基碳二亚胺(3.25g，3.99mL，25.83mmol)。然后加入氮杂丁烷-1，4-二羧酸二乙酯(5g，24.6mmol)和二曱氨基吡咬(0.305g，2.5mmol)。将溶液升温至室温，并进一步搅拌6小时。通过TLC确定反应完成。在真空下浓缩反应混合物，并加入乙酸乙酯沉淀二异丙基脲。过滤悬浮液。滤液用5%含水的盐酸、5%的碳酸氢钠和水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠千燥、并浓缩来产生粗产物，并通过柱层析(50%的EtOAC/己烷)纯化来产生11.87g(88%)的AB。3-[(6-氨基-己酰基)-乙氧基羰基甲基-氨基j-丙酸乙酯ACoAC在0°C将3-{乙氧基羰基甲基-[6-(9H-芴-9-基曱氧基羰基氨基)-己酰基-氨基}-丙酸乙酯AB(11.5g，21.3mmol)溶解于20%在二曱基甲酰胺中的哌啶中。持续搅拌溶液l小时。在真空下浓缩反应混合物，并向残余物添加水，并用乙酸乙酯提取产物。粗产物通过转化成为其盐酸盐而进行纯化。3-({6-17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7,8，9，10，11，12,13，14,15，16，17-十四氢-lH-环戊[aj菲-3-基氧基羰基氨基1-己酰基}乙氧基羰基甲基-氨基)-丙酸乙酯AD〇〇AD将3-(6-氨基-己酰基)-乙氧基羰基甲基-氨基卜丙酸乙酯AC的盐酸盐(4.7g，14.8mmol)溶解在在二氯曱烷中。将悬浮液在冰上冷却至0°C。向悬浮液加入二异丙基乙胺(3.87g，5.2mL，30mmol)。向所得溶液加入氯甲酸48胆固醇酯(6.675g，14.8mmol)。搅拌反应混合物过夜。反应混合物用二氯曱烷稀释、并用10%的盐酸洗涤。产物通过快速层析纯化(10.3^92%)。1-{6國[17-(1,5-二曱基-己基)-10，13曙二甲基-2，3,4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16,17-十四氢-111-环戊[3菲-3-基氧基羰基氨基-己酰基}-4-氧代-吡咯烷-3-甲酸乙酯AE<formula>formulaseeoriginaldocumentpage49</formula>将叔丁醇钾(l.lg，9.8mmol)在30mL无水曱苯中淤浆化。混合物在水上冷却至0°C,并伴随搅拌在20分钟内緩慢加入5g(6.6mmol)二酉旨AD。在加入期间温度保持在5。C以下。继续在0。C搅拌30分钟，并加入lmL冰乙酸，随后立即加入4g在40ml水中的NaH2P04'H20。所得混合物每次用100mL二氯甲烷提取，提取两次，并且合并的有机提取物每次用10mL磷酸盐緩沖液洗涤，洗涤两次、干燥、并蒸发至干。将残余物溶解在60mL甲苯中，冷却至0。C，并用3份50mLpH9.5的冷碳酸盐緩沖液提取。将含水的提取物用磷酸调整为pH3，并用5份40mL的氯仿提取，并合并，干燥和蒸发至干。残余物通过柱色语用25%的乙酸乙酯/己烷纯化来提供1.9gb-酮酯(b-ketoester)(39%)。菲-3-基氧基羰基氨基I-己酰基L吡咯烷-3-基)酯AH<formula>formulaseeoriginaldocumentpage51</formula>将化合物AG(1.0g，1.05mmol)与琥珀酐(0.150g，1.5mmol)和DMAP(0.073g,0.6mmol)混合，并在真空中40。C干燥过夜。将混合物溶解在无水的二氯乙烷(3mL)中，加入三乙胺(0.318g，0.440mL，3.15mmol)，并在氩气下室温搅拌溶液16小时。然后将其用二氯甲烷(40mL)稀释，并用水冷的含水柠檬酸(5wt%，30mL)和水(2x20mL)洗涤。将有机相用无水硫酸钠干燥、并浓缩至干。残余物原样用于下一步。胆固醇衍生的CPGAI<formula>formulaseeoriginaldocumentpage51</formula>将琥珀酸酯AH(0.254g，0.242mmol)溶解在二氯曱烷/乙腈(3:2，3mL)的混合物中。相继向该溶液中加入在乙腈(1.25mL)中的DMAP(0.0296g，0.242mmol)和在乙腈/二氯乙烷(3:l，1.25mL)中的2,2，-二硫代-双(5-硝基吡啶)(0.075g，0.242mmol)。向所得溶液中加入在乙腈(0.6ml)中的三苯膦(0.064g，0.242mmol)。反应混合物变色为亮橙色。用手动振荡器简短搅拌溶液(5分钟)。加入长链烷基胺-CPG(LCAA-CPG)(1.5g，61mM)。搅拌悬浮液2小时。将CPG通过热压结的漏斗过滤，并相继用乙腈、二氯曱烷和醚洗涤。用乙酸酐/吡啶封闭未反应的氨基。完成的CPG加载通过采用UV测试来测定(37mM/g)。除了对胆固醇基衍生物的氧化步骤用Beaucage试剂进行以在核酸寡聚物5，-端引入硫代磷酸酯键夕卜，带有5，-12-十二烷酸二癸酰胺基(本文称为"5，-C32-")或5'-胆固醇基衍生基团(本文称为"5，-Chol-")的siRNA的合成如WO2004/065601中所述进行。实施例2:dsRNA表达栽体在本发明的另一方面，调节PIK4CB表达活性或PIK4CA表达活性的dsRNA分子由插入DNA或RNA栽体的转录单元表达(参见，例如Couture，A等人，TIG.(1996)，12:5-10;Skillern,A.等人，国际PCT公开号WO00/22113，Conrad,国际PCT公开号WO00/22114，和Conrad,美国专利号6,054,299)。这些转基因可以作为线性构建体、环状质粒、或者病毒载体引入，其可以掺入宿主基因组并作为整合入宿主基因组的转基因遗传。也可以将转基因构建为允许其作为染色体外的质粒遗传(Gassmann等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:1292)。dsRNA的各条链可以由在两个分开的表达载体上的启动子转录，并共转染入靶细胞。备选地，dsRNA的每条分别的链可以通过都定位在同一表达质粒上的两个启动子转录。在一个优选的实施方案中，dsRNA表达为通过接头多核苷酸序列连接的反向重复序列，如此以便dsRNA具有茎和环的结构。重组dsRNA表达栽体通常为DNA质粒或病毒载体。表达dsRNA的52病毒载体可以基于但不限于腺相关病毒(参见综述Muzyczka等人，Curr.TopicsMicro.Immunol.