专利名称：促进血管完整性的微rna及其用途的制作方法
促进血管完整性的微RNA及其用途
背景技术：
本申请要求2008年8月11号提交的美国临时申请序列号61/087，886的优先权， 其全部公开内容通过引用以整体并入本文。本发明在国立卫生研究院经费号为HL53351-06的支持下进行。政府对本发明享有一定权利。1.发明领域本发明主要涉及心脏病学、病理学和分子生物学领域。更具体而言，本发明涉及在内皮细胞和肌肉细胞中通过miR-U6进行的基因调控和细胞生理。此miRNA对保持血管完整性和促进血管修复有重要的作用，因此可将其作为用于疾病治疗的调节剂的靶标。2.相关技术内皮细胞(EC)排列在血管结构的内表面，并在血管发育、功能和疾病中具有关键性作用(Carmeliet，2003)。在称为小血管发生(vasculogenesis)的血管形成过程中， EC增殖、迁移并联合形成初始的血管网络以作为募集平滑肌细胞的框架。通过血管发生 (angiogenesis)随后进行的血管出芽使血管系统进一步扩张并使组织血管化。许多生长因子肽通过增强EC的迁移、增殖、存活和细胞间相互作用来促进血管发生。在胚胎发生和成体期的新血管发生中需要VEGF和FGF，其为最强的血管发生生长因子(Cross和Claesson-Welsh，2001)。这些因子与其细胞表面受体的结合激活MAP激酶通路，该通路促进血管发生性生长和成熟。与之相反，MAP激酶信号转导的抑制降低血管发生(Eliceiri等，1998 ；Giroux等，1999 ；Hood等，2002)，并已将其开发为抗血管发生疗法 (Hood 等.，2002 ；Panka 等，2006)。尽管有了这些进展，但是对涉及血管发生以及血管完整性和修复的细胞调控机制的认识仍然十分不足。因此，对这些过程的更完整认识将非常有助于鉴定可在体内调节这些功能(例如在疾病治疗中)的物质。发明概述因此，根据本发明，提供了促进血管完整性和/或内皮修复的方法，其包括向有血管损伤风险或具有血管损伤的对象施用miR-U6功能的激动剂。具有血管损伤的对象可能患有心脏组织中血管损伤，如缺血事件，包括包含下列之一的事件梗塞、缺血再灌注损伤或动脉狭窄。血管损伤可以是非心脏组织，可包括外伤或血管渗漏。或者，当对象有血管损伤风险时，该对象可能具有高血压、心脏肥大、骨质疏松、神经退变、纤维化或呼吸窘迫。所述方法还可包括向所述对象施用第二疗法。所述对象可以是非人动物或人。所述激动剂可以是miR-U6或miR_U6模拟物。 所述激动剂也可以是包含miR-U6编码核酸区段的表达载体，所述区段处于在靶细胞(如心脏细胞、平滑肌细胞、内皮细胞或造血细胞、骨髓细胞或心外膜细胞)中有活性的启动子控制之下。所述启动子可以是组织选择性/特异性启动子，组织选择性/特异性启动子是在心脏细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、造血细胞、骨髓细胞或心外膜细胞中有活性的启动子。 所述表达载体可以是病毒载体或非病毒载体。施用可包括全身性施用，如经口、静脉内或动脉内途径。施用也可通过渗透泵或导管进行。可以直接地或局部地施用到血管损伤组织或有血管损伤风险的组织，如心脏组织、 血管组织、骨组织、神经组织、呼吸系统组织、眼组织或胎盘组织。激动剂可以与患者、组织或部位接触多于 1 次，如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90 或 100次。激动剂可以与所述组织接触2、3、4、5或6天，1、2、3或4周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10 或 11 个月、或 1、2、3、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20 或 25 年。在另一个实施方案中，提供了抑制病理性血管化的方法，其包括使有病理性血管化风险或具有病理性血管化的对象与miR-U6拮抗剂接触。患有病理性血管化的对象可能患有动脉粥样硬化、视网膜病、癌症或中风。有病理性血管化风险的对象可能患有动脉粥样硬化、肥胖、哮喘、关节炎、牛皮癣和/或失明。所述对象可以是非人动物或人。所述拮抗剂可以是miR-126的拮抗性miRNA(antag0mir)。靶组织可以是血管系统、平滑肌、眼组织、造血组织、骨髓、肺组织或心脏外膜组织。所述方法还可包括向所述对象施用第二抗血管发生疗法。施用包括全身性施用，如经口、静脉内或动脉内途径。也可直接地或局部地施用到病理性血管化或具有病理性血管化风险的组织，例如眼组织中、血管组织、骨组织、脂肪组织或肺组织。施用也可通过渗透泵或导管进行。拮抗剂可以与患者、组织或部位接触多于 1 次，如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90 或 100 次。拮抗剂可以与所述组织接触2、3、4、5或6天，1、2、3或4周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个月、或 1、2、3、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20 或 25 年。当在权利要求和/或说明书中，术语“包含”、“包括”未加数量限制时，可以指“一”， 但也可以与“一或更多”、“至少一”以及“一或多于一”的意义相同。应理解，本文讨论的任何实施方案可以参照任何本发明方法或组合物实施，反之亦然。此外，可以采用本发明的组合物或药盒实现本发明的方法。在本申请中，术语“约”用于表示某值，其包括用于确定该值的装置或方法的误差的标准差。在权利要求中术语“或”的使用表示“和/或”，除非明确指明其仅表示可替代方案或者所述可替代方案是互斥的，但本公开内容支持表示仅有的可替代方案和“和/或”的定义。在本说明书和权利要求中使用的词语“包含”(以及其任何变形)、“具有”(以及其任何变形)、“包括”(以及其任何变形、“含有”(以及其任何变形)是包括性或开放性的， 不排除另外的未列举的要素或方法步骤。从以下详述中可以明确本发明的其他目的、特点和优点。然而应理解，当说明具体的本发明实施方案时，详细描述和具体实施例仅通过示例的方式给出，因为本领域技术人员能通过本详述明确在本发明精神和范围内的多种变化和修改。
通过参照这些附图中的一个或多个并结合本文具体实施方案，可更好地理解本发明。
图IA-B。miR-126的内皮细胞特异表达和基因结构。(图1A)用RNA印迹
5(northern blot)所检测到的不同组织和细胞系中miR-126的表达。U6或5s rRNA作为上样对照。箭头表示前体miR-126 (pre-miR-126)的位置，三角形表示成熟miR-126。SMC, 小鼠平滑肌细胞系；HUVEC，人脐静脉内皮细胞(EC)系；P19CL6，P19胚胎癌细胞的衍生物； C2C12，小鼠成肌细胞系；MSl，用SV40大T抗原转化的小鼠原代胰岛内皮细胞；HAEC，人主动脉内皮细胞；SVEC，SV40转化的小鼠内皮细胞系；Ε0ΜΑ，小鼠血管内皮细胞瘤衍生细胞系。(图1B)(SEQ ID N0:1)小鼠Egfl7基因的结构。产生内含子7所编码的茎环形式的 miR-126 (miR-126-3p)和(miR-U6_5p)。显示miR_U6 的进化保守性(SEQ ID NO 2)。
图2A-C。指导Egfl7/miR-126内皮细胞特异性表达的顺式调控序列。(图2A) E12. 5 转基因小鼠胚胎，其带有由Egfl7/miR-U6基因上游的5. 4kb 50侧翼DNA控制的LacZ转基因。显示下列项的EC特异性IacZ表达(a)胚胎整体，以及(b)软骨膜区域、(c)真皮、 (d)脑和(e)流出道的矢状切面。比例尺=50mm。(图2B)在E12. 5的转基因小鼠中针对 IacZ调节所测的Egfl7/miR-U6基因上游基因组区段的示意图。显示了显示IacZ内皮细胞特异性表达的转基因胚胎的部分。下方显示了 Egfl7/miR-126 50侧翼区域的进化保守性。用粉红和浅蓝突出显示保守的ETS结合位点。(SEQ ID NO :3_8)。(图2C)通过C0S-7 细胞中编码Ksl或缺少DNA结合结构域之Ksl突变体(Etsl mut)的表达质粒数量的增加来检测调控区域1 (区域I-Luc)的基因组片段的激活。将缺失突变引入到ETS结合位点中(区域1 (mut) -Luc) ο Etsl激活区域I-Luc但不激活区域1 (mut) -Luc，MEtsl mut不激活任一构建体。误差线表示标准偏差。
图3A-G。miR-126基因的靶向。(图3A)通过同源重组生成miR_U6突变体小鼠的策略。用侧翼为IoxP位点的新霉素抗性表达盒(Neo)替换含有miR-126的96bp Egfl7内含子 序列。通过将杂合小鼠与CAG-Cre转基因小鼠杂交来去除小鼠生殖细胞系中的Neo。 DTA,白喉毒素A。(图3B)ES细胞基因组DNA的DNA印迹(southern blot)分析。用ka I 消化DNA。采用50探针或30探针，野生型和突变体(miR-126ne°等位基因)的大小分别为 11.4kb和13.4kb。基因型在上方显示。(图3C)通过RT-PCR检测，分析miR-126nWne。或小鼠的心脏(左)或肺(右)中的Egf 17转录本。在底部显示Egf 17基因结构和外显子编号。RT-PCR所用的引物基于正向(F)或反向(R)的外显子编号命名。在上方显示基因型。用GAPDH作为对照。应注意，如在以7F和8R、6F和9R、8F和10R为引物的RT-PCR 所显示的，HiiR-I^wne。突变体中Egfl7的表达受到干扰，以及如使用所示引物的RT-PCR所示，相对于neo表达盒缺失的归一化。(图3D)通过WT和miR_126K0小鼠心脏提取物的蛋白质印迹(western blot)对EGFL7和GAPDH蛋白质的检测。(图3E)通过心脏和肺的RNA 印迹分析对miR-U6转录本的检测。5S rRNA为上样对照。(图3F)miR_126v_互交子代的基因型。显示了在标示阶段每种基因型小鼠的实际和预期数量。(图3G)miR-126v_互交胚胎的基因型。显示了每个年龄所分析的miR-126v-子代的数量。严重血管缺陷被定义为水肿、出血、严重生长迟缓和死亡。少于的野生型或miR-126v_胚胎或新生小鼠显示出血管异常。
