对饱腹感激素释放的刺激的制作方法

专利名称：对饱腹感激素释放的刺激的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及用电刺激诊断和/或治疗代谢紊乱。
背景技术：
人类已经进化到可在食物短缺时代储存能量。由于西方世界的大部分人都可以轻 易地获得食物，储存过量能量的能力导致病态肥胖症和2型糖尿病(T2D)的发病率升高。月巴胖症和T2D共影响了美国的约8000万人和全世界的约5亿人。患有此类病症的患者因相关联的共病(包括心血管疾病和关节炎)而发病率和死亡率升高。一类与调节人体自身的血糖控制激素即胰高血糖素样肽(GLP-I)的关键激素相似的新型药物在减轻T2D和肥胖症的尝试中已取得了一些进展，它们被称为“肠促胰岛素类似物”。艾塞那肽(Exenatide)是一种肠促胰岛素类似物，其对血糖控制和减重都有所助益(SchnabelCA，Wintle M，and Kolterman 0. Metabolic effects of the incretin mimeticexenatide in the treatment of type 2 diabetes. Vasc Health Risk Manag 2 :69-77，2006(肠促胰岛素类似物艾塞那肽在治疗2型糖尿病过程中对代谢的效应， Schnabel CA,Wintle M和Kolterman 0，《血管健康与风险管理》第2卷第69至77页，2006 年))。通常，由碳水化合物、脂肪和蛋白质组成的膳食中存在的养分(称为消化道中的“消化物”)会刺激人体自身的肠促胰岛素释放到血流中。由位于粘膜(其为肠的最里面的内 (腔内)壁)中的特异性L细胞释放的关键激素可协调人体对膳食的反应。该激素通过诱发饱腹和停止进食感(饱食感)来产生该作用，这引起胰岛素的释放来维持适当的血糖水平(肠促胰岛素效应)并放慢通过消化道的内容物的速度(延迟胃排空并放慢小肠输送速度)。这些效应统称为“回肠制动”。由Spiller在1984年首次提出的术语“回肠制动”是指肽YY的作用(Spiller RC Trotman IF, Higgins BE, Ghatei MA, Grimble GK, Lee YC, Bloom SR, Misiewicz JJ, and Silk DB.The ileal brake__inhibition ofjejunal motility after ileal fat perfusion in man. Gut 25 :365_374，1984 (回肠制动-人体内回肠脂肪灌注后对空肠运动的抑制，Spiller RC,Trotman IF,Higgins BE,Ghatei MA,Grimble GK、Lee YC,Bloom SR、 Misiewicz JJ和Silk DB，《内脏》第25卷第365至374页，1984年))；然而，在发挥作用的激素(如PYY、GLP-I和GLP-2等)和这些激素释放的多种效应(胃排空、停止进食的饱腹感、引起胰岛素分泌)这两方面，最近的研究扩展了对该重要机制复杂性的理解。回肠制动不足，即身体不能对膳食作出反应而足量地释放这些激素，是肥胖症和 T2D的促成因素。在非肥胖非糖尿病个体中，空腹GLP-I水平在5-lOpmol/L范围内，进 ^jpi^/K5FftiiSif-M 15-50pmol/L(Drucker DJ, and Nauck MA. The incretin system glucagon-likepeptide-1 receptor agonists and dipeptidyl peptidase-4 inhibitors in type 2diabetes. Lancet 368 :1696-1705，2006 (肠促胰岛素系统2 型糖尿病的胰高血糖素样肽-1受体激动剂和二肽基肽酶_4抑制剂，Drucker DJ和Nauck MA,《柳叶刀》 第368卷第1696至1705页，2006年))。在T2D患者中，与膳食相关的GLP-I升高显著减弱(Toft-Nielsen MB, Damholt MB, Madsbad S, Hilsted LM, Hughes TE, Michelsen BK, andHolst JJ. Determinants of the impaired secretion of glucagon-likepeptide-1 in type 2 diabetic patients. J Clin Endocrinol Metab 86 :3717_3723，2001 (2 型糖尿病患者体内胰高血糖素样肽-1分泌受损的决定因素，Toft-Nielsen MB, Damholt MB、 Madsbad S、Hilsted LM、Hughes TE、Michelsen BK 和 Hoist JJ,《临床内分泌学与代谢杂志》第86卷第3717至3723页，2001年))。此类患者的胰岛素水平降低归因于GLP-I水平不足，而不是胰腺对GLP-2的释放胰岛素响应不充分(Toft-Nielsen MB, Madsbad S， and Hoist JJ. Continuoussubcutaneous infusion of glucagon-like peptide 1 lowers plasma glucoseand reduces appetite in type 2 diabetic patients. Diabetes Care 22 =1137-1143，1999 (连续皮下输注胰高血糖素样肽1降低2型糖尿病患者的血糖并减少其食欲，Toft-Nielsen MB、Madsbad S和Hoist JJ,《糖尿病护理》第22卷第1137至1143 页，1999年))。相似地，肥胖受试者具有较低的基础空腹激素水平，并具有较小的膳食相关激素水平升高(Small CJ,and Bloom SR. Gut hormones and the control ofappetite. Trends Endocrinol Metab 15 :259_263，2004 (胃肠激素和食欲控制，Small CJ 和 Bloom SR,《内分泌学和新陈代谢趋势》第15卷第259至263页，2004年))。因此，提高GLP-I的人体内源性水平预计对肥胖症和糖尿病都会有影响。GLP-I以若干形式存在。