专利名称：用于修复、增强或替代骨的可植入材料及其制备方法
用于修复、增强或替代骨的可植入材料及其制备方法
背景技术：
本发明大体上涉及可植入材料及其制备方法。该材料例如可在整形外科应用中用 于修复、增强或替代一种或多种骨的几乎全部或部分，或用作骨移植物的替代物。
背景技术：
除非下文指明，否则术语‘丝心蛋白’用于一般性表示茧丝的主要结构蛋白，无论它们 是来自桑蚕、家香Bombyx 、转基因蚕，还是来自任何野蚕，包括但不限于，生产蒙加 丝、蓖麻蚕丝或柞蚕丝的那些。此外，术语‘丝’用于表示蚕分泌的天然细纤维，其包含两种主要蛋白质，丝心蛋白 和丝胶蛋白，丝心蛋白是丝中的主要结构材料，而丝胶蛋白是围绕丝心蛋白并在茧中将这 些纤维粘结在一起的材料。‘蚕茧’用于表示蚕幼虫纺成的在蛹期起保护作用的丝壳。术语‘骨修复’表示用于修复骨的任何方法，包括使用作为替代物的材料用于骨移 植的那些。术语‘骨增强’表示用于增加或构建骨的任何方法的应用。术语‘骨替代’表示用于替代现有的骨的任何方法的应用。术语‘聚合物’用于表示所有包含一种或多种单体单元的链的大分子并包括高分 子蛋白。有大量损伤和病症需要手术干预，以修复、增强或替代一种或多种骨的几乎全部 或部分。这些病症包括例如创伤性骨折、骨不连合、骨囊肿、临界性骨缺损、在骨/假肢接口 上的假肢松动和骨上的恶性肿瘤。在历史上，这些病症中的许多只能通过使用来自骨的材料的自体移植(将组织从 同一个体身体的一部分移植到另一部分，也称为自身移植)，或同种异体移植(将器官或组 织从一个个体移植到同种而不同基因型的另一个体，也称为异源移植(allogeneic graft) 或同种移植)而得以修复。自体移植是目前用于骨修复的受亲睐的选项。然而，自体移植存在若干相关问题， 包括外科采集手术(surgical harvesting procedure)的高成本以及疼痛和采集部位经历 的病态。例如，从髂嵴(患者髋骨的突出骨部分)采集移植物，对于采集操作和额外住院费 用而言，每次手术可花费$1，000至$9，000。当在采集部位经历病态时，症状包括疼痛、感 染、神经损伤和失血，后者常需要与血源性感染危险相关的输血。可采集的骨组织的数量是 有限的并且可能质量差，尤其是在骨质疏松患者中。采集自尸体的同种异体移植材料通过消除供区病态和供应受限的问题而避免 了自体移植的某些缺陷，正如Burkuss，J. K. Q002)在他的论文〃New Bone Graft Techniques and Applications in the Spine (新的骨移植技术和在脊柱中的应用)〃载 于Medscape today (http://www.medscape.com/viewarticle/443902)中所描述的。然而， 采用同种异体移植存在着自体移植所没有的额外危险和问题。在同种异体移植中，因为组 织得自供体，因此存在疾病从供体传播给受体的危险，并且已经证明HIV/肝炎可通过同种异体移植而传播。另外，同种异体移植物和同种异体植入物是非细胞的并且不如自体移植 成功和可预测，其原因在于免疫原性和缺乏可成为成骨细胞的活细胞。因为自体移植和同种异体移植的这些缺陷，所以一直在努力寻找合适的骨 修复材料(BRM)用作自体移植物和同种异体移植物的替代物。然而，BRM尚不能取 代自体移植物，因为在过去，它们一直无法完全达到5个主要标准承重力；骨传导性 (osteoconductivity)；骨诱导性(osteoinductivity)；再吸收能力(正如 Rose, F. R. A. J.禾口 Oreffo, R. 0. C. (2002)在他们的论文"Bone Tissue Engineering: Hope vs Hype.(骨组织工程希望还是骗局)〃发表于Biochem. Biophys. Res. Commun 292, 1-7 中所述)；和在手术室中易于使用。在手术室中易于使用是相当重要的，许多人工BRM都无 法满足这一点。理想的是，需要BRM能够具有完全的和立即的承重。在本文中，承重可定义为BRM 保持其机械完整性而没有过度变形的能力，当承受正常的日常生活过程中施加于其上的 力，而不依靠第二支持结构(例如钉、板、外固定器和石膏模(cast))时。此外，立即承重 (immediate load bearing)可定义为在患者从麻醉中恢复时修复承受满负荷的能力。使BRM能立即承重的材料性能取决于BRM植入部位，但还包括良好的压缩刚度 (compressive toughness)、良好的压缩强度、良好的压缩弹性模量和与已有骨之间的良好 的界面性能。显而易见，立即承重的最低要求就是，材料的强度和刚度与植入部位上的健康 骨相匹配。此外，通常知道，BRM需要非常接近地模拟骨性能，以防止局部应力高度集中或 应力遮挡(stress shielding)，这两者都可能对邻近植入BRM的天然骨具有不利影响。因 此，最好是采用正常骨的机械性能作为承重BRM的目标值。刚度提供对骨折的抵抗力并且在骨中是格外重要的。刚度的测量单位是焦耳每 立方米(JnT3)。测量骨刚度有若干方法，所得值在一定程度上取决于所用的方法和样品负 荷的准确条件。然而，对于健康的35岁的中骨干股骨(mid-diaphyseal femur)，骨折方法 (fracture method)、冲击带缺口骨的方法(the impact of notched bone method)禾口 J-积 分方法的工作都给出类似的结果，分别为3. 9 kj m_3、2.0 kj m_3和1.3 kj m_3 (公开于 Zioupos, J.在砠白勺论文"Ageing human bone: factors affecting its biomechanical properties and the role of collagen (老化人骨影响其生物力学性能的因素和胶原 的作用)〃发表于 Journal of Biomaterials (applied) (2001) 15，187-231)。此外， 在以下研究中提供了骨刚度约1 kj m_3的值=Ashby, MF ；Gibson, LJ ；ffegst, U ；和Olve, R.在其论文中，发表于Proceedings of the Royal Society, Mathematical and Physical Sciences (1995)，450，123-140。因此，通过J-积分方法测量的目标压缩刚度1. 3 kj m_3 对于承重BRM是合适的。正常人的松质骨的压缩强度表现出相当大的变异，但通常约为5Mpa，尽管在 骨质疏松骨中可低至 2Mpa 以下(TogawEi, D. Kayanja, Μ. Μ.，和 Lieberman, I. H. (2005), "Percutaneous Vertebral Augmentation (透皮脊椎增强作用)〃载于 The Internet Journal of Spine Surgery 1, (2), http://www.ispub.com/ostia/index. php xmlFiIePath=journals/ijss/volln2/vertebral. xml)。压缩强度约10-160 Mpa的皮质骨(cortical bone)比松质骨要强得多(Cowin, S.编著(1989) "Bone Biomechanics". CRC Press, Boca Raton 和 Duck, F. A. (1990)"Physical Properties of Tissue: A comprehensive Reference Book", Academic Press, London)。尽管皮质骨通常比下面的小梁骨薄得多，但是它对整个骨的机械性能作 出重要贡献，占股骨颈(femoral neck)的约60%的弯曲强度和锥体(vertebral body)约 10%的压缩强度(Werner等，1988)。因此目标压缩强度约20 Mpa对于承重BRM是合适的。BRM与骨的压缩弹性模量的大致匹配对于防止高应力积累和应力遮挡也是重要 的。皮质骨的弹性模量为12-18 Gpa，而松质骨则为0. 1-0. 5 GPa (Rezwana, K. ；Chena, Q. Z. ；Blakera, J. J. ；Boccaccini, A. R. , (2006), "Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering (用于骨组织工程学的可生物降解的和生物活性多孔聚合物/无机复合支架).“载于 Biomaterials, 27 3413-3431)。因为BRM植入物的大部分将会与松质骨而非皮质骨接触， 所以0. 1-0. 5 Gpa的压缩弹性模量对于BRM而言是合适目标。固体羟基磷灰石、生物玻璃或玻璃-陶瓷混合物都比骨头硬得多，而多孔羟基磷 灰石的硬度却相对小得多，公开于上述所引用的Rezwami，K Q006)。通常知道，矿物密度在矿化复合物中是压缩强度和压缩弹性模量的重要决定 因素。因此，小梁骨的压缩强度和压缩弹性模量大致上随其密度的平方的增加而增加 (Carter, D. R.禾口 Hayes, W. C. , (1976)在论文〃Bone compressive strength: the influence of density and strain rate (骨压缩强度密度和应变率的影响)“发表于 Science 194，1174-1176)。对于陶瓷复合BRM和含矿物的复合BRM而言，这也成立。因此， 从机械的观点来看，非常希望使复合BRM高度矿化。除了机械性能应与骨匹配的需要之外，BRM需要具有骨传导性。骨传导性通常定 义为成骨细胞(osteogenic cell)通过BRM移植之后立即建立的血纤蛋白凝块而迁移到材 料表面的过程。这种成骨细胞通过凝块的迁移造成瞬时血纤蛋白基质的凝缩。因此，重要 的是，血纤蛋白基质良好固定于材料上，因为如果不这样的话，当成骨细胞开始沿血纤蛋白 纤维迁移时，伤口收缩就可将血纤蛋白与材料分开。先前已经证明，与光滑表面相比，粗糙 表面会与血纤蛋白基质结合得更好，因此将有助于成骨细胞向材料表面的迁移。因此，通常可接受的是，对骨传导性而言重要的因素如下