图4A-F。miR-126无效(Null)小鼠的血管异常。(图4Α)Ε15· 5的野生型(WT)和 miR-126+(KO)胚胎。如箭头所示，KO胚胎的亚组显示出全身水肿和出血。(图4B)E10. 5 的WT和miR-126K0胚胎颅区的侧视图。箭头指示的表面脑血管在WT胚胎中很明显，但在突变体中严重缺陷。在右边显示了方框指示的颅区中的血管数(η = 6)。(图4C)P2的视网膜血管化，通过PECAM染色显示。视网膜中央动脉的位置通过白色虚线界定，突变体中视网膜血管的末端用红色箭头指示。标尺=200mm。在右边显示相对血管覆盖(n =幻。(图4D) 标示基因型的Ε15. 5胚胎的真皮和肝及新生小鼠的肺的矢状切面Η&Ε染色。上图和中间图的比例尺为200mm，下图的比例尺为500mm。大括号指示KO胚胎组织空间中红细胞和炎性细胞对真皮的加厚。三角形指示与WT肝脏相比KO肝脏的红细胞过剩。箭头指向肺，其中在KO小鼠中肺泡无法扩张。星号指示KO新生小鼠胸腔中的水肿。(图4E)E15. 5的WT和 KO胚胎中毛细血管的电子显微镜照片。括号显示KO胚胎中血管的损坏。绿箭头指向WT内皮细胞的紧密联结，红箭头指向在KO胚胎血管外漂浮的红细胞，而三角形指示KO胚胎血管内皮层变薄。EC，内皮细胞；rbc，红细胞。(图4F)E15. 5的KO胚胎中的内皮细胞增殖。与 WT胚胎相比，在KO胚胎中观察到的BrdU(红色)和PECAMl (绿色)双阳性细胞显著减少。 红箭头指向PECAM/BrdU双阳性细胞，而白箭头指向PECAM单阳性细胞。用DAPI (蓝色)对细胞核染色。误差线表示标准偏差。在柱图中显示了数据统计(P = 0.014)。
图5A-E。miR_126K0内皮细胞中警损的血管发牛。(图5A)显示了从4-6日龄野生型(WT)和miR-126+(K0)小鼠中分离的培养的主动脉环的代表性图像。在WT外植体中可见大量的内皮生长，但在突变体中没有。对每种条件下的相对迁移活性进行了定量，在统计柱图中显示。误差线表示标准偏差。(图5B)显示了所示基因型小鼠中植入的基质胶栓 (matrigel plug)的PECAMl (绿色)染色的代表性图像。与WT小鼠相比，在KO小鼠中有 FGF-2的基质胶中观察到的血管发生显著减少。在WT和KO小鼠无FGF-2的基质胶栓中没有观察到显著的血管发生。比例尺=60mm。(图5C)通过用Image J软件确定PECAM染色面积来定量基质胶栓测定中血管发生的程度。误差线表示标准偏差。KO与WT基质胶塞相 Kp = O. 0008。(图5D)在MI后WT和KO小鼠的存活。MI后1周和3周KO小鼠的存活率与WT相比，ρ值为0. 05和0. 014。(图5E)MI后WT和KO小鼠心脏的组织学分析。图a_d 显示了穿过右心室(RV)和左心室(LV)的纵切片。注意突变体心脏心房处的血栓块，表示心力衰竭。图e-f显示用Masson三色法染色的横切面，以显示瘢痕形成。注意KO小鼠中心肌的大量缺失。图g和h显示了 e和f中加框显示梗死区的PECAMl染色。注意MI后KO 小鼠的血管系统缺陷。图a-f中的比例尺等于1cm，图g和h中的比例尺等于40mm。
图6A-I。miR_U6对血管发生生长因子信号转导的调控。(图6A)miR_U6增强了 FGF依赖性ERK1/2磷酸化。用表达LacZ或miR-126的腺病毒感染HUVEC细胞，并用 FGF-2 (lOng/ml)处理标示的时间。用所示的抗体对细胞裂解物进行免疫印迹以确定磷酸化的和总的ERKl/^2水平。Ad-miR-U6增强了 FGF-2依赖性ERKl/^2磷酸化。(图6B)miR_U6 的敲除减少了 VEGF依赖性ERK1/2磷酸化。用2，-O-甲基-miR_U6反义寡核苷酸或对照寡核苷酸转染HAEC细胞，并用VEGF(lOng/ml)处理10分钟。用所示的抗体对细胞裂解物进行免疫印迹以确定磷酸化的和总的ERK1/2水平。用GAPDH为上样对照。(图6C) miR-126 与不同物种中Spred-I 30非翻译区(UTR) (SEQ ID NOS :9_14)的序列比对。(图6D)通过 E15. 5WT和miR-U6K0胚胎的卵黄囊提取物的蛋白质印迹对Spred-1、CRK和GAPDH的检测。 (图 6E)miR-U6 靶向 Spred-I 30UTR。将 Spred-ImRNA 的 3，UTR，以及在与miR_U6种子区域 (seed region) (GGTACGA至TTGGAAG)互补的区域中经改造具有突变的Spred m3，UTR，插入到pMIR-REPORT载体(Ambion)。miR_U6突变体(miR_U6m)构建物由下列项组成突变为GCATGG 的 miR-U6-3p 序列 CGTACC，以及突变为 CCATGC 的 miR-U6_5p 序列 GGTACG。用标示的质粒组合进行C0S-7细胞的转染。用CMV-bGAL作为转染效率的内对照。误差线表示标准偏差。显示了 P值；ns，不显著。(图6F)miR-126过表达或敲除后的相对Spred-ImRNA表达水平。将HUVEC或HAEC细胞进行标示的处理，通过实时PCR确定Spred-ImRNA的水平。GAPDH 为对照。误差线表示标准偏差。显示了 P值。(图6G)miR-126+内皮细胞中Spred-ImRNA 的上调。用实时PCR以L7作为对照确定了 Spred-ImRNA的水平。误差线表示标准偏差。KO 与WT相比，ρ = 0.01。(图6H)显示了从5和6日龄的野生型(WT)和miR_U6K0小鼠中分离的培养的主动脉环的代表性图像。在WT外植体中Spred-I的腺病毒过表达损害了内皮细胞生长，而miR-126K0小鼠外植体中siRNA介导的Spred-I敲低(knockdown)增强了内皮细胞的生长。如在统计柱图中所示，对每种条件下的相对迁移活性进行定量。误差线表示标准偏差。(图61) HUVEC细胞对VEGF应答的划痕测定(scratch-wound assay)。用反义RNA敲低miR-U6的表达削弱了 EC的迁移，而在miR_U6反义RNA的存在下，用siRNA 敲低Spred-I恢复了迁移。用红色虚线指示了划痕的边缘。定量了迁移的细胞，如在统计柱图中所示。误差线表示标准偏差。
图7。miR-126在血管发牛中功能的樽型。VEGF和FGF与其在EC上受体的结合激活了 MAP激酶信号转导通路，所述通路到达细胞核激活参与血管发生的基因的转录。miR-126 抑制Spred-I的表达，Spred-I是Ras/MAP激酶信号转导的负调控子。因此，miR_U6功能的丧失减弱了应答于VEGF和FGF的MAP激酶信号转导，而miR_U6功能的获得增强了血管发生信号转导。
图8。Pri-miR-126及其宿主基因Etf 17的内皮细胞特异性表达。用内含子7作为 pri-miR-126的探针，用Egfl7cDNA片段作为Egfl7的探针。标记表示E8. 5、E10. 5和E14. 5 的节间血管(黑色三角形)、背主动脉(黑色箭头)、心内膜(白色三角形)和肝(白色箭头) 中pri-miR-126和Egf 17的内皮细胞特异性表达。黑色标尺=200 μ m，白色标尺=1600 μ m。
具体实施例方式近期的研究显示，微RNA在心血管系统对损伤和胁迫的应答中起重要作用 (Latronico 等，2007 ；van Rooij 和 Olson, 2007)。miRNA 表示一类 22 个核苷酸的非编码 RNA，其通过靶向mRNA以实现切割或翻译抑制来调控基因表达(Bartel，2004)。在人和其他真核物种中已鉴定到多于500种miRNA，其中约三分之一由蛋白质编码基因的内含子所编码。miRNA首先转录为大pri-miRNA，其通过连续的步骤被加工产生杂合双链RNA。杂合双链的 miRNA 链并入 RNA 诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex (RISC))中，在其中它能够通过在3’非翻译区的互补序列靶向特异性mRNA (He和Harmon，2004)。杂合双链中的相对链(称为星(*)链)通常被降解。
现在，发明人证明内皮细胞特异性miRNA——miR-126——在体内调控血管发生。 在突变小鼠亚组中，小鼠中miR-126的靶向缺失导致血管渗漏、出血和胚胎死亡。这些血管异常可以归因于血管发生生长因子信号转导的降低，从而导致EC生长、出芽和粘附的减少。存活的突变体动物亚组易于在具有梗死的缺陷性血管化的心肌梗死后发生心脏破裂以及死亡。miR-126的促血管发生作用与其对Spred-I (MAP激酶信号转导的负调节物)的抑制相关。因此，在不存在miR-126时，Spred-I的表达提高，减少了 VEGF和FGF的细胞内血管发生信号的传递。
根据这些发现，发明人认为miR-126的作用是血管发生信号转导的内皮细胞特异性调节物。在疾病期间，内皮在心血管内稳态和重构(remodeling)中起到多种多样的作用，包括控制血管伸缩性和渗透性、平滑肌细胞生长和增殖、白细胞粘附、凝结和血栓形成。 已经提出miRNA在体外调控EC基因的表达和功能(KuetAacher等，2007 ；Suarez等，2007)， 但是还没有针对在体内miRNA在EC生物学中功能的研究。在血管完整性和血管发生以及 MI后存活中需要miR-U6的发现提示，在缺血的心肌中提高miR-U6可以增强心脏的修复。 相反地，减少miR-126的表达可能在调节病理性血管化中有效，所述病理性血管化如癌症、 动脉粥样硬化、视网膜病和中风。最近，已有报道称miR-U6抑制肿瘤发生，以及在转移的乳腺肿瘤中下调，尽管没有确定其下调的具体细胞类型和可能介导这些作用的miR-U6靶标(Tavazoie等，2008)。本发明人认为，将会发现miR_U6和其他miRNA在组织重构和疾病中起重要作用。下面更详细地讨论本发明的这些和其他方面。
I. miRNA A.背景 2001年，多个小组采用新的克隆方法在秀丽隐杆线虫(C. elegans)、果蝇 (Drosophila)和人中分离和鉴定了一大类“微 RNA”(miRNA) (Lagos-Quintana 等，2001 ；Lau 等，2001 ；Lee和Ambros，2001)。已经在似乎不具有内源性siRNA的植物和动物(包括人) 中鉴定出几百种miRNA。因此，尽管与siRNA类似，但是miRNA仍然是不同的。