在细胞内，GLP-I的前体为胰高血糖素原，其被裂解而形成GLP-l-(l-37)，随后下一步为从N端移除开始的六个氨基酸，形成两种已知的GLP-I 生物活性形式。大多数GLP-I (大约80% )被酰胺化而形成GLP-I (7-36)NH2,少数(大约 20%)为GLP-I (7-37)。这种蛋白酶解过程于分泌前在细胞内发生，并且这两种形式构成了 GLP-I的生物活性形式。GLP-I (7-36)NH2和GLP-I (7-37)两者均可提高胰岛素对血糖的反应，而且在释放后，GLP-I在人体内被蛋白酶二肽基肽酶IV(DPP-IV)代谢为无活性的 GLP-I (9-36)酰胺(Vahl TP,Paty Bff,Fuller BD,Prigeon RL, and D' Alessio DA. Effects ofGLP-l-(7-36)NH2, GLP-I-(7-37), and GLP-I-(9-36)NH2 on intravenousglucose tolerance and glucose-induced insulin secretion in healthyhumans.J Clin Endocrinol Metab 88 :1772-1779，2003 (GLP-1 (7-36) NH2、GLP-1 (7-37)和 GLP-1 (9-36) NH2对健康人体内静脉注射葡萄糖耐量和葡萄糖引发的胰岛素分泌的效应，Vahl TP、 PatyBff, Fuller BD、Prigeon RL和D' Alessio DA,《临床内分泌学与代谢杂志》第88卷第1772至1779页，2003年))。增加GLP-I的内源活性形式的药物方法包括使用二肽基肽酶-4ΦΡΡ-4)抑制剂(如维格列汀)来抑制它的降解。在糖尿病患者中，通过用维格列汀提高GLP-I的循环水平来获得对血糖控制的改善(Ahren B, Pacini G，Foley JE, and Schweizer A. Improved meal-related beta-cell function and insulinsensitivi by the dipeptidyl peptidase-IV inhibitor vildagliptin inmetformin-treated patients with type 2 diabetes over 1 year. DiabetesCare 28 :1936-1940, 2005 (使用二肽基肽酶-IV抑制剂维格列汀改善了用二甲双胍治疗长达1年的2型糖尿病患者的与膳食相关的β细胞的功能和胰岛素敏感度，Ahren B、Pacini G、Foley JE和Schweizer A, 《糖尿病护理》第28卷第1936至1940页，2005年))。在单独用药物治疗未得到良好控制的T2D和肥胖症患者中，还存在尚未满足的治疗需求。目前，对病态肥胖症最有效的治疗方式是减肥手术，其可以使77%的具有共病现象的患者减重并改善 T2D(Buchwald H, Avidor Y, Braunwald Ε, Jensen MD, Pories W, FahrbachK, and Schoelles K. Bariatric surgery -.a systematic review andmeta-analysis. Jama 292 :1724-1737，2004 (减肥手术系统评论和荟萃分析， Buchwald H、Avidor Y、Braunwald E、Jensen MD、Pories W、Fahrbach K 禾口 Schoelles K，《美国医学会杂志》第292卷第1724至1737页，2004年))。对病态肥胖患者实施 Roux-en-Y胃旁路术之后，激素水平甚至在体重显著减轻前就发生了改变(Rubino F， GagnerM, Gentileschi P, Kini S, Fukuyama S, Feng J, and Diamond Ε.The earlyeffect of the Roux-en-Y gastric bypass on hormones involved in bodyweight regulation and glucose metabolism. Ann Surg 240 :236_242，2004 (Roux-en-Y 胃旁路术对涉及体重调节和葡萄糖代谢的激素的早期效应，Rubino F、Gagner M、Gentileschi P、Kini S、 Fukuyama S、Feng J 和 Diamond Ε,《外科年鉴》第 240 卷第 236 至 242 页。2004 年))。 对减肥手术后的患者进行的大量研究表明，肠促胰岛素通路有助于观察到T2D改善和减重。具体地讲，手术后与膳食相关的循环GLP-I水平有所提高(Laferrere B, Heshka S， Wang K, Khan Y, McGinty J, Teixeira J, Hart AB, and Olivan B. Incretin levels and effect are markedlyenhanced 1 month after Roux-en-Y gastric bypass surgery in obes印atients with type 2 diabetes. Diabetes Care 30 :1709_1716，2 007 (患有 2 型糖尿病的肥胖症患者在接受Roux-en-Y胃旁路手术后1个月其肠促胰岛素水平和效应显著提高，Laferrere ΒλHeshka SΛWang KΛKhan Y、McGinty J、Teixeira JΛHart AB禾口Olivan B， 《糖尿病护理》第 30 卷第 1709 至 1716 页，2007 年)；Whitson BAiLeslie DBiKellogg TA， Maddaus MAiBuchwald HiBillington CJ,and Ikramuddin S. Entero-endocrine changes after gastric bypass in diabetic and nondiabeticpatients :a preliminary study. J Surg Res 141 :31_39，2007 (糖尿病患者和非糖尿病患者在接受胃旁路术后肠内分泌发生改变初步研究，Whitson BA、Leslie DB^Kellogg TA^Maddaus MA^Buchwald H^Billington CJ和Ikramuddin S，《外科研究杂志》第141卷第31至39页，2007年))。然而，减肥手术被认为是极端的治疗措施，并且目前仅建议对病态肥胖患者实施该手术。在2008度美国糖尿病学会会议上，(.!1.501~1丨，10.博士(Billings Clinic,Montana)报告了使用研究性旁路的微创方法，该研究性旁路包括通过内窥镜放置并在十二指肠入口处用有倒钩的金属锚固件扣紧的不可渗透的含氟聚合物套管。在一周的时间内，该套管改善了 16名患者的血糖控制，但因为研究时间较短，没有观察到体重减轻。因此，使用既可减重又可改善血糖控制的装置(其具有手术时间短、无需全身麻醉并易于恢复的前景)较之侵入式减肥手术具有优势。

