抑制p1gf以治疗费城染色体阳性白血病的制作方法

专利名称：：抑制p1gf以治疗费城染色体阳性白血病的制作方法
技术领域：
：本发明涉及癌症领域，尤其是白血病领域。更特别地，其涉及费城染色体阳性(Ph+)白血病的治疗。这通过抑制胎盘生长因子(PlGF)而实现。因此，本发明提供了使用PlGF抑制剂(尤其是使用抗PlGF抗体)治疗Wi+白血病的方法。预计用此方式治疗的一种特定类型的白血病是慢性髓细胞性白血病(chronicmyelogenousleukemia，CML)，尤其是在常规BCR/ABL抑制剂(如伊马替尼)无法提供足够治疗作用的患者中。
背景技术：
：费城染色体(也称为费城易位)是与慢性髓细胞性白血病(CML)相关的特定染色体异常。其是9号和22号染色体之间相互易位的结果，并特别地命名为t(9；22)(q34；qll)。该易位的存在是CML的高敏感性检测，因为95%的CML患者具有此异常。剩余5%的CML患者通常具有G带染色体制备物中不可见的隐匿易位(cryptictranslocation)或者具有涉及另外染色体与9号和22号染色体长臂的变异易位(varianttranslocation)。然而，仅仅费城(Ph)染色体的存在不足以特异性诊断CML，因为其也在25-30%的成年人急性淋巴母细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,ALL)病例中发现(以及在2-10%的小儿ALL病例中)。尽管如此，这些疾病有明显区别。急性淋巴母细胞白血病(ALL)是白血病的一种形式，其中恶性、不成熟的白血细胞持续倍增并在骨髓中过度产生。ALL通过在骨髓中驱逐正常细胞以及散播(转移)到其他器官而导致损伤和死亡。ALL在儿童和青年中最常见，在4-5岁发病率达到峰值，并在更大年龄达到另一个峰值。儿童中的总治愈率为85%，并且约50%的成年人可长期无疾病存活。“急性”是指循环淋巴细胞的未分化、不成熟状态(“原始细胞(blast)”)以及疾病的快速发展，如果不治疗将在几周至几个月内致命。对急性白血病的治疗可包括化学治疗、类固醇、放射治疗、强化组合治疗(包括骨髓或干细胞移植)以及生长因子。另一方面，慢性髓细胞性白血病(CML)是白血病的另一种形式，其特征为骨髓中主要的髓细胞增加和生长失调以及这些细胞在血液中积累；因此其是骨髓增生性疾病。CML是克隆性骨髓干细胞异常，其中主要所见是成熟粒细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和其前体的增殖。之前，已经使用化疗、干扰素及骨髓移植对其进行治疗，但是现在也可进行靶向治疗并且其已作为标准治疗使用。在费城染色体中观察到的9号和22号染色体的部分交换产生了BCR-ABL融合基因(Melo，1996)。也就是说，来自于22号染色体(qll区)的BCR基因的一部分(断点簇区)与9号染色体(q34区)上ABL基因的一部分融合。Abl表示“Abelson”，其是携带类似蛋白质的白血病病毒的名称。根据BCR区的断点产生两种BCR-ABL转录本(其产生pl85和p210同工型，根据其以kDa计的表观分子量命名)。融合的“BCR-ABL”基因位于所得的较短的22号染色体上。ABL携带可将磷酸基团添加到酪氨酸残基上的结构域(酪氨酸激酶)，BCR-ABL融合基因产物也是酪氨酸激酶O^aderl等，1999)。融合的BCR-ABL蛋白质与白介素-3β普通受体亚基相互作用。BCR-ABL转录本持续具有活性并且不需要由其他细胞信号蛋白的激活。随后，BCR-ABL激活控制细胞周期的蛋白质级联，加速细胞分裂。而且，BCR-ABL蛋白质抑制DNA修复，导致基因组不稳定并使细胞更易于产生进一步的基因异常，并有可能促进CML从慢性阶段发展为不可治疗的原始细胞危象(blastcrisis).认为BCR-ABL蛋白的酪氨酸激酶作用是导致慢性髓细胞性白血病的病理生理原因。已经开发了特异性抑制BCR-ABL蛋白活性的靶向治疗。它们之中的第一个是伊马替尼(其甲磺酸盐形式已上市，商品名为Glivec或Gleevec)。这些和其他酪氨酸激酶抑制剂可诱导CML的完全缓解，这确认了BCR-ABL在CML中的核心重要性(Hehlmarm等，2007)。也有报道在用BCR-ABL抑制剂治疗费城染色体阳性(Ph+)ALL时的有限成功(Yanada和Naoe，2006；Piccaluga等，2006)。尽管伊马替尼和第二代BCR/ABL抑制剂(例如，达沙替尼)已经引起了对费城染色体阳性(Ph+)白血病患者治疗的革命，但是已知的问题是甚至在成功治疗的患者中仍存在白血病细胞，并且一些患者产生抗性并最终复发(Swords等，2007；Buchert,2007；Li和Li,2007；Kujawski和Talpaz，2007)。这些缺点的原因尚未完全了解。因此，具有用于治疗费城染色体阳性白血病患者的其他选择将是有利的，尤其是对于那些对BCR-ABL抑制剂治疗没有应答的患者。发明概述本申请的一个目的是提供治疗费城染色体阳性(Ph+)白血病的新治疗方法。尤其地，设想其也能够对那些不适于(或不再适于)用BCR-ABL抑制剂(如伊马替尼)进行治疗的患者提供有帮助的治疗方法。出乎意料的是，发现抑制胎盘生长因子(PlGF)(尽管该因子不在白血病细胞系中表达)可使白血病小鼠的存活显著延长。而且，该存活延长不依赖于BCR-ABL的突变状态，这不同于针对BCR-ABL抑制剂所观察到的。因此，根据第一方面，涉及胎盘生长因子抑制剂在治疗费城染色体阳性白血病中的用途。还涉及胎盘生长因子抑制剂在制备用于治疗费城染色体阳性白血病的药物中的用途。同样，提供了在有此需要的对象中治疗费城染色体阳性白血病的方法，包括向所述对象施用PlGF抑制剂。当然，由此在有此需要的对象中改善症状或最终治疗Wi+白血病是目的所在。根据一些特定的实施方案，在本文所述的用途和方法中提供的胎盘生长因子抑制剂是胎盘生长因子选择性抑制剂。特别地，所述选择性抑制剂是特异性结合胎盘生长因子的抗体或其片段。这些抗体可以是单克隆或多克隆抗体。根据一些特定的实施方案，所述与胎盘生长因子特异性结合的抗体或其片段是单克隆抗体。根据其他一些特定的实施方案，其是鼠单克隆抗体。根据另外一些特定的实施方案，鼠单克隆抗体可人源化，即通过重组DNA技术制备的小鼠单克隆抗体的人源化形式，其起始于编码重链和轻链的小鼠和/或人基因组DNA序列或编码重链和轻链的cDNA克隆。根据替代性实施方案，所述抗体或其片段是人抗体(或其片段)，尤其是人单克隆抗体。根据一些特定的实施方案，特异性结合PlGF的抗体片段是Fab片段，F(ab')2片段或单链可变区片段(scFv)。根据一些替代性特定实施方案，选择性抑制剂是抗PlGF的纳米抗体(nanobody)。根据另一些特定实施方案，所述PlGF抑制剂不是选择性抑制剂。其具体实例是VEGFR-I抑制剂，如VEGFR-I抗体或其片段。提供了用于治疗费城染色体阳性(Ph+)白血病的PlGF抑制剂的方法和用途。根据一些特定的实施方案，费城染色体阳性白血病是慢性髓细胞性白血病(CML)。根据一些替代性实施方案，所述Ph+白血病是急性淋巴母细胞白血病(ALL)，如B-ALL(其中B细胞是白血病细胞)或T-ALL(其中白血病细胞为T细胞)。预计本文所述的方法和用途具有广泛适用性。尤其地，预计PlGF抑制剂可用于治疗(或用在其治疗方法中)全部费城染色体阳性白血病，尤其是不能用BCR-ABL抑制剂治疗的那些和/或不能用BCR-ABL抑制剂单独治疗的那些。由于多种原因，Ph+白血病可能不能用BCR-ABL抑制剂或单独的BCR-ABL抑制剂治疗。最常见的原因是白血病可能(至少部分上)对治疗不敏感(或对治疗产生至少部分抗性/不敏感性)，或者患者可能对BCR-ABL抑制剂不耐受(例如，由于过敏或不利副作用)。尽管PlGF抑制提供了治疗Wi+白血病的通用方法，但是其可能对下述情况特别有利，即BCR-ABL抑制(对例如CML的标准治疗方法)无法产生所需的治疗作用。继而，PlGF抑制剂的应用可提供替代性或补充性方法。根据一些特定的实施方案，PlGF抑制剂可与BCR-ABL抑制剂联合使用。图1显示了在体外白血病细胞、造血细胞和原代骨髓基质细胞中的PlGF表达。A不同细胞系和分离细胞分泌的PlGF蛋白质的量(细节参见实施例1)；B鼠BMDSC的造血级分(CD45+)和非造血级分(CD45—)的PlGF表达。*表示ρ<0.001。BM骨髓。在图2中，显示了PlGF和其他分子的体内表达(细节参见实施例2)。Α，B在小鼠中白血病发展的不同时间点外周血或骨髓中的PlGF蛋白质水平；C，D在小鼠中白血病发展的不同时间点外周血或骨髓中PlGF与sVEGFR-1蛋白质水平的比值；E健康和白血病小鼠中骨髓PlGFmRNA的表达，*表示ρ<0.002；F骨髓亚群中PlGF的表达特性，*表示ρ<0.05；G健康和白血病小鼠中骨髓VEGFmRNA的表达；H，I外周血或骨髓中PlGF蛋白质水平与疾病末期小鼠中白血病负荷相关。图3证实了PlGF引起的白血病细胞增殖(细节参见实施例3)。A，B不同白血病细胞系中Npn-I和Npn-2的表达；C不同浓度的PlGF对BV-173细胞系增殖的诱导；D:50ng/mlPlGF分别对K562(左上图)、BV-173(右上图)、KCL-22(左下图)和BaF3(右下图)细胞系增殖的诱导。E抗VEGFR-I抗体对BV-173细胞系中PlGF诱导增殖的抑制；F抗PlGF抗体对BV-173细胞系中PlGF诱导增殖的抑制；BM骨髓；PlGF胎盘生长因子；αVEGFR-I抗血管内皮生长因子受体-I抗体；αPlGF抗PlGF抗体。在图4中，显示了体外白血病细胞与BMDSC之间旁分泌相互作用(A-D)以及白血病细胞条件培养基的诱导(E)。A:BMDSC、BV-173细胞系和共培养物(BMDSC+BV)中PlGF的表达；B:S17细胞、BV-173细胞系和共培养物中PlGF的表达；C单独的BV-173白血病细胞以及其与BMDSC共培养时的增殖，以及抗-PlGF抗体对其的抑制；D单独的BMDSC以及其与BV-173白血病细胞共培养时的增殖，以及抗-PlGF抗体对其的抑制；E通过用白血病细胞(BV-173)条件培养基孵育，S17细胞中PlGF的上调。BV:BV_173细胞系；αPlGF抗PlGF抗体。图5A白血病PlGF+和野生型小鼠的存活；B交换白血病小鼠的存活(细节参见实施例5)；C用抗PlGF抗体或对照抗体处理后，患有由淋巴BCR-ABL+BaF3细胞诱导的白血病的小鼠的存活；D，E早期(dl5)和晚期(业8)白血病的BCR-ABL+细胞的FACS分析，以及抗-PlGF抗体的抑制作用；F对照和抗PlGF处理的晚期白血病小鼠的骨髓组织学；G用抗PlGF抗体或对照抗体处理的伊马替尼敏感性CML小鼠模型的存活；H用抗PlGF抗体或对照抗体处理的伊马替尼抗性CML小鼠模型的存活。