目前为止观察到的miRNA的长度约为21_22个核苷酸，它们来自于更长的前体，所述前体转录自非蛋白质编码基因。参见Carrington等的综述^00 。所述前体形成在自互补区域彼此折回的结构；而后它们被核酸酶所加工，在动物中是Dicer，在植物中是DCL1。 miRNA分子通过与其靶标的精确或非精确碱基配对来干扰翻译。
miRNA由RNA聚合酶II转录，可来自于个体miRNA基因、蛋白质编码基因的内含子或者经常编码多个紧密相关的miRNA的多顺反子转录本。在细胞核中由RNase Drosha 将通常几百个碱基长度的前体miRNA加工成70-100nt的发夹状前体。在转运到细胞质后， 所述发夹被Dicer进一步加工生成双链miRNA。而后成熟的miRNA链整合入RNA诱导沉默复合体(RISC)，在其中miRNA通过碱基互补与其靶标mRNA结合。相对较少的情况是，miRNA 碱基对与mRNA靶标完全配对，则其促进mRNA的降解。更常见的是，miRNA与靶标mRNA形成不完全配对的杂合双链，这影响mRNA的稳定性或抑制mRNA的翻译。
miRNA的5’部分跨越2-8个碱基，称为“种子(seed) ”区，其对靶标识别尤其重要 (Krenz和Robbins，2004 ；Kiriazis和Krania，2000)。种子的序列以及靶标序列的进化保守性形成了目前多个靶标预测模型的基础。尽管有越来越多可用的预测miRNA及其靶标的复杂计算方法，但是靶标的预测仍是重大的挑战并需要实验的验证。由于单个miRNA具有与数百种潜在的高亲和性和低亲和性mRNA靶标碱基配对的能力，以及多个miRNA靶向单个 mRNA,因此使得将miRNA的功能归于调控特异性mRNA靶标更为复杂。
第一个miRNA被鉴定为秀丽隐杆线虫中发育时序的调控子，这表明，一般来讲， miRNA可能通过关闭特异性靶标而在不同发育阶段的转换中起决定性调控作用(!^atkin 等，2000 ；Lowes等，1997)。然而，随后的研究提出，除了用作打开-关闭的“开关”之外，
9miRNA更常见的功能是通过抑制对特定细胞类型来说不适宜的蛋白质的表达，或通过调整蛋白质的量，来调节或微调细胞表型。还提出miRNA通过避免基因表达的剧烈波动来为细胞表型提供健壮性(robustness)。
随着科学家开始理解这些分子在真核基因表达调控中所起的广泛作用，针对微 RNA的研究正在增加。两个研究最透彻的miRNA(lin-4和let_7)通过调节关键mRNA家族的翻译来调节秀丽隐杆线虫的发育时序(在I^Squinelli，2002中综述)。已经在秀丽隐杆线虫、果蝇和人中鉴定出几百种miRNA。如对于调控基因表达的分子可以预计的，已经显示在组织和发育阶段之间miRNA的水平有不同。此外，一项研究显示两种miRNA的表达下降与慢性淋巴细胞性白血病紧密相关，这为miRNA和癌症提供了可能的联系(Calin，2002)。 尽管该领域还很年轻，仍然认为在高等真核生物中miRNA在调控基因表达上与转录因子同样重要。
对于miRNA在细胞分化、早期发育以及如凋亡和脂肪代谢的细胞过程中起重要作用有几个实例。在秀丽隐杆线虫发育中，lin-4和let-7均调控从一个幼虫状态到另一个的转化过程(Ambros，2003)。Mir-14和bantam是果蝇中调控细胞死亡的miRNA，其调控显然是通过调控参与凋亡的基因表达(Brennecke等，2003，Xu等，2003)。已经提出miR-14参与脂肪代谢(Xu等，200 。Lsy-6和miR-273是秀丽隐杆线虫中调节感化性神经元不对称性的miRNA (Chang等，2004)。另一种调节细胞分化的动物miRNA是miR-181，其指导造血细胞分化(Chen等，2004)。这些分子代表了已知功能的动物miRNA的全部范围。毋庸置疑， 对miRNA功能的进一步理解将揭示作用于正常发育、分化、细胞间和细胞内信息传递、细胞周期、血管发生、凋亡以及许多其它细胞过程的调控网络。考虑到它们在众多生物功能中的重要作用，miRNA有可能为治疗干预或诊断分析提供重要意义。
表征诸如miRNA的生物分子的功能通常涉及将该分子引入细胞或将分子从细胞中去除并测定结果。如果将miRNA引入细胞后导致凋亡，则该miRNA毫无疑问地参与了凋亡通路。已经描述了在细胞中引入或去除miRNA的方法。两个近期的出版物描述了可以用于抑制特定miRNA活性的反义分子(Meister等，2004 ；Hutvagner等，2004)，其他人已经在心脏中证明了它们的功能性，在心脏中它们有效地敲低miR-133和miR-1 (Care等2007 ；Yang 等2007)。其它出版物描述了由内源RNA聚合酶所转录并在转染进细胞后产生特定miRNA 的质粒的用途Geng等，2002)。这两套试剂已经用于单个miRNA的评估。
B. miR-126 根据近期将miRNA与心血管发育和疾病联系起来的研究，本发明人检索了公共数据库以寻找显示为限制于心血管组织的miRNA。在几个此类miRNA中，miR-U6在具有高血管组分的组织(如心脏和肺)中显示出富集(Lagos-Quintana等，2002)。对斑马鱼miRNA 表达谱的研究也显示miR-U6对血管系统特异(Wienholds等，2005)。
RNA印迹分析显示miR_U6在大范围的组织中表达，在肺和心脏中表达最多，这与之前的研究一致(Harris 等，2008 ；Lagos-Quintana 等，2002 ；Musiyenko 等，2008)。 miR-126*只检测到痕量水平的表达(数据未显示)。对细胞系的调查显示miR-U6在原代人脐静脉EC (HUVEC)和多种EC细胞系中表达，包括MS1、HAEC和EOMA细胞系，但不在SV40 转化EC(SVEC)或非内皮细胞类型中表达。
从河豚到人(Homosapiens)中，miR_U6 (也称为 miR-U6_3p)和
10miR-126* (miR-126-5p)是保守的(microrna. sanger. ac. uk/sequences/index, shtml)。在哺乳动物和鸟类中，由EGF样结构域7 (Egf 17)基因的内含子7编码miR-126和miR-126*, 所述Egf 17基因编码EC特异性分泌肽，已有报道称所述分泌肽是平滑肌细胞迁移的化学吸引剂和抑制剂(Campagnolo 等，2005 ；Fitch 等，2004 ；Parker 等，2004 ；Soncin 等，2003)。 miR-126在组织和细胞系中的表达谱与Egf 17的平行(Fitch等，2004 ；Soncin等，2003)，这与该miRNA加工自前体Egfl7mRNA的内含子RNA序列的结论相符。
已经鉴定了来自于多种不同生物体(小鼠、人、大鼠、狗、鸡、斑马鱼、河豚)的 miR-126，它们的序列完全保守 UCGUACC⑶GAGUAAUAAUGCG (SEQ ID NO 1) C. miR-126的激动剂和拮抗剂 miR-U6的激动剂通常采用三种形式的一种。第一种是miR-126自身。这种分子可以通过如注射或输注的方式递送到靶细胞，任选地在如脂质(如脂质体或脂质乳剂)的递送载体中。第二种，可以采用驱动miR-U6表达的表达载体。多种表达载体的组成和结构将在本文的其他部分描述。第三种，可以采用区别于miR-126的起上调、稳定或增强miR-126 活性功能的试剂，包括小分子。这些分子包括“模拟物”，模拟物是模拟miR-U6的功能以及有可能模拟其形式的分子，但是在化学结构上与其不同。
可以通过“拮抗miRNA(antagomir) ”实现miRNA功能的拮抗。由Kriitzfeldt及同事首先描述(Kriltzfeldt等.，2005)，拮抗miRNA是单链经化学修饰的核糖核苷酸，其与 miRNA序列至少部分互补。拮抗miRNA可以包含一个或更多经修饰的核苷酸，如2’ -0-甲基-糖修饰。在一些实施方案中，拮抗miRNA只包含经修饰的核苷酸。拮抗miRNA还可以包含一个或更多硫代磷酸酯连接以得到部分或全部的硫代磷酸酯骨架。为了便于体内递送和稳定，可以在其3’端将拮抗miRNA与胆固醇部分连接。适于抑制miRNA的拮抗miRNA长度可以是约15至约50个核苷酸，长度更优选约18至约30个核苷酸，长度最优选约20至约25个核苷酸。“部分互补”是指序列与目的多核苷酸序列至少约75% ΑΟ^Αδ^ΑΟ^、 95 %、96 %、97 %、98 %或99 %互补。拮抗miRNA与成熟miRNA序列可以至少约75 %、80 %、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%互补。在一些实施方案中，拮抗miRNA可以与成熟miRNA序列基本互补，即与靶标多核苷酸序列至少约95 %、96 %、97 %、98 %或99 %互补。 在另一些实施方案中，拮抗miRNA与成熟miRNA序列100%互补。
还可以通过施用反义寡核苷酸对miRNA的功能进行抑制。所述反义寡核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。优选地，所述反义寡核苷酸具有至少一个化学修饰。反义寡核苷酸可以包括一个或更多“锁核酸(locked nucleic acid) ”。“锁核酸”(LNA)是经修饰的核糖核苷酸，其在核糖部分的2’和4’碳之间含有额外的连接，导致“锁(locked) ”构型， 其使含有LNA的寡核苷酸的热稳定性提高。或者，反义寡核苷酸可以包含肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)，其包含基于肽的骨架而不是糖-磷酸骨架。反义寡核苷酸可以包含的其他化学修饰包括但不限于糖修饰，如2’ -0-烷基(如2’ -0-甲基、2’ -0-甲氧乙基)、 2’ -氟代，和4’硫代修饰；以及骨架修饰，如一个或更多硫代磷酸酯、吗啉代或膦酰羧酸酯键(参见，例如，美国专利6，693，187和7，067，641，其通过全文引用并入本文)。在一些实施方案中，适合的反义寡核苷酸是2’ -0-甲氧乙基“间隔体(gapmer) ”，其在5’和3’端均含有2’ -0-甲氧乙基修饰的核糖核苷酸，并且中间至少有十个脱氧核糖核苷酸。这些“间隔体”能够引发RNA靶标的RNase H依赖性降解机制。其他增强稳定性并提高有效性的反义寡核苷酸修饰(如在美国专利6，838，观3中描述的，其通过全文引用并入本文)为本领域已知并适合用于本发明的方法中。用于抑制microRNA活性的特定反义寡核苷酸的长度为约19至约25个核苷酸。反义寡核苷酸可以包含与成熟miRNA序列至少部分互补的序列，例如，与成熟 miRNA 序列至少约 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%互补。在一些实施方案中，反义寡核苷酸可以与成熟miRNA序列基本互补，即与靶标多核苷酸序列至少约95%、96(%、97(%、98(%或99(%互补。在一个实施方案中，反义寡核苷酸包含与成熟miRNA序列100%互补的序列。