发明内容
在一个方面，本发明提供了刺激受试者释放一种或多种饱腹感激素的方法，这些方法包括在受试者胃肠系统中的组织的L细胞接触养分刺激的同时，向所述组织施加第一电刺激。在另一方面，本发明提供了预测患者对减重手术的反应的方法，这些方法包括 在所述患者胃肠系统中的组织的L细胞接触养分刺激的同时，向所述组织施加第一电刺激；评估价电刺激对所述患者的效果；以及将所述效果与所述患者对减重手术的反应相关联。


图1示出用于向切开的大鼠回肠施加电刺激的组件。图2示出从整个胃肠道上切下的片段在亚油酸中培养45分钟后释放的GLP-I的浓度。图3示出对小肠和大肠的上皮粘膜中存在的GLP-I进行分析得出的结果。图4示出在具有(两例)和不具有3mg/mL亚油酸的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液中培养期间，GLP-I浓度随时间升高。图5图示了在存在亚油酸的情况下响应各种电刺激条件而释放的GLP-I与仅暴露于亚油酸的成对样品相比的差值。图6示出了与上图相同的数据，但响应各种电刺激条件所释放的GLP-I是以百分 t匕给出ο图7示出了神经毒素对施加或未施加电刺激的亚油酸引发的GLP-I释放效应的影响。图8表明刺激过程中每相位传递的平均电荷(QaJ取决于平均电流(IaJ和脉冲宽度(PW)。图9示出了离体回肠在各种培养和刺激条件下保持40分钟后，其肌肉张力的变化。
具体实施例方式结合对构成本公开一部分的附图和实例的下列详细说明，可以更易于理解本发明。应当理解，本发明不限于本文所述和/或所示的具体产品、方法、条件或参数，并且本文所用术语仅用于以举例的方式描述具体实施例的目的，并非旨在限制受权利要求书保护的本发明。在本公开中，除非上下文另行明确指出，否则单数“一个”、“一种”和“所述”包含复数含义，对具体数值的引用至少包括该具体数值。因此，例如当提及“一个刺激”时，是指一个或多个这类刺激，以及本领域技术人员已知的该刺激的等同物，等等。当前面用“约”将值表示为近似值时，应当理解，该具体值形成了另一个实施例。如本文所用，“约X”(此处X 为数值)优选地指所引用值士 10%，包括端点值。例如，短语“约8”是指7.2至8.8之间的值，包括端点值；又如，短语“约8%”是指7. 2%至8. 8%之间的值，包括端点值。凡是存在的，所有范围均包括端点值并且是可组合的。例如，当引用“1至5”的范围时，所引用范围应当理解为包括“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2 & 4-5”、“1-3 & 5”等范围。本文所引用或描述的每一项专利、专利申请和专利公开中的公开内容均在此全文以引用方式并入本文中。除了其他方面，本发明提供了增强人体内源性GLP-I对进入小肠的养分的反应、 从而为肥胖症或糖尿病患者提供治疗价值的位点特异性方法。如本文所述，已发现对肠进行电刺激的特定疗法可增加主要的饱腹感激素的释放。如本文所示，可以将电刺激施加到离体肠的片段上，以增加响应养分亚油酸的GLP-I释放。此外，还证明了电刺激可以直接作用于响应养分而生成这些激素的肠中细胞L细胞。L细胞释放可调节胰岛素分泌、血糖稳态、胃排空、肠道转送和饱腹感的回肠制动激素。它们遍布于小肠和大肠，其中绝大多数细胞位于远端小肠(回肠)和近端结肠中。有趣的是，在T2D患者体内，肠中的L细胞数增多 (Theodorakis MJ,Carlson O,Michopoulos S,Doyle ME,Juhaszova Μ,Petraki K,and Egan JM. Human duodenal enteroendocrinecells :source of both incretin peptides, GLP-I and GIP.Am J PhysiolEndocrinol Metab 290 :E550_559，2006 (人类十二指肠肠内分泌细胞肠促胰岛素肽 GLP-I 和 GIP 两者的来源， Theodorakis MJ, Carl son O,Michopoulos S、 Doyle ME、Juhaszova Μ、Petraki K和Egan JM,《美国生理学杂志内分泌学与新陈代谢》 第290卷第Ε550至559页，2006年))，似乎这些患者的体内正试图补偿减弱的激素释放。如本文所公开，使用位点选择性电刺激来促进肠释放GLP-I的优点在于增加的 GLP-I可在释放的几分钟内局部地影响GLP-1。GLP-I作用的局部位点在位于肠和肝门静脉血管循环中的迷走神经末梢上的自身受体上(Vahl TP, Tauchi M，Durler TS, Elfers EE, Fernandes TM, Bitner RD, Ellis KS, Woods SC, Seeley RJ, Herman JP, and D' Alessio DA. GLP-I receptors expressed on nerve terminals in the portal vein mediatethe effects of endogenous GLP-I on glucose tolerance in rats. Endocrinology 2007 (在门静脉中的神经末梢上表达的GLP-I受体可间接促成大鼠体内内源性GLP-I对葡萄糖耐量