αPlGF抗PlGF抗体；d天；T315IBCR-ABL融合蛋白的T315I突变。细节参见实施例6。图6显示了抗PlGF治疗对骨髓过度血管化和纤维化的抑制(参见实施例7)。A，C模拟移植、对照抗体处理和抗PlGF处理的晚期白血病小鼠的骨髓血管密度(bonemarrowvasculardensity,MVD)；B,D:模拟移植、对照抗体处理和抗PlGF处理的晚期白血病小鼠的网硬蛋白+(reticulin)纤维长度和骨髓纤维化。在图7中，显示了人CML的PlGF表达数据(A_D，实施例8)以及与小鼠(E)和人(F，实施例9)中PlGF表达和伊马替尼治疗相关的数据。A:CML不同时期的血浆PlGF水平(健康对照、慢性期和原始细胞危象)，*表示P<0.0001。B=CML患者的骨髓浆(bonemarrowplasma)PlGF水平；C人CML中PlGF水平和BCR/ABL转录本数之间的相关性；D健康对照、CML患者的白血病细胞和基质细胞中PlGF表达的QRT-PCR；E未处理的白血病小鼠、用伊马替尼处理的健康的和白血病小鼠的骨髓PlGF水平；F健康人对象和对伊马替尼(IM)具有不同应答水平的患者的PlGF水平。细节参见实施例9。发明详述定义将针对具体实施方案并参照一些附图描述本发明，但是本发明不受其限制，而仅受权利要求的限制。不应将权利要求中的任何参照标记解释为对范围的限制。所述的图是示意性的并非限制性的。在附图中，对一些要素的尺寸可能有夸大并为说明目的未按照比例绘制。当在本描述和权利要求中使用术语“包含”时，其不排除其他要素或步骤。当名词没有数量词修饰时，除非特别说明，否则其包括该名词的复数。而且，说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等用于区别累似的要素，并不一定按次序或时间顺序描述。应理解在适当的环境下所用的术语是可互换的，并且本文所述的本发明的实施方案能够以不同于本文描述或说明的其他顺序进行。以下术语或定义只是为了帮助理解本发明而给出。除非本文特别定义，否则本文所用的所有术语与本发明领域技术人员理解的意义相同。尤其推荐专业人员参考SambrookMolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborPress,Plainsview,NewYork(1989)；以及Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology(附录47),JohnWiley&Sons,NewYork(1999)中关于本领域的定义和术语。不能将本文提供的定义解释为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围。本文所用的“胎盘生长因子”或“PKiF”是指VEGF(血管内皮生长因子)亚家族成员，尤其是人PlGF(GenelD52;RefSeqs(独立于基因组架构)NM_002632.4(mRNA)和NP_002623.2(蛋白质))。除非另外指明，否则术语“P1GF”可指基因以及其产物，如PlGFRNA(最特别地，PlGFmRNA)以及PlGF蛋白质。PlGF的所有同工型都应包括在PlGF的定义中。6本文所用术语“费城染色体阳性”或“Ph+”白血病是指其中证实了存在费城易位的疾病。费城染色体是t(9;22)(q34;qll)易位(费城易位)的产物。至少记录了两种费城染色体易位的可选形式，但是两个可选断点均导致22号染色体上BCR(0MIM*151410)的不同外显子组与位于9号染色体上的ABL基因(0MIM*189980)的常见外显子亚组相连。因此，融合可导致2种可选的嵌合致癌基因产物，称为p210(BCR-ABL)和ρ185(BCR-ABL)，本文中统称为“BCR-ABL”(包含于0ΜΙΜ*151410和0ΜΙΜ*189980中)。ABL酪氨酸激酶活性的激活是嵌合致癌基因致癌能力所必需的。因为嵌合BCR-ABL基因(以及其基因产物)的存在是Ph+白血病的标志，所以“Ph+”还可被称为“BCR-ABL阳性”或“BCR-ABL+”白血病，以表示融合基因的存在。应注意不论易位的机制为何，导致产生功能性BCR-ABL嵌合基因(即BCR-ABL+)的易位或突变在本文中也归类为“Wi+”。例如这可以是更复杂的易位情况。本申请中所用的“胎盘生长因子选择性抑制剂”是抑制PlGF功能或信号转导通路而不干扰其他分子生理功能的分子或化合物。尤其地，PlGF选择性抑制剂不干扰VEGF的功能。因此，作为非限制性实例，特异针对PlGF的化合物(例如，抗PlGF抗体)是选择性抑制剂，而还靶向VEGF(如基于VEGFRl的化合物)或靶向VEGF/P1GF共有受体(如抗VEGFRl或sVEGFR-Ι的抗体)的化合物通常是非选择性抑制剂。本文所用的“慢性髓细胞性(myelogenous)白血病”、“慢性髓性(myeloid)白血病”或“CML”是指具有特异细胞遗传异常(费城染色体)的多能干细胞的克隆性骨髓增生性疾病，其涉及髓细胞、红细胞、巨核细胞、B淋巴细胞并且有时涉及T淋巴细胞，但不涉及骨髓成纤维细胞(0ΜΙΜ#608232；Silver，2003)。本申请所用“急性淋巴细胞白血病”、“急性成淋巴细胞白血病”或“ALL”是指白血病的急性形式，其中不成熟的白细胞不断倍增并在骨髓中过度产生。ALL的实例包括T-ALL和B-ALL。混合型的ALL病例的特定亚组也是费城染色体阳性，即Ph+或BCR-ABL+(Radich，2001；Alvarado等，2007)。如在本申请所用，“BCR-ABL抑制剂”是抑制嵌合BCR-ABL基因或其基因产物之表达或功能的分子或化合物。应注意，BCR-ABL抑制剂不一定是BCR-ABL特异性的。例如，它可以是不只靶向BCR-ABL酪氨酸激酶的酪氨酸激酶抑制剂。BCR-ABL抑制剂是公知的Ph+白血病靶向疗法，一个非限制性但典型的实例是伊马替尼。其他实例包含在本申请中。本申请中所用的“治疗”是指实现Wi+白血病相关的一种或更多种临床症状的显著改善。根据情况，可定量或定性对显著改善给予评分。例如定性的标准可以是患者健康。在定量评价的情况下，显著的改善通常是相对施用PlGF抑制剂之前的情况有多于10%、多于20%、多于25%、多于30%、多于40%、多于50%、多于60%、多于70%、多于75%、多于80%、多于90%、多于95%或100%或更多的改善。当然，如果将改善表示为降低(例如，在患者样本中存在的恶性细胞数)，则改善不能超过100%。评价改善的时间段应取决于观察标准的类型并可由本领域技术人员确定。本发明的一个重要方面是提供用于治疗费城染色体阳性白血病的方法和胎盘生长因子抑制剂在其中的用途。另外，还教导了胎盘生长因子抑制剂在制造用于治疗费城染色体阳性白血病的药物中的用途。尤其地，胎盘生长因子(PlGF)抑制剂是PlGF选择性抑制剂，以不干扰其他分子。尤其地，PlGF选择性抑制剂不应干扰VEGF的功能。根据一些特定的实施方案，PlGF抑制剂不是VEGF抑制剂。根据一些替代性特定实施方案，PlGF抑制剂不是VEGFRl抑制剂。根据一些具体的实施方案，PlGF抑制剂不基于VEGFRl。抑制剂可通过干扰PlGF的合成、翻译、二聚化、受体结合和/或受体结合介导的信号转导来中和其活性。中和PlGF的活性应理解为将PlGF的活性抑制至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或甚至100%。PlGF的抑制剂(尤其是选择性抑制剂)是本领域已知的。根据一些特定的实施方案，所述选择性抑制剂是抗体。术语“抗体”涉及具有下述特征的抗体，即其特异性针对PlGF或其任何功能性衍生物或其抗原结合片段，尤其是F(ab’)2、F(ab)或单链Fv(ScFv)类型，或由其衍生的任何类型的重组抗体。本文所述的抗PlGF抗体，包括针对PlGF制备的特异性多克隆抗血清或其任何功能性衍生物在内，与其他蛋白质没有交叉反应性。根据一些特定的实施方案，抗PlGF抗体是单克隆抗体。单克隆抗体可例如从易于根据经典方法由动物(特别是针对PlGF或其任何功能性衍生物免疫的小鼠或大鼠)的脾细胞和骨髓瘤细胞系的细胞形成的任何杂交瘤产生，并且可根据杂交瘤产生识别PlGF或其任何功能性衍生物(其起初用于免疫动物)的单克隆抗体的能力来对其进行选择。根据一些特定的实施方案，可用例如以下的方法制备抗人PlGF的单克隆抗体将重组人PlGF融合蛋白(由PlGF编码的氨基酸或其片段组成)偶联到谷胱甘肽S-转移酶(GST)并在大肠杆菌中表达，通过固定化谷胱甘肽(AmershamBiosciences)的亲和层析进行纯化。也可从下列公司购得重组人PlGF:R&DSystemsInc.614McKinleyPlaceN.Ε.Minneapolis,MN55413,USA.(264-PG-010,264-PG-010/CF,264-PG-050或264-PG-050/CF),ResearchDiagnosticsInc,PleasantHillRoad,FlandersNJ07836，USA(重组人PIGF-I:Cat#RDI-300-015&Cat#RDI-300_016和重组人PIGF-2Cat#RDI-300-019)或ALEXISCorporation，CH-4415Lausanne,Switzerland(胎盘生长因子-2(人)(重组)cat#RLT-300-020)。将重组人PLGF与等量佐剂混合，并且将所得的混合物皮下施用给Balb/c雄性小鼠(免疫开始时8周龄)，施用量对应PlGF的量为IOOyg/小鼠(引发免疫)。在约21天后，可按照与上文所述相同的方式通过皮下施用进行免疫(加强免疫)。在加强免疫19天至30天后，可通过尾静脉向小鼠施用200μ1的浓度为250yg/ml的制剂(最终免疫)，所述制剂通过用PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)稀释人PlGF获得。在最终免疫后约3天，从小鼠中切取脾，并且必须将其分离成单个细胞。然后，应用合适的培养基(例如DMEM培养基)清洗脾细胞。另一方面，必须在对数生长期收集适合的小鼠骨髓瘤细胞(如Sp2/0-Agl4)并用合适的培养基(例如DMEM培养基)清洗。