(i)具有足够大小的孔隙的连通多孔结构，以允许骨形成细胞迁移，而阻止其它组织 和不需要的细胞种类的迁移；
(ii)提供一些足够大小的孔隙，以允许血管向内迁移；
(iii)维持合适的血管形成环境(vascularisedenvironment)，用于骨细胞分化；
(iv)为了骨细胞的粘附和功能提供合适的表面；和 (ν)粗糙表面，以结合血纤蛋白基质。因此，非常需要多孔结构，以使细胞和新血管能定殖在多孔BRM的内部。认为允 许细胞进入的最小孔径是100 μ m，但300 μ m的孔径可促进血管生成和新骨形成，而较小 孔隙有助于低氧条件和骨生成之前的软骨形成(Karageorgiou，V. ；Kaplan, D. (2005), "Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis (3 维生物材料支架的孔隙 和骨生成)〃载于Biomaterials，26，(27)，474M91)。然而，更大的孔径和孔隙率对BRM 的压缩强度、压缩弹性模量和压缩刚度具有负面影响。一系列方法已经用于在材料中产生多向互通孔隙，所述方法包括热诱导相分离(thermally induced phase s印aration)、冷冻、溶剂流铸、颗粒浸提、超临界气体发泡、再 吸收单丝 参人(incorporation of resorbable monofilament)、微球体烧结(sintering of microsphere)和固体游离形态涂层(solid free form coating )。许多已提出的BRM 或完全缺乏孔隙或具有对于最佳骨传导性而言的大小不合适的孔隙。骨诱导性通常定义为诱导非分化干细胞或骨原细胞(osteoprogenitor cell)分 化为成骨细胞的能力。对骨诱导性的最简单测试就是在通常不形成骨的组织位置(例如肌 肉)上诱导骨形成的能力(异位骨生长)。某些同种异体移植替代物是骨诱导性的，大概 是因为结合生长因子。某些磷酸钙矿物是骨诱导性的，可能是因为它们从组织液中吸附和 浓缩骨生长因子。公知的是，通过将生长因子例如rhBMP-2添加到BRM中，可使各种各样的 BRM为骨诱导性的。公知的是，非常期望BRM是完全可再吸收的，以允许BRM完全替代内源组织。还公 知的是，在承重BRM中，需要半再吸收时间(half-resorption time)非常缓慢，也许是约9 个月，为置换组织获得完全的强度和刚度提供时间，以便从BRM接管承重。基于乳酸、乙醇 酸、对二氧环己酮(dioxanone)、三亚甲基碳酸酯和己内酯的单体或这些单体组合的合成聚 合物再吸收太快并且具有可能是刺激物的酸性分解产物。目前，市场上没有现有产品能满足上述所引用的Rose和Oreffo (2002)的论文所 陈述的理想BRM的主要标准。包含矿物和树脂复合物、生物玻璃或金属的现有的承重BRM 不能被吸收并且永久地留在移植部位原位。通常可接受的是，这可引起导致高应力集中的 模量错配和导致骨再吸收的应力分离(stress shedding)。这可引起植入物松动并因此导 致植入物与内源组织完全整合的失败。不可再吸收的植入物材料也可作为感染灶和刺激 灶。不可再吸收的骨植入物的最终机械故障需要通过外科手术来替换，导致伴发疼痛、感染 危险和更多的费用。含有磷酸钙的材料距达到可接受的同种异体移植标准还有很大差距，所述标准陈 述于Tas，Α. C，"Participation of calcium phosphate bone substitutes in the bone remodeling process: Influence of materials chemistry and porosity (憐酸 丐骨替 代物参与骨重塑过程材料化学和孔隙的影响)"，发表于Euro Ceramics Viii, Pts 1-3, 2004 ；第 264-268 卷，第 1969-1972 页。非承重BRM在整个愈合期(在某些情况下超过6个月)需要第二支持机制，以允 许将断裂的表面与移植物成功连接。非承重材料仅用于不需要承重的极少数情况。WO 2005/094911A2公开了在丙烯酸类基质或交联蛋白质基质中包含一种或多 种丝成分的复合材料。所述丝成分是由一组丝制备，所述成分由家蚕丝、野蚕丝、蜘蛛曳 引丝(spider dragline silk)和由重组丝蛋白或蛋白类似物纺成的丝组成。该复合材 料尤其可用于手术移植物。所公开的丝心蛋白质基质由按照广泛接受的作为制备再生丝 心蛋白的‘标准程序’制备的再生丝心蛋白来制备，所述标准程序公开于文献(Chen，X.， Knight, D. P. , Shao, Ζ. Ζ.,禾口 Vollrath, F. (2001) "Regenerated Bombyx silk solutions studied with rheometry and FTIR (用电、流测定和FTIR研究再生家蚕丝溶 液)〃 Polymer, 42，9969-9974)。制备再生丝心蛋白溶液的标准程序包括在热的(通常 IOO0C )碱性溶液中脱胶和在热的9M至9. 5M溴化锂溶液中溶解超过M小时的时间。已经 发现，制备再生丝心蛋白的标准程序导致强度、刚度和硬度不足以赋予立即和完全的承重。
WO 2007/020449 A2公开了具有生物相容的、生物可再吸收的三维丝或其它纤维 层和生物相容的、生物可再吸收的实质上多孔的基于丝的或其它的水凝胶的软骨组织修复 设备，该水凝胶可部分或完全填充纤维层的间隙，用或不用将该设备稳固锚定在患者骨上 的整合装置。该申请公开了酰化剂(包括脂族和双功能异氰酸酯、异氰酸月桂酯或六亚甲 基二异氰酸酯在增加材料疏水性中的用途。PCT/IB2009/051775公开了可植入材料及其制备方法，其中所述材料是从优化的 再生丝心蛋白溶液制备的。所述可植入材料可用于替代、部分替代、修复或增强人软骨。 所述可植入材料具有在10%应变下为0. 3-5. 0 Mpa的无侧限压缩正切模量(unconfined compressive tangent modulus)，至多20 Mpa的极限压缩强度(屈服点应力)，是实质上回 弹的(resilient)，具有孔径范围为20-1000 μ m的多向互通孔并且是缓慢可再吸收的。用于交联蛋白质(包括丝心蛋白丝线)的芳族异氰酸酯的无水吡啶溶液首次公 开于 Fraenkel-Conrat, H. ；Cooper, Μ. ；Olcott, H. S. 1945, "Action of Aromatic Isocyanates on proteins (芳族异氛酸酉旨对蛋白质的作用)〃，Journal of the American Chemistry Society, 67，314。该说明书建立在以下工作上Farnworth, Α. (1955)， "The Reaction Between Wool and Phenyl isoCyanate (羊毛与异氰酸苯酯之间的反应)" Biochemistry Journal, 59，529，其广泛地公开了异氰酸苯酯的无水吡啶在交联羊毛中 的用途。最近，Arai,T, Ishikawa, H. , Freddi, Winkler, GS 禾口 Tsukack, M (2001) 已经调查了不同异氰酸酯对天然丝心蛋白丝线的交联作用，"Chemical modification of Bombyx mori silk using isocyanates (使用异氰酸酯进行家蚕丝的化学改性)〃， Journal of Applied Polymer Science, 79，1756-1763。先将纤维在二甲亚砜或二甲基 甲酰胺中溶胀，然后用异氰酸酯在相同溶剂中处理。不同异氰酸酯对纤维量有不同程度的 增加，而拉伸强度与纤维量增加成比例地稍微下降。用异氰酸苯酯的二甲亚砜以不同的时 间段处理丝线，实际上导致拉伸强度和断裂伸长率的明显和逐步降低。因此，本领域技术人 员将不指望实际降低丝纤维拉伸强度和硬度的试剂可用于增加由再生丝心蛋白制备的多 孔材料的压缩强度和硬度。US 6，902，932公开了具有钢缆几何学的基于丝纤维的基质用于离体产生韧带或 腱，尤其是前交叉韧带，以植入到有需要的受体中。该文件进一步公开了接种多潜能细胞的 基于丝纤维的基质，所述细胞可在基质上增殖和分化，离体形成韧带或腱。也公开了生物工 程韧带，其包括接种有多潜能细胞的基于丝纤维的基质，所述细胞在基质上增殖和分化而 形成韧带或腱。最终也公开了用于离体产生包含基于丝纤维的基质的韧带或腱的方法。该 材料是设计用作细胞支架的，当用于骨修复时不能承重。US 2006/0095137公开了可含有陶瓷的无纺丝心蛋白纤维。该材料可用于经引导 的骨组织再生。该材料仅可用于引导骨组织再生，不能用作承重BRM。该材料在植入时极不 可能是承重的，而且没有表明承重能力的证据。US 2007/0187862公开了通过针对吸湿聚合物反渗析而浓缩的丝心蛋白溶液的用 途和使用盐颗粒和/或通过向溶液中通气鼓泡而产生泡沫。US 2007/0187862,W02005/012606.EP1613796 和 CA2562415 公开了可含有合适信 号因子包括骨形态发生蛋白的多孔丝心蛋白支架，所述支架中可接种骨基质细胞。本发明
9的一方面，可将三维多孔丝支架本身植入体内并作为骨的组织替代物而起作用。然而，不能 认为该材料在植入时可以承重而且没有表明承重能力的证据。因此，本发明的目的是提供可植入的骨修复、增强或替代材料以及制备所述材料 的方法，其中所述材料具有改进的机械性能。本发明的另一目的是提供用于完全或部分替代、增强或修复骨的植入物。发明概述
根据本发明的第一方面，提供从丝心蛋白溶液制备用于修复、增强或替代骨的可植入 材料的方法，所述方法包括以下步骤 -从所述丝心蛋白溶液制备凝胶；和