Vahl TP、TauchiM、Durler TS> Elfers EE> Fernandes TM、Bitner RD、Ellis KS> WoodsSC,Seeley RJ,Herman JP 和 D' Alessio DA，《内分泌学》，2007 年))。因此，释放的 GLP-I增量在局部产生作用，而不会抑制循环的GLP-I的正常降解。与外源药理学药剂给药相比，预计该方法的不良反应更小。因此，可以使用肠内电刺激来让身体自然运行，并且在身体自然运行时使之更有效地运行。据报道，植入肥胖症患者胃中的电刺激装置对体重减轻具有可更改的积极效应 (Zhang C, Ng KL, Li JD, He F, Anderson DJ, Sun YE, andZhou QY. Prokineticin 2 is a target gene of proneural basichelix-loop-helix factors for olfactory bulb neurogenesis. J Biol Chem 282 :6917_6921，2007 (前动力蛋白2为形成嗅球神经的原神经碱性螺旋-环-螺旋因子的靶基因，Zhang C、Ng KL、Li JD、He F、Anderson DJ、Sun YE 和Zhou QY,《生物化学杂志》第282卷第6917至6921页，2007年))，并继减重后改善了 T2D患者的血糖控制。预计这种刺激不会直接对L细胞产生作用，因为胃中没有这种细胞。 对肥胖症或糖尿病患者进行的肠电刺激研究为数较少，并且这些研究倾向于报告所得到的神经和运动性效应。例如，对于糖尿病神经病变，向位于小肠口端的十二指肠给予电刺激产生较对照组患者更弱的神经反应(Frokjaer JB, Andersen SD, Ejskaer N, Funch-Jensen P, Arendt-NielsenL, Gregersen H, and Drewes AM.Gut sensations in diabetic autonomicneuropathy. Pain 131 :320_329，2007 (糖尿病自主神经病变中的肠道感觉， Frokjaer JB、Andersen SD>Ejskaer N、Funch-Jensen P>Arendt-Nielsen L>Gregersen H 和Drewes AM,《疼痛》第131卷第320至329页，2007年))。对于健康的志愿者，十二指肠电刺激可延迟胃排空并降低水摄入(Liu S,Hou X，and Chen JD. Therapeuticpotential of duodenal electrical stimulation for obesity :acute effects ongastric emptying and water intake. Am J Gastroenterol 100 :792_796，2005 (十二指肠电刺激治疗肥胖症的潜力对胃排空和水摄入的急性作用，Liu S, Hou X和Chen JD，《美国胃肠病学杂志》 第100卷第792至796页，2005年))。对于大鼠和狗的临床前模型，刺激小肠近(a)端的十二指肠(20Hz，6mA，300ms)减少了食物摄入，并且该效应在大鼠中持续了 4周(Yin J， Ouyang H,and Chen JD. Potentialof intestinal electrical stimulation for obesity a preliminary canine study. Obesity (Silver Spring) 15 :1133_1138，2007 (肠电刺激治疗肥胖症的潜力初步的犬研究，Yin J、Ouyang H和Chen JD，《肥胖症》(SilverSpring) 第 15 卷第 1133 至 1138 页，2007 年)；Yin J, Zhang J, and ChenJD. Inhibitory effects of intestinal electrical stimulation on food intake, weight loss and gastric emptying in rats. Am J Physiol Regul Integr CompPhysiol 293 :R78-82,2007 激对大鼠食物摄入、体重减轻和胃排空的抑制作用，Yin J>Zhang J和Chen JD，《美国生理学杂志调节、整合与比较生理学》第293卷第R78至82页，2007年))。在这些研究中，对食物摄入的积极效果归因于运动性改变，而不是改变的激素水平，未见有这方面的报道。通过电刺激改变神经(如迷走神经和交感神经)的活性可以调节GLP-I，然而已证明，对代理猪回肠的迷走神经的直接电刺激对GLP-I释放仅有微弱的刺激作用(Hansen L, Lampert S, Mineo H, and Hoist JJ. Neural regulation of glucagon—like peptide—1 secretion in pigs. Am JPhysiol Endocrinol Metab 287 :E939_947，2004 (猪胰高血糖素样肽-I分泌的神经调节，Hansen L、Lampert S、Mineo H和Hoist JJ，《美国生理学杂志内分泌学与新陈代谢》第287卷第E939至947页，2004年))。众所周知，迷走神经感知进入胃部的食物，并通过长反射环经由大脑协调使该信息返回肠，从而通过促使 GLP-I增加使肠准备产生回肠制动反应(Rocca AS, and Brubaker PL. Role of the vagus nerve inmediating proximal nutrient-induced glucagon—like peptide-1 secretion. Endocrinology 140 :1687-1694，1999 (迷走神经在介导养分引起的近侧胰高血糖素样肽-1分泌中的作用，Rocca AS和Brubaker PL,《内分泌学》第140卷第1687至1694页， 1999年))。在美国专利公布No. 2007/0179556中描述了一个实验，其中由通过手术植入狗的远端回肠的装置施加的电刺激导致GLP-I的释放时机和血中浓度发生改变。通过由手术插入胃部的电阻抗感测装置模拟反射机制，以确定胃的横截面积，并结合植入肠中的电刺激装置引起GLP-I释放(同上)。胃横截面积的增大与胃运动性的改变和饱腹感相关。