(1992)158:97-129))、腺病毒(参见例如Berkner等人，BioTechniques(1998)6:616)，Rosenfeld等人(1991，Science252:431-434)，和Rosenfeld等人(1992)，Cell68:143-155))、或曱病毒、以及本领域已知的其它病毒构建。逆转录病毒已经用于在体外和/或体外将多种基因引入许多不同的细胞类型，其中包括上皮细胞(参见，例如Eglitis，等人，Science(1985)230:1395-1398;Danos和Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)85:6460-6464;Wilson等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:3014-3018;Armentano等人，l朔，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6141-6145;Huber等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8039-8043;Ferry等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8377-8381;Chowdhury等人，1991，Science254:1802-1805;vanBeusechem.等人，1992,Proc.Nad.Acad.Sci.USA89:7640-19;Kay等人，1992，HumanGeneTherapy3:641-647;Dai等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10892-10895;Hwu等人，1993，丄Immunol.150:4104-4115;美国专利号4,868,116;美国专利号4,980,286;PCT申请WO89/07136;PCT申请WO89/02468;PCT申请WO89/05345;以及PCT申请WO92/07573)。能够转导和表达插入细胞基因组的基因的重组逆转录病毒载体可以通过将重组的逆转录病毒基因组转染入适当的包装细胞系例如PA317和Psi-CRIP来产生(Comette等人，1991,HumanGeneTherapy2:5-10;Cone等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6349)。重组的腺病毒载体可以用来感染易感宿主(例如大鼠、仓鼠、狗和黑猩猩)中大范围的多种细胞和组织(Hsu等人，1992，J.InfectiousDisease,166:769),并且也具有不需要感染有丝分裂活性的细胞的优点。在本发明的DNA质粒或病毒载体中驱动dsRNA表达的启动子可以是真核的RNA聚合酶I(例如核糖体RNA启动子)、RNA聚合酶II(例如CMV早期启动子或肌动蛋白启动子或UlsnRNA启动子)或者通常的RNA聚合53酶III启动子(例如U6snRNA或7SKRNA启动子)，或者原核启动子，例如T7启动子，条件是表达质粒也編码由T7启动子转录所需的T7RNA聚合酶。启动子也可以指导转基因表达至胰腺(参见例如用于胰腺的胰岛素调节序歹'J(Bucchini等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:2511-2515))。来精确调节，例如对某些生理调节剂例如循环的葡萄糖水平或激素敏感的调节序列(Docherty等人，1994，FASEBJ.8:20-24)。此类适合在细胞或哺乳素、孕酮、四环素、二聚作用的化学诱导剂、和异丙基-P-Dl-硫代吡喃半乳糖苷(EPTG)的调节。本领域技术人员能够基于dsRNA转基因的预期用途选择适当的调节/启动子序列。一般而言，能够表达dsRNA分子的重组载体如下文所述进行递送，并保持在靶细胞中。备选地，病毒栽体可以用来提供dsRNA分子的瞬时表达。此类载体可以根据需要反复施用。一旦表达，dsRNA就结合至耙RNA，并调节其功能或表达。dsRNA表达载体的递送可以是全身的，例如通过静脉内或肌内的施用，通过施用至自患者移出体外的靶细胞、并随后将粑细胞重新引入患者，或者通过任意其它允许引入目的靶细胞的方法。表达dsRNA的DNA质粒一般以与阳离子脂质载体(例如Oligofectamine)或基于非阳离子脂类的载体(例如Transit-TKOTM)的复合体转染入靶细胞。本发明也考虑了在一周或更长时间期间进行dsRNA介导的敲低的多次脂类转染，靶向PIK4CB基因的不同区域。向宿主细胞中成功引入本发明的载体可以使用多种已知方法来监测。例如，瞬时转染可以用报告基因作为信号，其中所述的报告基因例如荧光标记物，例如绿色荧光蛋白(GFP)。离体(exvivo)细胞的稳定转染可以用提供经转染细胞对特定环境因素(例如抗生素和药物)的抗性例如潮霉素B抗性的标记物来确4呆。PIK4CB和PIK4CA特异的dsRNA分子也可以插入载体，并用作人类患者的基因治疗载体。基因治疗载体可以通过例如静脉内注射、局部施用(参见美国专利5，328，470)或者通过立体定位(stereotactic)注射(参见，例如Chen等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3054-3057)来递送至受试者。基因治疗载体的药物制品可以包括在可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或者可以包含埋入了基因递送运载体的緩慢释放基质。备选地，当完整的基因递送运载体能够完全由重组细胞产生时，其中所述完整的基因递送运载体例如逆转录病毒载体，药物制品可以包括一种或多种产生基因递送系统的细胞。实施例3:鉴定PIK4CB和PIK4CA为HCV感染的必需宿主革巴基于siRNA递送系统的大规模转染用于鉴定PIK4CB靶和PI4KCA革巴。以前对该系统的描述(BorawskiJ,LindemanA，BuxtonF,LabowM,GaitherLA.在384孔形式中优化小干扰RNA转染的方法，JBiomolScreen.2007年6月；12(4):546-59.Epub2007年4月13日)在此处引用作为参考。