-通过使所述凝胶经历一个或多个冷冻和融化该凝胶的步骤而制备材料， 其中从所述丝心蛋白溶液制备所述凝胶的步骤是在磷酸盐离子存在下进行的。在从丝心蛋白溶液制备凝胶的步骤之前，可将磷酸盐离子分散在丝心蛋白溶液 中。从丝心蛋白溶液制备凝胶的步骤可包括用碱性溶液处理丝心蛋白溶液。优选磷酸盐离 子在丝心蛋白溶液中的分散包括中性PH的含水缓冲液中的磷酸盐离子。最优选从丝心蛋白溶液制备凝胶的步骤包含含有磷酸盐离子的胶凝剂。当使用调 节至碱性PH的磷酸二氢钠含水缓冲液使丝心蛋白溶液胶凝时，观察到特别好的结果。从丝心蛋白溶液制备凝胶的步骤可包括例如使所述溶液经历微波辐射、声、次声 或超声、激光辐射机械剪切或快速拉伸流(rapid extensional flow)或酸性溶液或蒸汽。从丝心蛋白溶液制备凝胶的步骤可在例如温度范围为约0°C至约30°C的任何合 适温度下，进行例如约2小时的时间，其中从丝心蛋白溶液制备凝胶的步骤是对Visking袋 (visking bag)中的20ml丝心蛋白溶液用围绕该袋的0. 9 M磷酸二氢钠溶液进行的。可根据所需胶凝渗透深度来决定胶凝时间。上述方法可包括在从丝心蛋白溶液制备凝胶的步骤之前，将骨锚定设备(bone anchoring device)的一端插入丝心蛋白溶液中。骨锚定设备可包括多个编织或缠绕的纤 维或丝线、或缆索。凝胶的冷冻可在例如温度范围为约-1°C至约_120°C的任何合适温度下进行。优 选在温度为约-10°C至约-30°c范围内进行冷冻。例如，当冷冻在约-13°C的温度下进行时 得到良好结果。可进行多次冷冻和融化循环，以增加孔隙直径。在-13°C至多5次冷冻/融化循 环，观察到良好的孔径。在用异氰酸酯处理材料之前，可用钙离子处理所述材料以形成丝心蛋白-磷灰 石。丝心蛋白-磷灰石的形成可包括用氯化钙或硝酸钙之一或者其混合物来处理材料， 以形成丝心蛋白-氯磷灰石、或丝心蛋白-羟基磷灰石、或丝心蛋白-氯磷灰石和丝心蛋 白-羟基磷灰石的混合物。优选可用氯化钙水溶液提供钙离子。其它合适的水溶液可包括例如硝酸钙。优选将材料用钙离子在碱性pH下进行处理。最优选将材料用钙离子在约7. 0和 约10. 0的PH下进行处理。当将材料用钙离子在PH约9. 0时处理时，得到良好结果。
过量氯化钙或其它合适的含钙离子的盐，可从材料中除去。材料也可经处理，以使丝心 蛋白转化为丝II状态。例如，材料可用乙醇洗涤以除去过量氯化钙并将丝心蛋白转化为丝II状态。在洗涤步骤之后，可将材料干燥。干燥可以是加热干燥、风干或任何其它合适方 法。用真空干燥观察到良好结果。材料可用交联剂处理。通过用交联剂处理材料，材料中的丝心蛋白聚合物之间形 成交联。丝心蛋白聚合物之间的交联可以是共价交联。材料可用任何合适的交联剂处理。合适的交联剂可包括例如异氰酸酯、碳二亚胺 或氰基丙烯酸酯。合适的碳二亚胺可包括EDC (1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)或 N, N’ - 二环己基碳二亚胺。合适的氰基丙烯酸酯可包括2-氰基丙烯酸甲酯、2-氰基丙烯酸 乙酯、氰基丙烯酸正丁酯和氰基丙烯酸2-辛基酯。当使用氰基丙烯酸酯时，可在惰性气氛 条件下进行交联，以防固化。优选交联剂是异氰酸酯。优选所述异氰酸酯是二异氰酸酯。合适的二异氰酸酯可 包括六亚甲基二异氰酸酯(HDI)、二异氰酸亚甲基二苯酯(MDI)、甲苯二异氰酸酯(TDI)和 异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI)中的一种或多种。例如，使用六亚甲基二异氰酸酯得到良好结^ ο或者，异氰酸酯可包括具有额外官能团的单异氰酸酯。合适的额外官能团例如可 包括戊二IS官能团(gluteraldehyde group)。当交联剂处理是在基本上没有丝心蛋白溶胀剂(例如水、二甲亚砜或二甲基甲酰 胺)的条件下进行时，得到特别好的结果。优选交联剂处理在没有丝心蛋白溶胀剂的条件 下进行。通过在没有丝心蛋白溶胀剂或基本上没有丝心蛋白溶胀剂的情况下用交联剂处 理材料，降低了或阻止了钙和磷酸盐从丝心蛋白的分离。当在约80°C，用干燥氮，用未稀释的无水六亚甲基二异氰酸酯处理材料时，得到良 好结果。上述方法可包括改变材料对交联剂的暴露时长的步骤，以调节交联密度，并因此 达到可植入材料的所需硬度和可再吸收性。上述方法可包括从材料中除去过量交联剂的进一步步骤。所述方法可因此而包括 一个或多个漂洗步骤，使用例如无水丙酮。上述方法也可包括一个或多个步骤，以水解过量的CNO基团。这可通过在水中漂 洗材料而达到。上述方法还可包括通过任何合适的干燥方法(尽管优选通过加热干燥方法)将材 料干燥的步骤。可通过任何合适方法对材料进行灭菌，所述方法包括例如高压灭菌、暴露给Y射 线或用乙烯二氧化物(ethylene dioxide)处理。丝心蛋白溶液可以是再生丝心蛋白溶液。再生丝心蛋白溶液可通过包括用包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的离子 试剂处理丝或丝茧的方法而制备，所述阳离子和阴离子具有至少1.05埃的离子半径和在 250CT -0. 001 至-0. 05 的 Jones-Dole B 系数。正如本领域技术人员容易理解的那样，Jones-Dole方程的B系数(Jones，G.，和Dole, Μ.，J. Am. Chem. Soc, 1929, 51，2950)与离子和水之间的相互作用相关，并被视 为电解质在溶液中的结构形成和结构破裂能力的度量。优选上述阳离子和阴离子在25°C下具有-0. 001至-0. 05的Jones-Dole B系数。 更优选所述阳离子和阴离子在25°C下具有-0. 001至-0. 007的Jones-Dole B系数。制备再生丝心蛋白溶液的方法可包括在用离子试剂处理丝或丝茧之前、之后或同 时，对所处理的丝或丝茧进行脱胶。特别优选的是，上述方法包括在用离子试剂处理丝或丝茧之后，将所述丝或丝茧 干燥的进一步步骤。优选所述干燥步骤是在离子试剂处理步骤之后连续进行。最优选所述 干燥步骤是在所述离子试剂处理和所述脱胶步骤已经完成之后才进行。干燥步骤的目的是从已处理的丝或丝茧中尽可能地去掉水分。理想的是，几乎所 有水分都从已处理的丝或丝茧中除去。丝或丝茧的干燥过程可通过例如风干、冻干或通过加热干燥来进行。优选丝或丝 茧的干燥步骤包括风干。丝或丝茧可在任何合适的温度下干燥。例如，通过在室温下(21°C )干燥丝或丝 茧，观察到良好结果。丝或丝茧可干燥任何合适的时间段。通常，丝或丝茧可干燥数小时的时间，例如 12-16小时。在某些实施方案中，丝或丝茧可以在小于20%湿度的条件下风干。优选在干燥剂 (其可包括无水氯化钙或其它合适的干燥剂)存在下进行丝或丝茧的干燥。其它合适的干 燥剂可包括硅胶、硫酸钙、氯化钙和蒙脱土。也可以使用分子筛作为干燥剂。离子试剂可包括可包含氢氧化物溶液。氢氧化物溶液可在原位形成。例如，可以 用氨气或氨蒸气处理丝或丝茧以与该丝或丝茧中已存在的水结合形成氢氧化铵。此外，可 以在氨气或氨蒸气之前、与氨气或氨蒸气一起、或在之后将水蒸汽添加到该丝或丝茧中。合适的离子试剂包括氢氧化铵、氯化铵、溴化铵、硝酸铵、氢氧化钾、氯化钾、溴化 钾、硝酸钾、氢氧化铷、氯化铷、溴化铷和硝酸铷的水溶液。离子试剂通过提高蛋白质上电荷密度而发挥功能以增加蛋白质在丝中的溶解度 (“盐溶(salting in)”)。上述方法可包括将脱胶的丝或丝茧溶于离液剂的后续步骤(C)。将脱胶的丝或丝茧溶于离液剂的步骤可以在下列任一条件或下列条件的任何组 合下进行
在小于60°C的温度下； 以最多9. 5M的离液剂浓度；和 进行小于M小时的时间。可以在任何合适温度下，例如在约10°C至约60°C的温度范围内将脱胶的丝或丝 茧溶解在离液剂中。例如，在约15°C至约40°C的温度范围内将脱胶的丝或丝茧溶解在离液 剂中。例如，通过在约37°C的温度下将脱胶的丝或丝茧溶解在离液剂中，得到良好结果。脱胶的丝或丝茧可以溶解在任何合适浓度的离液剂中，例如在9. 3M浓度的离液 剂中。例如，脱胶的丝或丝茧可以溶解在小于9M浓度的离液剂中。脱胶的丝或丝茧可以溶 解在约6M至9M浓度范围内例如约7M的离液剂中。
脱胶的丝或丝茧可以在离液剂中溶解任何合适的时间段，例如小于M小时的时 间段。脱胶的丝或丝茧可以在离液剂中溶解小于12小时的时间段。优选脱胶的丝或丝茧 可以在离液剂中溶解4-5小时和最优选小于4小时的时间。离液剂可包括一种合适的离液剂或合适离液剂的组合。合适的离液剂包括溴化 锂、硫氰酸锂或硫氰酸胍。优选的离液剂包括溴化锂水溶液。丝或丝茧的脱胶可包括从丝或丝茧中选择性除去丝胶蛋白并可以使用裂解丝胶 蛋白、但产生极少或不产生丝心蛋白的裂解的蛋白水解酶。该蛋白水解酶可包括胰蛋白酶。 或者，该蛋白水解酶可包括脯氨酸内肽酶。脱胶可以使用在含氢氧化铵的缓冲剂中的酶溶 液。可以在任何合适的温度，例如小于100°C的温度下进行脱胶。优选在约20°C至约 40°C的温度下进行脱胶。当在约37°C的温度下进行脱胶时，观察到良好的结果。可通过渗析除去离液剂以提供再生丝心蛋白溶液。例如，可以使用高级去离子II 级水进行渗析并通常使用超纯I级超纯水进行。可以在任何合适的温度下，例如在约0°C至约40°C的温度范围内进行渗析。更优 选在约2°C至约10°C的温度范围内进行渗析。在约4°C至5°C的温度下得到良好结果。上述方法可包括浓缩再生丝心蛋白溶液的步骤。可通过使密封的渗析管或其它渗 析容器暴露在真空中来浓缩该溶液。可将该再生丝心蛋白溶液浓缩至约5-25% w/v的浓度。 优选将该再生丝心蛋白溶液浓缩至约8-22% w/v的浓度。更优选将该再生丝心蛋白溶液浓 缩至约8-12% w/v的浓度。举例来说，在将该再生丝心蛋白溶液浓缩至约10% w/v的浓度 时，得到特别好的结果。优选在凝胶冷冻之前，移出渗析管或其它渗析容器。根据本发明的第二方面，提供从丝心蛋白溶液制备用于修复、增强或替代骨的可 植入材料的方法，所述方法包括以下步骤