目前已发现，单独使用的电刺激参数不会弓I起肠L细胞释放GLP-I，除非此类细胞同时暴露于养分如亚油酸，这种情况据知通常会释放回肠制动激素。该发现表明，可以将局部植入的肠电刺激装置设计成暂时起效的，因为这样就可以在电刺激与养分刺激在部分时间同时存在时才增加GLP-I的释放。 本文证明的第二个意想不到的结果是在存在神经毒素的情况下，电刺激可增强响应亚油酸而释放的GLP-I。可通过阻滞钠通道而防止神经传导的浓度为0. 5μ M的河豚毒素的存在，不会阻止通过直接电刺激回肠组织而引起的GLP-I的双倍增加。L细胞不是来源于与神经细胞相同的胚胎谱系，然而它们具有神经细胞的许多特性。已在分泌GLP-I的肠细胞系上识别出神经型离子通道(Reimann F, Maziarz M, Flock G, Habib AM, Drucker DJ, and Gribble FM. Characterization andfunctional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-likepeptide-1 secreting GLUTag cell line. J Physiol 563 161-175,2005(电压门控性阳离子传导在分泌胰高血糖素样肽_1的GLUTag细胞系中的特性描述和功能，Reimann F、Maziarz M、Flock G、Habib AM、DruckerDJ 和 Gribble FM,《生理学杂志》第 563 卷第 161 至 175 页，2005 年)；Gameiro A, Reimann F, Habib AM,O' Malley D,Williams L,SimpsonAK,and Gribble FM. The neurotransmitters glycine and GABA stimulateglucagon—like peptide—1 release from the GLUTag cell line. J Physiol 569 :761_772，2005 (神经递质甘氨酸和GABA刺激GLUTag细胞系释放胰高血糖素样肽-1，Gameiro A、Reimann F、Habib AM、0' Malley D、Williams L、Simpson AK 禾口 Gribble FM,《生理学杂志》第569卷第761至772页，2005年))。虽然无意受任何具体理论的约束，但可设想的是电刺激就地直接改变了肠中细胞的兴奋性并增强了它们对养分刺激的激素反应。因 此，对小肠的电刺激不依赖于神经刺激，而是直接响应腔内养分刺激而顺利地改变来自内分泌细胞(包括，例如L细胞)的至少一种(并有可能是一系列)激素的释放。 实质上讲，本文所公开的电刺激的精确方式可产生助力回肠制动。在一个方面，本发明提供了刺激受试者释放饱腹感激素的方法，这些方法包括在让受试者胃肠系统的组织的L细胞接触养分刺激的同时，向所述组织施加第一电刺激。组织可以是形成肠的最内层壁的粘膜组织。在其他实施例中，组织可以是形成肠的最外层壁的浆膜组织。如本文所用，“饱腹感激素”是由一种或多种内分泌组织分泌出的要素，其通过与其一种或多种受体发生交互作用引发可抑制食欲、减少食物摄入或这两者的满足感和 /或饱腹感。一种示例性的饱腹感激素为GLP-I。“刺激饱腹感激素的释放”包括直接和间接刺激激素的释放；例如，电刺激可能是激素(如来自L细胞)释放的直接原因，并且/或者电刺激可能引发最终导致饱腹感激素释放的一连串或一系列事件。此类一连串或一系列事件可以包括刺激一类饱腹感激素，其转而又导致一种或多种其他类型的饱腹感激素或更多的第一类饱腹感激素释放。可以对胃肠系统的任何组织施加第一电刺激。例如，可以对回肠的粘膜组织施加刺激；在具体情况中，可以对远端回肠的粘膜组织施加刺激。与现有的方法相比，本发明可以包括对形成为胃肠系统的内腔里层的粘膜组织施加电刺激，这与仅对胃肠器官的外表面施加电刺激(例如对胃或肠的浆膜施加电刺激)形成对照。已经发现，将直接刺激粘膜组织与本发明的其他的具体方面相结合可提供非常有利的结果。目前已发现，在施加第一电刺激期间使用特定的电参数对于饱腹感激素的最佳释放是优选的。根据本发明而可以不同的示例性电参数包括频率、电压和脉冲持续时间。第一电刺激可以具有约0. IHz至约90Hz的频率；例如，刺激的频率可以为约0. 1Hz、约0. 15Hz、 约 0. 2Hz、约 0. 4Hz、约 IHz、约 4Hz、约 IOHz、约 20Hz、约 25Hz、约 30Hz、约 35Hz、约 40Hz、约 50Hz、约70Hz或约90Hz。第一电刺激可以具有约0. 5V至约25V的电压；例如，电压可以为约 IV、约2V、约5V、约10V、约15V、约20V或约25V。在特别优选的实施例中，电压为约14V。第一电刺激可以具有约3ms至约500ms的脉冲持续时间；例如，脉冲持续时间可以为约5ms、 约 50ms、约 100ms、约 150ms、约 200ms、约 250ms、约 300ms、约 350ms、约 400ms、约 450ms 或约 500ms。在一些实施例中，可以用约14V的电压、约5ms的脉冲持续时间以及约20至约 80Hz的刺激频率来施加第一电刺激；对于此类实施例，刺激频率可以为(例如)约20Hz、约 40Hz或约80Hz。在其他方面，可以用约14V的电压、约300ms的脉冲持续时间以及约0. 4Hz 的频率来施加第一电刺激。对受试者胃肠系统内腔中的组织施加的电刺激也可表示为电荷(其单位为微库仑(yc))，另外也可将其称为“Q”。第一电刺激可以具有大于3μC的电荷。在其他方面，第一电刺激可以具有介于约3 μ C和约6000 μ C之间(包括3yC和6000μΟ的电荷。在一个具体实施例中，第一电刺激具有约1680 μ C的电荷。另一个实施例涉及施加具有约2800 μ C 电荷的第一电刺激。其他实施例涉及施加具有约3. 75 μ C、约7. 5 μ C、约15 μ C、约 31. 5 μ C、 约280 μ C、约1400 μ C或约5600 μ C电荷的第一电刺激。根据本发明，在组织的L细胞接触养分刺激的同时，向内腔中的组织施加第一电刺激。如本文所用，“同时”是指在对组织施加电刺激的至少部分时间内，L细胞接触到养分刺激。因此，如果施加第一电刺激的总持续时间为1秒，而L细胞与养分刺激的接触时间在施加第一电刺激后为5秒，在施加第一电刺激的过程中为0. 1秒，则可认为在施加第一电刺激的同时接触到养分刺激。组织的L细胞接触养分刺激是指L细胞直接接触养分刺激。 这与一些方法形成了对照，通过这些方法，定时发生的电刺激所响应的仅为进食动作(诸如通过一般地感测表示摄取(包括判读胃部电活动)的胃部生理参数、感测表示开始或即将开始进食的胃窦收缩、检测自然胃起搏的异常部位，或感测胃的电活动的传出神经调节) 或检测到的血糖水平的整体提高(参见，例如美国专利公布No. 2007/0179556第W191]至