在这种情况下，该系统使用经设计的HCV亚基因组复制子系统旨在鉴定对HCV复制必需的宿主蛋白质。使用激酶组(即，人类基因组的已知的激酶(Dharmacon(BoulderCO)))siRNA文库筛选Huh7亚基因组复制子细胞系(由Lohmann,V.等人(1999)Science.285:110描述)。该HCV亚基因组复制子系统允许使用稳定转染了修饰的HCV基因组(缺少结构蛋白质)的人类肝癌细胞(Huh7)来体外和体内研究HCV复制。HCV亚基因组复制子含有在新霉素选择标记下的与萤光素酶报告基因顺式的非结构蛋白基因。这种构建体设计用来体外稳定测量HCV复制子RNA水平和复制子活性。该研究的目的是使用siRNA筛选技术作为工具来鉴定新的在Huh7细胞中抑制亚基因组HCV复制子的宿主蛋白质。为此，筛选了一组779个靼向激酶组的siRNASmartPools,并发现和证实了HCV复制子的新的调节子。(SmartPool指以等摩尔浓度混合4种分别的siRNA，之后添加所述混合物到细胞)。确定了针对PIK4CB(磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽)或针对PIK4CA(磷脂酰肌醇4-激酶催化性a多肽)的siRNA能高效地抑制来自病毒复制子的萤光素酶的聚集。这些数据证实这种细胞蛋白质可用作抑制HCV复制的药物靶点。Huh7亚基因组复制子细胞系(本文也称为克隆A细胞)的构建是基于HCV基因组的。全长HCV基因组图解于图1A中。该9.6kb基因组是具有4种结构蛋白质和6种非结构蛋白质的正单链RNA病毒。复制子的突出特征是有效的复制子活性所需的5'和3，非翻译区。这种病毒能在体外复制，但需要特定的培养和i殳备才能产生感染病毒(ThomsonBJ，FinchRG.丙型肝炎病毒感染.ClinMicrobiolInfect.2005Feb;ll(2):86-94)。因此，将感染病毒改变以产生最小的病毒基因组，所述最小的病毒基因组能在不依赖产生感染颗粒的情况下体外复制。构建体显示于图IB中，HCV亚基因组复制子用于产生克隆A细胞(LohmannV,KornerF，KochJ，HerianU,TheilmannL，BartenschlagerR.，在肝癌细胞系中复制亚基因组的丙型肝炎病毒RNA，Science.1999年7月2日；285(5424):110-3)。在人类肝脏细胞中，这种病毒被高度优化以体外获取HCV复制子活性。该病毒不能产生感染性病毒颗粒，但是能在细胞浆中自我复制，这使它易于进行细胞培养研究以及高通量筛选。结构蛋白基因已用新霉素抗性基因和用于测量复制子活性的萤火虫萤光素酶报告基因替代。克隆Ar构建体由与亚基因组病毒相同的主链构成，但是已经移除了结构蛋白质(图1C)。这种细胞系用于测试siRNA是否能非特异地抑制萤光素酶活性或表达。将针对779种系统发育相关激酶的siRNASmartPool转染入克隆A(HCV亚基因组复制子)细胞中。针对pGL2萤光素酶的siRNA双链体用作阳性对照以抑制萤光素酶活性。细胞转染72小时，并使用Bright-Glo萤光素酶测定法来测量萤光素酶活性(BorawskiJ，LindemanA，BuxtonF，56LabowM，GaitherLA.在384孔形式中优化小干扰RNA转染的方法，JBiomolScreen.2007年6月；12(4):546陽59.Epub2007年4月13日)。发现了几种siRNA是萤光素酶活性的有效抑制剂，所述siRNA包括那些草巴向PIK4CB(NM—002651)和PIK4CA(NM—002650)的库。实施例4:PIK4CB和PIK4CAsiRNA活性的确认和测定来自筛选的命中目标的siRNA(siRNAhits)的确认通过一系列的步骤来完成，所述步骤包括分析多个独立的基因特异性siRNA，和将表型活性siRNA与mRNA敲低的效率相关联。为了首先确认命中目标的siRNA的特异性，测试了多个序列独立的siRNA的抑制萤光素酶活性的能力和不能影响细胞生存力这两者。也在克隆Ar(如图lc中与克隆A相似但缺少结构蛋白质)细胞中测试命中目标的siRNA以确认siRNA特异耙向复制子蛋白质和以复制子独立方式不抑制萤光素酶活性(或表达)。接下来的步骤是表型和RTPCR确认。分析了4个针对PIK4CB的独立siRNA和4个针对PIK4CA的独立siRNA敲低复制子活性的能力、对细胞生存力的影响和敲低靶基因mRNA水平的能力。该实施例中4吏用的siRNA示于表1和表2中。图2显示在克隆A测定中耙向PIK4CB和PIK4CA的dsRNA的结果。测试dsRNA的结果表示为分别的双链体PIK4CA1-PIK4CA4(柱1-4)、表示为PIK4CASmartPool(柱5)、表示为分别的双链体PIK4CB1-PIK4CB4(柱6-9)或表示为PIK4CBSmartPool(柱10)。转染细胞72个小时，并使用Bright-Glo萤光素酶测定法来测量萤光素酶活性(BorawskiJ，LindemanA,BuxtonF,LabowM，GaitherLA.在384孔形式中优化小干扰RNA转染的方法.JBiomolScreen.2007年6月；12(4):546-59.Epub2007年4月13日)。结果相对于GAPDH(对照；柱11)来测量，使用每孔25nM的dsRNA、克隆A细胞进行测定；Bright-Glo活性测量在转染后72小时进行。靼向GAPDH(柱ll)的dsRNA用作阴性对照和耙向pGL2(柱12)的dsRNA是阳性对照。图2的结果显示，相对于GAPDH而言，针对PIK4CB或PIK4CA的dsRNA能在克隆A细胞中降低至少20%和多达大约卯％的HCV复制子的表达(通过萤光素酶表达测量)。多种中间活性物得到了鉴定。其它数据证实，该测定法的dsRNA不阻碍细胞生存力，所述dsRNA也对克隆Ar测定法中的细胞不显示出显著的非特异性作用(数据没有显示)。图3A和图3B证实靼向PIK4CA的dsRNA对PIK4CA而非PIK4CB特异。图3C和图3D证实乾向PIK4CB的dsRNA对PIK4CB而非PIK4CA特异。使用实时PCR产生了图3的结果。在该方法中，将转染了siRNA的两孔合并在一起，并使用RNeasy96试剂盒(Qiagen#74182)分离mRNA。将制备物用DNA酶I处理两次、每次15分钟。