必须在塑料管中以101的细胞数比例充分混合脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞，而后加入50%(w/v)聚乙二醇(PEG，例如BoehringerMannheim，平均分子量4000)在37°C进行细胞融合7分钟。在去除上清溶液(通过离心)后，将残余物加入HAT培养基(含有10%胎牛血清并加入次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶的DMEM培养基)。必须将残留物悬浮以获得浓度为5XIO6细胞/ml的脾细胞。然后可将该细胞悬液分散并倒入96孔塑料培养板中，使得一个孔含约100μ1的悬液，而后在5%二氧化碳中，37°C下培养。必须补加HAT培养基，例如在第2和第5天以50μ1/孔的量。在此之后，可依照杂交瘤的增殖每3或4天更换一半体积的培养基。必须筛选产生本发明单克隆抗体的杂交瘤。这可通过将单克隆抗体对PlGF具有的生理活性的抑制作用作为指标来进行。然后从选择的克隆中选择表现出产生与PlGF反应性的单克隆抗体的杂交瘤。而后将获得的杂交瘤转移到合适的培养基(例如HT培养基，其除了没有氨基喋呤之外与HAT培养基相同)中进一步培养。可按照限制稀释法进行两次克隆获得稳定的杂交瘤。然后可按照以下所述生成并纯化单克隆抗体将2，6，10，14-四甲基十五烷(如Sigma的姥鲛烷(Pristane),0.5ml)腹膜内注射入Balb/c雌性小鼠(出生6至8周)。10至20天后，可在PBS中悬浮细胞克隆(1XIO6至IO7细胞)，并腹膜内接种小鼠。在7至10天之后，处死小鼠并进行腹部手术以收集产生的腹水。可离心腹水以去除不溶物质，获得上清液并在-20°C储存待纯化。随后，可通过使用Hi-Trap蛋白A抗体纯化试剂盒(可从Pharmacia,Roosendaal,Netherlands购得)从上述的腹水上清液中纯化IgG0即，将腹水(anl)加入溶液A(1.5M甘氨酸，3MNaCI,pH8.9,8ml)并用孔径为451m的滤器(Millipore)过滤。随后，将获得的滤液加样到装填有ftOteinSepharoseHP(Pharmacia生产)并用溶液A充分平衡的柱(柱体积1ml)，用10倍柱体积的量的溶液A清洗柱。随后，用10倍柱体积量的溶液B(0.IM甘氨酸，pH2.8)洗脱IgG级分。用PBS透析洗脱的IgG级分。使用购得的亚型测定试剂盒(商品名=MonoAb-IDEIAKitA，由Zymed生产)通过使用之前获得的纯化抗体测定单克隆抗体的IgG亚型。该方法基于ELISA方法。可通过对rPlGF与其VEGFRl受体结合的完全抑制来检测单克隆抗体的抑制活性。例如这可通过以下免疫功能性ELISA检测，其中用ΙΟΟμ11μg/ml的rmFlt-1/Fc嵌合体在室温下在PBS中包被96孔板过夜。在用PBS中1%BSA封闭1小时后，将与70μ110ng/ml的重组mPIGF-2室温下预孵育2小时的70μ1杂交瘤基质的100μ1混合物加入板中。可包含范围为20ng/ml至156pg/ml的rmPlGF_2标准品(在PBS-Tween.BSA-EDTA中稀释)。然后板可在37°C下孵育1小时并在室温下孵育1小时，用PBS-Tween清洗5遍，并加入100μ1200ng/ml的生物素化的山羊抗鼠P1GF-2室温放置2小时。在用PBS-Tween清洗5遍后，加入100μ1亲和素-HRP缀合物(VectastorinABC试剂盒)并在室温下放置1小时。在用PBS-Tween清洗5遍后，用90μ1含邻苯二胺的柠檬酸磷酸盐缓冲液(ρΗ5.0)处理板30分钟，并在490nm检测。本文还提供能够与PlGF结合的抑制性抗体配体。更优选地，该配体应能够识别位于PlGF上的特异表位。例如，本发明涉及上述类型的配体，其源自有意免疫动物而产生的单克隆抗体。本发明还提供抗原结合Fab片段或该片段的同源衍生物，其可使用本领域公知的方法通过木瓜蛋白酶对所述单克隆抗体的蛋白水解消化获得。为了降低小鼠抗-PlGF单克隆抗体的免疫原性，本发明还包括嵌合抗体的构建，所述嵌合抗体优选地作为单链可变结构域，其将小鼠抗体的可变区与人抗体的恒定区结合，即所谓的人源化单克隆抗体。在动物中产生的单克隆抗体可被人源化，例如通过将来自非人单克隆抗体的结合互补决定区(“CDR”)与人构架区(尤其是人基因的恒定C区)结合(如Jones等(Jones等，1986)或Riechmann(Riechmann等，1988)所公开的)或杂交。根据这些实施方案的单克隆抗体可以是通过重组DNA技术生成的小鼠单克隆抗体的人源化版本，区别在于编码重链和轻链的小鼠和/或人基因组DNA序列或者编码重链和轻链的cDNA克隆。或者，根据这些实施方案的单克隆抗体可以是人单克隆抗体。这些人单克隆抗体通过例如以下的方式制备，即在PCT/EP99/03605中描述的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的人外周血淋巴细胞(PBL)重建或者使用在美国专利5，545,806中描述的能够产生人抗体的转基因非人动物。只要源自这些单克隆抗体的片段(如Fab、F(ab’)2和scFV(“单链可变区片段”))保留了初始结合特性，其就构成本公开的一部分。这些片段通常通过例如抗体的酶促消化(使用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或其他蛋白酶)来产生。根据特定的实施方案，PlGF的选择性抑制剂是抗体片段，该片段特异性结合胎盘生长因子。根据一些特定的实施方案，抗体片段是Fab片段、F(ab’)2片段或单链可变区片段(scFv)。根据一些具体的实施方案，F(ab')2或单价Fab片段的制备例如下文所述为了制备F(ab’)2片段，可在0.lmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH3.5)中透析单克隆抗体过夜。然后通过用胃蛋白酶(1份)(购自Sigma(Saint-Louis,Missouri))在37°C孵育1小时消化抗体QOO份)。然后，通过将1体积的IMTrisHCl缓冲液(pH9)加至10体积的抗体中终止消化反应。可如下所述通过木瓜蛋白酶消化来制备单价Fab片段将1体积的IM磷酸盐缓冲液(PH7.3)加至10体积的单克隆抗体，然后将1体积木瓜蛋白酶(Sigma)加至25体积含单克隆抗体、lOmmol/1L-半胱氨酸盐酸盐和15mmol/l乙二胺四乙酸(下文中称SEDTA)的磷酸盐缓冲液中。在37°C孵育3小时后，通过加入终浓度为30mmol/l新鲜制备的碘乙酰胺溶液(Sigma)并将混合物避光在室温下放置30分钟终止消化反应。可使用蛋白A-kpharose对F(ab，)2和Fab片段进一步纯化去除完整IgG和Fc片段杂质。最终可在磷酸盐缓冲液(下文中称为PBQ中透析纯化的片段。可通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测定片段纯度，并且可使用二辛可宁酸蛋白质测定试剂A(Pierce，R0ckf0rd，Illinois)测定蛋白质浓度。本领域技术人员公知，可为了多种用途修饰(单克隆)抗体或其片段。本发明涉及的抗体可用适当的酶、荧光或放射性类型的标记物来标记。本领域对抗PlGF抗体的实例有许多记载。它们包括但不限于Fischer描述的(Fischer等，2007)，或鼠单克隆抗体Mab_PL5D11(W001/85796；该单克隆抗体可在VIBVesaliusResearchCenter,UZGasthuisberg,Herestraat49,B-3000Leuven获得)。其他抗体如16D3抗体，在如EP1869085中描述。W02004/0025M也描述了如何生成抗PlGF抗体。EP1869085和W02004/0025M均通过引用并入本文。此外，还可购得抗PlGF抗体，例如购自SantaCruzBiotechnologyInc,Abcm,Novusbiologicals,R&Dsystems,Sigma-Aldrich以及其他更多公司。应理解以上方法也用于其他抗体的生成，如用于生成抗VEGFR-I抗体，其是PlGF的非选择性抑制剂。其他PlGF抑制剂(尤其是PlGF的选择性抑制剂)包括但不限于具有以上指出的中和作用的肽、四聚肽、蛋白质、有机分子或其片段或同源物。在该非穷举性列表中的其他抑制剂为具有PlGF翻译抑制功能的反义RNA、DNA分子和核酶，肽适体(ρ印tideaptamer)(例如siRNA(例如SantaCruzBiotechnologyInc)、发夹RNA或shRNA(例如SantaCruzBiotechnologyInc)、吗啉基(morfolino)、纳米抗体和小分子。这些(选择和非选择)抑制剂中的很多可购得。本文将进一步讨论可能抑制剂中的一些。从例如组合和天然产物文库可获得小分子(例如小有机分子)和其他药物候选物。为了筛选所述候选物/测试分子，可使用例如表达VEGFR-I的细胞系并如WO1001/85796(通过引用并入本文)中详细描述的那样监测信号转导。所述监测可使用标准生物化学技术进行检测。还可监测其他应答，例如催化活性的活化或阻抑、其他蛋白质的磷酸化(例如受体细胞内结构域的酪氨酸磷酸化)或去磷酸化、第二信使产生的激活或调节、细胞离子水平的变化、信号分子的结合、解离或移位或者特定基因的转录或翻译。这些测定可使用为在筛选过程中的这些目的而开发的常规技术进行。对配体与其细胞受体结合的抑制可通过信号转导通路影响多种细胞过程。在VEGFR-I/PlGF信号转导通路控制下的细胞过程可包括但不限于正常细胞功能、增殖、分化、细胞形状维持以及粘附，还有异常或潜在有害的过程，如失调的细胞增殖、接触抑制的丧失、分化或细胞死亡的阻断。可有利地使用本领域已知技术进行的对所述任何细胞过程的定性或定量观察和测定作为在筛选过程中对信号转导进行评分的方法。筛选小分子的一种替代方式是通过硅片上(insilico)设计。可获得人胎盘生长因子的晶体结构(PDB编码1FZV)，因此其也可作为进一步的小分子拮抗剂筛选的平台。可根据PlGF的结构设计抑制性分子或一系列分子，之后可使用上述的筛选对其进行评价。本文还描述了随机肽文库(如四聚体肽文库)，其由所有连接在固相支持物上的氨基酸所有可能组合组成，其可用于鉴定能结合给定受体的配体结合位点或受体的其他功能性结构域(如激酶结构域)的肽(Lam等，1991)。对肽文库的筛选可能在药物开发中具有治疗意义，所述药剂通过它们与给定受体相互作用抑制受体的生物活性。