段)。养分刺激可以涉及能够引起L细胞释放一种或多种激素的任何物质。示例性的养分刺激物质包括碳水化合物、其他糖类、氨基酸、蛋白质、脂肪酸、脂肪或它们的任何组合。 养分刺激可以采取的形式包括天然食物、补给品(如营养饮料)或以刺激L细胞为明确目的而制成的物质，因此不必是传统意义上的“养分”本身。在本发明的另外的实施例中，可以对受试者胃肠组织上的不止一个位置施加第一电刺激。例如，可以在受试者远端回肠上的两个、三个、四个或更多个位置上施加第一电刺激。“位置”可用在组织与电刺激递送装置(如电极)之间实际接触的面积来限定。因此， 对受试者胃肠组织上的第二位置施加第一电刺激可以包括使电极与未实际接触到向胃肠组织上的初始位置递送电刺激的装置的那部分组织接触。本发明还可以包括对所述受试者的胃肠组织施加第二电刺激。可以对施加第一电刺激的相同胃肠组织上的相同位置、相同胃肠组织上的不同位置、受试者胃肠系统的第二组织或它们的任何组合施加第二电刺激。可以对所述受试者的十二指肠组织(如十二指肠的粘膜组织)、空肠组织(如空肠的粘膜组织)或大肠组织(如大肠的粘膜组织)施加第二电刺激；例如，在对远端回肠施加第一电刺激的情况下，可能已对受试者的第二腔内组织施加了第二电刺激。第二电刺激与第一电刺激在电压、频率、脉冲持续时间、电荷或它们的任何组合方面可不相同。可以在施加第一电刺激的同时施加第二电刺激。就此而论，“同时”是指在对组织施加第一电刺激的至少部分时间内，视情况而定对该组织的相同或不同位置或不同组织施加第二电刺激。因此，如果施加第一电刺激的总持续时间为1秒，而第二电刺激的施加时间在施加第一电刺激后为5秒，在施加第一电刺激的过程中为0. 1秒，则可被认为与第一电刺激的施加同时。根据本发明对组织进行电刺激可为患者诊断提供有益效果。需要一种对患者进行细分的方法，以确定施行肥胖症手术治疗的最佳人选。根据本发明，还提供了预测患者对减重手术的反应的方法，这些方法包括在所述患者胃肠系统中的组织的L细胞接触养分刺激的同时，向所述组织施加第一电刺激；评估施加于患者的电刺激的效果；以及将所述效果与患者对减重手术的反应相关联。

如本文所用，“减重手术”包括减肥手术、植入手术或旨在修改胃肠道的一个或多个部位以减少养分摄入和/或吸收、降低食欲或引起减重和/或保持理想体重的任何其他外科手术。示例性的减重手术包括(尤其是)胆胰分流术、胃垂直束带造形术、可调节胃束带术、袖状胃切除术、胃旁路手术、袖状胃切除及十二指肠转位手术，以及可植入胃刺激作用。可以根据前文所述的有关用于刺激饱腹感激素释放的所公开方法施加电刺激。通常，关于所公开的用于刺激饱腹感激素释放的方法所描述的定义和参数，全部适用于本发明的预测患者对减重手术反应的方法。对施加于患者的电刺激的效果评估可以包括确定一个或多个与回肠制动过程、饱腹感、食欲调节或它们的任何组合相关的生理和/或心理参数的存在，以及任选地确定其量值。例如，对于电刺激效果进行评估可以包括测定一种或多种饱腹感和/或回肠制动激素、葡萄糖或这两者的血中浓度、就患者而言的饱腹感、响应养分刺激而减慢的胃排空和/ 或饱腹感、或它们的任何组合的存在、量值或这两者。在具体实例中，对于电刺激效果进行评估可以包括确定响应试验食物的循环GLP-I的水平、血糖控制的改善程度(例如，如葡萄糖耐量和Hbalc;之类的试验所示)、较早响应膳食而感知饱食感和/或满足感(饱腹感)以及较早停止进食等等。可用于以人工或电子记录来测量食欲和饱腹感的常用视觉模拟评分法包括三因子饮食问卷；食欲、饥饿感和感知问卷(AHSP)；营养协会食欲问卷(CNAQ)和简易营养食欲问卷(SNAQ)；食欲及饮食评估工具(ADAT)。所评估的电刺激对患者的效果可能与患者对治疗干预(例如使用增加GLP-I水平的药物或减重手术进行治疗)的有利反应的可能性增大相关联。例如，在一些其中与回肠制动过程、饱腹感、食欲调节或它们的任何组合相关的一种或多种生理和/或心理参数有所提高的情况下。对前段所描述的措施响应局部电刺激而改善的程度和随后经历减肥手术的患者的体重与T2D的实际改善的回归分析可建立试验的可预测性，作为一种为实施减肥手术而对患者进行细分的手段。因此，根据本发明方法的使用电刺激的微创方法可以用于在治疗之前预测患者的反应，并提高出现积极效果的可能性。通过内窥镜在刺激部位处或其附近放置(优选地暂时放置，但可以任选地永久或长时间放置)合适的装置后，对患者回肠制动激素或葡萄糖的血中浓度增大、饱食感、或响应第二养分刺激(即与根据本发明方法的养分刺激不同的养分刺激，例如营养餐(如营养饮料或标准热量餐))而减慢的胃排空或饱腹感进行监测。 这可用于预测减重和血糖控制改善的实际治疗益处，从而增大对肥胖症和糖尿病患者有选择地进行药物治疗和/或全身麻醉与减肥手术或植入手术后出现积极效果的可能性。根据本发明所公开的任何方法，对患者进行监测也可以构成进行中的患者护理以及随访的一个方面，以使得随着时间推移调节和微调刺激参数成为可能。因此，本发明的方法可以包括随着时间推移修改施加电刺激(例如第一电刺激、第二电刺激或这两者)的一种或多种参数。可以相对于两个单独的时间点作出更改(例如，可在t = 1时施用第一刺激疗法，而在t = 2时施用不同的刺激疗法)或相对于多个时间点进行更改。所述更改可涉及增大或减小一种或多种诸如频率、电压、脉冲持续时间、电荷和位置之类的刺激参数。