使用HighCapacitycDNAArchive试剂盒(AppliedBiosystems#4322171)产生cDNA，并使用OligodT25(SigmaGenosys)引发RNA。补充有MgCl2(Ambion弁9530g)的PCR緩冲液(RocheM699105)如下10nll0x緩沖液、0.55^11MMgCl2、50uMoligodT25、4^1lOOmMdNTPs、lpl20U/plRNasIn、5|ul50，Multiscribe、12.45|il水、和66plRNA,总体积为lOOpl。使用内部设计的引物、(SigmaGenosys)使用Sybergreen在AppliedBiosystems7900HT(AppliedBiosystems#4329001)中对cDNA进行定量，PIK4CA(匪002650)正向GCCCTGTCTGAAGTGAAGGT，SEQIDNo.:417反向CTTTTGCAGCACTCTGCATC，SEQIDNo.:418在1662处跨过在1690处的内含子3006bp;在1774处，反向跨过在1690处的内含子3006bp;使用内部设计的针对PIK4CB(NM—002651)的引物、(SigmaGenosys)使用Sybergreen在AppliedBiosystems7900HT(AppliedBiosystems#432卯01)中对PIK4CB进4亍测量正向ATGGACAAGGTGGTGCAGATSEQIDNo.:419反向CCTCAGTCATGCTCATGTGGSEQIDNo.:420在2334到2452处跨过在2374处的内含子981bp。图3中，符号"sp"指术语SMARTpool。所述SMARTpool指在添加该混合物到细胞中前以等摩尔浓度混合4种分别的siRNA。在一个SMARTpool中，4种分别的siRNA以较低的相对浓度加入(即，50nM等摩尔浓度是SMARTpool中12.5nM的各分别的siRNA的浓度)。使用另一组针对PIK4CA(NM—002650，Dharmacon^D-006776)和PIK4CB(NM一002651，Dharmacon弁D-006777)的3种单独双链体来实现对靼的进一步确认。使用的siRNA如表1和表2中显示。各siRNA重悬于siRNA緩沖液中(Dharmacon,#B-002000-UB-015)以达到20pM的储备浓度。在96孔PCR板中，将2.5各储备溶液稀释到197.5Opti-Mem中以制备250nM工作液。将稀释于10juLOpti-Mem的0.20Dharmafectl转染试剂(Dharmacon,#T2001-03)加入96孔组织培养板(Costar，#3917)的各孔中。将10各siRNA工作液加入含有Dharmafectl的96孔板，并赙育20分钟以允许复合物形成。孵育后，将80测定培养基中的6000个Huh7HCV亚基因组复制子细胞加入每孔。孵育细胞72小时，并测定萤光素酶活性和细胞存活能力(如此前对图2的描述)。图4中，依据厂商说明书使用Taqman基因表达测定法(TaqmanGeneExpressionAssay)(AppliedBiosystems)验证各siRNA。长口前戶斤述,在96孔形式中，将siRNA转染入Huh7HCV亚基因组复制子细胞。使用RNeasy96试剂盒(Qiagen，#74182)分离mRNA。将重复孔的mRNA合并在一起，并使用SprintPowerscriptPreprimed96PlateOligo(dt)(ClontechLaboratories,#639557)来产生cDNA。在384孔形式中，使用预混合的Taqman探针和来自AppliedBiosystems的引物((PIK4CA(NM—002650，AppliedBiosystems#Hs01021073ml);PIK4CB(NM—002651，AppliedBiosystems#Hs00356327—ml))来定量cDNA。向384孔PCR板中每孔加入4.8cDNA(AppliedBiosystems,#4309849)。向每孑L的cDNA中加入0.6^L针对目标基因(GOI)的Taqman探针、0.6pLp-肌动蛋白对照探针(AppliedBiosystems,#4310881E)和62xPCRMasterMix(AppliedBiosystems,#4304437)。在AppliedBiosystems7900HT实时PCR系统(AppliedBiosystems,#432卯01)中运行反应。在图4A中，用PI4KAsiRNA转染细胞，并使用PI4KARTPCRTaqman探针和PI4KBRTPCRTaqman探针这两者来测量mRNA。在图4B中，用PI4KBsiRNA转染细胞，并使用PI4KARTPCRTaqman探针和PI4KBRTPCRTaqman探针这两者来测量mRNA。如图所示，所述siRNA特异地敲低了它们所指向的靶，并且没有交叉反应和抑制其它PI4KmRNA转录物或对照(GAPDH)。实施例5:抑制宿主和病毒蛋白质的表达在图5中，全细胞裂解物制备自转染了siRNA的Huh7HCV亚基因组复制子细胞或仅制备自稚细胞。图5中的结果使用的siRNA如表1和表2中那样命名。在每10ml裂解液含一片蛋白酶混合抑制剂片(Roche,#04693116001)的放射免疫沉淀緩冲液(RIPA)(BostonBioproducts，#BP-115)中裂解细胞。裂解物#^居厂商说明书，使用BCA蛋白质测定法(PierceBiotechnology,#23227)进行定量。等量裂解物上样于15%Tris-HCL凝胶(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA，#345-0019),并200V运行1小时。将凝胶转移至硝酸纤维素膜(Bio-RadLaboratories,#162-0232)100V1小时。将膜在5%奶(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA，#162-0232)、TBS-0.1。/。吐温(Bio-RadLaboratories,#170-6435，#161-0787)中封闭1小时。使用1:1000稀释于封闭緩沖液中的针对PIK4CB的小鼠单克隆抗体(BDBiosciences,#611817)或针对HCV蛋白质NS3的小鼠单克隆抗体60(Virostat，#1828)和作为上样对照的针对P-肌动蛋白的小鼠单克隆抗体(Sigma，St.Louis,MO，^A-5441)探测印迹1小时(针对PIK4CA的抗体未能获得)。