鉴定能结合PlGF(或者VEGFR-1)的分子可通过筛选重组PlGF蛋白质(或可溶性VEGFR-I蛋白质)的肽文库进行。例如，可分别表达VEGFR-I的激酶和细胞外配体结合结构域，并用于筛选肽文库。除了使用可溶性VEGFR-I分子之外，在另一个实施方案中，有可能使用完整细胞来检测结合细胞表面受体的肽。在该技术中使用的细胞可以是活细胞或固定细胞。细胞与随机肽文库一起孵育并结合文库中的一些肽从而在靶细胞和相关固相支持物/肽之间形成“花状体(rosette)”。而后花状体可通过差速离心分离或在解剖显微镜下通过物理方式取出。在一些具体的实施方案中，可使用反式显性负突变体形式的VEGF受体(例如VEGF-Rl反式显性负受体)来抑制PlGF的信号转导。在美国专利5，851，999完整描述了所述反式显性负突变体形式的VEGF受体的用途。此外，已知缺少跨膜和细胞质结构域的VEGF受体Fitl的剪接变体——胎盘可溶性fms样酪氨酸激酶1(sFltl)——可作为强PlGF拮抗剂(Kendall等，1996；Shibuya，2001)，并且可溶性VEGFRl融合蛋白质(Aiello等，1995)可在体内用于抑制PlGF活性。然而，尽管其凭借自身条件获得了成功，但反式显性负受体的使用可能具有不是单独的PlGF选择性抑制剂的缺点。因此，根据一些具体的实施方案，所述PlGF抑制剂不是反式显性负受体。当考虑体内使用以使蛋白质功能失活时，RNA具有优于有机小分子的明显优势。可将RNA编码序列与启动子相连并将此人工基因引入细胞或生物体。根据所包含的调控序列，这提供了构建时间和/或组织特异性阻抑基因的独特方法。该RNA表达基因通常比蛋白质编码基因更小，并可容易地插入基因治疗载体中。不像外源或改造蛋白质，RNA较少引起免疫应答。反义分子和核酶由于具有其合理药物设计和精确特异性的希望，已被开发为“密码子阻断剂(codeblocker)，，以使基因功能失活(Altman,1995；Matteucci和Wagner，1996)。从机制上讲，预计反义寡脱氧核苷酸(“0DN”)和生物改造的核酶均通过基于Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对与靶标核苷酸序列形成稳定双链体(或在ODN的一些情况下为三链体)而实现其作用的第一步骤中的特异性结合。在一些实施方案中，PlGF抑制剂可为适体(aptamer)。构建造体并确定其结合特性的方法是本领域公知的。例如，在美国专利No.5，582，981,5,595，877和5，637，459(其各自通过引用并入本文)中描述了该技术。可使用任何已知方法制备适体，包括合成、重组和纯化方法，并且适体可单独使用或与对相同靶标具有特异性的其他配体联合使用。一般地，需要最少约3个核苷酸(优选地最少5个核苷酸)来实现特异性结合。短于10个碱基的适体序列是可行的，尽管可优选10、20、30或40个核苷酸的适体。适体需要包含赋予结合特异性的序列，但可在侧翼区域延长以及另外衍生化。在一些具体的实施方案中，适体的PlGF结合序列侧翼可以是引物结合序列，以便于通过PCR或其他扩增技术扩增适体。在其他一些实施方案中，侧翼序列可包含优先识别或结合某部分以增强所述适体在基质上之固定的特定序列。适体可与常规DNA或RNA分子一样进行分离、测序和/或扩增或合成。或者，目的适体可包含经修饰的寡聚体。在适体中常规存在的任何羟基基团可被膦酸基团、磷酸基团替换，被标准保护基团保护，或被活化以制备与其他核苷酸连接的额外连接基，或可缀合到固体支持物上。一个或更多个磷酸二酯键可被替代性连接基团所替换，例如用P(O)s、p(0)NR2、P(0-)R、P(0)0R'、⑶或CNR2替换P(0)0，其中R是H或烷基(1-20C)以及R，为烷基(1-20C)；此外，该基团可通过0或S与邻近的核苷酸连接。寡聚体中的连接不需全部相同。用作起始材料以确定特异性结合序列的适体可以是单链或双链的DNA或RNA。在一个具体的实施方案中，所述序列是单链DNA，其与RNA相比更不易被核酸酶降解。根据一些具体的实施方案，起始适体包含随机序列部分，一般含有约10至400个核苷酸，特别地20至100个核苷酸。随机序列的侧翼是引物序列，其允许扩增发现与靶标结合的适体。对于随机区域的合成，可在合成中在所需的随机位置加入核苷酸的混合物。制备和筛选与特定目的靶标结合的适体的方法是公知的，例如，美国专利5，475，096和美国专利5，270，163，其各自通过引用并入本文。所述技术通常包括从候选适体的混合物中进行选择，以及逐步重复下述步骤结合、将结合的与未结合的适体分离以及扩增。由于在混合物中只有少数的序列(可能只有一个适体分子)对应最高亲和适体，因此通常需要设定分配标准以使在分离过程中保留混合物中相当数量的适体(约5-50%)。每个循环均导致具有对靶标高亲和力的适体的富集。可使用3至6次重复的筛选和扩增循环来产生与靶标(如P1GF)以高亲和力和特异性结合的适体。根据一些具体的实施方案，适体是RNA适体，其与P1GF、或任选地与VEGF-Rl或VEGFR-1/P1GF信号转导通路的其他非核酸物质特异性相互作用。这些可被用作治疗剂。RNA适体由于其直接干扰蛋白质功能的能力而使用。适体的体外选择允许快速分离极其稀有的与特定蛋白质具有高特异性和亲和性的RNA。在Gold等的美国专利No.5，270，163以及Ellington和kostak，1990以及Tuerk和Gold，1990的文章中描述了示例性RNA适体。与反义化合物不同，其靶标是一个二维网格，RNA适体可结合蛋白质的三维表面。而且，RNA适体常常可以精确地区分蛋白质的不同功能位点(Gold等，1995)。作为治疗剂，适体不止具有抗体和小分子质量药物的优点之和，而且还可在基因层面控制RNA适体的体内产生。高亲和性的RNA适体的控制表达提供了使得蛋白质特定结构域快速失活的方式并由此提供了评价它们的功能和作用机制的方式。Toole等在美国专利No.5，840,867中以及Grossman等在美国专利No.6，207,388中公开了生成适体的方法以及结合生物分子的适体。这些适体可作为分离工具、诊断或治疗工具用于干扰生物分子的正常生物功能。Toole等描述的适体可为单链或双链RNA或DNA。Korth等(Korth等，1997)应用了针对金黄地鼠(Syriangoldenhamster)朊蛋白的单链RNA适体并且该适体能在数百种不同蛋白质的混合物中识别它们的特异性靶标。Davis(1994)描述了结合凝血酶活性位点并在体内显示抗凝集作用的单链DNA适体。Rajendran,Manjula等(US20020127581)提供了体外选择信号适体的方法，其包括以下步骤合成DNA库，所述DNA具有特定偏斜摩尔比的核苷酸随机插入；扩增所述DNA库；使用荧光标记的核苷酸从扩增的DNA转录RNA库；将荧光标记的RNA库上样于亲和柱从而从荧光标记的RNA库中分出高亲和性的荧光RNA分子；从高亲和性的荧光RNA分子获得cDNA库；重复对荧光RNA分子的扩增和选择步骤以及克隆荧光RNA分子以生成信号适体。还选择了包含DNA分子的信号适体。本文还提供了将结合配体后的构象改变转化为信号适体荧光强度变化的信号适体。因而可设计与非核酸物质(如PlGF或VEGFR1)特异性相互作用的适体。适体可作为PlGF的高亲和性受体起作用或者可与PlGF(任选地与VEGFR1)紧密相互作用。起初未结构化的分子在PlGF或VEGFRl周围折叠以及与PLGF或VEGFRl形成氢键网络利于该中和性结合。然而适体也可以是催化性的。催化性的适体被认为近似于核酶或适体酶(aptazyme)。适体也可被设计为与核酸物质特异性相互作用，而不是基于相反方向核酸序列中碱基之间Watson-Crick配对与其简单结合。这些适体如果是催化性的，则可被恰当地称为适体酶。可出于治疗性目的寻求这种特异性作用。在Ruckman等，1998以及Bridonneau等，1999中详细描述了针对165氨基酸形式的血管内皮生长因子(VEGF165)(其为与PlGF具有53%的序列同源性的蛋白质)的基于RNA的2’-氟尿嘧啶适体的产生。使用SELEX法(Gold等的上述美国专利)分离了针对人VEGF165的2’-F-嘧啶RNA寡核苷酸配体(适体)。这些适体也结合VEGF165和P1GF123的异二聚体，并也有可能结合更大的同工型(如P1GF152同工型)。将来自三个不同序列家族的典型适体截短至能与VEGF高亲和性结合的最小序列03-个核苷酸)，并且通过在允许替换的所有核糖嘌呤位点用2’-0-甲基替换2’-OH来进行进一步修饰。本领域技术人员可使用该方案制造中和性抗PlGF适体。VEGF适体(Macugen,哌加他尼钠)也是第一种施用给人的治疗性适体并且目前销售给患年龄相关黄斑变性的患者。寡核糖核苷酸序列也在本文所述的抑制剂的范围内，其包括催化性RNA分子(如用于抑制VEGFR-ImRNA或PlGFmRNA翻译的核酶)。已知许多RNA分子具有催化活性并不仅仅通过将信息移出细胞核的方式发挥作用。核酶是能催化RNA特异切割的具有酶性质的RNA分子。核酶作用的机制涉及核酶分子与互补靶标RNA的序列特异性杂交，而后是核酸的内切。应理解的是核酶的自切割或切割其他RNA的活性依赖于RNA的二级结构，其可依赖于以下因素如碱基序列和金属加入的位置。核酶在人工控制基因表达中有很大用途。可利用核酸非常特异的电荷模式、它们的碱基和骨架以及DNA根据碱基序列和可预测的Watson-Crick碱基对形成可预测二级结构的能力。核酸的小体积和柔性的特点使其非常适于构建能够识别和特异性结合其他物质(例如蛋白质)上特征的复合物。通过依赖于与生物芯片上所载单链核酸的结合的SELEX指导筛选(Gold等的美国专利No.5，567，588)，研究者发现了具有100或甚至1000倍高的催化活性的核酶。i^rnandez等Q001)报道了从核酶中单分子构象变化所收集的数据。Fernandez等还报道基本上双链体核酸结构经历“全或无”的非连续构象转化，而不是所预计的渐进的逐对结合。在Been等的美国专利No.5，712，128和Sioud的美国专利No.5，985，620描述了具有在切割位点切割分离的RNA分子的酶活性的环状RNA以及能够通过内源核酶结合蛋白在体内赋予RNA稳定性的RNA分子。最初通过扫描靶标分子的核酶切割位点(包括以下序列，GUA、GUU和GUC)来鉴定任何潜在RNA靶标中的特异性核酶切割位点。一旦通过鉴定，则可评价与含切割位点的靶基因区域相对应的15至20个核糖核苷酸的短RNA序列的预计结构特征，例如可使寡核苷酸序列不适合的二级结构。