卷曲蛋白结合药剂及其应用的制作方法

专利名称：卷曲蛋白结合药剂及其应用的制作方法
卷曲蛋白结合药剂及其应用技术领域
本发明的领域主要涉及与人类卷曲受体(frizzled receptors)结合的抗体及其他药剂，还涉及使用所述抗体或其他药剂来治疗诸如癌症等疾病的方法。
技术背景
在发达国家中癌症是引起死亡的主要原因之一，仅在美国每年就有超过一百万人被诊断患有癌症并有500，000人死亡。据估算，总体上每3个人中有超过I个人在其一生中将发展某种形式的癌症。有200种或多种不同类型的癌症，其中4种——乳腺癌、肺癌、 结肠直肠癌和前列腺癌——占所有新病例的一半以上(Jemal等，2003,Cancer J. Clin. 53 5-26)。
已经将Wnt信号传导途径鉴定为癌症疗法的潜在靶点。Wnt信号传导途径是胚胎模式形成、胚后组织维持和干细胞生物学的若干关键调控途径之一。更具体而言，Wnt 信号传导在细胞极性产生和包括干细胞群的自我更新在内的细胞命运特化中起重要作用。 Wnt途径的非调控活化与多种人类癌症有关，其中该活化能够改变肿瘤细胞的发育命运，从将肿瘤细胞保持在未分化且增殖的状态。因此癌的发生能够通过篡夺体内平衡机制来进行，所述体内平衡机制控制通过干细胞而进行的正常发育和组织修复(综述见于Reya和 Clevers, 2005, Nature 434 :843 ；Beachy 等，2004, Nature432 :324)。
在果蝇发育无翅(wg)突变体中首次阐明了 Wnt信号传导途径，该途径来自鼠原癌基因 int-Ι (现名为 Wntl) (Nusse 和 Varmus, 1982, Cell 31 :99-109 ；Van Ooyen 和 Nusse, 1984，Cell 39 :233-40 ;Cabrera 等，1987，Cell 50 :659-63 ;Ri jsewijk 等，1987，Cell50 649-57)。Wnt基因编码分泌型脂质修饰糖蛋白，其中19种已在哺乳动物中鉴定出。这些分泌型配体激活由卷曲(Frizzled, Fzd)受体家族成员和低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5或6(LPR5/6)组成的受体复合体。Fzd受体是属于G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的具有7个跨膜结构域的蛋白，其包含具有10个保守半胱氨酸的大型细胞外N端配体结合结构域，即富含半胱氨酸的结构域(CRD)或Fri结构域。人类FZD受体有10种FZD1 FZD10。 对于特定的Wnt，不同的Fzd CRD具有不同的亲和力(Wu和Nusse，2002，J. Biol. Chem. 277 41762-9)，而且已将Fzd受体划分为活化下文所描述的经典β -catenin途径的Fzd受体和活化非经典途径的Fzd受体(Miller等，1999，Oncogene 18:7860-72)。为了形成可结合 FZD配体的受体复合体，FZD受体与LRP5/6相互作用，LRP5/6是具有由6个YWTD氨基酸重复序列分隔的四个细胞外EGF样结构域的单次穿膜蛋白(Johnson等,2004, J. Bone Mineral Res. 19 1749)。
经典Wnt信号传导途径在结合受体时被激活，并且由直接与Fzd受体相互作用的散乱蛋白(Dishevelled, Dsh, 一种细胞质蛋白)介导，导致β -catenin在细胞质中稳定和积累。在无Wnt信号的情况下，β-catenin定位于细胞质中的降解复合体 (destructioncomplex),该降解复合体包括肿瘤抑制蛋白结肠腺瘤息肉蛋白(APC)和轴蛋白(Axin)。这些蛋白发挥下述功能作为关键骨架使糖原合成酶激酶(GSK)-3i3结合并磷酸化β -catenin,从而将其标记以便通过泛素/蛋白酶体途径进行降解。Dsh的活化导致GSK3 0的磷酸化和降解复合体的解离。积累的细胞质β-catenin随后输送至细胞核， 在细胞核中β -catenin与Tcf/Lef家族的DNA结合蛋白相互作用，从而激活转录。