另一种抑制miR_U6功能的方法是施用抑制性RNA分子，其与成熟miR_U6序列具有至少部分序列同一性。该抑制性RNA分子可以是双链、小干扰RNA(siRNA)或包含茎环结构的短发夹RNA分子(shRNA)。抑制性RNA分子的双链区可以包含与成熟miRNA序列具有至少部分同一性的序列，如约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。在一些实施方案中，抑制性RNA的双链区包含与成熟miRNA序列至少具有显著同一性。 “显著同一性”是指与目的多核苷酸序列具有至少约95196197198%或99%同一性的序列。在其他一些实施方案中，抑制性RNA分子的双链区可与靶标miRNA序列具有100%的同一性。
在本发明的其他一些实施方案中，miR-126的抑制剂可以是抑制性RNA分子，如核酶、siRNA或shRNA。在一个实施方案中，miR-499的抑制剂是含有双链区的抑制性RNA分子，其中双链区所含的序列与成熟miR-U6序列具有100%的同一性。在一些实施方案中， 抑制剂是含有双链区的抑制性RNA分子，其中所述双链区包含与成熟miR-U6序列具有约 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的序列。
II.血管发生，miR-126 和 Sprechl 以下报告的研究结果显示miR_U6在体内血管发生和血管完整性的保持上具有重要作用。miR-126的作用似乎反映(至少部分地)在其对用作血管发生强力诱导剂的 VEGF和FGF下游的MAP激酶信号转导的增强(图7)。作为Ras/MAP激酶通路细胞内抑制剂的Spred-I用作miR-126的抑制靶标。因此，无miR-126存在时，Spred-I表达提高，导致血管发生信号转导的抑制。相反，miR-126的过表达缓解了 Spred-I对VEGF和FGF激活的信号转导通路的抑制作用，利于血管发生。
与这些发现一致，EC中Spred-I的过表达削弱了血管发生和细胞迁移，与miR-126 功能丧失表型类似，而在培养的EC中，敲低Spred-I的表达增强了血管发生并挽救miR-126 功能丧失表型。有意思的是，只有miR-126+胚胎的亚组死于因血管破裂的胚胎死亡，而其他存活到成年，这表明该miRNA调控基因表达程序，而不是作为血管发生的“打开-关闭”开关。
除了在胚胎发生时的正常血管发育中必需之外，在MI后，当在梗塞部位的损伤血管引发新血管发生以恢复流向受损心肌壁的血流时，miR-U6的功能似乎很重要。在胁迫条件下，如MI后的心脏，由于需要新血管发生(neoangiogenesis)的血管发生信号，miR-126 的作用可能更加重要。关于这点，应答于心肌的局部缺血，VEGF和FGF的表达升高，这对局部缺血的心肌中侧支血管的发育很关键(Semenza，2003)。心脏损伤除了激活临近EC的迁移和增殖外，也导致循环的造血祖细胞归巢到局部缺血部位并帮助心脏修复(Kocher等，2001 ；Takahashi等，1999)。miR_U6在造血干细胞中表达，并因此可能在该细胞类群的再生功能中起作用(Garzon 等，2006 ；Landgraf 等，2007)。
A. miR-126对血管发生的控制 例如VEGF和FGF的血管发生生长因子通过激活MAP激酶通路来调节EC的增殖、 迁移和粘附，MAP激酶通路终止于细胞核以提高血管发生和血管完整性所需基因的表达。 与miR-U6功能丧失相关的异常与在EC中抑制MAP激酶信号转导而导致的血管缺陷类似 (Hayashi 等，2004)。
与miR-U6通过阻碍Spred-I的表达而促进血管发生的结论一致，Spred-I抑制细胞运动和Mio介导的肌动蛋白再组织(Miyoshi等，2004)，这两者是对血管发生很重要的过程。Spred-I和其他Spred家族成员作为生长因子诱导之ERK激活的膜结合抑制子起作用，并阻断应答于生长因子信号的细胞增殖和迁移(Wakioka等，2001)。Spred蛋白质的抑制性作用通过干扰Raf的磷酸化和激活介导，Raf是MAP激酶通路的上游激活子。在三种 Spred蛋白质中，只有Spred-I包含miR-126的预测靶序列。尽管这些结果与Spred-I作为miR-U6促血管发生作用的中介物发挥重要作用的结论一致，但miR-126的作用有可能反映为多个调节血管发生和血管完整性的靶蛋白的联合作用。
因此，本发明提供了在有此需要的对象中促进血管发生的方法，其包括向所述对象施用至少一种miR-126的激动剂。在一个实施方案中，所述方法还包括施用第二促血管发生剂。所述第二促血管发生剂可包括但不限于VEGF、FGF、IL-8、CCNl和Ang_2。
在另一个实施方案中，本发明提供了在细胞中调控MAP激酶信号转导的方法，其包括将细胞与至少一种miR-U6活性调节剂相接触。在一些实施方案中，在与miR-U6拮抗剂接触的细胞中MAP激酶信号转导降低。在另一些实施方案中，在与miR-U6激动剂接触的细胞中MAP激酶信号转导增强。在一个实施方案中，所述细胞是内皮细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是造血干细胞。
B. miR-126的生物发生 根据miR-U6和Egfl7mRNA的共表达，以及本发明人对miR_U6产生自Egfl7前体mRNA亚群中保留内含子的发现(未发表数据)，本发明人得出了 miR-U6来自Egf 17前体mRNA的结论。尽管具有独立于其宿主基因转录的内含子miRNA，但是至今为止发现的所有这些miRNA均转录自mRNA的相对链，这与miR_U6和Egfl7mRNA相反。此外，内皮特异性表达需要Ets结合位点，但在Egfl7基因的内含子7中没有这类位点。
最近，已有报道称Egf 17敲除小鼠显示出与miR-126无效小鼠极其类似的血管异常(khmidt等，2007)。已有报道称这些小鼠中的缺失突变导致Egfl7转录本的缺乏，这提示miR-126的表达也被阻止。然而，没有检测miR-126的表达。因此，这些突变体小鼠的表型真实地反映miR-U6功能丧失的可能性有待考察。
日益明显的是，miRNA整合进蛋白质编码基因的内含子代表了 miRNA的表达和调节性功能与蛋白质表达基因相互协调的普遍机制。作为这类共调节的另一个实例，本发明人之前提出，由α-肌球蛋白重链(MHC)基因的内含子编码的miR-208在调控网络中用于控制心脏胁迫应答(van Rooij等，2007)。miRNA并入组织特异性基因的内含子为确保 miRNA与其所调控的基因程序的共调节提供了有效机制。
III.治疗疾病状态的方法 本发明提供了通过向对象施用miR_U6激动剂或拮抗剂来治疗多种疾病状态的方法。出于本申请的目的，治疗包括减少与以下讨论的疾病状态相关的一个或更多症状。任何水平的改善都视为治疗，并且对改善的具体水平或“治愈”没有要求。如果症状稳定，即疾病状态没有恶化，对于治疗也是足够的。
本发明提供了促进血管完整性和/或血管修复的方法，其包括向患有血管病症的对象施用miR-U6功能的激动剂。所述血管病症可以包括但不限于心肌梗死、缺血再灌注损伤、狭窄、纤维化、血管外伤以及血管渗漏。
A.损害血管完整性和/或导致需要血管修复的病症 如以上所讨论的，本发明提供了 miR_U6激动剂用于改善血管组织完整性以及在损伤(包括缺血损伤)后促进血管修复和新血管形成(neovascularization)的用途。尤其考虑用本发明治疗以下疾病状态/病症，但这些不是限制性的。
治疗方案会根据临床情况而变化。然而，在大部分情况下，似乎适合长期维持治疗。也可能需要用miR-U6的调节剂间歇地治疗血管病症，如在疾病发展的短暂窗口期内。
心肌梗死。在供向部分心脏的血液供给受阻时发生心肌梗死(Myocardial infarcti0n，MI)。这通常是由于易损的动脉粥样硬化斑块破裂后的冠状动脉闭塞(阻塞)， 所述动脉粥样硬化斑块是动脉壁上脂类(如胆固醇)和白细胞(尤其是巨噬细胞)的不稳定集合体。如果在足够长的时间内没有治疗，所导致的缺血(血液供应受限)和氧气缺乏可造成心脏肌肉组织(心肌)的损伤和/或死亡(梗死)。
急性心肌梗死(AMI)的典型症状包括突发胸痛(通常波及到左臂或脖子的左侧)、 呼吸急促、恶心、呕吐、心悸、流汗和焦虑(通常描述为末日将近的感觉)。女性发生的典型症状可能比男性少，最普遍的是呼吸急促、虚弱、消化不良感和疲劳。所有心肌梗死中大约四分之一是无症状的，没有胸痛或其他症状。心脏病发作是医疗紧急事件，建议发生胸痛的人通知其紧急医疗机构，因为迅速地治疗是有利的。
对疑似急性心肌梗死的立即治疗包括氧气、阿司匹林以及舌下施用三硝酸甘油 (口语中称为硝化甘油并简写为NTG或GTN)。经常还给予疼痛缓解剂，典型的是硫酸吗啡。 患者将接受多种诊断检测，如心电图(ECG、EKG)、胸部X光透视和检查心脏标记物升高的血液检测(检查心肌损伤的血液检测)。最经常采用的标记物是肌酸激酶-MB (CK-MB)级分和肌钙蛋白I(TnI)或肌钙蛋白T(TnT)水平。基于ECG，区分ST段抬高心肌梗死(STEMI)或非ST段抬高心肌梗死(NSTEMI)。大部分STEMI病例用溶栓进行治疗，或者，如果可能，用经皮冠状动脉介入(PCI，血管成形术和支架植入)进行治疗，只要医院有冠状动脉造影设备。 NSTEMI用药物治疗，尽管在入院时经常实施PCI。在具有多个阻塞并相对稳定的患者中，或在少数极端紧急的病例中，对阻塞的冠状动脉进行搭桥手术是一种选择。