也可使用核糖核酸酶保护测定通过检测它们与互补寡核苷酸的杂交难易度来评价候选靶标的适合性。提供抑制的另一种途径是使用改造的锤头基序核酶分子，其特异性且有效地催化PlGF(或任选地VEGFR-1)RNA序列的核酸内切以治疗对象(优选哺乳动物，更优选人)的费城染色体阳性白血病。RibozymePharmaceuticalsInc,Boulder,Colorado80301，USA开发的针对VEGFR-ImRNA的抗VEGFR-I核酶(如Angiozyme)已被用于癌症治疗(Weng和Usman,2001；Pavco等，2000)。Angiozyme以及其他抗VEGFR-I催化性RNA分子可用于抑制PlGF受体活性，其通过特异性切割初始PlGF受体VEGFR-I的mRNA来下调PlGF受体功能。目前正在进行针对乳腺癌的抗VEGFR-I核酶临床试验。本文所涉及的其他抑制剂是寡核糖核苷酸序列，其包括与PlGF基因mRNA或其受体VEGFR-ImRNA的部分序列同源的反义RNA和DNA分子以及siRNA构建体。RNA干扰或“RNAi”最初是Fire和同事启用的术语，用于描述双链RNA(dsRNA)可阻断基因表达的发现(Fire等，1998)。在许多生物体(包括脊椎动物)中dsRNA指导基因特异性转录后沉默，其为研究基因功能提供了新的工具。RNAi涉及mRNA降解。可通过在目标细胞中选择性转录后沉默PlGF表达的方法沉默P1GF，其包括向所述细胞弓丨入与所述PlGF基因部分mRNA序列同源的siRNA构建体。本发明提供了通过在细胞中RNA干扰(RNAi)PlGF表达和/或在细胞中RNA干扰(RNAi)VEGFR-I表达的转录后基因沉默在对象中治疗Wi+白血病的方法。此方法在人患者体内特别有意义。同样，设想了使用PlGFRNAi治疗W1+白血病。用于起始RNAi的dsRNA可从天然来源分离或用已知方式产生，例如从DNA转录。例如，RNA聚合酶与启动子(意为包含被DNA依赖性RNA聚合酶所识别的结合位点的任何双链DNA序列)的结合使转录起始。许多已知的启动子序列可用于产生dsRNA，例如但不限于被噬菌体T7、T3或SP6的RNA聚合酶识别的序列。然而这不代表限制，因为对本领域技术人员来说显然可使用如此鉴定的并且对应RNA聚合酶的任何可用启动子序列。或者，用于形成dsRNA的DNA的两条链可属于相同或两个不同的双链体，其中它们各自形成具有至少部分互补序列的DNA链。当这样产生dsRNA时，待转录的DNA序列侧翼有两个启动子，一个控制一条链的转录，另一个控制互补链的转录。这两个启动子可以是相同的或不同的。事实上，根据美国专利No.5，795，715，在每个末端有一个启动子序列的DNA双链体可直接产生确定长度的RNA，并且其可配对形成dsRNA。无论是合成还是天然来源的dsRNA都受到多种动物物种(尤其是灵长类动物)血清中存在的核酸酶的快速降解。因此涉及dsRNA的随后步骤一般在整个过程中使用烘烤过的玻璃器皿，并且将所有的缓冲液过滤除菌(例如通过Nalgene45微米滤器)。所有溶液必须使用无热原的双蒸水以使得任何内毒素污染的可能性最小化。dsRNA溶液的浓度可通过其UV光谱确定。例如，使用可从文献中获得或使用标准方法确定的吸光系数7倍0拟60=微克dsRNA/ml)通过260nm处的光密度(OD)确定天然或合成的dsRNA的摩尔浓度。如果适合的话，可以用无热原的缓冲液稀释dsRNA溶液以方便处理。所得的RNA可以任选地结合在支持物或配体(如生物素)上，生物素可连接到包被有亲和素的支持物上。在用作分析工具时，其允许直接定量。根据一个具体的实施方案，本发明的dsRNA组合物可制备为用于治疗对象尤其是用于治疗人患者的药物组合物。更特别而言，施用所述药物组合物以治疗人患者的费城染色体阳性白血病。在一些可替代性实施方案中，组合物用于产生功能性“敲除”的模式生物体，其中靶基因缺陷，或在此情况下，表达被抑制。可将dsRNA药物组合物局部施用给所述患者。本发明的dsRNA药物组合物优选地包含可药用载体或赋形剂，其适于使化合物或混合物可施用，例如胃肠外、静脉内、皮内、肌肉内或皮下，或透皮。活性成分可与任何常规可药用载体或赋形剂混合或复合。从DharmaconInc.Lafayette,CO80026，USA可购得经选择用于沉默VEGFRl基因的siRNA，其具有高的功能性概率并敲低多于90%的mRNA。称为SMART集合/SMART选择(SMARTpooling/SMARTselection)的全部针对一个靶基因的数个不同siRNA双链体的库用作沉默VEGFl基因和/或PlGF基因的有效技术。还可购得针对PlGF的siRNA(例如SantaCruzBiotechnologyInc.)反义RNA和DNA分子通过结合靶mRNA并阻止蛋白质翻译来直接阻断mRNA翻译。对于反义DNA，特别考虑了源自VEGFR-I或PlGF核苷酸序列翻译起始位点(例如在-10至+10之间区域)的寡脱氧核糖核苷酸。例如已经通过标准反义技术使用VEGFR2反义寡核苷酸转染实现了另一个酪氨酸激酶受体VEGFR2受体的下调(Berard等，1997)。此外，已经证实针对PlGF受体VEGFRl的反义(AS)寡核苷酸在体内阻断血管发生(Marchand等，2002)。此外，Yonekura等已证明了PlGF蛋白质产生的反义抑制(1999)。可通过用于合成RNA(或DNA)分子的本领域已知的任何方法制备反义RNA和DNA分子以及核酶。这包括本领域公知的用于化学合成寡脱氧核糖核苷酸的技术，如固相亚磷酰胺化学合成。或者，RNA分子可通过编码反义RNA分子的DNA序列的体外和体内转录来产生。这些DNA序列可被合并入多种载体中，所述载体含有适合的RNA聚合酶启动子如T7或SP6聚合酶启动子。或者，可将依赖于所用启动子组成型或可诱导合成反义RNA的反义cDNA构建体稳定地引入细胞系。在一个具体的实施方案中，应明确本发明用于治疗费城染色体阳性白血病的治疗方法还可与本领域已知的任何其他治疗Wi+白血病的疗法组合使用。特别设想的疗法包括蛋白质酪氨酸激酶抑制剂，尤其是BCR/ABL抑制剂，如伊马替尼等。本申请所用术语“药物”涉及包含上述分子(抑制剂)和可药用载体或赋形剂(两个术语可互换使用)以治疗上述疾病的组合物。技术人员已知的合适的载体或赋形剂为盐水、Ringer溶液、葡萄糖溶液、Hank溶液、不挥发油、油酸乙酯、5%葡萄糖的盐水溶液、增强等渗性和化学稳定性的物质、缓冲剂和防腐剂。其他合适的载体包括自身不诱导产生对接受所述组合物的个体有害的抗体的任何载体，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。“药物”可通过技术人员已知的任何适合方法施用。优选的施用途径是胃肠外。在胃肠外施用中，本发明的药物可配制成可注射的单位剂量形式，如溶液、混悬液或乳液，并与上述的可药用赋形剂组合。然而，剂量和施用方式取决于个体。通常，施用药物以使PlGF抑制剂(例如，蛋白质、多肽、肽、核酸、化合物或分子)以1μg/kg至10mg/kg，更特别10μg/kg至5mg/kg,最特另Ij0.1至2mg/kg的剂量给出。优选地，以推注给药(bolusdose)的形式给予。还可使用持续输注，包括通过渗透迷你泵的持续皮下递送。如果这样，输入药物的剂量可以为5至20μg/kg/分钟，更具体而言为7至15μg/kg/分钟。如本文所用，术语“可药用载体”包括任何和全部溶剂、分散基质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂、延迟吸收剂等。本领域公知用于药物活性物质的这些基质和试剂的使用。除不与本发明组合物相容的任何常规基质或药剂外，考虑其在治疗制剂中的应用。还可将附加的活性成分掺入药物制剂中。本领域的技术人员应理解任何施用形式、通常使用的并相对于活性剂为惰性的运载体或载体都可用于制备并施用本发明的药物组合物。这些方法、运载体和载体的说明在如Remington'sPharmaceuticalSciences，第4版(1970)(其公开内容通过引用并入本文)中有述。接受本发明原理的本领域技术人员在确定适合和恰当的运载体、赋形剂和载体或在将其与活性成分组合以形成本发明药物组合物时不会遇到困难。在每种情况下，包含在本发明药物组合物中活性剂的治疗有效量取决于几个因素，如待治疗患者的类型、身体大小和情况、预计施用方式、患者摄用预计剂型的能力等。通常，在提供的每个剂型中包含的活性剂的量为约0.1至约250mg/kg，更特别地约0.1至约100mg/kg。本文所用的“治疗量”或治疗有效量是改善疾病的一种或更多种症状的量。通常该量取决于抑制剂和疾病的严重性，但可由技术人员确定，可能通过常规试验确定。治疗给药的另一方面是使用基因疗法递送上述反义基因或PlGF的功能性部分或针对PlGFmRNA的核酶或其功能性部分。基因疗法是指将治疗性核酸递送到患者细胞的治疗。这在Lever和Goodfellow1995；Br.MedBull.，51，1-242;Culver等，1995;Ledley，1995中有详细的综述。为了实现基因治疗，必须有将基因递送到患者细胞的方法以及保证任何治疗性基因有效产生的另外的方法。本领域已经详细描述了旨在不但体外而且特别在体内的靶细胞中实现治疗性基因产物表达的基因治疗方案。这包括但不限于肌内注射质粒DNA(裸DNA或在脂质体中)、间质注射、气道滴注、施用到内皮、肝实质内以及静脉内或动脉内施用(例如，肝内动脉、肝内静脉)。已经开发了多种增强靶标细胞对DNA的可获得性的装置。一种简单的方法是使靶细胞与含有DNA的导管或可植入材料物理性接触。另一种方法是使用无针射流注射(jetinjection)装置，其在高压下将液柱直接喷射入靶组织。这些递送范例可用于递送病毒载体。靶向基因递送的另一个方法是使用分子缀合物，其由以下组成与用于将核酸特异性靶向到细胞的核酸结合剂或DNA结合剂连接的蛋白质或合成配体(Cristiani等，1993)。靶细胞通常取决于需要治疗的症状，并可由技术人员选择(例如，治疗白血病的骨髓细胞或基质细胞)。基因治疗载体应表达治疗量的PlGF抑制剂。根据具体的实施方案，本申请所述的基因治疗载体指导治疗量的基因产物表达一段时间。事实上，只要达到治疗水平，就不需要新的治疗。通常，预计治疗表达持续至少20天，至少50天，至少100天，至少200天，并且在一些情况下持续300天或更多。可通过任何本领域认可的方式(例如通过基于抗体的测定，如Western印迹或ELISA测定，如评价基因产物的治疗性表达是否实现)测量编码序列所编码的基因产物(如多肽、RNAi等)的表达。