除经典信号传导途径外，Wnt配体还激活β-catenin非依赖型途径(Veeman等， 2003,Dev. Cell 5 :367-77)。已表明非经典Wnt信号传导参与多种过程，但其中最有说服力的是通过与果蝇平面细胞极性(PCP)途径相似的机制来参与原肠胚形成活动。非经典Wnt 信号传导的其他潜在机制包括钙流动、JNK和小G蛋白及异源三聚体G蛋白。在经典途径和非经典途径之间经常观察到拮抗作用，一些证据表明非经典信号传导能够抑制癌的形成 (Olson和Gibo,1998,Exp. Cell Res. 241 :134 ;Topol等，2003，J.CellBiol. 162 :899-908)。 因此，在某些背景下，Fzd受体可作为经典Wnt信号传导途径的负调节因子。举例而言，FZD6 在与FZDl共表达时通过TAKl-NLK途径抑制Wnt_3a所引起的经典信号传导(Golan等， 2004，JBC 279 =14879-88)。类似地，Fzd2 在 Wnt_5a 存在的情况下通过 TAKl-NLK MAPK 级联对经典Wnt信号传导起到拮抗作用(Ishitani等，2003，Mol. Cell. Biol. 23 :131-9)。
经典Wnt信号传导途径还在小肠和结肠干细胞群的维持中起核心作用，该途径的不当激活在结肠直肠癌中起主导作用(Reya和Clevers, 2005, Nature 434 :843)。肠吸收上皮的构造为绒毛和隐窝。干细胞居于隐窝中并缓慢分裂产生快速增殖的细胞，后者产生上行离开隐窝并占据肠绒毛的所有分化细胞群。fct信号传导级联在控制沿隐窝-绒毛轴的细胞命运中起主导作用，并且对维持干细胞群而言必不可少。同源重组所造成的Tcf7/2遗传丢失(Korinek 等，1998, Nat. Genet. 19 :379)或强分泌型 Wnt 抗结剂 Dickkopf-1 (Dkkl) (Pinto 等，2003, Genes Dev. 17 :1709-13 ;Kuhnert 等，2004, Proc. Nat，1. Acad. Sc1. 101 266-71)的过表达会破坏Wnt信号传导，从而致使肠干细胞群耗尽。
结肠直肠癌最常见是由Wnt信号传导级联中的激活性突变引发的。在全部结肠直肠癌中大约5% 10%是遗传性的，其中一种主要形式是家族性腺瘤息肉病(FAP)，该病是一种常染色体显性疾病，其中约80%的患病个体具有结肠腺瘤息肉病(APC)基因的种系突变。在包括 Axin和β-catenin在内的其他Wnt途径组分中也已经鉴定出了突变。个别腺瘤是含有第二失活等位基因的上皮细胞的无性系长出物，而大量的FAP腺瘤通过在致癌基因和/或肿瘤抑制基因增加突变而不可避免地导致腺癌的发展。此外，fct信号传导途径的激活，包括APC和β -catenin的功能获得性突变，能够在小鼠模型中引发增生性发生和肿瘤生长(Oshima 等，1997，Cancer Res. 57 :1644-9 ;Harada 等，1999，EMBO J. 18 :5931-42)。
随着在通过鼠病毒的近位插入而转化的乳腺肿瘤中将Wntl (原inti)鉴定为癌基因，首次揭示了 Wnt信号传导在癌症中的作用(Nusse和Varmus，1982，Cell31 :99-109)。 之后已积累了 fct信号传导在乳腺癌中作用的其他证据。举例而言，乳腺中β-catenin的转基因过表达导致增生和腺癌(Imbert 等，2001, J. Cell Biol. 153 :555-68 ；Michaelson 和Leder，2001，Oncogene 20 :5093-9)，而Wnt信号传导的丢失则破坏正常的乳腺发育 (Tepera 等，2003, J. Cell Sc1. 116 :1137-49 ;Hatsell 等，2003, J.Mammary Gland Biol. Neoplasia 8:145-58)。最近已显示Wnt信号传导可激活乳腺干细胞(Liu等,2004, Proc. Nat，I Acad. Sc1. 101 :4158)。在人类乳腺癌中，β-catenin的积累在超过50%的癌中意味着激活的fct信号传导，虽然未鉴定出特异性突变，但是已观察到了卷曲受体表达的上调(Brennan和 Brown, 2004, J. Mammary Gland Neoplasia9 :119-31 ;Malovanovic 等，2004,Int. J. Oncol. 25 1337-42)。