-从所述丝心蛋白溶液制备凝胶；
-通过使所述凝胶经历一个或多个冷冻和融化该凝胶的步骤而制备材料， 其中所述方法包括随后用异氰酸酯处理所述材料的进一步步骤。所述凝胶可用磷酸盐离子处理。最优选从丝心蛋白溶液制备凝胶的步骤在磷酸盐离子存在下进行。可以理解，关于本发明的第一方面描述的优选特征适用于本发明的第二方面。根据本发明的第三方面，提供从再生丝心蛋白溶液制备用于修复、增强或替代骨 的可植入材料的方法，其中所述再生丝心蛋白溶液是通过包括用包含一价阳离子和一价阴 离子的水溶液的离子试剂处理丝或丝茧的步骤的方法制备的，所述阳离子和阴离子具有至 少1. 05埃的离子半径和在25°C下-0. 001至-0. 05的Jones-Dole B系数。可以理解，关于本发明的第一和第二方面描述的优选特征适用于本发明的第三方根据本发明的第四方面，提供可通过本文所述的任一方法而获得的可植入材料。根据本发明的第五方面，提供用作骨修复、增强或替代材料的可植入丝心蛋白材 料，其中所述材料具有以下性能
-通过J-积分方法测定的在6%应变下的约1 kj m_3至约20 kj m_3的压缩刚度；-在5%应变下的约0. 1 Mpa至约20 Mpa的压缩强度；和 -在5%应变下的约100 Mpa至约500 Mpa的平均压缩弹性模量。上述材料可包括在6%应变下的约1 kj m_3至约5 kj m_3的压缩刚度。优选所述 材料包括约1. 3 kj πΓ3的压缩刚度，这是健康骨的近似压缩刚度。上述材料的极限压缩强度可取决于植入的靶位置。例如，如果材料在紧挨着骨质 疏松的松质骨的位置上，为了避免高应力积累和应力遮挡，所述材料的压缩强度(屈服点 应力)可为约0. 1 MI^a至约2 MPa0如果材料在紧挨着健康松质骨的位置上，则所述材料的 极限压缩强度(屈服点应力)可为约5 MPa0或者，如果材料在紧挨着皮质骨的位置上，则 所述材料的极限压缩强度(屈服点应力)可为至少10 MPa0优选上述材料的极限压缩强度(屈服点应力)为约5 MPa至约14 MPa0优选材料 的极限压缩强度(屈服点应力)为至少12 MPa0最优选材料的极限压缩强度(屈服点应 力)为约14 MPa0上述材料的压缩弹性模量在5%应变下为约100 Mpa至约400 MPa0最优选材料的 压缩弹性模量在5%应变下为约175 MPa0上述材料可包含丝心蛋白-磷灰石。优选地，磷灰石以丝心蛋白-磷灰石纳米复 合物的形式分布在整个材料中。这可通过在磷酸盐离子存在下从丝心蛋白溶液制备凝胶而 达到。丝心蛋白-磷灰石纳米复合物可包括丝心蛋白-羟基磷灰石和丝心蛋白-氯磷灰石 中的一种或其组合。另外或或者，磷灰石可作为涂层存在于丝心蛋白材料表面，这可通过从丝心蛋白 溶液制备凝胶，然后将所述凝胶暴露给磷酸盐离子而达到。最优选地，使磷灰石同时以分散于整个材料中的纳米复合物的形式和材料表面上 的涂层的形式存在。优选上述材料还包含多向互通孔。这些孔可覆盖该材料横截面的约10%至约80%。 在一个优选的实施方案中，这些孔覆盖该材料横截面的约75%。这些孔可以为约10 μπι至约1000 μ m的直径范围。平均孔径范围可以为约25 μ m至约400 μ m。优选平均孔径范围可以为约100 μ m至约300 μ m。优选至少部分磷灰石存在于孔壁内。上述材料可含有约15% w/v至约70% w/v的的磷酸钙含量。优选所述材料含有约 30% w/v的磷酸钙含量。上述材料可包括共价丝心蛋白-丝心蛋白交联。交联量可根据材料所需应用来调 整，例如通过增加材料中的交联量而增加材料硬度或降低再吸收性。上述材料可以是生物相容和至少部分地可生物再吸收的。所述材料的再吸收半衰 期为约约6个月至约12个月。优选所述材料的再吸收半衰期为约9个月。所述材料在约 12个月至约M个月内可被完全再吸收。优选所述材料在约12个月内被完全再吸收。优选上述材料在植入生物体时不诱导免疫应答或所诱导的免疫应答可以忽略不 计。优选所述材料具有可忽略不计的热原含量。优选上述材料是成骨性的并在植入体内之后显示出新骨形成。所述材料在植入体 内6个月之内也显示出新骨形成。优选所述材料在植入体内8周之内显示出新骨形成。上述材料可包含粗糙粘附表面，用于结合血纤蛋白基质，以促进成骨细胞向材料表面的迁移。上述材料中可接种组织培养细胞，包括骨髓基质细胞、间充质干细胞 (mesenchymal stem cell)、来自成骨细胞系的细胞、血细胞或从目标患者中采集的细胞。根据本发明的第六方面，提供包含本文所述的可植入材料的植入物，用于在整形 外科应用中修复、增强或替代一种或多种骨的几乎全部或部分，或用作骨移植物的替代物。上述植入物可包括植入了材料中的骨锚(bone anchor) 0所述骨锚可包括植入材 料中的多个丝线或细丝。根据本发明的第七方面，提供本文所述的可植入材料在整形外科应用中用于修 复、增强或替代一种或多种骨的几乎全部或部分，或用作骨移植物的替代物，或用作固定设 备的用途。联系附图，根据以下详细公开，可得出本发明的其它目的、特征和优势。
现在，仅以说明性方式并参考附图进一步描述本发明，在所述附图中 图1.本发明的多孔可植入骨修复材料的横截面的扫描电子显微(SEM)图； 图2.能量色散X射线(EDX)谱，显示图1所示的材料的磷酸钙含量；
图3.图1所示的多孔可植入骨修复材料的支架孔壁的高倍放大SEM图； 图4.本发明的多孔可植入骨修复材料的横截面的扫描电镜显微(SEM)图； 图5.图4所示的多孔可植入骨修复材料的扫描电镜显微(SEM)钙图； 图6.图4所示的多孔可植入骨修复材料的扫描电镜显微(SEM)磷酸盐图； 图7.能量色散X射线(EDX)谱，显示图4所示的多孔可植入骨修复材料的磷酸钙含
量；
图8.傅里叶转换红外光谱显示本发明的多孔可植入骨修复材料的拉伸/弯曲模式； 图9.本发明多孔可植入骨修复材料的粉末X光衍射图10.曲线图，显示来自Rncloboii 的多孔烧结陶瓷磷酸钙骨修复材料的一个对照样 品(A)和本发明多孔可植入骨修复材料的3个样品(各自具有30 wt%矿物质含量)(B-D) 的对压缩应变的压缩应力(MPa)；
图11.柱状图，显示来自人血的IL-I β (pg mL—1)对大肠杆菌脂多糖的对照样品和本 发明的多孔可植入骨修复材料的反应；
图12.在免疫缺陷小鼠中，在植入后8周的接种了骨髓基质细胞的本发明多孔可植入 骨修复材料的苏木精和伊红染色的甲基丙烯酸乙二醇酯树脂切片；
图13.图12所示的多孔可植入骨修复材料的截面的高倍放大图，显示在类骨质表面 和疏松结缔组织(CT)上的成骨细胞栅(箭头)；
图14.本发明的多孔可植入骨修复材料的截面的高倍放大图，显示折骨的重塑 (osteoclastic remodelling)(箭头)和新形成的骨；和
图15.图14所示的多孔可植入骨修复材料的截面的高倍放大图，显示通过多核破骨细 胞的新合成骨的折骨的浸润和重塑(箭头)。发明详述
本发明的用于修复、增强或替代骨的可植入材料包含丝心蛋白。所述材料具有与植入部位的骨的承重能力大致匹配的承重能力(包括压缩强度和压缩刚度)，以使其在受到由 正常身体活动施加于其上的力时能保持其机械完整性而没有过度变形。丝心蛋白可由桑蚕丝、野蚕丝、重组丝或这些丝的组合制备。承重件能
材料的压缩强度、压缩刚度和压缩弹性模量值近似于健康人骨并能立即承重。承重性 能也阻止由高度局部应力集中或应力遮挡所造成的不想要的邻接骨再吸收。压缩强度是材料抵抗轴向推力的能力。按照定义，材料的压缩强度是当材料彻 底破坏时单轴压缩应力所达到的值。应力-应变曲线是表示测量施加在样品上的承重而 得到的应力(测量单位是MPa)与测量样品的压缩而得到的应变之间的关系的曲线图。如 图10所示，当测定湿的材料样品时，材料的无侧限极限压缩强度(屈服点应力)至多为 14 MPa (n=5) (when a sample of the material is tested wet the material has an unconfined ultimate compressive strength)。压缩刚度是材料在经受轴向推力时抵抗折断的能力。按照定义，材料的压缩刚度 是吸收达到破坏点的机械能(或动能)的能力。刚度的测量单位是焦耳/立方米(J πΓ3) 并可作为应力-应变曲线下面积来测量。因此，正如根据图10可计算的，当测定湿的材料 样品时，材料的平均无侧限压缩刚度至多为11. 93+8. 40 kj m_3，η = 6 (用J-积分方法得 到)。压缩弹性模量是当将力施加于其材料上时，材料有弹性地变形(即非永久性)的 趋势的数学描述。杨氏模量(E)描述了拉伸弹性，或当相反的力沿轴施加时材料沿该轴变 形的趋势；它定义为拉伸应力与拉伸应变(测量单位MPa)的比值并且已知还是材料硬度 的度量。物体的弹性模量定义为应力-应变曲线在弹性变形区的斜率。压缩弹性模量可从 图10求得，该图显示当测量湿的材料样品时，材料的无侧限压缩弹性模量为175 MPa (n = 5)。丝心蛋白的共价交联允许材料硬度可控。使用二异氰酸酯交联剂，可通过改变材 料暴露给试剂的暴露时间而调整丝心蛋白的共价交联密度，以改变材料硬度。如图10所示，可植入骨修复材料(样品B、C和D)的压缩强度、压缩刚度和压缩弹 性模量(在弹性变形相中测量)比所测量的作为Endoto丨ι 而为人所知的多孔烧结陶瓷 磷酸钙骨修复材料(ΒΙ0ΜΕΤ Orthopaedics Switzerland GmbH制造)(样品Α)高得多。认 为样品B、C和D的差异大，是因为在所取的样品上制备光滑的、完全平行的面中的困难。矿化作用
矿物密度是矿化复合材料的压缩强度和压缩弹性模量的决定因素。因此，矿化作用对 材料的承重性能有影响。参见图1至图3，本发明的材料样品显示出具有高含量磷酸钙微晶的多孔矿化结 构。图3显示孔壁具有几乎覆盖壁表面并延伸至这些壁的两个断裂表面的微晶，这表明微 晶紧密粘附在孔壁上。图5和图6显示更多的本发明材料样品的钙图和磷图。图7的能量色散X射线 (EDX)谱显示相同材料样品的磷酸钙含量。可见图5至图7所示材料主要包含丝心蛋白和 磷灰石(一种磷酸钙陶瓷)。丝心蛋白-磷灰石复合物有一部分是象天然骨那样的真正的 磷灰石-蛋白纳米复合物，而不仅仅是包覆有磷灰石的丝心蛋白，尽管某些磷灰石确实是