还可通过检测基因产物的酶学或生物学活性的生物测定来测量基因产物的表达。基因治疗载体可为附加体载体(即不整合进宿主细胞的基因组)，或者可以是整合进宿主细胞基因组的载体。附加体载体的实例包括(染色体外)质粒以及所谓的“小圈(mini-circle)”，其只包括表达盒并且无细菌序列，整合进宿主细胞基因组的载体的实例包括病毒载体。代表性的质粒载体包括PUC载体，bluescript载体(pBQ和pBR322或其无细菌序列的衍生物(小圈)。一些质粒载体可改造成包含增强附加体质粒在所转染细胞中存留的元件。这些序列包括S/MAR，其对应于连接转录单元的脚手架/基质连接区域模块(Jenke等，2004；Manzini等，2006)。代表性的病毒载体包括源自腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒和慢病毒的载体。或者，可使用基因递送系统将病毒和非病毒组分组合在一起，如纳米颗粒或病毒体(virosome)(Yamada等，2003)。逆转录病毒和慢病毒是能够在感染后将它们的基因插入宿主细胞染色体的RNA病毒。已经开发了缺少编码病毒蛋白质的基因但是保留感染细胞并将它们的基因插入靶细胞染色体能力的逆转录病毒和慢病毒载体(Miller，1990；Naldini等，1996)。慢病毒和传统的基于Moloney鼠白血病病毒(MLV)的逆转录病毒载体之间的区别在于慢病毒载体可转导分裂中和不分裂的细胞而基于MLV的逆转录病毒载体只可转导分裂中的细胞。将腺病毒载体设计为直接施用给活对象。不像逆转录病毒载体，大部分腺病毒基因组不整合进宿主细胞的染色体。相反，使用腺病毒载体引入细胞的基因作为染色体外元件(附加体)在细胞核中存留一段时间。腺病毒载体在体内的多种不同组织中转导分裂中的和不分裂的细胞，包括气道上皮细胞、内皮细胞、肝细胞和多种肿瘤(Trapnell，1993)。腺相关病毒(AAV)是感染人和一些其它灵长类物种的小ssDNA病毒，已知不导致疾病并因而只导致非常温和的免疫应答。AAV可感染分裂中的和不分裂的细胞并可将其基因组整合入宿主细胞的基因组。这些特征使AAV成为产生基因治疗用病毒载体的非常有吸引力的候选，尽管该载体的克隆能力相对有限。另一种病毒载体来源于单纯疱疹病毒(一种大型双链DNA病毒)。另一种dsDNA病毒牛痘病毒的重组形式可容纳大型插入物并通过同源重组产生。本文列举的抑制剂可用于治疗费城染色体阳性(Ph+或BCR-ABL+)白血病，或用于制造治疗Wi+(BCR-ABL+)白血病的药物。治疗W1+/BCR-ABL+白血病的方法通常涉及将该PlGF抑制剂施用给有此需要的对象，最特别地是人对象。W1+白血病的一个特别亚组是慢性骨髓性白血病(CML)。因此，根据具体的实施方案，本申请所述的用途和方法用于治疗CML。Ph+白血病的另一个重要分类是急性淋巴细胞性白血病(ALL)组，其特征也是存在费城染色体。该分类通常预后差，因为许多标准治疗在Wi+ALL病例中失败。根据具体的实施方案，存在费城染色体(或BCR-ABL融合蛋白质)的其它白血病也适于本文所述的用途和方法。然而，这些病例比CML或ALL少见。尽管如此，已经报道了一些Wi+AML(急性骨髓性白血病)的病例，并且预计Wi+白血病的这些病例也获益于本申请提供的用途和方法。重要的是认识到白血病是破坏力极强的疾病，通常患者的预后很差。因此，如果一种治疗方法失败，那么能够提供替换性治疗策略或组合策略非常重要。本申请的一个目标是提供治疗益处，尤其也是对未从其它治疗方案中获益的患者。费城染色体阳性白血病(尤其是CML)的标准治疗是使用BCR-ABL抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂。该类型药物的最为人所知的实例是伊马替尼，但也有其它实例，如尼罗替尼(AMN107)、达沙替尼(BMS354825)、AT9283(Astextherapeutics)、SGX393(EliLilly)、INNo-406(InnovivePharmaceuticals)、伯舒替尼(SKI606)和MK0457(Merck)。然而，一些报告指出对这些药物的抗性是普遍问题。事实上，即使在成功治疗的患者中白血病细胞也持续存在，并且一些患者产生抗性并最终复发(Swords等，2007;Buchert,2007；Li和Li，2007；Kujawski和Talpaz，2007)。根据具体的实施方案，PlGF抑制剂用于治疗不能用BCR-ABL抑制剂治疗的W1+白血病，和/或更特别地不能用单独的BCR-ABL抑制剂治疗的病例。由于多种原因费城染色体阳性白血病不能被BCR-ABL抑制剂(或单独的BCR-ABL抑制剂)治疗，最常见的两个原因是恶性细胞对BCR-ABL抑制剂不敏感以及患者不耐受所述药物。白血病细胞对BCR-ABL抑制剂的不敏感可能是由于几种机制(Siah和Sawyers，2003)，并且可能从发作就产生(即第一次治疗时不敏感)或者抗性可能是获得性的(例如，在显示为复发的患者中，或在进一步发展的白血病的患者中，例如原始细胞危象)。并且，已知BCR-ABL抑制剂在患者中引发有害副作用，其可使药物不再适用于特定患者。患者的过敏反应也可导致对药物不耐受。根据特定的实施方案，PlGF抑制剂用于治疗对BCR-ABL抑制剂治疗有抗性(至少部分上)的Wi+白血病。对BCR-ABL抑制剂(部分)有抗性的白血病可定义为其中存在的白血病细胞对BCR-ABL抑制剂应答减小的白血病。应答减少的细胞量指示了对BCR-ABL抑制剂的抗性的程度。通常，尽管不必要，对BCR-ABL抑制剂的(部分)抗性是获得性现象。根据又一特定的实施方案，PlGF抑制剂可用于治疗伊马替尼抗性的W1+白血病。这些白血病的非限制性实例包括伊马替尼抗性Wi+CML、伊马替尼抗性Wi+ALL，如伊马替尼抗性Wi+T-ALL、伊马替尼抗性Wi+B-ALL。有时(尽管当然不是在所用病例中)，对BCR-ABL抑制剂的抗性(尤其是对伊马替尼的抗性)与BCR-ABL基因中的突变相关，尤其是在酪氨酸激酶结构域中。其最为人所知的实例是T3151突变。其它实例包括E255K、E255V、Y253H、H396P、F317L、M351T.G250E,F311L、M244V、F359V、L387M、H396R、Q252H、Y253F、Q252R和E355G突变(Shah和Sawyers，182003)。Corbin等报道尤其是G250E、H396P、H396R、E255V和T315I显示赋予对伊马替尼的抗性(Corbin等，2003)。根据具体的实施方案，PlGF抑制剂用于治疗其中BCR-ABL基因至少有一处突变的Wi+白血病。根据又一具体的实施方案，PlGF抑制剂用于治疗W1+白血病，其中Wi+白血病不能用BCR-ABL抑制剂治疗和/或不能被单独的BCR-ABL抑制剂治疗，并且其中BCR-ABL基因具有至少一处突变。根据又一其它的具体实施方案，Ph+白血病不能用伊马替尼治疗或不能单独用伊马替尼治疗。根据另一更特定的实施方案，BCR-ABL基因的至少一种突变选自T315I、E255K、E255V、Y253H、H396P、F317L、M351T,G250E、F311L、M244V、F359V、L387M、H396R、Q252H、Y253F、Q252R和E355G突变。考虑使用胎盘生长因子抑制剂治疗费城染色体阳性白血病可以是独立疗法或治疗方法。根据具体的实施方案，考虑在Ph+白血病中使用PlGF抑制剂是联合治疗的一部分。因此，PlGF抑制可与其它用于治疗W1+白血病的疗法一起使用，所述疗法如放射治疗、化学治疗、生物治疗(如干扰素治疗)、干细胞移植、骨髓移植、手术(如脾切除)或者靶向治疗例如BCR-ABL抑制、Lyn抑制、Hsp90抑制、Src抑制。当然，PlGF抑制可与多于一种的这些疗法联合使用(例如与BCR-ABL和Lyn抑制一起)。PlGF抑制可与其它疗法同时使用，或在其它疗法的之前或之后，或者它们可以例如间歇地改变。本领域技术人员能够决定最佳的治疗方案，任选地在常规的实验之后。应理解尽管在本文中讨论了本发明细胞和方法的具体的实施方案、特定配置以及材料和/或分子，可对形式和细节作出多种变化或修饰而不背离本发明的范围和精神。提供以下实施例以更好地说明具体的实施方案，不应将它们理解为对本申请的限制。本申请仅受到权利要求的限制。实施例材料和方法动物从Janvier获得雌性Balb/c小鼠(8周龄)。K.U.Leuven的动物保护和研究咨询委员会批准了饲养和全部的动物实验过程。细胞和培养条件从ATCC获得KCL-22和CRL_1^9细胞。J.Cools(VIB,Leuven)提供了Bv-173、Κ562、BaF3、32D禾ΠNalm6细胞。Bv-173禾ΠΚ562细胞培养在含有20%FCS(HycloneLaboratories)的RPMI培养基(Gibco,InvitrogenCorporation)中。BaF3、32D禾口KCL—22细胞培养在含有10%FCS的RPMI培养基中；Nalm6细胞培养在含有10%FCS的DMEM培养基(Gibco,InvitrogenCorporation)中以及CRL_1^9细胞培养在含有20%FCS和0.05mMβ-JfiSZiI(Gibco,InvitrogenCorporation)白勺IMDMJ^#S(Gibco,InvitrogenCorporation)中。分离原代小鼠骨髓源性基质细胞(BMDSC)对于BMDSC的分离，冲出股骨和胫的骨髓，用裂解缓冲液(150mMNH4CI，0.ImMEDTA,IOmMKHC03,pH7.4)去除红细胞，随后将细胞在加有15%FCS的DMEM培养基中培养。在M小时后，去除未贴壁的细胞级分，将贴壁的细胞进一步培养和扩增3周。增殖测定和共培养使用MTT测定或通过血球计数板人工计数来分析白血病细胞和BMDSC的增殖。从R&DSystems获得鼠重组PlGF和抗VEGFRl。ThrombogenicsandBiolnvent生产了抗PlGF和对照IgGl，其特征如所述(Fischer等，2007)。除非另外指明，否则PlGF以50ng/ml的浓度使用，抗体100倍摩尔过量。对于共培养实验，将IO5的BMDSC与单独的4XIO5白血病细胞或在无血清培养基中的对应抗体的存在下共培养48小时。随后，确定贴壁的BMDSC和未贴壁的白血病细胞的数量，收集上清液用于分析PlGF和VEGF蛋白质。外周血分析通过眶后取血用毛细吸管收集血液，使用自动细胞计数仪(BeckmanCoulter)确定白细胞数(WBC)。