缺血再灌注损伤。至少部分缺血再灌注损伤是由于损伤组织的炎性应答。被新返回的血液输送到区域中的白细胞应答于组织损伤而释放大量炎性因子(例如白细胞介素) 以及自由基。恢复的血流将氧重新引入细胞，其损伤细胞蛋白质、DNA和细胞膜。继而，细胞膜的损伤可导致更多自由基的释放。这些活性反应成分也可以在氧化还原信号中间接作用以启动凋亡。白细胞也可能在小毛细血管中堆积、阻塞毛细血管并导致进一步的缺血。
再灌注损伤在脑的缺血级联反应中起作用，所述级联反应在中风和脑损伤中涉及。还认为缺血与再灌注损伤的重复发作是导致慢性创伤(如褥疮和糖尿病性足部溃疡)
14形成和不能愈合的因素。持续的压力限制血液供应并导致缺血，而在再灌注过程中发生炎症。当此过程重复时，其最终会损伤组织以致形成创伤。
已经在研究来源于超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和小麦醇溶蛋白的膳食补充物Glisodin缓解缺血再灌注损伤的能力。对作为心脏手术常见程序的主动脉夹闭(aortic cross-clamping)的研究证明了很大的潜在益处，进一步研究正在进行中。
狭窄。狭窄是血管或其他管状器官或结构的异常变窄。血管类型的狭窄常伴随着流经狭窄血管的湍流引起的噪音(杂音)。可通过听诊器听到该杂音。其他或更可靠的诊断狭窄的方法是影像方法，包括超声、磁共振成像/磁共振血管造影、计算机断层照相/CT-血管造影，其将解剖学成像(即血管的可见狭窄)与血流现象的显示(使体液通过身体结构的运动可视化)相组合。血管狭窄包括间歇性跛行综合症(外周动脉狭窄)、心绞痛(冠状动脉狭窄)、易于导致中风和短暂脑缺血发作的颈动脉狭窄和肾动脉狭窄。
其他病症。可以用miR_U6或其激动剂治疗的病症还有外伤和血管渗漏。
风险。本发明还设想治疗具有任何上述疾病状态风险的对象。这些对象可包括那些患纤维化、高血压、心肌肥厚、骨质疏松、神经退变和/或呼吸窘迫的人。
B.病理性新血管形成 如以上所述，本发明提供miR-126的拮抗剂用于阻止导致或有助于疾病发生的新血管形成的用途。尤其设想根据本发明的治疗用于以下疾病状态/病症，但不限制于此。
本发明提供在有此需要的对象中抑制病理性血管形成的方法，其包括向对象施用 miR-126的拮抗剂。与病理性血管形成相关的病症包括但不限于动脉粥样硬化、视网膜病、 癌症和中风。
早期动脉粥样硬化。动脉粥样硬化是影响动脉血管的疾病。其是动脉壁上的慢性炎性应答，很大程度上是由于在功能性高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL) 没有从巨噬细胞充分去除脂肪和胆固醇的情况下巨噬细胞类白细胞的积累，并且由低密度 (尤其是小颗粒)脂蛋白(携带胆固醇和甘油三酯的血浆蛋白质)所促进。其通常被称为动脉“硬化”。是由于动脉内多个斑块的形成所导致的。
动脉粥样硬化由低密度脂蛋白胆固醇(LDL) ( 口语中成为“坏胆固醇”)发展而来。 当该脂蛋白通过动脉壁时，氧自由基与其反应形成氧化-LDL。身体的免疫系统通过派遣专门的白细胞(巨噬细胞和T淋巴细胞)吸收氧化-LDL来应答。但是，这些白血细胞不能处理氧化-LDL，并最终涨大并破裂，将更大量的氧化胆固醇沉积入动脉壁。这诱发了更多的白细胞，并继续此循环。最终，动脉发炎。胆固醇斑使肌细胞增大并在所影响的区域形成硬盖。此硬盖导致动脉的狭窄，减少血流并使血压升高。
动脉粥样硬化通常起始于青春期早期，并经常在大部分主动脉中发现，但其是无症状的并且在一生中不能被大部分诊断方法所检测到。紧邻急性动脉粥样硬化前的阶段称为亚临床动脉粥样硬化。最常在干扰供应心脏的冠脉循环或供应脑的脑循环时成为严重的症状，一般来讲，认为其是导致中风、心脏病发作、多种心脏病包括充血性心力衰竭和大部分心血管疾病的最重要原因。手臂中或者更常见于腿部动脉中的导致血流减少的粉瘤 (atheroma),称为夕卜周云力脉闭塞性疾病(peripheral artery occlusive disease, PA0D)。 大部分动脉血流中断事件发生于具有少于50%腔变窄(平均 20%狭窄)的位置。
尽管此病程倾向于在数十年内缓慢进展，但是其通常保持为无症状直到粉瘤阻碍了动脉中的血流。这通常是粉瘤的破裂，形成凝块和腔内凝块的纤维组织化，覆盖破裂但仍产生狭窄，或者随着时间以及重复破裂后，导致持久的通常是局部的狭窄。狭窄可以是缓慢进展的，而斑块破裂是突发事件，其尤其发生在具有较薄/较弱的已变得“不稳定”的纤维帽的粉瘤中。
随着时间产生大多数狭窄的过程如下，未引发整个腔闭塞的重复斑块破裂与破裂上的凝块补片和稳定该凝块的愈合应答相组合。狭窄区域倾向于变得更稳定，尽管在这些狭窄区血流速度增加。绝大部分血流停止事件发生于大的斑块，其在破裂前产生非常少的狭窄(如果有的话)。
根据临床试验，随后破裂导致完全的动脉封闭的斑块处狭窄平均为20%。大部分严重的临床事件不发生在产生高程度狭窄的斑块。根据临床试验，只有14%的心脏病发作由在血管封闭之前产生75%或更多狭窄的斑块处的动脉封闭产生。
如果将软的粉瘤与动脉血流分开的纤维盖破裂的话，则暴露并释放组织片段，血液进入壁内的粉瘤，并且有时导致粉瘤大小的突然膨胀。组织片段非常促进凝块形成，其含有胶原蛋白和组织因子；它们激活血小板并激活凝血系统。结果是形成覆盖粉瘤的血栓 (血液凝块)，其严重地阻碍血流。随着血流的阻碍，下游组织缺乏氧和养分。如果这发生在心肌，则会产生心绞痛(心部胸痛)或心肌梗死(心脏病发作)。
如果动脉粥样硬化导致症状，则可治疗一些症状例如狭心痛。非药物手段通常是治疗的第一方法，如戒烟和经常进行运动。如果这些方法不奏效，药物通常是治疗心血管疾病的下一步骤，并且随着改进，其越来越多地成为长期内最有效的方法。然而，药物通常因它们的价格、专利控制和偶发的不利作用而受批评。
通常，称为他汀类(statins)的一组药物是最常用的并最广泛地被用于治疗动脉粥样硬化。它们具有相对较少的短期或长期不利副作用，并且多个比较性治疗/安慰剂试验相当一致地显示，在临床试验中其在降低动脉粥样硬化疾病“事件”中有很好的作用并具有通常 25%的比较性死亡率降低，尽管一项研究设计(ALLHAT)不是十分有利。
通过IVUS (血管内超声评估)，最新的他汀——罗舒伐他汀(rosuvastatin)首先证实消退冠状动脉中的动脉粥样硬化斑块。进行该研究证明了在患活跃期/有症状疾病的人中2年的时间段内主要针对动脉粥样硬化体积的作用(心绞痛频率也显著降低)，而非对预计需要更长试验时间的整体临床结果的作用；这些更长期的试验仍在进行中。
然而对于大部分人，将它们的生理行为从通常高风险变为极大降低的风险需要无限期地每天服用几种化合物的组合。越来越多的人治疗试验已完成以及正在进行，其证明采用更复杂和有效的治疗方案对这些人的结局有改善，所述治疗方案将生理行为模式改变为更近似于人在脂肪条纹开始形成之前的童年时期所显示的。
视网膜病。视网膜病是表示眼部视网膜一些非炎性损伤形式的通用术语。最常见的是血液供应问题导致此病症的形成。视网膜病经常是全身性疾病的眼部表现。视网膜病在眼底检查时由验光师或眼科学家所诊断。治疗取决于疾病的成因。
视网膜病的主要原因是糖尿病-糖尿病性视网膜病；高动脉压-高血压性视网膜病；新生儿早熟-早熟视网膜病(retinopathy of prematurity, R0P)；镰刀形红细胞白血病；遗传性视网膜病；直接阳光暴露-阳光视网膜病；医药产品-药物相关视网膜病；以及视网膜静脉或动脉闭塞。视网膜病的很多类型是进展性的并可导致失明或严重视觉丧失或损伤，尤其是如果影响了角膜斑翳。
中风。中风是由于向脑供血的血管障碍导致的快速发生的脑功能丧失。这可以是因为由血栓形成或栓塞导致的缺血(血液供应缺乏)，或由于出血。如果不迅速诊断并治疗，其可导致永久性神经损伤、并发症和死亡。中风的风险因素包括高龄、高血压(血压高)、中风病史或短暂性脑缺血发作(transient ischemic attack，TIA)、糖尿病、高胆固醇、吸烟、心房纤维性颤动、含雌激素形式的激素避孕、有先兆的偏头痛、和血栓形成倾向 (血栓形成的倾向)、卵圆孔未闭和几种罕见疾病。高血压是最重要的可变中风风险因素。
世界卫生组织在1970年间提出的中风的传统定义为“持续超过M小时或在M 小时内致死的脑血管神经功能缺损”。该M小时限制将中风与短暂性脑缺血发作区分，短暂性脑缺血发作是在M小时内完全消退的中风症状的相关综合征。随着在早期给予时可减轻中风严重程度的治疗的获得，许多人现在更愿采用替代性概念，如脑中风发作(brain attack)和急性缺血性脑血管综合征(分别取自心脏病发作和急性冠状动脉综合征)，其反映了中风症状的紧急性和快速处理的需要。
有时将中风与溶栓(“去除凝块”)一起治疗，但是通常伴随支持性治疗(如物理疗法或工作疗法)以及用抗血小板药物(阿斯匹林和经常用的潘生丁)、血压控制、他汀类和抗凝剂的二级预防(在选定的患者中)。
可以将中风分为两个主要类型缺血性和出血性。缺血性的是由于供血的中断，而出血性是由于血管或异常血管结构的破裂。80%的中风是由于缺血；剩余的是由于出血。
在缺血性中风中，对部分脑的供血减少，导致该区域脑组织的功能障碍和坏死。这种情况的产生原因有4个血栓形成(由局部形成的血液凝块导致的血管阻碍)、栓塞(同上，由于来自身体其他部位的栓塞，参见下述)、全身性灌注不足(供血的总体下降，例如休克中)和静脉血栓形成。无明显解释的中风称为“隐源性”(原因未知)。
在血栓形成性中风中，通常在粥样硬化斑块周围形成血栓(血液凝块)。由于动脉是逐渐堵塞的，有症状的血栓性中风的发作更慢。如果血栓破裂，血栓自身(即使未遮蔽血管)可导致栓塞中风(见下文)，此时称其为“栓塞”。血栓形成性中风可根据形成血栓的血管类型分为两类-大血管病或小血管病。
栓塞型中风是指栓塞对动脉的阻塞，栓塞是源自别处的在动脉血流中运动的颗粒或碎片。栓塞最常见的是血栓，但是还可以是一些其他物质，包括脂肪(例如，来自断骨中的骨髓)、气体、肿瘤细胞或细菌团(通常来自感染性内心膜炎)。由于栓塞来自于别处，局部治疗只临时解决问题。因此，必须鉴定栓塞的来源。由于栓塞堵塞是突然发生的，症状通常在开始时就是最严重的。症状也可以是暂时的，因为栓塞被部分再吸收以及运动到不同的位置或者完全分散。栓塞最常见产生自心脏(尤其在心房纤维性颤动中)，但也可来源于动脉树的其他位置。在反常栓塞(paradoxical embolism)中，深静脉血栓栓塞通过心脏中房间隔缺损或室间隔缺损进入脑。