FZD10、FZD8、FZD7、FZD4和FZD5是10种已鉴定的人类Wnt受体中的5种。在肺中FzdlO与Wnt7b共表达，而且细胞转染研究已表明FzdlO/LRP5共受体在响应于Wnt7b 时激活经典fct信号传导途径(Wang等，2005，Mol. Cell Biol. 25 :5022-30)。在包括子宫颈、胃和成胶质细胞瘤细胞系在内的多种癌细胞系中，以及在包括约40%的原发性胃癌、结肠癌和滑膜肉瘤在内的原发性癌中，FZDlOmRNA发生上调(Saitoh等，2002，Int. J. Oncol. 20 :117-20 ；Terasaki 等，2002, Int.J. Mol. Med. 9 :107-12 ；Nagayama 等，2005， Oncogene 1-12) 0在若干人类癌细胞系、原发性胃癌和肾癌中FZD8发生上调(Saitoh等， 2001, Int. J. Oncol. 18 :991-96 ；Kirikoshi 等，2001, Int. J. Oncol. 19 :111-5 ；Janssens 等，2004, Tumor Biol. 25 :161-71)。FZD7的表达遍及胃肠道，并且在6例人类原发性胃癌中的一例中发生上调(Kirikoshi等,2001, Int. J. Oncol. 19 :111-5)。结肠癌细胞系中 FZD7胞外域的表达引起形态学变化，并且在异种移植模型中使肿瘤生长下降(Vincan等， 2005，Differentiation 73:142-53)。在卵黄囊和胎盘血管发生中FZD5发挥必不可少的作用(Ishikawa等，2001，Dev. 128 :25_33)，并且在与Wnt/β-catenin信号传导的活化有关的肾癌中发生上调(Janssens等，2004, TumorBiology 25:161-71)。FZD4在肠隐窝上皮细胞中高度表达，并且是在正常组织中相对于瘤组织显示差异表达的若干因子中的一种 (Gregorieff 等，2005，Gastroenterologyl29 :626-38)。因此，将 FZD 受体鉴定为癌干细胞 (cancer stem cell)的标记物,使得这些蛋白成为癌症疗法的理想祀点。

发明内容
本发明提供与一种或多种人类卷曲受体(FZD)结合的新型药剂，所述药剂包括但不限于与两种或多于两种人类卷曲受体结合的抗体或其他药剂，以及这些药剂的使用方法。本发明还提供新型多肽，例如与一种或多种卷曲受体结合的抗体、此类抗体的片段和与此类抗体有关的其他多肽。在某些实施方式中，所述药剂、抗体、其他多肽或与FZD结合的药剂，与在本文中称为生物学结合部位(BBS)的FZD区域结合，本发明人现已将所述区域首次鉴定为用于抑制fct信号传导和/或肿瘤生长的靶点。还提供了具有与多于一种FZD 结合的抗原结合部位的抗体和其他多肽。还提供了包含编码所述多肽的核酸序列的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的载体。另外提供了含有本发明的多肽和/或多核苷酸的细胞。 还提供了包含所述新型FZD结合药剂或抗体的组合物(例如,药物组合物)。此外还提供制造和使用所述新型FZD结合药剂或抗体的方法，例如使用所述新型FZD结合药剂或抗体来抑制肿瘤生长和/或治疗癌症的方法。
因此，在一个方面中，本发明提供与人类卷曲受体特异性结合的药剂。在某些实施方式中，所述药剂抑制配体(例如fct)与人类卷曲受体生物学结合部位(BBS)的结合。在某些实施方式中，所述药剂与人类卷曲受体内生物学结合部位(BBS)的至少一部分结合。 在某些实施方式中，所述药剂与BBS的结合导致了对Wnt信号传导和/或肿瘤生长的抑制。 在某些实施方式中，人类卷曲受体是FZD8，并且所述药剂与下述(a)、(b)和/或(c)的至少一部分结合(a)由氨基酸 72(F)、74 75(PL)、78(I)、92(Y)、121 122 (LM)和 129 132(WPDR(SEQ ID NO :70))构成的 FZD8 的构象表位；(b)由序列 QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID N0:67)组成的FZD8的区域；(c)由序列QYGFA(SEQ ID NO :66)组成的FZD8的区域。