ELISA使用〃Quantikine"小鼠PlGF和小鼠VEGF免疫测定(R&DSystems)对细胞培养上清、外周血血浆和骨髓浆中PlGF或VEGF浓度进行定量。浓度表示为pg/ml/105细胞或pg/ml0定量实时PCR基本上使用如之前所述的引物和探针进行RT-PCR(Fischer等，2007)。BCR-ABL+前B细胞白血病的同系模型如上所述培养BCR_ABL+BaF3细胞并且将1XIO6的细胞通过尾静脉注射入同系8周龄的Balb/C小鼠。伊马替尼敏感和伊马替尼抗性CML移植模型对于CML的诱导，通过冲洗用200mg/kg5-氟尿嘧啶(5-FU；SigmaAldrich)处理后4天的Balb/C供体(8周)的股骨和胫骨来收集骨髓细胞，将骨髓细胞在体外用含有10ng/mlIL-3,10ng/mlIL-6和50ng/mlSCF的培养基预刺激。随后，将细胞与逆转录病毒储备物(逆转录病毒构建体MCSV-GFP、MSCV-BCR-ABLp210IRES-EGFP,MSCV-BCR-ABL-T315I-IRES-EGFP；由JanCools提供)进行1轮的共沉积。通过致死性辐射制备受体雌性小鼠，通过静脉内注射0.5XIO6细胞/动物移植经转导的骨髓。实施例1体外分析白血病细胞和原代骨髓基质细胞的PlGF表达为了在体外确定白血病细胞和不同白血病相关基质细胞群的PlGF的表达谱，在一系列BCR-ABL+骨髓和淋巴细胞系中分析PlGF的表达(鼠BaF3、32D；人K562、Bv_173、KCL-22)。此外，研究了人BCR-ABL淋巴细胞系Nalm-6。而且，在不同类群的骨髓基质细胞中对PlGF的表达进行定量。经ELISA确定所有研究的白血病细胞系中均未发现PlGF的表达，在从鼠骨髓中分离的健康⑶45+造血细胞中表达量极低((41士2.3pg/ml)(图1A)。与之不同，鼠原代骨髓源性基质细胞(BMDSC)和基质细胞系(S17、0P9)表达大量的PlGF蛋白质(图1A)。骨髓源性基质细胞的FACS分析显示在平均培养3周后49.7%士20%的鼠BMDSC是造血谱系(未显示)。为了研究鼠BMDSC的造血级分(⑶45+)还是非造血级分(⑶45_)表达P1GF，我们通过免疫磁性法分离了两种类群(纯度>93%，未显示)，随后测定了BMDSC⑶45+和⑶45—上清液中的P1GF。这些实验显示⑶45—BMDSC几乎特有地表达PlGF(图1B)(N=3;p<0.001)。此外，我们测定了人(HUVEC)和鼠(fEND5)内皮细胞中的PlGF表达，并发现PlGF蛋白质的大量表达(HUVEC:279.7士四.9pg/ml；fEND5:125.7士18.8pg/ml；N20=3)。综上，这些结果指出在体外PlGF主要由骨髓基质细胞而不是白血病细胞表达。^MM2在体内PlGF由白血病某质细胞,表汰并Hl白血病发展的牛夺勿标记物为了阐明在体内PlGF对白血病疾病发展的可能影响并由此阐明αPlGF的治疗潜力，通过将经BCR/ABL-GFP转导的骨髓移植入同系的经亚致死辐照的小鼠，使用已经详细描述的CML原始细胞危象模型。我们首先分析了不同时间点(dl4、d21和d28)疾病小鼠与对照小鼠相比血浆中的PlGF蛋白质水平，在健康小鼠或移植了模拟转导骨髓的小鼠外周血中检测到非常少量的PlGF蛋白质，在它们的骨髓中检测到少量的PlGF蛋白质。与之不同，白血病小鼠显示随着疾病发展循环中PlGF蛋白质增加，在末期达到与带有实体瘤的小鼠相当的水平(Fischer等，2007)(图2A、B)。在骨髓浆中观察到了类似的PlGF动力学增加(图2B)。我们也对PlGF的天然抑制剂sVEGFR-1进行了定量，并发现尽管sVEGFR-Ι相对于PlGF过量存在，但是随着疾病的发展血液和骨髓中PlGF/sVEGFR-1的比例增力卩，表明在白血病病程中PlGF的上调比sVEGFR-Ι的更加显著(图2C、D)。为了分析体内PlGF的来源，我们进行了骨和骨髓的实时PCR分析，结果显示PlGFmRNA在骨髓中有12.6倍的上调(N=8;P<0.002)(图2E)。骨中PlGF的mRNA水平在疾病和健康小鼠中类似(数据未显示)，这表明在白血病小鼠骨髓浆中检测到的PlGF升高的主要来源是骨髓。为了进一步确定骨髓中的PlGF产生细胞，我们用FACS分选了白血病细胞(GFP+)、非白血病造血细胞(GFPTD45+)和非白血病非造血基质细胞(GFPTD45_)，随后在这些亚级分中通过RT-PCR的方法测定PlGFmRNA的表达。这些实验表明，类似于上述在体外的发现，PlGF在白血病小鼠体内主要由⑶45_基质细胞表达，在白血病细胞或造血细胞中的表达可忽略。事实上，与白血病细胞相比，GFPXD45—基质细胞表达的PlGFmRNA高95.6倍，与造血细胞相比，PlGFmRNA高32倍(N=4;P<0.05)；(图2F)。当将白血病小鼠CD45_骨髓细胞中的PlGFmRNA水平与健康小鼠骨髓CD45_细胞中PlGFmRNA水平进行比较时，我们发现在患白血病的小鼠的非造血基质细胞级分中PlGF表达强05.4倍)上调(N=4;P<0.05)(图2F)。有趣的是，当与健康小鼠比较时，患白血病小鼠的骨髓中VEGFmRNA只轻微上调(N=8;P=0.23)(图2G)，这表明PlGF在体内也是BCR/ABL+白血病的特异性基质来源的致病因素。以下结果进一步证实了该假说，通过FACS分析疾病末期小鼠骨髓中GFP+细胞确定，白血病小鼠血浆或骨髓浆中存在的PlGF蛋白质的量与渗透入骨髓的白血病原始细胞(blast)的数量相关(r=0.81和r=0.85；ρ<0.05；图2Η，I)。因此，PlGF是小鼠原始细胞危象CML疾病发展的生物标记物。实施例3抗PlGF抑制PlGF诱导的白血病细胞增殖为了确定PlGF对白血病细胞潜在的生物学作用，研究了白血病细胞系中主要PlGF受体VEGFR-I及其共受体Npnl和Νρη2的表达。根据发表的文献，VEGFR-I在大部分研究的细胞系中表达(Fragoso等，2006)(数据未显示)。Npnl和Νρη2在Κ562、Nalm-6、BV-173和KCL-22细胞系中表达但水平不同，不在32D细胞中表达(图3A、B)。根据这些发现，我们在体外将白血病细胞与PlGF—起孵育，与已发表的文献一致，PlGF剂量依赖性诱导了5种BCR/ABL.细胞系中4种的增殖(图3C、D)。除了其主要受体VEGFR-I之外，PlGF还结合共受体Npn-I和Npn-2。为了阐明PlGF诱导的白血病细胞增殖是否需要VEGFR-I，评价了细胞外VEGFR-I阻断抗体(αVEGFR-1)的抑制作用。发现在αVEGFR-I存在下PlGF介导的增殖被抑制(图3Ε)。相反，在加入抗Npn-I和Npn-2的细胞外功能阻断抗体后，PlGF诱导的白血病细胞增殖没有被抑制，这表明PlGF的促增殖作用主要通过VEGFR-I介导(图1G)。在下一步中，研究了抗PlGF(aPlGF)是否抑制PlGF诱导的白血病细胞增殖，并发现加入αPlGF后PlGF的促增殖作用几乎完全被消除，这表明其对白血病的治疗潜力(图3F)。为了阐明PlGF是否诱导BCR/ABL+白血病细胞的ABL磷酸化的变化，我们进行了在PlGF存在或不存在时孵育的Βν-173和KCL-22细胞的Western印迹。这些实验表明PlGF不修饰ABL的磷酸化(数据未显示)。实施例4白血病细胞和BMDSC之间的旁分泌相互作用诱导BMDSC分泌PlGF进行了共培养实验以研究人白血病细胞和小鼠BMDSC或小鼠骨髓基质细胞系(S17)的可能相互作用导致BMDSC或S17细胞PlGF分泌的增多，以及发现共培养后小鼠PlGF的显著上调(图4A、B)。该发现促使我们分析了共培养物的增殖，其揭示了白血病细胞和BMDSC增殖的显著诱导(图4C、D)。在将αPlGF加入培养物后，该增殖作用几乎完全被消除，表明PlGF可以旁分泌形式诱导白血病细胞的增殖，但同时通过自分泌回路介导了骨髓基质细胞的增殖，因而同时促进了白血病克隆及其支持基质的增殖(图4C、D)。有趣的是，该相互作用特异地导致PlGF上调，因为共培养时VEGF未上调(数据未显示)。为了检测PlGF在BCR-ABL+白血病中的体内潜在作用，建立了BCR/ABL+骨髓性和淋巴性白血病的3种不同小鼠模型。为了阐明可能诱导PlGF上调的分子信号，我们首先分析了与白血病细胞条件培养基(CM)—起孵育是否足以诱导和直接与白血病细胞共培养类似的基质细胞(S17)中PlGF上调，发现CM确实足以诱导S17分泌PlGF(N=3;P=0.008；图4E)。種仿丨丨5:針胃砠(■础S血翩胞』)白條_膽正紐血_/丨、鼠,讓舌为了确定PlGF在BCR/ABL+白血病的体内作用，我们在PlGF基因缺陷小鼠(P1GF+)和野生型小鼠(WT)中诱导了白血病，比较了两个组的存活。我们发现与WT小鼠相比缺少PlGF的小鼠存活显著更长，这表示PlGF在体内白血病致病中起重要作用(N=14/15；P=0.003；图5A)。为了试图证明我们关于PlGF是BCR/ABL+白血病基质源性因子的假说，我们通过将来自WT小鼠和PlGF敲除小鼠的经转导骨髓细胞移植入WT宿主并比较不同组的存活(WT—WT,K0—WT和WT—K0)进行了交换研究(cross-overstudy)。我们发现白血病细胞中PlGF的缺失并不延长小鼠的存活，但在宿主基质中PlGF的缺陷诱导了白血病小鼠显著的存活优势，其范围与完全PlGF缺陷系统相当(见上)。因此，基质源性PlGF明显促进了体内BCR/ABL+白血病的发展(图5B)。实施例6用抗PlGF治疗白血病小鼠显著延长其存活为了研究PlGF抑制在小鼠W1+白血病中治疗潜力，用aPlGF治疗了通过静脉内注射BCR-ABL+BaF3细胞诱导白血病的小鼠，发现与对照抗体相比，中位存活期显著延长了18天(N=9;P=0.015；图5C)。这些结果促使我们建立了通过移植BCR-ABL转导的BM而诱导的伊马替尼敏感和伊马替尼抗性(T315I突变)CML小鼠模型，临床模拟了人原始细胞危象的疾病情况，其特征为脾肿大以及骨髓白血病细胞的大量增殖，导致疾病小鼠于在其外周血中首次检测到白细胞升高一周后死亡。随后，研究了aPlGF对白血病负荷、骨髓组织学以及小鼠存活的作用。观察到了白血病负荷降低(数据未显示)，对早期(dl5)和晚期(业8)白血病GFP+细胞的FACS分析显示BM和PB中BCR-ABL+细胞的特异性减少(N=7^<0.05)(图503以及未显示)。而且，晚期的骨髓组织学表明αPlGF治疗诱导了对疾病发展的实质性抑制(图5F)。之后，我们研究了aPlGF对小鼠存活的作用。