用TBS-0.1%吐温(TBST)连续洗涤3次后，加入1:5000稀释于封闭緩沖液中的针对小鼠IgG的HRP-缀合的二次抗体(Sigma，#A4416)1小时。将该膜在TBST中洗涤3次，并使用SuperSignalWestFemto化学发光底物(Pierce,#34096)来显示免疫反应条带。由于PI4KA抗体未能获得，所以图5中仅检测了PI4KB蛋白质。图5中的结果显示，在Huh7细胞中，PI4KAsiRNA对PI4KB蛋白质水平没有影响，但是PI4KBsiRNA切除了PI4KB蛋白质。各测试的siRNA也显示出可测量的相对于对照而言的NS3(病毒)蛋白质产生的降低，因此确认对病毒复制能力的直接活性。使用与蛋白质敲低相关联的这些siRNA降低mRNA水平暗示这些人类蛋白质是HCV复制必需的。实施例6:使用短发夹RNA(shRNA)进行确认在图6中，订购的耙向PIK4CA(NM—002650)和PIK4CB(NM—002651)的短发夹RNAs(shRNA)为5种单独的SigmaMISSIONTMshRNA。耙向CD38(NM000732)、CD28(NM—006139)、CD29(NMJB3666)和GFP(U76561)的shRNA用作对抑制HCV复制的阴性对照(仅显示GFP数据)。所有shRNA序列如人类文库MISSIONtmTRC-Hsl.O.(人类)中的方式进行构建(MoffatJ.等人，针对人和小鼠基因的慢病毒RNAi文库用于排列的病毒的高容量筛选，Cdl,124，1283-1298.2006.;Stewart,S.A.等人，在原代细胞中通过RNAi进行慢病毒递送的稳定基因沉默，RNA，9,493-501(2003);ZuffereyR等人，体内繁殖减毒的慢病毒栽体达到有效的基因递送，Nat.Biotechnol.15,871-85(1997).;ZuffereyR等人，用作安全和有效的体内基因递送的自失活慢病毒载体，JVirol.,72，9873-80(1998))。该shRNA序列是与前述实验报道的siRNA不同的独立序列。表4显示了对应于表达的RNA链的DNA序列。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>为了测试shRNA，将6000个Huh7HCV亚基因组复制子细胞铺板于96孔组织培养板中。第二天，培养基用下述转导培养基替代，所述转导培养基含具有终浓度为8ug/ml的1，5-二曱基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(sigmaH9268)和终浓度为10mM的hepes(Invitrogen，#15630080)的测定培养基。将1shRNA病毒加入每孔，并将细胞在2100转/分钟室温离心90分钟。将细胞孵育24小时，并通过添加终浓度为2pg/ml的噤呤霉素(Sigma，#P9620)来选择细胞。然后，将细胞最少孵育72小时，并测定表型、通过蛋白质印迹和RT-PCR进行分析或增殖用于长期敲低研究。在图6A中，通过萤光素酶活性来测量HCV复制子表达，并归一化为转导细胞的GAPDHshRNA。使用PI4KATaqman探针(图6B)或PI4KBTaqman探针(图6C)的RTPCR来测量shRNA转导后的Huh7细胞中的PI4KA和PI4KBmRNA水平。使用与实施例5中相似的那些蛋白质印迹方法来测定PI4KB蛋白质水平和NS3蛋白质水平。在shRNA转导96小时后(图6D)和3周时(图6E)测量蛋白质水平。图6A中的结果显示涉及PI4KA或PI4KBshRNAs的shRNA能降低HCV复制子活性，所述结果通过萤光素酶活性测量并归一化为GAPDHshRNA转导细胞。图6B显示处理后PI4KAmRNA的相对水平。针对PI4KA的shRNA显示出相当大程度的敲低，然而仅一个耙向PI4KB的shRNA对PI4KA水平具有影响(大概由于高拷贝数和与PI4KA的低交叉反应性)。图6C显示针对PI4KA的shRNA对PI4KBmRNA水平没有影响，然而大多数耙向PI4KB的shRNA具有显著的PI4KB的敲低。图6D显示处理后96小时，针对PI4KA或PI4KB的shRNA成功地降低了NS3病毒蛋白质产生(且PI4KAshRNA并不下调PI4KB蛋白质水平)。图6E中的结果显示病毒蛋白质产生的敲低可持续至少3周。总而言之，PI4KAmRNA降低和NS3蛋白质水平之间存在明显的相关性，所述相关性表明细胞中的病毒载量受到了抑制。PI4KBmRNA和蛋白质降低和NS3蛋白质水平之间存在明显的相关性，所述相关性表明细胞中的病毒载量受到了抑制。实施例7:活病毒感染前或感染后的处理在这个实施例中，通过使用针对PIK4CA或PIK4CB的s股NA处理HCV感染前细胞(图7)或HCV感染后细胞(图8)来达到HCV复制的有效抑制。这个实施例也证实了mRNA敲低的剂量依赖。就这个实验而言，将针对PIK4CA和PIK4CB的siRNA(如表1和表2中所示的那样)重悬于siRNA緩冲液(Dharmacon,#B-002000-UB-015)中至20pM的储备浓度。在96孔PCR板(ABgene，#AB-1000)中，将3JUL各储备溶液稀释到197pLOpti-Mem中以制备300nM工作液。将siRNA在Optimem(InvitrogenCat#51985-034)中稀释为10x储液形式，并加入完全细胞培养基至25nM、1.5nM和O.lnM的终浓度。将0.20|uL的Dharmafectl转染试剂(Dharmacon,#T2001-03)稀释到10pLOpti-Mem中，并将其加入96孔组织培养板(Costar，#3917)的各孔中。将10各siRNA工作液加入含Dharmafectl的96孔板中，并孵育20分钟以允许复合物的形成。孵育后，将在100jaL测定培养基中的10000个Huh7.5细胞加入每孔中。孵育细胞24小时，然后用含海肾报告基因的JFH-1感染性HCV基因型2病毒进行感染。针对海肾的siRNA用作抑制海肾萤光素酶的阳性对照。活病毒感染前转染siRNA(图7)或病毒感染63后转染siRNA(图8)显示siRNA可阻断HCV病毒的摄取和复制这两者。