在某些实施方式中，人类卷曲受体选自由FZDl、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8组成的组，并且所述药剂与所述人类卷曲受体中的序列Q(DE/ED)AGLEVHQF(Y/W)PL(SEQ ID NO :24)的至少一部分结合。举例而言，在某些实施方式中，人类卷曲受体是FZD8，并且所述药剂与FZD8 中的序列QDEAGLEVHQFWPL (SEQ ID NO :67)的至少一部分结合。在某些实施方式中，所述药剂与序列GLEVHQ(SEQ ID NO 25)的至少一部分结合。在某些实施方式中，人类卷曲受体是 FZDl、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD9 或 FZD10，并且所述药剂与对应于由 QDEAGLEVHQFWPL (SEQ ID NO :67)组成的FZD8的区域的人类卷曲受体的区域的至少一部分结合。在某些实施方式中，所述药剂与？201、？2024205、？207和/或？2058中的序列(K/ Q) (F/Y)GF(Q/A) (SEQ ID NO :69)的至少一部分结合。举例而言，在某些实施方式中，人类卷曲受体是FZD8，并且所述药剂与FZD8中的序列QYGFA (SEQ ID NO :66)的至少一部分结合。在某些实施方式中，人类卷曲受体是FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD9 或FZD10，并且所述药剂与对应于由QYGFA(SEQ ID NO 66)组成的FZD8区域的人类卷曲受体区域的至少一部分结合。在某些实施方式中，所述药剂特异性地结合两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述药剂特异性地结合包括 FZD5和FZD8在内的人类卷曲受体。
在另一个方面中，本发明提供与抗体竞争对人类卷曲受体的特异性结合的药剂 (例如，在体外竞争性结合测定中)，其中所述抗体具有包含SEQ ID NO 10的重链可变区和包含SEQ ID N0:12或SEQ ID NO :14的轻链可变区。在某些实施方式中， 所述抗体具有包含SEQ ID NO: 10的重链可变区和包含SEQ ID NO :14的轻链可变区。在某些实施方式中，所述药剂竞争对两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种人类卷曲受体的特异性结合。在某些实施方式中，所述药剂竞争与？2014202、？205、？207或？208的特异性结合。
在再一个方面中，本发明提供与抗体竞争对FZD5和/或FZD8的特异性结合的药剂，其中所述抗体具有包含SEQ ID NO 85的重链可变区和包含SEQ ID NO 86的轻链可变区。
在又一个方面中，本发明提供与两种或更多种人类卷曲受体特异性地结合的药剂。在某些实施方式中，所述两种或更多种卷曲受体包括(a)FZDl和选自由FZD2、FZD5、 FZD7和FZD8组成的组的第二卷曲受体；(b)FZD2和选自由FZD5、FZD7和FZD8组成的组的第二卷曲受体；(c)FZD5和FZD7 ;或(d)FZD7和FZD8。在某些实施方式中，所述药剂特异性地结合三种或更多种(即3、4或5种)人类卷曲受体，其中所述三种或更多种人类卷曲受体包括FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。在某些实施方式中，所述三种或更多种人类受体包括FZD5和FZD8。在某些实施方式中，所述三种或更多种人类卷曲受体还包括FZD3、 FZD4、FZD6、FZD9 和 / 或 FZDlO。
在另外一个方面中，本发明提供与人类卷曲受体特异性结合的多肽，其中所述多肽具有包含下述(a)、(b)和/或(c)的重链可变区(a)包含GFTFSHYTLS (SEQ ID NO 1) 或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链⑶Rl ； (b)包含VIS⑶GSYTYYADSVKG(SEQ ID NO 2)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链⑶R2 ； (c)包含NFIKYVFAN(SEQ ID N03)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链⑶R3。在某些实施方式中，所述多肽特异性地结合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。在某些实施方式中，所述多肽特异性地结合包括FZD5和FZD8在内的两种或更多种人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述氨基酸取代是保守性取代。