更改一种或多种刺激参数的一个目的可以是确定最佳刺激条件。例如，可以根据本发明的方法确定施加电刺激的一个或多个优选的位置。可以针对具体的患者类别(例如，男性患者、女性患者、根据年龄分组的患者、轻度肥胖症患者、中度肥胖症患者、重度肥胖症患者、平均体重的糖尿病患者、未患糖尿病的肥胖症患者、患有糖尿病的肥胖症患者等)或针对个体患者确定最佳刺激条件。在另一方面，可以确定与随后的积极刺激反应相关的最低的最佳电刺激参数，如频率、电压、脉冲持续时间和/或电荷。积极的刺激反应可以包括(例如)响应试验食物的循环GLP-I水平提高、用常规试验(葡萄糖耐量和HbaJ所示的血糖控制改善、较早响应膳食而感知饱食感和/或满足感(饱腹感)以及较早停止进食等等。因此，可以对患者的胃肠组织施加极小的电刺激，并可增大刺激的一种或多种参数，直到获得至少一个充分反应， 然后保持该刺激水平。实例1 测量离体小肠的GLP-I释放用(X)2对8至12周、重250至300g的雌性Sprague-Dawley大鼠实施安乐死，并立即从回盲部开始切下至少17cm的远端回肠。用温热的改性Krebs Ringer碳酸氢盐(KRB) 缓冲液冲洗管腔内容物，并将肠放入装有充氧的冷KRB缓冲液的50mL管中。将大鼠远端回肠的未受损段(1.5cm)纵向放置，口端固定在双极刺激电极之间的器官室中，反口端连接到固态测力传感器上，并使其浸没于装有37°C的KRB的IOml室中，并不断充入95% O2/5% CO2(图1)。图1中的图像示出了电极顶端(箭头)相对于回肠的位置，其中回肠的口端安装在最靠近电极的位置、并在玻璃钩与玻璃丝线之间的张力下保持以压迫传感器(箭头)。 整个组件被放入带夹套的IOmL myobath室内的37°C的KRB缓冲液中。调节每一段的长度， 以使初始静止张力为lg，并将其保持在37°C的KRB缓冲液或含有亚油酸(LA，3mg/mL)和二肽基肽酶-4抑制剂(用于防止GLP-I发生蛋白质水解)的KRB中。使用PowerLab硬件和 Chart软件(AWnstruments (Colorado Springs, CO))将收缩活动数字化，并获得用于离线分析的数据。在分开进行的各实验中，在存在或不存在电场刺激的情况下，将片段放入KRB 或KRB+LA中连续进行45分钟的培养。在45分钟时采集的浴液样品和粘膜的上皮碎屑被冷冻保存("SO0C )。使用检测范围为2 至 IOOpM 的 ELISA (Linco Research (St. Charles，MO))，在酶标仪上通过荧光测量解冻的等分试样中的活性GLP-I浓度。该方法可测量GLP-I的两种生物活性形式，即GLP-I (7-36)和(GLP-l(7-36))酰胺，目前已知它们是由肠粘膜释放的。将 GLP-I的测量值归一化为IOmL体积中的浓度并以pM为单位记录。计算每种处理方式的均值以及SEM GLP-I释放。对于各种电刺激条件(+/-LA)均有2至6只大鼠供使用，每种条件用每只大鼠的2至4个组织片段。在治疗前(开始前约5分钟)和治疗后(开始后40分钟)，测定5分钟内的肌肉张力和收缩幅度(分别计算为平均循环最小值和最大值)。对于各种条件，通过单因素方差分析将-5分钟和+40分钟时的张力和幅度与该条件的基线进行比较。在1、3和lOmg/mL LA中培养的组织在3mg/ml (数据未示出)处产生了最大的 GLP-I响应，将该浓度用于所有后续的实验。十二指肠、空肠、回肠和结肠(但不包括食道或胃)的片段被置于LA(3mg/mL)中培养45分钟，培养基中的GLP-I浓度升高(图2)。图 2示出了在:3mg/mL LA(LL0Q =定量下限)中培养45分钟后得自整个胃肠道的各片段所释
13放的GLP-I的浓度。在离体片段中的这种区域依赖性释放与已知的L细胞在肠中的位置以及它们不存在于上胃肠道(即胃和食道)中是相符的。还分析了得自小肠和大肠的粘膜的GLP-I含量(图3)。图3显示，十二指肠、空肠、回肠和结肠的上皮中的GLP-I是可被测出的。在LA 中培养45分钟后采集小肠和结肠中的粘膜碎屑样本(n =片段的数量，均值+SEM(标准差均值))。在远端回肠粘膜中的GLP-I量最大(图幻。因此，远端回肠被选用来进行所有后续实验的GLP-I释放研究。在;3mg/ml LA中培养的两个回肠片段的GLP-I浓度随着时间升高，然而在KRB缓冲液中培养的回肠片段的GLP-I浓度等于或低于定量水平(图4)。得自51个远端回肠片段的汇集数据显示，在LA中培养45分钟后释放的GLP-K21.9 士 2. 6pM GLP-1)显著高于仅在KRB缓冲液中培养后释放的GLP-I (3. 6士0. IpM GLP-I ；t检验，P < 0. 05 ;n = 12)。实例2 测量电刺激条件下GLP-I的释放共选择了 11种电刺激条件来进行评估。相对于在LA中培养的相同大鼠的回肠对照片段，作为GLP-I浓度绝对变化的差值(图5)和百分比(图6)示出结果。所表示的数据对于7种电刺激条件是一致的。如图6所示，其中8种条件使GLP-I的释放超出了仅在 LA中培养时(归一化为100% )的预计值。如图5所示，8种条件导致了 GLP-I的浓度升高。如图5所示，0. 7V 0.15Hz 300ms使GLP-I超出了对仅存在LA所反应的浓度，在图6中， 14V 4Hz 5ms使GLP-I的百分比高于归一化为100%的LA。如图5和6所示，任一分析均表明，有两种条件未使GLP-I升高至LA以上。它们是14V 0. 4Hz 5ms和2V0. 15Hz 5ms。在不存在LA的情况下，施加到组织上的电刺激条件未引起可检测出的GLP-I释放(2. 3士0. 2pM GLP-I，η = 46，其中46个样本中的38个低于ELISA的检测水平)。神经毒素对刺激GLP-I释放的效应。为了通过组织片段中的神经确定电刺激的效应，将通常用于阻滞神经元中的钠通道的河豚毒素(TTX)以0.5μ M的浓度加入最终的KRB 组织洗涤液中洗涤15分钟(预培养15分钟)。TTX以0. 5 μ M的浓度与亚油酸和/或电刺激同时存在45分钟。仅有TTX对GLP-I的释放无作用，而在存在TTX时LA引起的GLP-I 升高是持续的(图7)。因此，对于LA而言，不需要激活神经元钠通道，就可以与其在L细胞上的受体相互作用并引起GLP-I的释放。尽管存在ΤΤΧ，但电刺激(14V 0.4Hz 300ms)与 LA相结合导致的GLP-I释放比仅由LA引起的GLP-I释放高239士64%。这与在不存在TTX 的情况下通过相同的电刺激条件引起的LA对GLP-I的提升是相似的(图6)。由此得出的结论是，神经元激活并非是电刺激提升LA引起的来自L细胞的GLP-I释放的必要和充分条件。进行了统计分析，其包含所有的条件(包括通过频率、电压和电刺激持续时间的组合限定的条件)，并包含条件的期限、作为重复因子的治疗(仅LA或LA加电刺激)以及两者间的相互作用。