16以牢固粘附在丝心蛋白上的涂层形式存在。成骨件能
骨生成是用成骨细胞铺设新骨材料的过程。成骨细胞通过产生类骨质以构成类骨质基 质而构建骨，所述基质主要包含I型胶原。骨组织包含类骨质基质和矿物质(大部分带有 磷酸钙)，其构成称为羟基磷灰石钙的化学排列。成骨细胞通常负责类骨质基质的矿化作 用，以形成骨组织。材料的骨传导性和骨诱导性对骨生成有影响。骨传导性
骨传导性通常定义为材料促进成骨细胞通过材料植入后立即建立的血纤蛋白凝块向 支架表面迁移的能力。材料的孔隙率影响该材料的骨传导性。图1的扫描电镜显微(SEM)图(刻度尺=200 μ m)显示本发明材料包含多孔矿化 结构，当采用材料样品的横截面时。材料包含多向互通孔。此外，图3 (刻度尺=IOym) 显示相同材料样品的孔壁。骨诱导性
骨诱导性定义为材料促进骨原细胞(成骨细胞)分化的能力，所述骨原细胞是骨组织 (osseous (bone) tissue)的成分。矿化作用和生长因子的添加影响材料的骨诱导性。本发明的材料是高度成骨性的并在植入8周之内显示出骨的铺设和重塑的体内 证据。(图12-15)。在这一方面，图12至图15显示在免疫缺陷小鼠中的材料的苏木精和伊 红染色的甲基丙烯酸乙二醇酯树脂切片，所述材料在植入8周之后接种了骨髓基质细胞。图12 (刻度尺=100 μ m)显示新类骨质基质的形成(箭头)，所述基质是由成骨 细胞分泌在材料表面的(SB)。图13 (刻度尺=20μπι)显示图12所示的类骨质基质的放 大部分，其中在类骨质表面和疏松结缔组织(CT)上可观察到成骨细胞栅(箭头)。图14 (刻度尺=100 μ m)显示材料的折骨的重塑(箭头)并在植入物中可观察 到新形成骨。图15 (刻度尺=20 μ m)显示图14截面的放大部分，其中可见通过多核破骨 细胞的新合成骨的折骨的浸润和重塑(箭头)。材料也可包括额外的可再吸收的生物聚合 物、药物、生长因子、填充颗粒和矿物质。可再吸收性
可再吸收性是材料分解的能力。BRM的目的是材料被逐渐分解，以允许它被内源性骨组
织替换。本发明的材料表现出缓慢的可再吸收性，显示无侧限压缩弹性模量在12周至9个 月内减半，这取决于所引入交联的程度。材料显示出在植入8周之内丝心蛋白再吸收的体 内证据(图14和15)。丝心蛋白的共价交联允许控制材料的可再吸收性。具体地讲，丝心蛋白的交联使 丝心蛋白具有更少的亲水性和更能耐受酶攻击，这增加了再吸收时间。使用二异氰酸酯交 联剂，可控制丝心蛋白的共价交联密度以改变材料的疏水性和可再吸收性。当氯化钙试剂用于将钙引入材料中时，所述材料显示出对磷灰石的某些氯取代， 以形成部分氯磷灰石和部分羟基磷灰石的材料。认为与未取代羟基磷灰石相比，氯取代加 速了磷灰石的再吸收。材料的用途
上述材料可用锐利的解剖刀进行修整并可铸模和/或经机械加工成杆或棱柱或任何三维形状，以模拟所替换的骨或部分骨的形状。它可容易地制备平均尺寸为1-50 mm的部 件，用于嵌塞移植(impaction grafting)或用于安放在骨折骨或破碎骨之间。可容易地对 它钻孔并用可再吸收的或不可再吸收的螺丝、钉或板固定在位。此外，它可通过植入材料中 的扭绞、编织或缠绕的纤维或丝线或缆索而固定在位。也可将上述材料铸模、打磨或用其它方法成形，以形成固定设备例如螺钉或钉，从 而将植入物固定在已有的骨上。制备可棺入骨修复材料的方法的概沭 上述可植入材料可按照下述的优化方法而制备。可用氨或含铵离子的水溶液处理丝或丝茧。将丝或丝茧在温和条件下通过选择性除去丝胶蛋白而脱胶。这可通过使用裂解丝 胶蛋白的、但产生极少或不产生丝心蛋白的裂解的合适酶进行酶促切割并除去丝胶蛋白而 达到。 上述丝或丝茧通过提取水而干燥。将上述丝或丝茧溶于溴化锂水溶液中，在一个或多个小于60°C的温度下和/或用 浓度小于9. 5M的溴化锂溶液和/或时间段为小于M小时。在约4_5°C温度的冷却条件下，使用超纯水，通过渗析除去所述离液剂。浓缩所得 溶液，得到优化的再生丝心蛋白溶液。可浓缩上述丝心蛋白溶液。将溶液转移到模具中进行胶凝，或者，将溶液留在渗析容器中。通过用含磷酸盐离 子的浓缩缓冲液处理溶液，从而在将磷酸盐离子加入到丝心蛋白溶液中的同时使所述溶液 胶凝。在优选的实施方案中，缓冲磷酸盐溶液包含用2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1，3-二 醇(Tris)缓冲液缓冲的磷酸二氢钠，调节至碱性pH。冷冻之前，将凝胶从模子或渗析容器中移出。使凝胶经历一个或多个冷冻循环。每个冷冻循环包括冷冻步骤和融化步骤。通过 冷冻凝胶，水滴变成冰晶，其在所述凝胶内形成穴或孔隙。因此，使凝胶经历一个或多个冷 冻循环引入多向互通孔。将上述丝心蛋白凝胶用含钙离子的浓缩缓冲液处理，以形成丝心蛋白-磷灰石材 料。磷灰石以孔壁内和孔壁上的纳米复合物形式存在。所述缓冲钙溶液包括用Tris也缓 冲至碱性PH的氯化钙。上述材料在乙醇水溶液中洗涤，以除去过量盐并促进丝心蛋白的丝II (β折叠) 形式的形成。通过例如真空干燥从材料中除去尽可能多的游离水。用未稀释的异氰酸酯或高度浓缩的异氰酸酯的二甲亚砜或其它有机溶剂的溶液， 任选使材料中的丝心蛋白交联。通过用无水溶剂处理所述材料除去过量的异氰酸酯。所得材料用作可植入材料，用于修复、增强或替代骨。用氨或铵离子处理
已经发现，用氨气或者氨或铵盐的稀溶液处理丝极大提高丝在溴化锂溶液或其它离液 剂中的易溶解性。在该步骤中，认为铵离子作为“盐溶”试剂，通过参与去除环绕蛋白链的 内水壳(inner water shell)并通过与丝心蛋白的带电荷氨基酸侧链结合来提高该蛋白质在离液剂中的后续溶解度。已经发现，应用于以下三个阶段之一或全部时直接用于未脱胶茧；用于生丝纤 维、用于脱胶或部分脱胶的丝(无论是通过传统工业脱胶法还是通过酶促脱胶法脱胶)，上 述处理有效。氨或铵离子在作为用于酶促脱胶的缓冲剂组分包含时也有效。因此，用氨或 铵离子处理丝的任何这些方法可用于降低溶解该丝所需的温度或时间或离液剂浓度，从而 降低对丝心蛋白的破坏并节省工艺成本。用氨或铵离子处理桑蚕丝能将在60°C下在9. 3M溴化锂溶液中溶解该丝的时间从 几小时缩减至15分钟。或者，氨或铵离子处理能在60°C下使用7M溴化锂代替9. 3M溴化 锂。也能在20°C下在M小时内将该丝完全溶解在9. 3M溴化锂溶液中。还能在37°C下在 4-5小时内将该丝完全溶解在9. 3M溴化锂中。因此，已经发现，用氨或铵处理能实现一系列更温和的处理，其中可以单独或联合 改变温度、离液剂浓度或溶解所需的时间。这些更温和处理导致丝心蛋白溶液的更快速胶 凝时间和在该方法结束时更强韧更刚硬的材料。目前认为，具有相同大小的其它离子对，例如氯化钾也具有相同作用并可代替氨 使用。这由以下两条证据证实(1)如电荷密度那样，钾离子和氯离子的Jones-Dole粘度 (离液力(chaotropicity)的度量)类似，以致这些离子能形成离子对和有助于除去该蛋白 质的内水壳(与氯化铵共有的性质)；和( 氯化钾通常在50 mM至600 mM的盐浓度下用 于“盐溶”蛋白质。此外，包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的某些其它离子试剂可提供相同作 用。特别地，包含具有至少1. 3埃的离子半径和在25°C下-0. 05至+0. 1的Jones-Dole B 系数的一价阳离子和一价阴离子的离子试剂被认为提供与关于铵离子所述的相同作用。合适的离子试剂可包括氢氧化铵、氯化铵、溴化铵、硝酸铵、氢氧化钾、氯化钾、溴 化钾、硝酸钾、氢氧化铷、氯化铷、溴化铷和硝酸铷的水溶液。脱胶
也已发现，脱胶方法的选择对丝心蛋白的胶凝时间以及最终材料的硬度和强度而言是 至关重要的。商业缫丝和脱胶过程都使用约100°c的温度和使用碳酸钠和/或马赛皂，而且 据发现，可能由于这种处理，缫出的生丝和脱胶丝没有茧丝容易溶解。用商业碱性蛋白酶(alcalase)(细菌性枯草杆菌蛋白酶(bacterial subtilisin))脱胶能将脱胶温度降至60°C。碱性蛋白酶是丝氨酸S8内蛋白酶家族成员并 可能使丝心蛋白大幅劣化，因为其具有优先选择Pl位置中的大的不带电残基的广泛特异 性。对于这种酶，桑蚕和柞蚕重链丝心蛋白具有许多预计裂解位点。通过由碱性蛋白酶脱 胶丝制备的再生丝心蛋白溶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳，证实桑蚕丝心蛋白对碱性蛋白酶裂 解的敏感性。在使用胰蛋白酶脱胶的情况下，可以将脱胶温度降至20-40°C并与传统高温脱胶 程序相比产生具有降低的胶凝时间和具有改进的硬度和强度的凝胶。与碱性蛋白酶相比， 工具P印tideCleaver显示在桑蚕丝心蛋白重链丝心蛋白的重复结晶畴和亲水间隔基的共 有序列中的预计胰蛋白酶裂解位点极少，在柞蚕重链丝心蛋白中的共有序列或亲水间隔基 中则没有裂解位点。这表明在胰蛋白酶中将丝脱胶可能有益于制备再生丝心蛋白溶液。胰 蛋白酶确实被认为非常有利于将丝脱胶以形成改进的再生丝心蛋白溶液。
用胰蛋白酶脱胶的丝以较短胶凝时间产生再生丝溶液并能够形成与由使用碱性 蛋白酶脱胶丝制备的再生丝而获得的那些凝胶相比更硬的凝胶。在暴露在一种胶凝剂即冰 乙酸蒸气中时，用胰蛋白酶脱胶产生小于5分钟的胶凝时间，也产生最硬和最强韧的材料， 表明胰蛋白酶在这些条件下产生比碱性蛋白酶处理少得多的链断裂。可以理解，产生极少或不产生丝心蛋白的裂解的其它蛋白水解酶也可能有利地用 于将丝脱胶以制备改进的再生丝心蛋白溶液。观察到桑蚕重链丝心蛋白含有极少脯氨酸， 而这种氨基酸在丝胶蛋白中相对丰富，这提示脯氨酸内肽酶是在产生极少破坏或完全不破 坏丝心蛋白的同时选择性除去丝胶蛋白的理想候选物。干燥