在另一个方面中，本发明提供与人类卷曲受体特异性结合的多肽，其中所述多肽具有包含下述(a)、(b)和/或(c)的轻链可变区(a)轻链CDR1，所述轻链CDRl包含 S⑶KLGKKYAS(SEQ ID NO :4)或 SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO :7)，或者具有 1、2、3 或 4 个氨基酸取代的SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 7的变体；(b)轻链CDR2，所述轻链CDR2包含 EKDNRPSG (SEQ ID NO :5)或DKSNRPSG(SEQ ID NO :8)，或者具有 1、2、3 或 4 个氨基酸取代的 SEQ ID NO 5 或 SEQ ID NO 8 的变体；(c)轻链 CDR3，所述轻链 CDR3 包含 SSFAGNSLE (SEQ ID NO 6)或 QSYANTLSL(SEQ ID NO :9)，或者具有 1、2、3 或 4 个氨基酸取代的 SEQ ID NO 6或SEQ ID NO :9的变体。在某些实施方式中，所述多肽特异性地结合FZD1、FZD2、FZD5、 FZD7和/或FZD8。在某些实施方式中，所述多肽特异性地结合包括FZD5和FZD8在内的两种或更多种人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述氨基酸取代是保守性取代。
在另一个方面中，本发明提供具有下述(a)和/或(b)的多肽(a)包含 GFTFSHYTLS (SEQ ID NO :1)的重链 CDR1、包含 VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO :2)的重链 CDR2 和包含 NFIKYVFAN(SEQ ID NO :3)的重链 CDR3 ; (b)包含 SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO :4) 或 S⑶NIGSFYVH(SEQ ID NO :7)的轻链 CDRl、包含 EKDNRPSG (SEQ ID NO :5)或 DKSNRPSG (SEQ ID NO 8)的轻链 CDR2 和包含 SSFAGNSLE (SEQID NO :6)或 QSYANTLSL (SEQ ID NO :9)的轻链CDR3。在某些实施方式中，所述多肽特异性地结合人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述多肽特异性地结合两种或更多种(例如至少FZD5和FZD8)、三种或更多种或四种或更多种人类卷曲受体。
在又一个方面中，本发明提供与人类卷曲受体特异性地结合的抗体，其中所述人类卷曲受体选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组，其中所述抗体具有重链可变区，所述重链可变区含有(a)包含GFTFSHYTLS (SEQ ID NO :1)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链CDRl ;包含VIS⑶GSYTYYADSVKG(SEQID NO 2)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链⑶R2 ;和包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO 3)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体的重链⑶R3 ;和/或(b)轻链⑶Rl，所述轻链⑶Rl包含S⑶KLGKKYAS (SEQ ID NO 4)、S⑶NIGSFYVH(SEQ ID NO :7)，或者具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的SEQ ID NO 4 或 SEQID NO 7 的变体；轻链 CDR2，所述轻链 CDR2 包含 EKDNRPSG (SEQ ID NO :5)、 DKSNRPSG (SEQ ID NO :8)，或者具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的SEQ ID NO :5或SEQ ID NO 8 的变体；轻链 CDR3，所述轻链 CDR3 包含 SSFAGNSLE (SEQ IDNO :6)、QSYANTLSL (SEQ ID NO :9)，或者具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :9的变体。在某些实施方式中，所述抗体具有(a)包含GFTFSHYTLS (SEQ ID NO I)的重链CDR1、 包含 VIS⑶GSYTYYADSVKG(SEQ IDNO :2)的重链 CDR2 和包含 NFIKYVFAN(SEQ ID NO :3)的重链 CDR3 ;和/或(b)包含 SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO 4)或 SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO 7)的轻链 CDRl、包含 EKDNRPSG (SEQ ID NO 5)或 DKSNRPSG (SEQ ID NO 8)的轻链 CDR2 和包含 SSFAGNSLE (SEQ ID NO :6)或QSYANTLSL (SEQ ID NO :9)的轻链CDR3。在某些实施方式中，所述抗体具有(a)包含 GFTFSHYTLS (SEQ ID NO 1)的重链CDR1、包含 VIS⑶GSYTYYADSVKG(SEQ ID NO 2)的重链 CDR2 和包含 NFIKYVFAN (SEQ IDNO :3)的重链 CDR3 ;和 / 或(b)包含 S⑶NIGSFYVH(SEQ ID NO 7)的轻链 CDRl、包含 DKSNRPSG (SEQ ID NO 8)的轻链 CDR2 和包含 QSYANTLSL (SEQ ID NO 9)的轻链 CDR3。
在另一个方面中，本发明提供包含下述(a)和/或(b)的多肽(a)与SEQ ID NO 10的序列同一性至少为约80%的多肽；(b)与SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14的序列同一性至少为约80%的多肽。在某些实施方式中，本发明提供包含下述(a)和/或(b)的多肽 (a)与SEQ ID NO 10的序列同一性至少为约80%的多肽；(b)与SEQ ID NO 14的序列同一性至少为约80%的多肽。在某些实施方式中，所述多肽特异性地结合人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述多肽特异性地结合两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种人类卷曲受体。在某些实施方式中，人类卷曲受体选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组。
在又一个方面中，本发明提供例如与人类FZD5和/或FZD8特异性地结合的抗体等药剂，其中所述抗体具有(a)包含GFTFSSYYIT(SEQ ID NO :77)或其具有1、2、3 或4个保守性氨基酸取代的变体的重链CDRl ;包含TISYSSSNTYYADSVKG(SEQID NO :78) 或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体的重链⑶R2 ;和包含SIVFDY(SEQ ID NO 79)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体的重链CDR3 ;和/或(b)包含 SGDALGNRYVY(SEQ ID NO :80)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体的轻链⑶Rl ； 包含SG(S EQ ID NO :81)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体的轻链⑶R2 ;包含 GSffDTRPYPKY(SEQ ID NO 82)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体的轻链CDR3。 