治疗是一种受试者体内的效应，这允许将各受试者对仅有LA时的反应作为从同一研究日开始的该受试者对电刺激的反应的对照。以仅有LA或LA加电刺激作为重复因子，在所有11种条件下对GLP-I释放通过重复测量方差分析(ANOVA)进行分析。下表记录的均值和SEM以每种条件下的2至6只大鼠为基础，得自对每只大鼠两次重复每种电刺激条件的数据对每只大鼠作平均。P值根据重复测量方差分析(ANOVA)记录，用于各自分析和成对比较。数据在分析前对作对数转换，以更好地满足等变异的基础统计模型假设(underlying statistical modelingassumptions of equal variability) liXRhKM^^iE 态分布的总体的取样。当将所有11种条件相结合时，电刺激效果的总P值为P < 0. 001。因此，可以得出结论，与仅使用LA相比，电刺激加LA可显著地改变GLP-I的释放量。下表汇总了针对这些条件中每一条件的个别P值，所作的严格分析表明，两种条件均产生了达到统计上显著水平的GLP-I释放水平。下面的表1汇总了在14V、5ms脉冲持续时间和不同频率下测得的5种电刺激条件的结果。作为这些条件之一，40Hz、14V和5ms产生了(与仅暴露于LA的组织相比)具有统计上显著差异的GLP-I释放。^ 1在14V和5ms以及不同频率条件下仅有LA和LA加电刺激之间的GLP-I释放比较
权利要求
1.一种刺激受试者释放饱腹感激素的方法，包括对所述受试者的胃肠系统的组织施加第一电刺激，所述施加第一电刺激与所述组织的L细胞接触养分刺激同时。
2.根据权利要求1所述的方法，其中对所述受试者的所述胃肠系统的粘膜组织施加所述第一电刺激。
3.根据权利要求1所述的方法，其中对回肠的粘膜组织施加所述第一电刺激。
4.根据权利要求3所述的方法，其中对远端回肠的粘膜组织施加所述第一电刺激。
5.根据权利要求1所述的方法，其中以约0.IHz至约90Hz的频率施加所述第一电刺激。
6.根据权利要求1所述的方法，其中以约0.5V至约25V的电压施加所述第一电刺激。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一电刺激具有约3ms至约500ms的脉冲持续时间。
8.根据权利要求1所述的方法，其中以约14V的电压、约5ms的脉冲持续时间以及约 20至约80Hz的频率施加所述第一电刺激。
9.根据权利要求8所述的方法，其中以约40Hz的频率施加所述第一电刺激。
10.根据权利要求1所述的方法，其中以约14V的电压、约300ms的脉冲持续时间以及约0. 4Hz的频率施加所述第一电刺激。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一电流具有大于3μ C的电荷。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一电流具有约3μ C、约3 μ C至约6000 μ C 以及约6000 μ C的电荷。
13.根据权利要求1所述的方法，包括对所述受试者的所述腔内组织上的不止一个位置施加所述第一电刺激。
14.根据权利要求1所述的方法，还包括对所述受试者的所述腔内组织施加第二电刺激。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二电刺激与所述第一电刺激在电压、频率、脉冲持续时间、电荷或它们的任何组合上不同。
16.根据权利要求1所述的方法，还包括在与施加所述第一电刺激不同的位置处对所述受试者的所述胃肠系统内腔中的第二组织施加第二电刺激。
17.根据权利要求16所述的方法，其中对所述受试者的所述回肠施加所述第一电刺激，并且其中对所述受试者的十二指肠腔内组织、空肠腔内组织或大肠腔内组织施加所述第二电刺激。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述第二电刺激与施加所述第一电刺激同时地被施加。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述第二电刺激与所述第一电刺激在电压、频率、脉冲持续时间、电荷或它们的任何组合上不同。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述养分刺激包括碳水化合物、氨基酸、蛋白质、 脂肪酸、脂肪、以刺激L细胞为明确目的而制成的物质或它们的任何组合。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述饱腹感激素包括GLP-I。
22.—种预测患者对减重手术的反应的方法，包括对所述患者的胃肠系统的组织施加第一电刺激，所述施加第一电刺激与所述组织的L细胞接触养分刺激同时；评估所述电刺激对所述患者的效应；以及将所述效应与所述患者对所述减重手术的反应相关联。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述评估包括确定一种或多种饱腹感激素、一种或多种回肠制动激素、葡萄糖或它们的任何组合在所述患者血液中的水平；评估由所述患者表现出来的饱腹感的存在、增强或这两者；评估所述患者响应第二养分刺激而产生的胃排空、饱腹感或这两者的存在、增强或这两者；或它们的任何组合。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述评估包括确定所述患者血液中的循环 GLP-I的水平。
全文摘要
除了其他方面，本发明提供了增强天然激素对胃排空后进入小肠的养分的反应，从而为肥胖症或糖尿病患者提供具治疗价值的位点特异性方法。在一个方面，本发明提供了刺激受试者释放饱腹感激素的方法，所述方法包括与所述组织的L细胞接触养分刺激同时对所述受试者的所述胃肠系统内腔中的组织施加第一电刺激。在另一方面，本发明提供了预测患者对减重手术的反应的方法，所述方法包括与所述组织的L细胞接触养分刺激同时对所述患者的所述胃肠系统的组织施加第一电刺激；评估所述电刺激对所述患者的效应；以及将所述效应与所述患者对减重手术的反应相关联。
文档编号A61N1/39GK102159281SQ200980134973
公开日2011年8月17日 申请日期2009年8月25日 优先权日2008年8月26日
发明者P·J·霍恩比, P·R·沃德, R·卡耶卡, T·奥尔特 申请人:森托科尔奥索生物科技公司