心脏起因可分为高和低风险 高风险心房纤维性颤动和阵发性心房纤维性颤动，二尖瓣风湿性疾病或主动脉瓣疾病，人工心脏瓣膜，心房或心室的已知心脏血栓，病态窦房结综合征，持久的心房扑动， 近期的心肌梗死，慢性心肌梗死并且射血分数< 观％，有症状的充血性心力衰竭并且射血分数< 30%，扩张性心肌病，Libman-Sacks心内膜炎，Marantic心内膜炎，感染性心内膜炎，乳头状弹性纤维瘤，左心房粘液瘤和冠状动脉搭桥(coronary artery bypass graft, CABG)手术。
低风险/潜在二尖瓣环的钙化，卵圆孔未闭(patent foramen ovale，PF0)，房间隔动脉瘤，具有卵圆孔未闭的房间隔动脉瘤，无血栓的左心室动脉瘤，超声波心动描记法中分离的左心房“烟雾状”(无二尖瓣狭窄或心房纤维性颤动)，升主动脉或近端拱(proximal arch)的复杂粉瘤。
全身性灌注不足是身体的所有部分血流减少。最经常是由于心动停止或心律失常导致的心脏泵功能衰竭，或由于心肌梗塞、肺栓塞、心包积液或出血导致的心脏输出降低。 低氧(血液氧含量低)可促成灌注不足。由于血流减少是全身性的，脑的所有部分都可受影响，尤其是“水源”区域-由主要脑动脉供血的边界区区域。流向这些区域的血流不一定停止，而是可能减少到脑损伤发生的程度。此现象也可被称为“最后的草场”，这是指在灌溉中最后的草场得到最少量的水。
脑静脉窦血栓由于局部静脉压的增加而导致中风，增加的局部静脉压超过了动脉产生的压力。梗死更有可能导致缺血性转化(血液向受损区域渗漏)而不是其他类型的缺血性中风。
缺血性中风是由于阻塞脑动脉的血栓(血液凝块)，当发现这种类型的中风时，根据原因，给予患者抗血小板药物(阿斯匹林、氯吡格雷、潘生丁)或抗凝结药物(华法令)。 必须用医学影像排除出血性中风，因为这种治疗对出血性中风患者有害。
在中风中保护脑的其他即时措施包括确保血糖尽可能地正常(如在已知的糖尿病患者开始进行胰岛素按比例增减(sliding scale))，并且使中风患者得到充分的氧和静脉流体。可以放置患者以使他或她的头部在担架上水平，而不是坐起，因为研究显示这增加到脑的血流。缺血性中风的另外疗法包括阿斯匹林(每天50至325mg)，氯吡格雷(每天 75mg)和阿斯匹林和潘生丁的组合的缓释O5/200mg，每天两次)。
在中风后血压立即提高是常见的。研究显示尽管高血压导致中风，但是这在紧急情况下实际上是有利的，其使血更好地流往大脑。
如果研究显示为颈动脉狭窄，并且患者在受影响一侧有残留功能，则若在中风后快速实施颈动脉内膜切除术(手术去除狭窄)，可降低复发的风险。
如果中风是具有心源性栓塞的心律失常的结果，则治疗心律失常并用华法令或高剂量阿斯匹林抗凝血可降低复发的风险。根据CHADS/CHADS2系统确定对普通心律失常、心房纤维性颤动的中风预防治疗。
在越来越多的中风初级处理中心，采用药物组织纤溶酶原激活剂(tPA)的药理性溶栓(“凝块破裂”)用于溶解凝块并解除动脉阻碍。然而，在急性中风中采用tPA是有争议的。对急性缺血性中风的另一种干预是直接去除侵害性血栓。这通过向股动脉插入导管， 将其导入脑循环，并采用螺旋钻样装置套住凝块，然后将凝块从身体中取出来实现。抗凝血可预防中风复发。在患非瓣膜心房纤维性颤动的患者中，抗凝血可减少中风60%，而抗血小板剂可减少中风20%。然而，近期的元(meta)分析显示在栓塞性中风后过早抗凝血是有害的。
癌症。癌症包含一类疾病，其中一组细胞显示失控的生长(分裂超出了正常限制)、侵袭(侵入并破坏邻近组织)以及有时发生转移(通过淋巴或血液扩散到身体的其他
18位置)。癌症的这三个恶性特征将他们与良性肿瘤区分，良性肿瘤是自限性的，不侵袭或转移。大部分癌症形成肿瘤但是一些癌症不会，如白血病。涉及癌症研究、诊断、治疗和预防的医学分支是肿瘤学。
几乎所有的癌症都是由转化细胞的遗传物质异常引起的。这些异常可能是由于致癌物的影响，如吸烟、放射、化学物或感染性物质。其他促成癌症的遗传异常可能在DNA复制错误中随机地获得，或者是遗传的，并因而在出生时的所有细胞中存在。癌症的遗传性通常受致癌物和宿主基因组复杂相互作用的影响。已越来越多地认识到癌症发病机理遗传学的新方面的重要性，如DNA甲基化和微RNA。
诊断通常需要病理学家对组织活检样本进行组织学检查，尽管起初的恶性指征可能是症状或放射照相的异常。根据具体的类型、部位和阶段，大部分癌症可被治疗，一些可治愈。一旦被诊断，通常用手术、化学疗法和放射疗法的组合治疗癌症。
放射疗法(也称为放疗、X-射线治疗或辐射)是用电离辐射杀死癌症细胞并缩小肿瘤。放射治疗可通过体外放射治疗(external beam radiotherapy,EBRT)在外部施用或通过近距放射治疗在内部施用。放疗可用于治疗几乎每一种类型的实体瘤，包括脑、胸、子宫颈、喉、肺、胰、前列腺、皮肤、胃、子宫或软组织肉瘤癌症。放疗也可用于治疗白血病和淋巴瘤。对每个位点的放疗剂量取决于多个因素，包括每个癌症类型的放射敏感性以及是否在附近存在可被放射损伤的组织和器官。因此，像每种形式的治疗一样，放射治疗不是没有副作用的。
化学疗法是用可损伤癌细胞的药物治疗癌症。在目前的应用中，术语“化学疗法” 通常指普遍影响正在快速分裂的细胞的细胞毒药物，其与靶向治疗相对(见以下所述)。 化学疗法药物以多种可能的方式干扰细胞分裂，如干扰DNA复制或新形成染色体的分离。 大部分形式的化学疗法靶向所有快速分裂细胞并不对癌细胞有特异性，尽管其由于下述原因可具有一定程度的特异性许多癌细胞无法修复DNA损伤，而正常细胞通常可以。因此，化学疗法有损伤健康组织的可能，尤其是具有高更新速度的那些组织(例如，肠内层 (intestinal lining))。这些细胞通常在化学疗法后自我修复。因为一些药物联用时比单独使用效果更好，所以经常同时给予两种或更多种药物。这称为“联合化学疗法”，并且事实上，大部分化学疗法方案是以组合给出的。
靶向治疗最早在1990年代末期出现，它对一些类型的癌症治疗有显著的影响，并且是目前非常活跃的研究领域。靶向治疗使用对癌细胞失调蛋白质具有特异性的药剂。小分子靶向治疗药物通常是癌细胞中突变、过表达或其他关键蛋白质中酶结构域的抑制剂。 著名的实例是酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼和吉非替尼。
单克隆抗体治疗是另一种策略，其中治疗剂是与癌细胞表面蛋白质特异结合的抗体。实例包括在乳腺癌中采用的抗HER2/neU抗体曲妥珠单抗(赫赛汀)以及在多种B细胞恶性肿瘤中采用的抗CD20抗体利妥昔单抗。
靶向治疗还可涉及小肽作为“归巢装置”，其可与细胞表面受体结合或影响肿瘤周围的细胞外基质。连接到这些肽上的放射性核素(如RGD)如果在癌细胞周围衰变的话，则最终杀伤细胞。这些结合基序的寡聚体或多聚体尤其受到关注，因为其可导致肿瘤特异性和亲和性的增加。
光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)是涉及光敏剂、组织氧和光(通常采用激光)的三重性癌症治疗。PDT可用于治疗基底细胞癌(basal cell cancer, BCC)或肺癌； PDT还可用于去除手术切除大型肿瘤后的微量恶性组织。
癌症的免疫治疗表示设计成诱导患者自身的免疫应答来抵抗肿瘤的一类多种多样的治疗策略。目前用于产生针对肿瘤的免疫应答的方法包括对浅表性膀胱癌的膀胱内 BCG免疫治疗，以及采用干扰素或其他细胞因子在肾细胞癌和黑素瘤患者中诱导免疫应答。 产生特异免疫应答的疫苗是针对多种肿瘤的大量研究的主题，特别是恶性黑素瘤和肾细胞癌。Sipulencel-T是处于后期临床研究的针对前列腺癌的类疫苗策略，其中在来自患者的树突细胞中装载前列腺酸性磷酸酶肽以诱导对前列腺来源细胞的特异性免疫应答。
可认为异体造血干细胞移植(来自遗传学不同供体的“骨髓移植”)是免疫治疗的一种形式，因为在已知的移植物对抗肿瘤作用现象中，供体的免疫细胞经常会攻击肿瘤。因此，对于几种癌症类型，异体HSCT与自体移植相比具有更高的治愈率，尽管副作用也更严重。
可通过提供或阻断某些激素来抑制一些癌症的生长。激素敏感肿瘤的常见实例包括一些类型的乳腺和前列腺癌。去除或阻断雌激素或睾酮通常是重要的额外治疗。在一些癌症中，施用激素激动剂(如孕激素)可对治疗有利。
血管发生抑制剂阻止肿瘤存活所需的血管大量生长(血管发生)。它们中的一些 (如贝伐单抗)已被批准且正在临床应用。抗血管发生药物的一个主要问题是在普通细胞和癌症中，许多因素刺激血管生长。抗血管发生药物只靶向一个因素，因此其他因素继续刺激血管生长。其他问题包括给药途径、稳定性和活性的保持以及对肿瘤血管系统的靶向。
风险。本发明还设想治疗具有任何上述疾病状态风险的对象。这些对象包括患动脉粥样硬化、肥胖症、哮喘、关节炎、牛皮癣和/或失明的人。
C.联合治疗 在另一个实施方案中，预计将miR-126的调节剂与其他治疗形式组合使用。因此， 除以上所述的治疗外，还可对患者提供更多的“标准”药物治疗。组合可通过将细胞、组织或对象与单一组合物或包含两种药剂的药物制剂接触来实现，或者通过将细胞与两种不同的组合物或制剂同时接触来实现，其中一种组合物包含表达构建体，另一个包含药剂。或者，采用miR-U6调节剂的治疗可在施用其他药剂之前或之后间隔几分钟至几周进行。在其他药剂和表达构建体分开施用到细胞的实施方案中，通常确保每次递送之间的时间段不太长，以使药剂和表达构建体仍能在细胞、组织或对象中发挥有力的组合作用。在这些情况下，预计通常应将细胞与两种形式在约12-24小时的时间间隔内接触，更优选地，在约6-12 个小时的时间间隔内，最优选延迟时间仅约12小时。然而在一些情况下，理想的是显著延长治疗时间间隔，在各个施用之间间隔几天0、3、4、5、6或7)至几周(1、2、3、4、5、6、7或 8)。
另外可预计，将需要多于一次的miR_U6调节剂或其他药剂的施用。为此，可采用多种组合。例如，当miR-126的调节剂为“A”，另一种药剂为“B”时，下列基于3和4次总施用的排列是示例性的 A/'KB/%/BB/'KA/%/BB/%'KA/%/BB/7B/%'KB/%%/B A/7A//BA/%7A//BA/%%'KB/%%B/%%/AB/%/BB/%'K A/%%/BB/%%A/%'KA/%'KA//BB/7A//BB/%/B 同样设想了其他组合。