这些实验表明在患伊马替尼敏感和伊马替尼抗性的白血病小鼠中，与对照抗体相比，用aPlGF治疗显著延长存活(图5G、H)。因此，aPlGF以不依赖BCR/ABL突变状态的形式抑制小鼠原始细胞危象白血病的发展。^MM7用杭PlGF治疗白血病小鼠抑制骨髓的i寸鹿血管仆JP纤维化骨髓的新血管发生是白血病的重要致病因素。PlGF是强的促血管发生细胞因子并且已经表明其促进肿瘤血管发生。因此，通过在模拟移植、对照抗体处理和aPlGF处理的晚期白血病小鼠中CD31染色的形态学分析来分析PlGF抑制对骨髓血管化的作用。这些实验表明与模拟移植的对照相比，白血病小鼠骨髓显示了明显的过度血管化(图6A、C)。在用aPlGF处理后该过度血管化显著降低(图6A、C)。骨髓纤维化是公知的CML不利因素，并与对伊马替尼的抗性相关。根据我们对PlGF刺激BMDSC增殖的观察(见上)，我们研究了用aPlGF治疗白血病小鼠是否可以调节骨髓的纤维化。在对骨髓中网硬蛋白+纤维平均长度的形态学分析后，我们发现PlGF抑制可诱导骨髓纤维化的显著降低(图6B、D)。因此，aPlGF同时降低白血病小鼠骨髓中的过度血管化和纤维化。有趣的是，起始的实验显示伊马替尼和抗-PlGF在体内对BCR/ABL+白血病有加和性抑制作用。实施例8人CML中PlGF上调为了研究PlGF作为人CML新靶标分子的实用性，我们确定了下列项中的PlGF血浆水平健康对照(n=10)、初次诊断后在慢性期(CP)的未治疗患者(n=32)和用不同酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗的原始细胞危象(BC，疾病的末期)患者(η=9)。这些分析显示与健康对照相比，在新诊断的CP患者中PlGF有2.1倍的上调(ρ<0.0001)，在BC患者中PlGF水平有3.7倍的升高(ρ<0.0001)(图7Α)。随后，我们确定了新诊断为CML的患者(n=7)和诊断为淋巴瘤而无骨髓侵入的对照患者(n=5；图7Β)骨髓浆(BMP)中的PlGF水平。这些分析显示与对照相比在CML患者的BMP中PlGF也上调。然后我们在单中心(n=43CP，η=2加速期；用不同的TKI治疗，伊马替尼+干扰素，或高三尖杉酯碱)研究了通过QRT-PCR测得的PBPlGF蛋白质和BCR-ABL1转录本数之间的可能相关性。我们发现PlGF水平和BCR-ABL1转录本数之间有显著的相关性(r=0.45；ρ=0.0016)，这表明PlGF是人CML的疾病特异性靶标(图7C)。随后，我们从健康供体以及CP和BCCML患者中分离了⑶34+细胞，并通过QRT-PCR测定了PlGF表达。这些分析显示白血病细胞中的PlGF表达与健康CD34+细胞中的表达一样低(图7D)。因此，升高的循环中PlGF最有可能不是由白血病细胞而是由基质细胞分泌。为了研究该假说，我们从新诊断为CML的患者中分离贴壁BM基质细胞，并比较其与CD34+白血病细胞的PlGF表达水平。我们发现与白血病细胞相比基质细胞表达的PlGF高>7倍(图7D;p=0.003)，这证实了我们的临床前数据并扩展了以下概念，即PlGF最初由CML患者的基质细胞产生。实施例9在伊马替尼治疗下的CML患者的PlGF水平仍很高对于为什么在用伊马替尼治疗的患者中白血病细胞仍存留尚不清楚，这导致了在撤药后大部分病人的快速复发。宿主基质潜在地起重要作用，其不依赖于BCR/ABL+白血病细胞。为了阐明伊马替尼是否可诱导BMDSC的PlGF分泌，我们用递增浓度的伊马替尼孵育基质细胞。这些实验显示鼠BMDSC中的PlGF剂量依赖性诱导，这表明基质源性PlGF在介导伊马替尼抗性方面的潜在作用。为了阐明在体内是否也发生BMDSC中此PlGF诱导，我们用伊马替尼处理了患CML的小鼠(通过移植BCR/ABL转导骨髓诱导)，并将它们骨髓中的PlGF水平与未处理的白血病小鼠以及健康小鼠进行比较。这些实验显示与未治疗小鼠相比，用伊马替尼治疗的白血病小鼠的骨髓中PlGF上调，尽管白血病细胞对伊马替尼治疗小鼠的骨髓浸润明显更低(图7E)。这些结果表明伊马替尼对白血病诱导的PlGF表达有增强作用，其可能在伊马替尼存在下促进白血病细胞的存活和增殖。这些发现促使我们测定达到不同应答水平(完全分子消除(completemolecularremission,CMR)；BCR/ABL/ABL比例<1；BCR/ABL/ABL比例<10)的伊马替尼治疗的患者PB中的PlGF水平，并将它们与健康个体以及未治疗的初始诊断为CML患者的水平进行比较。有趣的是，CMR患者中PlGF水平显著高于健康对象，并且在低BCR/ABL/ABL比例<1的患者中，PlGF的水平升高到与未治疗新诊断为CML患者类似的水平(图7F)。这些数据表明尽管白血病负荷降低了几个数量级，但是PlGF仍然很高，这可能造成了在伊马替尼治疗下疾病的持续。总之，我们的数据表明PlGF是促进W1+白血病发展的基质源性因子，其不依赖于BCR/ABL突变状态，并且是白血病基质产生的可用于辅助BCR/ABL激酶抑制剂或在TKI难治性白血病中的新靶标。碰伊马替尼和第二代BCR-ABL抑制剂的引入掀起了费城染色体阳性(+)白血病患者治疗的革命，但是即使在成功治疗的患者中白血病细胞仍然存留，并且一些患者发展出抗性并最终复发。这些缺点的原因并未完全了解，但是我们猜测宿主基质可能以不依赖于BCR-ABL的方式发挥重要的作用。已经证明胎盘生长因子(PlGF)(VEGF同源物)由实体瘤中的基质细胞大量分泌。因此，决定值得去研究PlGF在Ph+淋巴和骨髓白血病中的作用，并研究αPlGF(抗PlGF的单克隆抗体)的治疗潜力，我们最近报道αPlGF在多种实体瘤的临床前模型中有广泛的抗肿瘤潜力(Fischer等，Cell,2007)。首先，在体外研究了5种不同的人和小鼠Wi+白血病细胞系(Bv-173、BaF3、32D、K562、KCL22)的PlGF表达，发现尽管这些细胞系表达PlGF靶标受体VEGFR-I，但都不分泌PlGF蛋白质。相反，原代小鼠贴壁骨髓基质细胞(BMDSC)表达大量的PlGF蛋白质(多达105pg/ml/105细胞)，这表明PlGF的潜在基质相关功能。其次，分析了PlGF是否能诱导增殖，并由此揭示了在所有分析的白血病细胞系中重组PlGF剂量依赖性地诱导增殖。PlGF的该作用几乎完全被αPlGF和抗VEGFR-I细胞外抗体消除，因而表明PlGF的促增殖作用主要由VEGFR-I介导。第三，通过进行共培养实验研究了BMDSC和白血病细胞之间的旁分泌相互作用。值得注意的是，BMDSC与白血病细胞共培养显著地诱导了白血病细胞的增殖。推测该增殖的诱导可能由PlGF介导，并且事实上，在将αPlGF加入到共培养物后发现该促增殖作用几乎完全消除。而且，在白血病细胞存在下培养时，BMDSC显著地上调了PlGF的分泌O.1倍；N=3;Ρ=0.00，这表明两个细胞类型之间的显著旁分泌相互作用。这些结果使我们得出这样的结论，即基质源性PlGF可能代表Wi+白血病的新靶标。为了在体内验证该假说，建立了Ph+骨髓性和淋巴性白血病的三种不同鼠模型。随后，分析了疾病小鼠与健康小鼠相比在血液和骨髓中存在的PlGF蛋白质。在健康小鼠的外周血中未发现PlGF蛋白质，在它们的骨髓中发现低量的PlGF蛋白质。相反，白血病小鼠显示出与带有实体瘤的小鼠水平相当的循环中PlGF蛋白质(76.5士18.4pg/ml血浆；N=7),且有趣的是，与健康小鼠相比，在它们的骨髓中PlGF的水平增高8.9倍(N=7；P<0.0001)，这再次表明PlGF是Wi+白血病的基质源性、新致病因子。为了研究αPlGF在鼠Wi+白血病中的治疗潜力，随后用aPlGF治疗患白血病小鼠(通过注射BCR/ABL+BaF3细胞诱导)，与对照抗体处理进行比较，发现aPlGF诱导中值存活显著延长18天(N=9;P=0.015)。受到这些阳性结果的鼓励，通过转导原代骨髓细胞并随后移植进经致死性辐照的受体小鼠建立了伊马替尼敏感和伊马替尼抗性(T315I突变)CML模型，将其用aPlGF和对照抗体处理。有趣的是，在这些侵略性模型中，我们也发现通过阻断PlGF诱导的疾病小鼠存活显著延长(在野生型BCR-ABL诱导白血病中中位存活延长5天；N=11;P=0.002；在T315I突变体中4天；N=12;P=0.039)。骨髓组织学和FACS的表型分析显示白血病细胞对脾和骨髓的浸润降低(在骨髓中降低38%，在脾肿降低24%)ο我们在此阐明了白血病细胞指导非造血骨髓源性基质细胞(BMDSC)上调胎盘生长因子(PlGF)，在临床前小鼠模型中其关键性地驱动BCR-ABLl+白血病的发展。重要的是，这些发现在人CML样本中得到证实，因为在CML患者的血液和骨髓中PlGF也上调。通过抗PlGF的单克隆抗体aPlGF抑制该新靶标分子延长了患伊马替尼敏感和抗性(T315I)白血病小鼠的存活。抗PlGF通过阻断白血病细胞的增殖以及使得异常的白血病骨髓微环境正常化(通过减少过度血管化和纤维化)显示治疗效力。有趣的是，伊马替尼可上调BMDSC中的P1GF，并且PlGF水平在用伊马替尼治疗的CML患者中维持高水平，这表明PlGF可能对白血病细胞的持续存在有贡献。这进一步支持了PlGF抑制可与这些疗法联用获得额外益处的事实。总之，PlGF的抑制可作为在联合疗法或在TKI难治性的CML中靶向的新候选。总之，这些数据表明PlGF是促进W1+白血病发展的基质源性因子，其不依赖于BCR-ABL突变状态，并可能是由白血病基质产生的新靶标，有可能可用于辅助BCR-ABL激酶抑制剂。参考文献AielloLP,PierceEA,FoleyED,TakagiH,ChenH,RiddleL,FerraraN,KingGL,SmithLE.Suppressionofretinalneovascularizationinvivobyinhibitionofvascularendothelialgroethfactor(VEGF)usingsolubleVEGF-receptorchimericproteins.ProcNatlAcadSciUSA.1995；92(23):10457-61.AltmanS.RNasePinresearchandtherapy.Biotechnology(NY).1995;13(4):327-9.AlvaradoY,ApostolidouE,SwordsR,GilesFJ.EmergingtherapeuticoptionsforPhiladelphia-posi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