将丝或丝茧在室温下在小于20%湿度和在无水氯化钙存在下风干过夜。通过干燥除去几乎所有水，提高了溶液中的离子浓度，认为这增强离子和所得材 料的效果。其它已知的干燥方法，如冻干和通过施热干燥将会达到相同效果。如果使用热干 燥，认为小于100°c的温度产生改进的丝心蛋白材料。渗析
已经发现，对 I 型 milliQ 水(可得自 Millipore , 290 Concord Road, Billerica, MA 01821，US)(或被称作超纯水)渗析再生丝心蛋白溶液以从该丝溶液中除去离液剂是 非常有益的。已注意到，在用作渗析剂时，PIPES或Tris缓冲剂或去离子水中的杂质不利地影 响最终产物的硬度和强度。已注意到，可能由于它们能够通过将丝心蛋白链粘结在一起来 促进其聚集，渗析剂中包含PIPES或Tris缓冲剂或杂质也会提高再生丝溶液的粘度。这在 坚硬刚性的丝心蛋白凝胶形成中被认为是不利的。认为使用在40°C下在碳酸铵缓冲剂中用胰蛋白酶脱胶的茧或生丝可以是更有利 的。凝胶的制备
优化的再生丝心蛋白溶液通过暴露给含有磷酸二氢钠的含水缓冲液而胶凝。1% TriS 缓冲液中的磷酸二氢钠的浓度为0.9 M并调节至pH 9.0。磷酸二氢钠的浓度和材料暴露于 其中的时间长度对于所得凝胶的孔径以及强度和硬度而言是至关重要的。已经发现，通过 在磷酸盐离子存在下胶凝溶液允许磷酸盐离子分散在整个溶液中，并因此整合到所述凝胶 中。当钙离子在后期加入时，这有助于形成丝心蛋白-磷灰石纳米复合物。已经发现，如果 将凝胶用磷酸盐离子进行后续处理，当钙离子在后期加入时，就会得到磷灰石涂层。此外，已经发现，冷冻未胶凝的丝心蛋白导致孔径缩小和材料较不牢固，而强烈的 过度胶凝产生含有由大冰晶所产生的低密度的大裂纹的无孔凝胶。已经发现，最佳胶凝所 需的暴露时间和缓冲液或蒸汽浓度取决于丝心蛋白铸塑品(cast)的几何形状和大小。因 此，与10 mm渗析管相比，在由20 mm直径渗析管构成的模具中，最优地胶凝丝心蛋白所需 的处理时间更长。发现在4°C下使包含在20 mm直径渗析管中的由胰蛋白酶脱胶丝制备的10% w/v 经优化的再生丝心蛋白溶液胶凝2小时是有利的。尽管优选的实施方案在一个步骤中组合了引入磷酸盐离子和使丝心蛋白溶液胶凝，其它胶凝剂或方法也可用于在引入磷酸盐离子之前使丝心蛋白溶液胶凝，所述方法包 括仅为示例性的加热、微波辐射、超声处理、激光辐射、酸性溶液和酸性蒸汽。冷冻
为了制备多孔可植入材料，可以通过冷冻使凝胶多孔化。认为冷冻造成富丝心蛋白相 从贫丝心蛋白相的相分离和后者中的冰晶形成。认为这两种机制联合在凝胶中产生高密度 的多向互通孔。已经发现，除去渗析容器或模具产生更大程度的孔隙和多向互通孔。上述冷冻步骤也使孔壁中的丝心蛋白不溶于水和大多数其它含水溶剂，表明它 已部分地转化为不溶性丝II状态，其中分子内和分子间键合的β折叠占主导。这种 向丝II状态的转化可能归因于水从蛋白质链中的除去，这是通过相分离与它们的排列 (alignment)及伸长(pulling)(两者都是冰晶形成的结果)的组合产生的。因此，不可溶 的丝II状态的形成相当接近地模拟蚕挤出丝的天然过程，这也取决于相分离、富丝心蛋白 相的水损失以及应变依赖型取向和丝II形成。对于单冷冻周期，冷冻步骤的温度对孔径的影响小，-12°C至_16°C之间的冷冻产 生最大孔隙。改变温度和在再生蛋白质溶液中包含低浓度防冻剂或糖可用于改变冰晶粒度 和形态，因此改变该材料中的孔尺寸和形状。增加冷冻循环次数会由于冰晶的破坏而产生孔径的增加。这伴随着最终材料的硬 度和强度的某些损失。可以理解，胶凝和冷冻以外的方法也可用于在该优化的再生丝心蛋白溶液中引入 多向互通孔。仅举例说明，这些包括盐浸析和气体发泡。引入钙离子
钙离子与磷酸盐离子构成磷灰石。如果在胶凝之前使磷酸盐离子分散遍及丝心蛋白溶 液，则得到丝心蛋白-磷灰石纳米复合物。然而，如果丝心蛋白溶液先胶凝，再用磷酸盐离 子处理的话，则观察到磷灰石涂层而不是纳米复合物。使用氯化钙导致磷灰石的某些氯取代。与未取代的羟基磷灰石相比，认为这加快 磷灰石再吸收，因此这是所期望的。再一个实施方案使用硝酸钙溶液代替氯化钙溶液，这 避免磷灰石中氯离子的存在并导致纯羟基磷灰石的形成，而不是部分氯取代的羟基磷灰石 (即部分氯磷灰石、部分羟基磷灰石)。将上述材料用钙离子在碱性pH下处理，这避免酸性或非晶形的磷灰石的形成。当 将材料用钙离子在PH约9. 0下处理时，得到良好结果。在凝胶向丝心蛋白-磷灰石材料的转化之前，可将其它成分掺入到丝心蛋白溶液 的丝心蛋白中。这些包括仅为示例性的短纤维、填充颗粒、骨促进因子和药物、抗肿瘤药、抗 生素、其它生物聚合物和其它活性要素。在可植入骨修复材料中，优选终浓度为30%矿物质(干重)，这可通过使用经缓冲 的0.9 M磷酸二氢钠溶液和经缓冲的1.5 M氯化钙溶液而得到。在可植入骨修复材料中， 高达70%的更高矿物质含量可通过化学计量地增加磷酸盐离子和钙离子溶液中的磷酸盐 浓度和钙离子浓度而得到。然而，发现含有超过40%矿物质含量的可植入骨修复材料比含 有30%矿物质含量的那些更脆。用乙醇溶液处理认为在冷冻之后用乙醇水溶液处理材料能促进丝II (β折叠)分子间和分子内氢键 的形成，这改善凝胶的机械稳定性并增加不溶解度和对酶攻击的抗性。讲一步干燥
将材料放入例如无水乙醇中超过2天并在40°C真空干燥，以基本上(如果不是全部的 话)除去游离水。冻干和加热干燥等其它已知干燥方法也可达到同样效果。如果采用热干燥，认为 低于100°c的温度可产生改进的材料。交联
使丝心蛋白-磷灰石交联。在一个优选的实施方案中，在水或其它溶胀剂不存在时，用未稀释的异氰酸酯例 如六亚甲基二异氰酸酯使丝心蛋白-磷灰石交联。该步骤增加可植入骨修复材料的硬度并 增加可植入骨修复材料对酶攻击的抗性，因此减缓再吸收。已经发现，如果使用溶胀剂，这就会引起丝心蛋白溶胀，导致磷灰石与丝心蛋白的 分离。因此，这导致材料具有降低的硬度，其反过来又导致材料弯曲的趋势并引起磷灰石从 材料中“剥离”。也已发现，改变将丝心蛋白-磷灰石暴露给异氰酸酯交联剂的时间，可用于调节 共价交联密度并因此调节可植入骨修复材料的硬度。也已发现，改变共价交联密度可用于改变丝心蛋白凝胶对酶攻击的抗性并因此以 可控的方式延长再吸收时间。使用上述引用的Arai，T, Ishikawa, H.，Freddi, Winkler, GS和Tsukack，M QOOl)中所述的已公开程序，用20%六亚甲基二异氰酸酯的二甲亚砜 (DMSO)溶液使材料中的丝心蛋白交联的尝试不能得到令人满意的可植入骨修复材料。在该 公开程序中，认为因为丝心蛋白-磷灰石在DMSO中溶胀，导致矿物质与丝心蛋白分离。因此，上述方法在水或其它溶胀剂例如二甲亚砜不存在时使用异氰酸酯交联剂。 异氰酸酯交联看来不影响材料的生物相容性，只要将过量交联剂通过充分洗涤除去。这已 通过在多孔丝心蛋白-磷灰石复合物上或其中培养人基质细胞在体外确认，以及通过在小 鼠皮下植入之后在体内确认(参加以下程序)。可以理解，其它交联剂也可使用。可植入骨修复材料的植入方法的概述
在一个优选的实施方案中，将材料直接植入骨，而不先对它接种组织培养细胞。或者，可在临植入之前，马上在材料中接种组织培养细胞或血细胞或即将植入所 述材料前从患者采集的细胞。仅举例来说，上述组织培养细胞包括骨髓基质细胞或间充质干细胞或成骨细胞 系。又或者，可将材料用细胞接种，然后经历组织培养，施加或不施加循环应变 (cyclical strain)，以在植入之前加速材料中骨的形成。可改变材料的尺寸和形状，以用于骨修复的不同应用。因此，可通过将材料浇铸在 适当形状的模具中或者通过对较大材料块进行打磨、切割或其它机械加工，来生产解剖学 形状的整体制品(monolith)。或者，可通过浇铸或机械加工或这些工艺的组合，来生产圆柱 状棒或矩形棱形物件。
也可在手术室中用解剖刀或其它工具使材料成形，使植入物能近似于其所需装入 的空间或空腔。对于需要小片段的嵌塞移植等应用而言，这些可通过对材料块进行切割或 碎裂以得到所需大小的块而生产。对于某些应用，可将材料切割、破碎或挤压成小块，通常直径为1-10 mm。可将材料 的小多孔颗粒配制为粗糙糊剂或灰泥，而不损失其多孔结构。包含一种或多种生物相容的 可再吸收的聚合物的生理盐水或溶液可用于将材料的小颗粒结合到糊剂或灰泥中。仅举例 来说，合适的生物相容的可再吸收的聚合物包括丝心蛋白、血纤蛋白、胶原、藻酸盐或基于 以下单体的合成聚合物乳酸、乙醇酸、对二氧环己酮、三亚甲基碳酸酯和己内酯。含有材料 颗粒的糊剂或灰泥也可包含天然表面活性剂，仅举例来说，包括例如磷脂、溶血卵磷脂或卵 磷脂。应当知道，上述材料良好地适合于涉及植入材料的多孔小片或多孔颗粒的应用， 无论是通过嵌塞移植或是在糊剂或灰泥中引入。这是因为颗粒的极高的刚度防止植入期间 产生的适当应力压垮材料的多向互通孔结构，维持中胚层干细胞或其它骨形成细胞进入所 植入材料的通道。在又一实施方案中，在全部或部分再生丝心蛋白胶凝并转化成丝心蛋白-磷灰石 复合物之前，使浓缩的再生丝心蛋白溶液首先渗透到纤维层中或纤维之间，在这两种情况 下都包括可再吸收的生物相容的纤维。这提供了进一步强化和韧化材料的方法。该实施方 案的纤维可包括例如丝、胶原或基于以下单体的合成聚合物乳酸、乙醇酸、对二氧环己酮、 三亚甲基碳酸酯和己内酯。如果使用丝纤维，有利的是首先通过将其在离液剂例如溴化锂 中短时间浸泡而使其表面溶胀，然后洗去离液剂，之后再加入再生丝心蛋白。这提供了纤维 与再生丝心蛋白之间的优异的界面，这改进了它们的相互作用，当其胶凝时强化材料。可通过形成缠绕或折叠或编织的丝线、缆索或纤维或者多个丝线、纤维或缆索，而 形成用于锚定人工韧带、腱或半月板的设备并将它们的一端插入浓缩的丝心蛋白溶液中。 然后，如上所公开地使丝心蛋白溶液胶凝并转化成丝心蛋白-磷灰石复合物。这确保一个 或多个丝线、缆索或纤维稳固地锚定在丝心蛋白-磷灰石复合物块上。一种坚固的锚可通 过将一块丝心蛋白-磷灰石复合物形成截锥而制备，所述截锥的窄端连接所述丝线或缆索 的末端。为了插入该锚，首先将连接所述截锥的缆索或纤维穿过在骨或软骨上钻出的孔洞。 只要该孔洞直径大致小于该截锥的宽端，通过将该截锥卡在钻孔中就可制备一个牢固的锚 点。其它几何形状(仅举例来说，包括台地或楔子)可用于以此方式形成牢固的锚。从主 纤维或缆索延伸出的多个次纤维(sub-fibre)提供大的表面积，以将主纤维或缆索锚定在 所述锚的丝心蛋白-磷灰石成分中。仅举例来说，可采用用于形成绒球(pom-pom)的技术例如用于装饰儿童服装的技 术的改良技术来制备用于锚的上述多个纤维。从一片薄而硬的材料上，切下一片直径通常 在5 mm至10 mm的小垫圈形状的圆片。将生物相容的和可再吸收的丝线或细丝多次穿过该 圆片的中心孔，使它们放射状排列在该圆片上。当足够数量的丝线或细丝圈放射状排列时， 在该圆片边缘通过它们进行圆周切割，使圆片可被除去并提供从中心丝线发出的一组放射 状排列的纤维。在丝心蛋白转化成丝心蛋白-磷灰石复合物之前，可用丝心蛋白渗透用该 方式产生的一个或数个绒球并放入模具内。实施例1 从缫出的(reeled)生丝或丝茧制备优化的再生丝心蛋白溶液的程序