D.药物治疗剂 本领域技术人员公知药物治疗剂和给药方法、剂量等(参见如，“I^hysicians Desk Reference,，，Klaassen "The Pharmacological Basis of Therapeutics,，，“Remington's Pharmaceutical Sciences,，，禾口"The Merck Index,Eleventh Edition,，，,相关部分通过弓| 用并入本文)，并可参考本文的公开内容与本发明向结合。根据接受治疗的对象的情况会对剂量进行一些必要的变更。在任何情况下，负责给药的人员应确定对单个对象的适合剂量， 并且这种对象确定在本领域普通技术人员的技术范围内。
可用于本发明的药物治疗剂的非限制性实例包括抗高脂蛋白剂、抗动脉粥样硬化剂、抗血栓形成/溶纤剂、凝血剂、抗心律失常剂、抗高血压剂、血管收缩剂、充血性心力衰竭的治疗剂、抗心绞痛剂、抗菌剂或其组合。还设想将以上IIIA-B部分讨论的药剂/疗法与miR-U6调节剂相组合。
E.治疗的调节 本发明还设想在治疗后除去或清除miR_U6激动剂或拮抗剂的方法。该方法可包括在靶组织中过表达miR-U6拮抗剂的结合位点。在另一个实施方案中，本发明提供了在治疗后除去或清除miR-126的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在靶组织中过表达 miR-126的结合位点区域。所述结合位点区域优选地包含miR-U6种子区序列。在一些实施方案中，结合位点可包含来自miR-U6 —个或更多靶标(Spred-I)的3’ UTR的序列。在另一个实施方案中，可以在miR-U6后施用miR-U6拮抗剂以减弱或停止miRNA的功能。
F.药物制剂和施用给患者的途径 当设想临床应用时，会将药物组合物制备成适于预定应用的形式。一般而言，这要求制备的组合物基本无热原并且没有其他会对人和动物造成损害的杂质。
一般需要使用适合的盐和缓冲液以使递送载体稳定并允许被靶细胞所摄入。当将重组细胞引入患者中时也会利用缓冲液。本发明的含水组合物包含有效量的载体或细胞， 其溶解或分散在可药用载体或含水基质中。用词“可药用”或“药理学可接受”是指当施用给动物或人时，不产生不利的、过敏的或其他不理想反应的分子实体和组合物。如本文所用，“可药用载体”包括可用于制备药物(例如适于施用给人的药物)的溶剂、缓冲液、溶液、 分散基质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗或延迟吸收剂等。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除非任何传统介质或试剂与本发明活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗组合物中。只要不使组合物的载体或细胞失活，也可在组合物中并入补充性活性成分。
本发明的活性化合物可以包含经典的药物制剂。可通过任何常见途径进行本发明这些组合物的施用，只要通过这些途径可抵达靶组织。这包括口服、鼻内或口含。或者，可通过真皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射施用，或通过直接注射入心脏组织施用。这些组合物通常以可药用组合物的形式施用，如以上所述。
活性化合物还可肠胃外或腹膜内施用。例如，游离碱或可药用盐形式的活性化合物溶液可在适当地与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)混合的水中制备。也可在甘油、液体聚乙二醇和其混合物以及在油中制备分散体系。在正常的储藏和使用条件下，这些制剂通常包含防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射用途的药物形式包括，例如，无菌水溶液或悬液和用于临时制备无菌注射溶液或悬液的无菌粉末。一般地，这些制剂是无菌的，并且为易于注射程度的流体。制剂在制造和储存条件下应是稳定的，并且应针对抗微生物(如细菌和真菌)污染作用进行保存。适合的溶剂或分散介质可包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，适合的其混合物，以及植物油。可以通过使用包衣(如卵磷脂)，就分散体系的情况来说通过维持所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂，来维持合适的流动性。预防微生物的作用可通过多种抗菌剂和抗真菌剂来实现，如苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包括等渗剂，如糖或氯化钠。注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收剂来实现，如单硬脂酸铝和明胶。
可通过根据需要将适当量的活性化合物和任何其他成分(例如以上列举的)并入溶剂中，然后过滤除菌，来制备无菌注射用溶液。一般地，通过将多种无菌活性成分并入包含有基本分散基质和其他所需的成分(如以上列举的)的无菌载体中来制备分散剂。对于用于制备无菌注射用溶液的无菌粉末的情况，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其从预先过滤除菌的溶液中产生活性成分及任何额外所需成分的粉末。
对于口服施用，本发明的多肽通常可与赋形剂合并，并且以非食用的漱口水和洁牙剂的形式使用。可通过将所需量的活性成分整合入适合的溶剂(如硼酸钠溶液(Dobell 溶液))中来制备漱口水。或者，可将活性成分合并入含有硼酸钠、甘油和碳酸氢钠的抗菌洗液中。活性成分也可分散在洁牙剂中，其包括凝胶、膏剂、粉剂和浆剂。可将治疗有效量的活性成分加入牙膏中，其中可包含水、粘合剂、磨料、调味剂、起泡剂和湿润剂。
本发明的组合物通常可制备成中性或盐形式。可药用盐包括，例如，源自无机酸 (如盐酸或磷酸)或有机酸(如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)的酸加成盐(通过蛋白质的游离氨基形成)。以蛋白质的游离羧基形成的盐也可源自无机碱(如钠、钾、铵、钙、铁的氢氧化物)或有机碱(如异丙胺、三甲胺、组胺、普鲁卡因等)。
制备后，溶液优选以与制剂相容的方式并且以治疗有效的量施用。制剂可以多种剂型方便地施用，如注射用溶液、药物释放胶囊等。例如对于在水溶液中的肠胃外施用，通常该溶液被合适地缓冲并且稀释溶液使其等渗，例如采用足够的盐水或葡萄糖。这些含水溶液可用于，例如，静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。优选地，如本领域技术人员已知的， 尤其是在本发明公开内容的启发下，可采用无菌含水基质。例如，单次剂量可溶解在Iml 的等渗NaCl溶液中，并加到IOOOml皮下输注流体中或注射到预定的输注位置(参见，例如，“Remington' s Pharmaceutical Sciences"第 15 版，1035-1038 和 1570-1580 页)。 根据接受治疗的对象的情况会对剂量进行一些必要的变更。在任何情况下，负责给药的人员会确定对单个对象的适合剂量。此外，对于人的给药，制剂应符合FDA生物制品标准要求的无菌性、热原性、普遍安全性和纯度的标准。
IV.药盒 本文所述的任何组合物可包含在药盒中。在一个非限制性实例中，将单独的miRNA 调节剂(例如，miRNA、表达构建体、拮抗miRNA)包含在药盒中。所述药盒还可包含水和杂交缓冲液以便于miRNA两条链的杂交。所述药盒还可包含一种或更多种转染试剂以便于将 miRNA递送到细胞。
药盒的组分可包装在含水基质中或以冰冻干燥的形式包装。药盒的容器装置通常包括至少一个小管、试管、烧瓶、小瓶、注射器或其他容器装置，组分可放入其中，优选地其为合适分装的。当药盒中存在多于一种成分时(标记试剂和标记物可包装在一起)，所述药盒通常还包含第二、第三或其他额外的容器，其中分别放置额外的组分。然而，在一个管中可包含组分的多种组合。本发明的药盒通常还包括含有核酸的装置，以及其他任何密封的试剂容器以用于销售。这些容器可包括注射或吹塑塑料容器，其中装有所需的管。
当在一种和/或更多种液体溶液中提供药盒的组分时，液体溶液为水溶液，尤其优选无菌水溶液。
然而，药盒的组分可以干粉形式提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可通过加入合适的溶剂重构干粉。设想溶剂可在另外的容器装置中提供。
容器装置通常包括至少一个小管、试管、烧瓶、小瓶、注射器和/或其他容器装置， 其中放置核酸制剂，优选地，其被恰当地分配。药盒还可包含第二容器装置用于包含无菌的，可药用缓冲液和/或其他稀释液。
本发明的药盒还通常包含用于将小瓶密封以销售的装置，例如，注射和/或吹塑塑料容器，其中装有所需的管。
这些药盒还可包含保护或维持miRNA或使其免于降解的成分。这些成分可无 RNase或保护其受RNase作用。这些药盒通常包括在合适的工具中的对每个单独的试剂或溶液的分别的容器。
药盒还包括使用药盒组分及使用其他任何未包含在药盒中的试剂的说明书。说明书中可包含可实施的变化。
这些试剂包含在本发明药盒的实施方案中。然而，这些药盒不限于以上定义的特定项，并可包含任何用于处理或测定miRNA的试剂。
V.筛选方法 本发明还包括在预防或治疗上述疾病中所用的鉴定miR-U6调节剂的方法。这些测定可包括随机地筛选候选物质的大型文库；或者，测定可用于关注特定化合物类别，该特定化合物类别的选择是着眼于认为能使它们更有可能调节miR-U6的表达和/或功能的结构特性。
为了鉴定miR_U6的调节物，通常会测定miR_U6在存在或缺乏候选物质时功能。 例如，方法通常包括 (a)提供候选调节物； (b)将候选调节物与miR_U6混合； (c)测量 miR-126 的活性 (d)将步骤(C)的活性与缺乏候选调节物的活性相比。
其中所测量活性的差异表明候选调节物的确是miR-126的调节物。
测定还可在分离的细胞、器官或在活生物体中进行。
当然，应理解，本发明的所有筛选方法本身均是可用的，尽管的确可能发现不了有效的候选。本发明提供筛选这些候选的方法，不只是发现它们的方法。
A.调节物 如本文所用，术语“候选物质”是指任何可潜在地调控miR-126的血管发生调节方面的分子。通常需要多种商业来源的分子文库，认为它们“穷举”鉴定有效化合物的能力满