在某些实施方式中，所述抗体具有(a)包含GFTFSSYYIT(SEQ ID NO :77)的重链CDR1、包含 TISYSSSNTYYADSVKG(SEQ ID NO :78)的重链 CDR2 和包含 SIVFDY (SEQ IDNO :79)的重链 CDR3;和 / 或(b)包含 SGDALGNRYVY (SEQ ID NO 80)的轻链 CDRl、包含 SG (SEQ ID NO 81) 的轻链 CDR2 和包含 GSWDTRPYPKY(SEQ ID NO :82)的轻链 CDR3。
在另一个方面中，本发明提供与FZD5和/或FZD8特异性地结合的多肽，其中所述多肽包括(a)与SEQ ID NO 85的同一性至少为约80%的多肽；和/或(b)与SEQ IDNO 86的同一性至少为约80%的多肽。
在又一个方面中，本发明提供与下述IgG抗体中的任一个竞争对人类FZDl、FZD2、 FZD5、FZD7和/或FZD8的特异性结合的药剂，所述IgG抗体为18R8、18R5、18R4605和 18R4805。
在再一个方面中，本发明提供与抗FZD的IgG抗体44R24竞争对人类FZD5和/或 FZD8的特异性结合的药剂。
在每个前述方面以及本文所述的其他方面的某些实施方式中，所述药剂或多肽是抗体。在某些替代性实施方式中，所述药剂不是抗体。
在每个前述方面以及本文所述的其他方面的某些实施方式中，所述药剂或多肽或抗体与其所结合的一种或多种人类卷曲受体的细胞外结构域(ECD)特异性地结合。在每个前述方面以及本文所述的其他方面的某些实施方式中，所述药剂或多肽或抗体与其所结合的一种或多种人类卷曲受体的Fri结构域(Fri)特异性地结合。
在每个前述方面以及本文其他部分所述的其他方面的某些实施方式中，所述抗体或其他多肽的单个抗原结合部位特异性地结合(或能够结合)多于一种人类卷曲受体。
在每个前述方面以及本文所述的其他方面的某些实施方式中，所述药剂或多肽或抗体抑制配体与人类卷曲受体的结合。在某些实施方式中，所述配体是fct。
在每个前述方面以及本文所述的其他方面的某些实施方式中，与FZD结合的药剂或多肽或抗体是该FZD的拮抗剂。
在每个前述方面以及本文所述的其他方面的某些实施方式中，所述药剂或多肽或抗体抑制Wnt信号传导。在某些实施方式中，受到抑制的Wnt信号传导是经典Wnt信号传导。在一些实施方式中，FZD结合药剂所抑制的Wnt信号传导是非经典Wnt信号传导。在某些实施方式中，fct信号传导是非经典Wnt信号传导。
在每个前述方面以及本文所述的其他方面的某些实施方式中，FZD结合药剂或多肽或抗体抑制肿瘤生长。
本发明还提供抗体18R8、18R5、18R4605、44R24和18R4805及其片段。
本发明还提供包含FZD结合药剂或抗体的组合物(例如，药物组合物)。
本发明提供在受试者中抑制Wnt信号传导(例如经典Wnt信号传导)和/或抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括施用治疗有效量的FZD结合药剂或多肽或抗体。
还提供了降低肿瘤的致瘤性的方法，所述肿瘤含有癌干细胞。在某些实施方式中， 所述方法包括对具有肿瘤的受试者施用治疗有效量的FZD结合药剂或多肽或抗体。在某些实施方式中，通过施用所述抗体减少了肿瘤中癌干细胞的频率。在某些实施方式中，FZD结合药剂的施用使得肿瘤中的致瘤性细胞分化为非致瘤状态。
还提供了诱导受试者肿瘤中的细胞进行分化的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的FZD结合药剂、多肽或抗体。
另外提供了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的FZD结合药剂、多肽或抗体。
此外，还提供了降低实体瘤基质中的成肌纤维细胞活化的方法，所述方法包括使所述基质接触治疗有效量的FZD结合药剂、多肽或抗体。