1.将新形成的家蚕丝茧或缫出的生丝用10mM乙二胺四乙酸(EDTA)溶液在室温下 (210C )处理1小时；
2.将所述丝茧或缫出的生丝随后在相同溶液中漂洗和用超纯水充分洗涤；
3.将所述丝茧或缫出的生丝随后在30-40°C下在含铵盐或氨的缓冲剂中用pH 8. 5-9. 3的胰蛋白酶溶液脱胶；
4.将所述丝茧或缫出的生丝在超纯水中充分洗涤；
5.挤出水，将所述丝茧或缫出的生丝在20°C下用含有铵离子的0.1至0.001M氯化铵 或氢氧化铵水溶液处理1小时；
6.将所述丝茧或缫出的生丝在室温下(21°C)、在小于20%湿度的条件下和在无水氯 化钙的存在下干燥过夜；
7.在37°C下，在持续搅拌下，以1g丝/5 ml溴化锂溶液的比率，将所述丝茧或缫出的 生丝在9. 3M溴化锂水溶液中溶解4-5小时；
8.将所得丝心蛋白溶液转移到Visking袋中(分子量截止值12-15kDa)，并在加盖烧 杯中在持续搅拌下、在5°C下对超纯水渗析最少5小时和最多3天——以均勻的时间间隔更 换5次极大地过量的超纯水；
9.渗析后，通过重量分析法和/或折射法测得的再生丝溶液中的丝心蛋白浓度为 8-10% w/v——通过将该未打开的渗析管置于真空中，以提高丝心蛋白浓度以获得8-10% w/v的浓度。 实施例2
由优化的再生丝心蛋白溶液制备可植入骨修复材料的程序
1.按照实施例1的描述制备10%w/v家蚕优化的再生丝心蛋白水溶液；
2.在4°C，将等分的20ml所述溶液在Visking袋(分子量截止值12_14KDa)中对含 有终浓度为0.9M磷酸二氢钠的缓冲水溶液和1% w/v 2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1，3-二 醇(Tris)缓冲液(用5M氢氧化钠调节至pH 9.0)渗析2小时，该步骤使丝心蛋白溶液轻 微胶凝并将磷酸盐离子引入所得凝胶；
3.将来自步骤2)的凝胶样品转移到冷冻浴中在_13°〇下M小时，以将多向互通孔引 入该材料中；
4.还在冷冻时，用锐利的解剖刀将所述材料样品切割成块并除去渗析管；
5.将冷冻凝胶样品转移到37°C的含有终浓度为1.5M氯化钙溶液的缓冲水溶液和1% w/v Tris (用5M氢氧化钠调节至pH 9. 0)中，以形成丝心蛋白-磷灰石材料；
6.将所述样品经过一天缓慢放入50%乙醇，以除去过量盐并将蛋白质转化成丝II状
态；
7.将所述样品放入无水乙醇2天；
8.将所述样品在40°C真空干燥，并转移到在80°C、干燥氮下的纯无水六亚甲基二异 氰酸酯中2天；
9.如下所述地从所述材料中除去过量六亚甲基二异氰酸酯
a)用冷无水丙酮漂洗4次，然后在无水丙酮中在60°C下回流过夜；
b)加入水，以水解任何残留的CNO基团；c)将所述材料在初始为40°C而最终为60°C的烤箱中干燥，然后高压灭菌(通过嗅觉 检测没有残留丙酮)；
d)采用傅里叶变换红外(FT-IR)光谱术检查材料中CNO峰不存在。实施例3.
测试丝心蛋白-磷灰石材料的程序矿化作用
通过在空气中将材料加热到500°C，用重量分析法测定矿物质填充量。优选的实施方 案得到30% w/w矿物质含量的填充量，而如上所述的程序的改良得到的矿物质填充量达70% w/w矿物质含量。通过装配有能量色散X射线分析器的扫描电镜显微术(JEOL JSM 6330)进一步研 究材料样品。X射线能量谱表明钙和磷酸盐在孔壁内共同定位(图5和6)和磷酸钙的高水 平矿化作用的存在(图7)。X射线能量谱中少量氯离子的证据说明了羟基磷灰石的氯取代 (参见以下)。FT-IR光谱(KBr片；Perkin-Elmer谱1)证实复合物中大量磷酸盐的存在(图8 峰E和峰F)。粉末X光衍射(Bruker D8)证明复合物中存在氯取代的羟基磷灰石(图9)。实施例4
测试丝心蛋白-磷灰石材料的程序承重性能
在材料的完全水合样品上进行机械测试(Z wick 1478)，所述样品被切割成圆柱状并 以2mm min ―1的十字头速度加压到破坏。应力/应变曲线(图10)表明该材料具有延长的塑性形变相。二异氰酸酯交联材料的平均无侧限压缩刚度为11. 93士8. 40 kj πΓ3，η = 6 (用 J-积分方法获得)。材料的平均无侧限极限压缩强度(屈服点应力)是14 MPa (n=5)。该材料的无侧限压缩弹性模量是175 MPa (n = 5)。就压缩强度和压缩弹性模量而言，测量值相当接近BRM的目标值，其压缩强度为 20 Mpa，压缩弹性模量为100-500 MPa0就刚度而言，测量值超过目标值，认为对于BRM是有利的，目标值为1.3 kj m_3。实施例5
测定丝心蛋白-磷灰石材料的程序热原性
用加热灭菌的镊子，将5 mg材料样品插入到具有1000 μ 1等渗盐水(Berlin-Chemie AG)的无热原1. 5 ml聚丙烯反应管(Eppendorf)，并用100 μ 1稀释在盐水中的LPS spike (NIBSC, UK ；WHO参考，大肠杆菌0113:H10)或者100 μ 1盐水作为对照。在样品中掺入LPS (1或4 EU/ml)用于排除来自血液单核细胞活性的干扰，例如 来自毒性或免疫调节样品。认为50-200%的Spike回收值对于排除干扰是可接受的。在所有测试中都包括在盐水中稀释的内毒素的标准曲线，以0. 5 EU/ml作为热原 性阈值浓度。将得自健康志愿者并通过血细胞分类计数(Pentra 60，ABX Diagnostics, France)检查感染的100 μ 1合并血，加入到各反应管，得到1200 μ 1的最终孵育体积并在 37°C禾口 5% CO2中放置21-24小时。通过在13，000 rpm离心2分钟，得到无细胞上清液，立即进行检测或贮存在_80°C直到可进行检测。通过ELISA，用抗体对和重组标准品(R&D Systems, Wiesbaden, Germany)检测到 了 IL-I的释放。ELISA的检测限为3.5 pg/ml IL-I β。该测定表明材料的热原性是可忽 略不计的(图11)。 实施例6
测定丝心蛋白-磷灰石材料的程序成骨性(Osteogenicity) 成人骨髓样品得自经历用于骨关节炎的常规髋替代手术的血液学正常患者。经南安 普敦和西南汉普郡地方研究伦理委员会(Southampton and South West Hampshire Local Research Ethics Committee)批准，仅使用要丢弃的组织。总共制备了 4个样品0男2 女，平均年龄70+13年)。通过使用STRO-I 抗体杂交瘤上清液(由 Dr J Beresford (University of Bath, UK)赠送)而选择STR0-1 ( 一种来自⑶34+部分的多能性标记)来富集之后，建立骨髓细 胞原代培养，其在植入之前促进体外快速扩增(S. Gronthos, S. E. Graves, S. Ohta, P. J. Simmons, Blood 84， 4164-4173 (1994))。在37°C下、在含5% CO2的加湿空气中，将培养物维持在基础培养基(含有10% FCS、1%青霉素/链霉素的MEM)中。在70%汇合时，用成骨培养基(基础培养基加上10 nmol/L地塞米松加上100 nmol/ L-抗坏血酸-2-磷酸)替代，再过M小时之后，将细胞温和地胰蛋白酶消化、计数并 重悬于成骨培养基中，准备接种到材料样品中。组织培养试剂得自Gibco/BRL (Paisley, Scotland)。试剂是分析级的，来自 Sigma Chemical (Poole, UK)，除非另有说明。将3 mm3的完全水合的经高压灭菌的材料浸泡在基础培养基中达M小时，然后转 移到M孔组织培养板。在植入前48小时，将10 μ 1成人骨髓基质细胞的细胞悬液[1 χ IO4细胞]移至 各立方体并在37°C孵育30分钟，然后将1 ml成骨培养基加入到各孔。未接种的材料样品用作对照。在指定间隔之后，将材料在经缓冲的甲醛溶液中固定并包埋在甲基丙烯酸树脂 中。用钨刀切下IOym切片。用细胞绿色荧光探针(cell tracker green)和乙啡啶同型二聚体_1 (ethidium homodimer-1)进行荧光染色，并用苏木精和伊红进行组织染色，表明在丝心蛋白-磷灰石 材料的孔中和表面上存在活的HBMSC (人骨髓基质细胞)。到第3天可见细胞向内生长，7 天后观察到多孔整体制品完全定殖。通过I型胶原和碱性磷酸酶免疫细胞化学证实，HBMSC在培养3周后仍保持活性， 并在材料内保持成骨细胞表型。实施例7
检测丝心蛋白-磷灰石材料的程序体内检测
在3 mm3的完全水合的经高压灭菌材料中接种人骨髓基质细胞。无经预先孵育而将它 们在皮下植入麻醉下的8只免疫缺陷MFI nu/nu小鼠中。