收集一段时程的病毒上清来测量分泌自细胞的活病毒，这一点通过重新感染稚细胞的百分比来测定(图8B)。Huh7细胞中敲低的mRNA百分比通过RTPCR来确定(图7B)。我们使用了Huh7HCV复制子siRNA筛选，其中所述Huh7HCV复制子siRNA篩选鉴定了几种新的宿主因子，所述宿主因子对最佳复制子驱动的萤光素酶活性是必需的。这种筛选用于证实所述发现。这种筛选不直接测量病毒复制，而是认为萤光素酶表达水平是直接由病毒复制子的拷贝数决定的。图解于图7和图8中的实验表明此处描述的活性siRNA确实导致病毒RNA产生的降低。根据SmartPool激酶组筛选，已鉴定PIK4CB和PIK4CA为HCV和其它正链RNA病毒复制所必需的宿主因子。多种独立的靶向基因的siRNA可显著地降低萤光素酶水平，而对复制子细胞的细胞生存力没有影响。降低萤光素酶水平的siRNA也抑制各自靶基因的mRNA水平。因此，我们可以得出以下结论该研究中使用的siRNA是达到目标的，并通过降低它们的耙细胞基因来显著地调节HCV复制。不期望被任何具体的作用机制束缚来解释我们的发现，很明显这些发现的意义是多重的。PIK4酶类是内质网和高尔基体区室中的磷脂酰肌醇4磷酸产生所需要的。磷脂酰肌醇4磷酸的产生对维持高尔基体完整性、自高尔基体和内质网膜芽出小泡和调节肌醇1，4，5三磷酸的产生是需要的，所述肌醇1，4，5三磷酸是产生自中间物肌醇4,5二磷酸的必需信号分子(GodiA,PertileP，MeyersR，MarraP，DiTullioG,IurisciC，LuiniA,CordaD,DeMatteisMA.ARF介导磷脂酰肌醇4羟基激酶|5的招募和在高尔基体复合体上刺激磷脂酰肌醇4,5二石粦酸的合成，NatCellBiol.1999年9月；l(5):280-7)。虽然本文中的发现不期望被任何具体的作用机制束繂，但是基于HCV复制复合物的定位，可能能够将PIK4酶的活性与HCV复制联系起来。如果复制复合物需要完整的高尔基体和内质网膜，那么破坏PIK4酶和磷脂酰肌醇4磷酸产生可能会阻断合适的复制环境的形成。同时，已知PIK4酶调节神经酰胺和胆固醇通过高尔基体和内质网膜的运输和辅助脂我的形成(TothB，BallaA，MaH，KnightZA，ShokatKM，BallaT.，磷脂酰肌醇4-激酶调节神经酰胺在内质网和高尔基体之间的运输，JBiolChem.2006年11月24日；281(47):36369-77)。HCV复制复合物4艮可能需要脂膜筏来获得其有效活性。如果PIK4敲低也干扰了胆固醇和神经酰胺运输，那么其也可在抑制HCV复制中起作用(RidsdaleA，DenisM，GougeonPY，NgseeJK，PresleyJF，ZhaX，胆固醇对分泌性膜蛋白质的有效内质网到高尔基体运输是需要的，MolBiolCell.2006年4月；17(4):1593-605.)。最后，已鉴定了许多含有PIP(4，5)特异的PH结构域的蛋白质，并且这类蛋白质的定位似乎受PIK4酶调节。因此，PIK4的作用可能也包括重新定向细胞蛋白质或病毒蛋白质至复制部位。总而言之，我们已鉴定PIK4CB和PIK4CA是HCV复制所需的人宿主因子酶类，以及耙向这些基因的dsRNA是治疗HCV和其它正链病毒感染的合适治疗靶。本领域技术人员熟悉除本公开具体给出的那些方法和组合物以外的方法和组合物，这使得他们能够在后文所附的权利要求书的全部范围内实践本发明。权利要求1.用于在细胞中抑制磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少两个彼此互补的序列，并且其中有义链包含第一序列，且反义链包含第二序列，所述第二序列包含基本互补于编码PI4K的至少部分mRNA的互补区域，并且其中所述的互补区域长度短于30个核苷酸，并且其中所述dsRNA与表达所述PI4K基因的细胞接触后，抑制所述PI4K基因的表达。2.权利要求1所述的dsRNA,其中所述第二序列包含基本互补于编码人磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽(PIK4CB)的至少部分mRNA的序列。3.4又利要求2所述的dsRNA，其中所述第一序列和所述第二序列选自表l。4.权利要求2所述的dsRNA,其中所述dsRNA包含至少一个经f务饰的核苷酸。5.权利要求3所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一个经纟务饰的核苷酸。6.权利要求4或5所述的dsRNA,其中所述经修饰的核苷酸选自2，-0-甲基修饰的核苷酸、包含5，-硫代磷酸酯基团的核苷酸、和连接至胆固醇基衍生物或十二烷酸二癸酰胺基的末端核苷酸。7.^L利要求4或5所述的dsRNA，其中所述经-f'务饰的核苷酸选自2，-脱氧-2，-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、脱碱基的核苷酸、2，-氨基修饰的核苷酸、2，-烷基修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、包含氨基磷酸酯的核苷酸、和包含非天然碱基的核苷酸。8.权利要求4或5所述的dsRNA，其中所述第一序列选自表l，并且所述第二序列选自表l。9.权利要求1所述的dsRNA，其中所述反义链包含基本互补于编码人磷脂酰月几醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA)的至少部分mRNA的序列。10.权利要求9所述的dsRNA,其中所述第一序列和所述第二序列选自表2。11.4又利要求9所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一个经4务饰的核苷酸。12.权利要求10所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一个经修饰的核苷酸。13.权利要求11或12所述的dsRNA，其中所述经修饰的核苷酸选自2，-0-甲基修饰的核苷酸、包含5，-硫代磷酸酯基团的核苷酸、和连接至胆固醇基衍生物或十二烷酸二癸酰胺基的末端核苷酸。14.