23足有效药物的基本标准。筛选这些文库(包括组合产生的文库(如拮抗miRNA文库))是筛选大量相关(和不相关)化合物活性的快速有效方法。组合方法还通过对有活性但其他方面不理想的化合物产生第二、第三和第四代化合物来使自身快速地发展为潜在的药物。
B.体外测定 快速、经济且简便的进行操作的测定是体外测定。这些测定通常使用分离的分子， 可快速以及大量地进行，因而增加了在短时间内获得的信息量。可采用多种载体进行测定， 包括试管、培养板、培养皿和其他表面，如量尺或珠子。
在WO 84/03564中描述了高通量筛选化合物的技术。可在固体基质(如塑料钉或其他表面)上合成大量的小核酸。可快速筛选这些分子抑制miR-126的能力。
C.细胞内(In cyto)测定 本发明还包括根据化合物在细胞内调节miR_U6活性和表达的能力来对化合物进行的筛选。可采用多种细胞系(包括那些从内皮细胞和造血细胞衍生的细胞系)来进行这些筛选测定，包括为此目的特别改造的细胞。
本发明还包括对miR-126靶基因表达的检测，以确定miR_U6的活性是否被调节。 因此，作为筛选策略的一部分，可检测在表3或4中给出的任何基因靶标，并且有利地可检测多个这些靶标。
D.体内测定 体内测定涉及上述血管疾病的多种动物模型的使用，包括经改造以具有特定缺陷，或携带标记的转基因动物，所述标记可用于测量候选物质到达并作用生物体内不同细胞的能力。由于小鼠的大小，方便处理，以及其生理和遗传组成方面的信息，小鼠是优选的实施方案，尤其是转基因小鼠。然而，其他动物也适合，包括大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、沙鼠、土拨鼠、猫、狗、绵羊、山羊、猪、牛、马和猴(包括黑猩猩、长臂猿和狒狒)。可采用源自任何这些物种的动物模型进行抑制剂的测定。
用检测化合物处理动物将涉及向动物施用合适形式的化合物。施用可以通过任何可用于临床目的的途径。在体内确定化合物的有效性可能涉及多种不同标准。并且，与体外或细胞内测定相比，可在动物中以更有意义的方式测定毒性和剂量反应。
VI.用于克隆、基因转移和表达的载体 在一些实施方案中，采用表达载体来表达miR_U6或相关分子(如拮抗miRNA)。表达需要在载体中提供合适的信号，并包括多种调控元件，如病毒和哺乳动物来源的增强子/ 启动子来引导目的基因在宿主细胞中的表达。还定义了设计为优化信使RNA在宿主细胞中稳定性和翻译能力的元件。还提供了使用多个显性药物选择标记来建立永久、稳定表达产物的细胞克隆的情况，以及将药物选择标记的表达与多肽的表达相连的元件。
A.调控元件 在本申请中，术语“表达构建体”是指任何类型的基因构建体，其含有编码基因产物的核酸，所述产物中部分或全部核酸编码序列能被转录。通常，编码基因产物的核酸在启动子的转录控制下。“启动子”是指被细胞的合成机器或引入的合成机器(需要其来起始特定基因的转录)识别的DNA序列。术语“在转录控制下”是指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向从而控制RNA聚合酶起始和基因表达。
本文所用术语启动子是指一组转录控制模块，其聚集在RNA聚合酶II的起始位点周围。有关启动子如何组织的大部分理论都来自于对几个病毒启动子的分析，包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单元的启动子。更多的近期工作丰富了这些研究，并显示启动子包括分离的功能模块，每个由约7_20bp的DNA组成，并包含一个或更多个转录激活或抑制蛋白的识别位点。
在每个启动子中至少一个模块的功能是提供RNA合成的起始位点。最熟知的实例是TATA盒，但在一些没有TATA盒的启动子中(如哺乳动物晚期脱氧核苷酸基转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)，与起始位点自身重叠的分离的元件帮助固定起始位置。
另外的启动子元件调控转录起始的频率。通常这些位于起始位点上游30_110bp 区域，尽管近期显示许多启动子在起始位点下游也含有功能元件。启动子元件之间的间隔经常是可改变的，因而当元件相对于彼此颠倒或移动时，启动子仍保有功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔可增加至50bp，再增加活性才会开始降低。根据启动子，似乎单个元件可共同或分别行使功能来激活转录。
在其他一些实施方案中，可采用人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40 早期启动子、劳氏肉瘤病毒长末端重复、大鼠胰岛素启动子和3-磷酸甘油醛脱氢酶来获得目的编码序列的高水平表达。还设想采用本领域公知的其他病毒或哺乳动物细胞或噬菌体启动子来获得目的编码序列表达的用途，只要对于给定目的来说表达水平是足够的。
通过采用具有公知特性的启动子，可优化转染或转化后目的蛋白质表达的水平和模式。而且，选择应答于特定生理信号而调控的启动子可允许基因产物的可诱导表达。表 1和2列出了在本发明内容中可用于调控目的基因表达的几种调控元件。该列表不是为了穷举在基因表达启动中涉及的所有可能元件，而仅为其示例。
增强子是提高启动子转录的基因元件，其位于同一 DNA分子的较远位置。增强子的构成与启动子十分相似。即，他们包括很多单独的元件，每个结合一种或更多种转录蛋白质。
增强子和启动子的基本区别是在作用上。增强子区域作为整体必须能在远端刺激转录；这对启动子区域或其组成元件来说是不需要的。另一方面，启动子必须具有一个或更多个在特定位点并以特定方向指导RNA合成起始的元件，而增强子没有这些特点。启动子和增强子经常重叠或连续，经常显示出类似的模块结构。
以下是可与表达构建体中编码目的基因的核酸组合使用的病毒启动子、细胞启动子/增强子和可诱导启动子/增强子的列表(表1和表幻。此外，还可采用任何启动子/ 增强子组合(按照真核启动子数据库EPDB)来指导基因表达。如果提供适合的细菌聚合酶 (作为递送复合物的一部分或额外的基因表达构建体)，则真核细胞可支持一些细菌启动子的胞浆转录。
权利要求
1.促进血管完整性和/或血管修复的方法，其包括向有血管损伤风险或患有血管损伤的对象施用miR-126功能的激动剂。
2.权利要求1的方法，其中所述对象患有血管损伤。
3.权利要求2的方法，其中所述血管损伤发生在心脏组织。
4.权利要求2的方法，其中所述血管损伤包括缺血性事件。
5.权利要求4的方法，其中所述缺血性事件包括梗塞、缺血再灌注损伤或动脉狭窄。
6.权利要求2的方法，其中所述血管损伤发生在非心脏组织。
7.权利要求6的方法，其中所述血管损伤包括外伤或血管渗漏。
8.权利要求1的方法，其中所述对象有血管损伤风险。
9.权利要求8的方法，其中所述对象患高血压、晚期动脉粥样硬化心脏肥大、骨质疏松、神经退变、纤维化或呼吸窘迫。
10.权利要求1的方法，其中所述对象为非人动物。
11.权利要求1的方法，其中所述对象是人。
12.权利要求1的方法，其中所述激动剂是miR-126。
13.权利要求1的方法，其中所述激动剂是miR-126的模拟物。
14.权利要求1的方法，其中所述激动剂是表达载体，其包含处于在靶细胞中有活性的启动子控制之下的miR-U6编码核酸区段。
15.权利要求14的方法，其中所述靶细胞为内皮细胞或造血细胞。
16.权利要求14的方法，其中所述启动子是组织选择性/特异性启动子。
17.权利要求16的方法，其中所述组织选择性/特异性启动子在内皮细胞或造血细胞中有活性。
18.权利要求14的方法，其中所述表达载体是病毒载体。
19.权利要求14的方法，其中所述表达载体是非病毒载体。
20.权利要求1的方法，其还包括向所述对象施用第二治疗。
21.权利要求1的方法，其中施用包括全身性施用。
22.权利要求21的方法，其中全身性施用是经口、静脉内或动脉内施用。
23.权利要求1的方法，其中施用是通过渗透泵或导管进行。
24.权利要求1的方法，其中施用是直接或局部施用到血管损伤组织或有血管损伤风险的组织。
25.权利要求M的方法，其中所述组织是心脏组织、血管组织、骨组织、神经组织、呼吸系统组织、眼组织或胎盘组织。
26.在有此需要的对象中抑制病理性血管化的方法，其包括向有病理性血管化风险或患有病理性血管化的对象施用miR-126的拮抗剂。
27.权利要求沈的方法，其中所述对象患有病理性血管化。
28.权利要求27的方法，其中所述病理性血管化包括早期动脉粥样硬化、视网膜病、癌症或中风。
29.权利要求沈的方法，其中所述对象具有病理性血管化的风险。
30.权利要求四的方法，其中所述对象患高脂血症、肥胖症、哮喘、关节炎、牛皮癣和/ 或失明。
31.权利要求沈的方法，其中所述对象是非人动物。
32.权利要求沈的方法，其中所述对象是人。
33.权利要求沈的方法，其中所述拮抗剂是miR-U6拮抗miRNA。
34.权利要求沈的方法，其中所述拮抗剂被递送到血管组织、平滑肌、眼组织、造血组织、骨髓、肺组织或心外膜组织。
35.权利要求沈的方法，其还包括向所述对象施用第二抗血管发生治疗。
36.权利要求沈的方法，其中施用包括全身性施用。
37.权利要求36的方法，其中全身性施用是经口、静脉内、动脉内施用。
38.权利要求沈的方法，其中所述施用是直接或局部施用到病理性血管化或具有病理性血管化风险的组织。
39.权利要求38的方法，其中所述组织是眼组织、血管组织、骨组织、脂肪组织或肺组织。
40.权利要求沈的方法，其中施用通过渗透泵或导管进行。
全文摘要
本发明涉及称为miR-126的微RNA的鉴定，其是内皮细胞血管完整性的调节剂。该内皮细胞限制性微RNA在体内介导发育性血管发生，在小鼠中miR-126的靶向缺失使得因血管完整性的丧失以及内皮细胞增殖、迁移和血管发生的缺陷而导致血管渗漏、出血和部分胚胎死亡。这些血管异常类似于血管发生生长因子例如VEGF和FGF的信号转导降低所造成的后果。这些发现对涉及血管发生异常和血管渗漏的多种疾病是重要的治疗启示。本文公开了通过调节miR-126的功能治疗特征为局部缺血、血管损伤和病理性新血管形成的疾病的方法。
文档编号A61K31/7088GK102186483SQ200980137927
公开日2011年9月14日 申请日期2009年8月11日 优先权日2008年8月11日
发明者埃里克·奥尔松, 王树生 申请人:德克萨斯大学系统董事会