接种的样品位于各动物的左侧，未接种的对照位于各动物的右侧。小鼠培养4、8 和12周，然后处死。检查了采自小鼠的经细胞接种的材料的苏木精和伊红染色的甲基丙烯酸乙二醇 酯树脂切片(图12-15)。8周之后，所述切片显示在多孔材料表面上存在着由成骨细胞分 泌的新形成的骨。在类骨质表面和结缔组织鳞屑上观察到成骨细胞栅。在类骨质基质表面 观察到由多核破骨细胞构成的新形成骨的重塑证据。在接种和未接种的对照中，没有观察 到不良细胞或组织反应的证据。这些观察以及上述体外测定结果表明了二异氰酸酯交联材料的优异的生物相容 性。体内测定的观察进一步有力表明上述材料是高度成骨性的、上述材料被缓慢再吸收、 并且在材料中重新形成的骨经历重塑。观察
上述多孔的、可再吸收的、生物相容的、无热原的、可植入材料是非常有利的，因为它将 接近于先前确定的目标值的压缩强度、压缩弹性模量和压缩刚度的性能与合适的再吸收率 和优异的组织再生性能结合。这些性能使所述材料适用于所有立即或非立即承重应用、非 承重应用和作为同种异体移植和自体移植骨的替代物。可植入材料与天然骨在机械性能方面的相似性使该材料能立即承载骨在正常运 动中所经受的应力，因此避免延长卧床休息时间的需要并将内部或外部支持物的使用降到 最低。该可植入材料因此可在承重植入物位置上使用以替代所有或部分骨，或者位于骨与 金属或陶瓷或塑料的假体之间。该可植入材料的优异的刚度使它特别适合嵌塞移植，因为在植入期间孔隙受到保 护而不会垮塌，允许细胞和血管的快速进入。因此，该可植入材料也可用于填充骨骼缝隙。可植入材料的高度而开放的孔隙和大平均孔径使间充质干细胞、成骨细胞、破骨 细胞和发展中的毛细血管能迁移到材料中，促进材料转化为天然骨。这与可植入材料的优 异的生物相容性和对细胞的粘附性共同允许细胞在材料孔隙内的粘附、生长和分化，使骨 能够快速重新产生。可植入材料的缓慢可再吸收性使它能逐渐地和完全地被功能性内源骨替代。
权利要求
1.从丝心蛋白溶液制备用于修复、增强或替代骨的可植入材料的方法，所述方法包括 以下步骤-从所述丝心蛋白溶液制备凝胶；和-通过使所述凝胶经历一个或多个冷冻和融化该凝胶的步骤而制备材料，其中从所述丝心蛋白溶液制备所述凝胶的步骤是在磷酸盐离子存在下进行的。
2.权利要求1的方法，其中所述方法包括随后用交联剂处理所述材料的进一步步骤。
3.从丝心蛋白溶液制备用于修复、增强或替代骨的可植入材料的方法，所述方法包括 以下步骤-从所述丝心蛋白溶液制备凝胶；-通过使所述凝胶经历一个或多个冷冻和融化该凝胶的步骤而制备材料，其中所述方法包括随后用异氰酸酯处理所述材料的进一步步骤。
4.权利要求3的方法，其中所述凝胶用磷酸盐离子处理，或从所述丝心蛋白溶液制备 所述凝胶的步骤是在磷酸盐离子存在下进行的。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中从所述丝心蛋白溶液制备所述凝胶的步骤包括 用碱性溶液处理所述丝心蛋白溶液。
6.权利要求1-2和4-5中任一项的方法，其中从所述丝心蛋白溶液制备所述凝胶的步 骤包含含有磷酸盐离子的胶凝剂。
7.权利要求2-6中任一项的方法，其中在用所述交联剂处理所述材料之前，将所述材 料用钙离子处理以形成丝心蛋白-磷灰石。
8.权利要求7的方法，其中用钙离子在pH约7.0至约10. 0的溶液中处理所述材料。
9.权利要求7或8中任一项的方法，其中通过氯化钙溶液提供钙离子。
10.权利要求9的方法，其中将所述材料用乙醇洗涤以除去过量氯化钙并使丝心蛋白 转化成丝II状态。
11.权利要求10的方法，其中在洗涤步骤之后将所述材料干燥。
12.权利要求2-11中任一项的方法，其中所述交联剂包括异氰酸己酯(HMI)、异氰酸 甲酯(MIC)、六亚甲基二异氰酸酯(HDI)、二异氰酸亚甲基二苯酯(MDI)、甲苯二异氰酸酯 (TDI)和异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI)中的一种或多种。
13.权利要求2-12中任一项的方法，其中使用所述交联剂的处理是在基本上没有丝心 蛋白溶胀剂的条件下进行的。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述方法还包括在从所述丝心蛋白溶液制备 所述凝胶的步骤之前，将骨锚定装置的一端插入到所述丝心蛋白溶液中。
15.权利要求2-14中任一项的方法，其中所述方法包括在一个或多个漂洗步骤中从所 述材料除去过量交联剂的进一步步骤。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述方法包括在水中漂洗所述材料的进一步 步骤，以水解过量CNO基团。
17.权利要求16的方法，其中所述方法包括将所述材料干燥的进一步步骤。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述材料是经灭菌的。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述丝心蛋白溶液是再生丝心蛋白溶液。
20.权利要求19的方法，其中所述再生丝心蛋白溶液是通过包括用包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的离子试剂处理丝或丝茧的方法制备的，所述阳离子和阴离子具有至 少1. 05埃的离子半径和在25°C下-0. 001至-0. 05的Jones-Dole B系数。
21.从再生丝心蛋白溶液制备用于修复、增强或替代骨的可植入材料的方法，其中所 述再生丝心蛋白溶液是通过包括用包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的离子试剂处 理丝或丝茧的方法制备的，所述阳离子和阴离子具有至少1. 05埃的离子半径和在25 V 下-0. 001 至-0. 05 的 Jones-Dole B 系数。
22.权利要求20或21中任一项的方法，其中所述离子试剂包括氢氧化铵、氯化铵、溴化 铵、硝酸铵、氢氧化钾、氯化钾、溴化钾、硝酸钾、氢氧化铷、氯化铷、溴化铷或硝酸铷中任何 一种或多种的水溶液。
23.权利要求20-22中任一项的方法，其中所述丝或丝茧是脱胶的。
24.权利要求23的方法，其中所述丝或丝茧的脱胶包括从所述丝或丝茧中选择性除去 丝胶蛋白并使用裂解丝胶蛋白、但产生极少或完全不产生丝心蛋白的裂解的蛋白水解酶。
25.权利要求20-24中任一项的方法，其中所述方法包括使所述丝或丝茧干燥的进一 步步骤。
26.从属于权利要求23或M中任一项时的权利要求25的方法，其中所述干燥步骤是 在使用所述离子试剂的处理和所述脱胶步骤已经完成之后才进行的。
27.权利要求23-26中任一项的方法，其中所述方法包括将所述脱胶的丝或丝茧溶于 离液剂的后续步骤。
28.权利要求27的方法，其中将所述脱胶的丝或丝茧溶解的步骤可以在下列任一条件 或下列条件的任何组合下进行在小于60°C的温度下；使用小于9. 5M的离液剂浓度；和进行小于M小时的时间段。
29.权利要求27或观中任一项的方法，其中所述离液剂包含一种或多种溴化锂、硫氰 酸锂或硫氰酸胍。
30.权利要求27-29中任一项的方法，其中通过渗析而从所述溶液中除去所述离液剂。
31.权利要求19-30中任一项的方法，其中将所述再生丝心蛋白溶液浓缩至约10%w/v 的浓度。
32.通过权利要求1-31中任一项的方法获得的可植入的修复、骨增强或骨替代材料。
33.用作骨修复、增强或替代材料的可植入丝心蛋白材料，其中所述材料具有以下性能-通过J-积分方法测定的在6%应变下的约1 kj m_3至约20 kj m_3的压缩刚度；-在5%应变下的约0. 1 Mpa至约20 Mpa的压缩强度；和-在5%应变下的约100 Mpa至约500 Mpa的平均压缩弹性模量。
34.权利要求33的材料，其中所述材料包含丝心蛋白-磷灰石。
35.权利要求34的材料，其中将所述磷灰石以丝心蛋白-磷灰石纳米复合物的形式分 布遍及所述材料。
36.权利要求34或35中任一项的材料，其中所述磷灰石作为涂层存在于所述丝心蛋白 材料表面。
37.权利要求33-36中任一项的材料，其中所述材料包含多向互通孔。
38.权利要求37的材料，其中平均孔径为约25μ m至约300 μ m。
39.权利要求37或38中任一项的材料，其中至少部分磷灰石存在于孔壁内。
40.权利要求33-39中任一项的材料，其中所述材料含有约15%w/v至约70% w/v的磷酸钙含量。
41.权利要求33-40中任一项的材料，其中所述材料包含丝心蛋白-丝心蛋白交联。
42.权利要求35-41中任一项的材料，其中所述材料包含粗糙粘附表面。
43.权利要求33-42中任一项的材料，其中将所述材料接种组织培养细胞，包括骨髓基 质细胞、间充质干细胞、来自成骨细胞系的细胞、血细胞或从目标患者中采集的细胞。
44.包含权利要求32-43中任一项的可植入材料的植入物，其用于在整形外科应用中 修复、增强或替代一种或多种骨的几乎全部或部分，或用作骨移植物的替代物。
45.权利要求44的植入物，其中所述植入物包括植入所述材料中的骨锚。
46.权利要求45的植入物，其中所述骨锚包括植入所述材料中的多个丝线或细丝。
47.权利要求32-43中任一项的可植入材料或权利要求44-46中任一项的植入物在整 形外科应用中用于修复、增强或替代一种或多种骨的几乎全部或部分，或用作骨移植物的 替代物，或用作固定装置的用途。
全文摘要
本发明描述了从丝心蛋白溶液制备用于修复、增强或替代骨的可植入材料的方法，所述方法包括以下步骤从所述丝心蛋白溶液制备凝胶；通过将所述凝胶经历一个或多个冷冻和融化该凝胶的步骤而制备材料，其中从所述丝心蛋白溶液制备所述凝胶的步骤是在磷酸盐离子存在下进行的。所述材料可经钙离子处理以形成丝心蛋白-磷灰石。一种进一步的方法包括用异氰酸酯处理所述材料的步骤。本发明也扩展到用于制备可植入材料的方法，其中使用再生丝心蛋白溶液。同样，也包括可植入材料和植入物。
文档编号A61L27/46GK102137686SQ200980132958
公开日2011年7月27日 申请日期2009年6月24日 优先权日2008年6月24日
发明者科林斯 A., 奈特 D., 斯凯尔 N., L. D. 盖森斯 T. 申请人:奥索克斯有限公司