权利要求11或12所述的dsRNA,其中所述经修饰的核苷酸选自2，-脱氧-2，-氟修饰的核苷酸、2，-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、脱碱基的核苷酸、2，-氨基修饰的核苷酸、2，-烷基修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、包含氨基磷酸酯的核苷酸、和包含非天然碱基的核苷酸。15.权利要求11或12所述的dsRNA，其中所述第一序列选自表2，并且所述第二序列选自表2。16.包含权利要求1或9所述dsRNA的细胞.17.用于在生物体中抑制磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽(PIK4CB)基因表达的药物组合物，其包含dsRNA和可药用载体，其中所述dsRNA包含至少两个彼此互补的序列，并且其中有义链包含第一序列，且反义链包含第二序列，所述第二序列包含基本互补于编码PIK4CB的至少部分mRNA的互补区域，并且其中所述的互补区域长度短于30个核苷酸，并且其中所述的dsRNA与表达所述PIK4CB基因的细胞接触后，至少10%抑制PIK4CB的表达。18.权利要求17所述的药物组合物，其中所述dsRNA的所述第一序列选自表1，并且所述dsRNA的所述第二序列选自表1。19.权利要求18所述的药物组合物，其中所述dsRNA包含至少一个经修饰的核苷酸。20.用于在生物体中抑制磷脂酰肌醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA)基因表达的药物组合物，其包含dsRNA和可药用载体，其中所述dsRNA包含至少两个彼此互补的序列，并且其中有义链包含第一序列，且反义链包含第二序列，所述第二序列包含基本互补于编码PIK4CA的至少部分mRNA的互补区域，并且其中所述的互补区域长度短于30个核苷酸，并且其中所述的dsRNA与表达所述PIK4CA基因的细胞接触后，至少10%抑制PIK4CA的表达。21.4又利要求20所述的药物组合物，其中所述dsRNA的所述第一序列选自表2并且所述dsRNA的所述第二序列选自表2。22.4又利要求22所述的药物组合物，其中所述dsRNA包含至少一个经修饰的核苷酸。23.用于在细胞中抑制磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽(PIK4CB)基因表达的方法，所述方法包括(a)向细胞中引入双链核糖核酸(dsRNA),其中所述dsRNA包含至少两个彼此互补的序列，并且其中有义链包含第一序列，且反义链包含第二序列，所述第二序列包含基本互补于编码PIK4CB的至少部分mRNA的互补区域，并且其中所述的互补区域长度短于30个核苷酸，并且其中所述的dsRNA与表达所述PIK4CB基因的细胞接触后，至少40%抑制所述PIK4CB的表达；和(b)维持步骤(a)产生的细胞一段足够的时间，以获得PIK4CB基因的mRNA转录物的降解，从而在细胞中抑制PIK4CB基因的表达。24.用于在细胞中抑制磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽(PIK4CA)基因表达的方法，所述方法包括(a)向细胞中引入双链核糖核酸(dsRNA),其中所述dsRNA包含至少两个彼此互补的序列，并且其中有义链包含第一序列，且反义链包含第二序列，所述第二序列包含基本互补于编码PIK4CA的至少部分mRNA的互补区域，并且其中所述的互补区域长度短于30个核苷酸，并且其中所述的dsRNA与表达所述PIK4CA基因的细胞接触后，至少40%抑制所述PIK4CA的表达；和(b)维持步骤(a)产生的细胞一段足够的时间，以获得PIK4CA基因的mRNA转录物的降解，从而在细胞中抑制PIK4CA基因的表达。25.治疗由正链RNA病毒感染介导的病理过程的方法，所述方法包括向需要此种治疗、预防或管理的患者施用治疗有效量或预防有效量的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少两个彼此互补的序列，并且其中有义链包含第一序列，且反义链包含第二序列，所述笫二序列包含基本互补于编码磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽(PIK4CB)的至少部分mRNA的互补区域，并且其中所述的互补区域长度短于30个核苷酸，并且其中所述的dsRNA与表达PIK4CB基因的细胞接触后，抑制PIK4CB的表达。26.权利要求25所述的方法，其中所述正链RNA病毒选自丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)和登革病毒。27.治疗由正链RNA病毒感染介导的病理过程的方法，所述方法包括向需要此种治疗、预防或管理的患者施用治疗有效量或预防有效量的dsRNA,其中所述dsRNA包含至少两个彼此互补的序列，并且其中有义链包含第一序列，且反义链包含第二序列，所述第二序列包含基本互补于编码磷脂酰月几醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA)的至少部分mRNA的互补区域，并且其中所述的互补区域长度短于30个核普酸，并且其中所述的dsRNA与表达PIK4CA基因的细胞接触后，抑制PIK4CB的表达。28.权利要求27所述的方法，其中所述正链RNA病毒选自丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)和登革病毒。29.抑制磷脂酰肌醇4-激,化性p多肽(PIK4CB)基因在细胞中表达的载体，所述载体包含有效连接至编码dsRNA的至少一条链的核普酸序列的调节序列，其中所述dsRNA的一条链基本互补于编码PIK4CB的至少部分mRNA,并且其中所述dsRNA长度短于30个碱基对，并且其中所述dsRNA与表达PIK4CB基因的细胞接触后，抑制PIK4CB的表达。30.包含权利要求29所述载体的细胞。31.抑制磷脂酰肌醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA)基因在细胞中表达的载体，所述载体包含有效连接至编码dsRNA的至少一条链的核苷酸序列的调节序列，其中所述dsRNA的一条链基本互补于编码PIK4CA的至少部分mRNA，并且其中所述dsRNA长度短于30个碱基对，并且其中所述dsRNA与表达PIK4CA基因的细胞接触后，抑制PIK4CA的表达。32.包含权利要求31所述载体的细胞。33.用于在细胞中降低磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽(PIK4CB)基因表达水平的双链核糖核酸(dsRNA),其中所述dsRNA包含至少两个彼此互补的序列，并且其中有义链包含第一序列，且反义链包含第二序列，所述第二序列包含基本互补于编码PIK4CB的至少部分mRNA的互补区域，并且其中所述的dsRNA与表达PIK4CB基因的细胞接触后，降低PIK4CB的表达水平。34.权利要求33所述的dsRNA,其中所述的接触至少40%降低PIK4CB的表达水平。35.权利要求33所述的dsRNA，其中所述的接触在体外以30nM或更低进行。36.用于降低生物体中PIK4CB的表达水平的药物组合物，其包含权利要求33所述的dsRNA和可药用载体。37.治疗正链RNA病毒感染的方法，所述方法包括向需要此种治疗的患者施用治疗有效量的权利要求33所述的dsRNA。38.权利要求37所述的方法，其中所述正链RNA病毒选自丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)和登革病毒。39.用于在细胞中降低磷脂酰月几醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA)基因表达水平的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少两个彼此互补的序列，并且其中有义链包含第一序列，且反义链包含第二序列，所述第二序列包含基本互补于编码PIK4CA的至少部分mRNA的互补区域，并且其中所述的dsRNA与表达PIK4CA基因的细胞接触后，降低PIK4CA的表达水平。40.权利要求39所述的dsRNA，其中所述的接触至少40%降低PIK4CA的表达水平。41.冲又利要求39所述的dsRNA,其中所述的接触在体外以30nM或更低进行。42.用于降低生物体中PIK4CA的表达水平的药物组合物，其包含权利要求39所述的dsRNA和可药用载体。43.治疗正链RNA病毒感染的方法，所述方法包括向需要此种治疗的患者施用治疗有效量的权利要求39所述的dsRNA。44.权利要求43所述的方法，其中所述正链RNA病毒选自丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)和登革病毒。45.dsRNA，其选自表1列出的那些dsRNA。46.包含权利要求45所述的dsRNA的药物组合物。47.dsRNA，其选自表2列出的那些dsRNA。48.包含权利要求47所述的dsRNA的药物组合物。49.包含多种dsRNA的药物组合物，其中至少一种dsRNA选自表1列出的那些dsRNA，并且至少一种dsRNA选自那些具有下述反义链的dsRNA，其中所述反义链包含具有基本互补于编码正链RNA病毒的至少部分mRNA的区域的核苷酸序列。50.权利要求49所述的药物组合物，其中所述正链RNA病毒选自丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)和登革病毒。51.权利要求49所述的药物组合物，其中每一dsRNA包含至少一个经修饰的核苷酸。52.包含多种dsRNA的药物组合物，其中至少一种dsRNA选自表2列出的那些dsRNA,并且至少一种dsRNA选自那些具有下述反义链的dsRNA，其中所述反义链包含具有基本互补于编码正链RNA病毒的至少部分mRNA区域的核苷酸序列。53.斥又利要求52所述的药物组合物，其中所述正链RNA病毒选自丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)和登革病毒。54.权利要求52所述的药物组合物，其中每一dsRNA包含至少一个经修饰的核苷酸。55，药物组合物，其包含a)至少一种选自表1和表2列出的那些dsRNA;和b)选自i)完全包封的脂质体；ii)脂类复合体；和iii)多聚体的递送形式。56.权利要求55所述的药物组合物，其中每一dsRNA包含至少一个经修饰的核苷酸。57.权利要求55所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含多种选自表1和表2列出的那些dsRNA。58.治疗HCV感染的方法，所述方法包括向需要此种治疗的患者施用治疗有效量的^又利要求17、20或55所述的药物组合物。59.治疗由正链RNA病毒感染的方法，所述方法包括向需要它的患者施用选择性抑制磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)的活性的化合物。60.权利要求59所述的方法，其中所述化合物选自dsRNA、DNA反义DNA、核酶或编码上述的DNA载体。61.权利要求60所述的方法，其中所述化合物是dsRNA。62.权利要求61所述的方法，其中所述化合物是权利要求2或权利要求9所述的dsRNA。63.权利要求62所述的方法，其中所述化合物是具有选自SEQIDNo.l至SEQIDNo.416的SEQIDNO.的dsRNA。全文摘要本发明涉及靶向磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)的基因表达的双链核糖核酸(dsRNAs)，尤其涉及靶向人磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB)或人磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽(PIK4CA)的双链核糖核酸(dsRNAs)，并涉及它们用于治疗由正链RNA病毒如丙型肝炎病毒(HCV)所致感染的用途。每一dsRNA包含具有这样的核苷酸序列的反义链，所述核苷酸序列长度短于30个核苷酸、通常长19-25个核苷酸，并且基本互补于PIK4CB靶mRNA或PIK4CA靶mRNA的至少一部分。许多这样的dsRNA可用于提供治疗益处。本发明也涉及包含dsRNA和可药用载体的药物组合物，并且包括递送形式如完全包封的脂质体或脂类复合体。文档编号A61K31/713GK101688206SQ200880023497公开日2010年3月31日申请日期2008年7月4日优先权日2007年7月5日发明者J·博劳斯基,L·A·该赛,M·A·拉博申请人:诺瓦提斯公司