在某些实施方式中，包括施用FZD结合药剂、多肽或抗体的方法还包括对受试者施用第二抗癌药剂(例如化疗剂)。在某些实施方式中，所述第二药剂是吉西他滨 (gemcitabine)、依立替康(irinotecan)或紫杉醇。在某些实施方式中，所述第二药剂是血管发生抑制剂和/或Notch信号传导抑制剂。
在另一个方面中，本发明提供包含选自由SEQ ID NO 10 15组成的组的序列的多肽。同样提供了包含选自由SEQ ID NO :85 86组成的组的序列的多肽。还提供了包含编码所述多肽的核酸序列的多核苷酸。
在又一个方面中，本发明提供包含选自由SEQ ID NO 17 12组成的组的序列的多核苷酸。另外提供了包含选自由SEQ ID N0:87 90、92和94 95组成的组的序列的多核苷酸。
在再一个方面中，本发明提供多核苷酸，所述多核苷酸包含在高严谨度条件下与选自由SEQ ID NO :17、19、21、87 90、92和94 95组成的组的多核苷酸杂交或者与编码选自由SEQ ID NO: 10、12、14和85 86组成的组的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。在某些实施方式中，本发明包括在高严谨度条件下与由SEQ ID N0:17、19或21组成的多核苷酸杂交或者与编码SEQ ID NO 10,12或14的多核苷酸杂交的多核苷酸。
在每个前述方面以及本文所述的其他方面的某些实施方式中，对所述药剂或多肽或抗体或多核苷酸进行了分离。在某些实施方式中，所述药剂或多肽或抗体或多核苷酸基本纯净。
本发明还提供Wnt基因标签(gene signature),可用于鉴定可能会对用FZD结合药剂(例如，人类卷曲受体的拮抗剂和/或fct信号传导抑制剂)或Wnt信号传导的其他抑制剂进行的治疗产生应答的肿瘤和/或患者。还提供了使用fct基因标签来选择可用FZD 结合药剂或fct信号传导的其他抑制剂治疗的患者的方法。在某些实施方式中，所述方法涉及对fct基因标签中的一种或多种基因的水平进行评估。还提供了筛选可对抗利用fct 基因标签所鉴定的肿瘤的候选药物的方法。还提供了在所述方法中有用的阵列、试剂盒和其他组合物。
本发明还提供筛选潜在候选药物或其他药剂的方法。这些方法包括但不限于包括对第一实体瘤中的一种或多种分化标记物的水平和第二实体瘤中的一种或多种分化标记物的水平进行比较的方法，所述第一实体瘤已暴露于所述药剂，而第二实体瘤未暴露于所述药剂。在某些实施方式中，这些方法包括(a)使第一实体瘤暴露于所述药剂，而第二实体瘤不暴露于所述药剂；(b)对第一实体瘤和第二实体瘤中的一种或多种分化标记物的水平进行评估；和(C)对第一实体瘤和第二实体瘤中的一种或多种分化标记物的水平进行比较。
在本发明的方面或实施方式用马库什组或可选要素的其他分组进行描述时，本发明不仅涵盖作为一个整体列出的整个组，而且还单独涵盖该组中的每个成员以及大组的所有可能的小组，以及缺少一个或多个组成员的大组。本发明还包括在要求保护的发明中明确排除该组中的任何一个或多个成员。


图1 :18R8结合多种人类卷曲受体。FACS分析展示了 18R8与瞬时转染的HEK293细胞上的FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8序列结合。显示了 18R8与HEK293细胞结合的FACS 绘图，所述HEK293细胞转染有编码所示FZD的表达载体和GFP表达载体。共转染(GFP阳性)细胞群中染色的升高表明18R8的结合。FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8的FACS绘图用粗线加框，从而突出这些显示与18R8结合的FZD。
图2 :抗FZD抗体18R5与细胞上的多种人类卷曲受体结合。FACS分析展示了 18R5 同18R8 —样与细胞上的 FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8序列结合。将不同浓度的抗体18R8 和18R5与过表达所示FZD的HEK293细胞进行共温育，并通过流式细胞术评估了抗体的结合。虽然18R8和18R5都与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8结合，但是18R5的结合具有更高的亲和力。
图3 :在稳定表达与荧光素酶连接的8xTCF启动子元件的STF293细胞中进行了荧光素酶报告基因测定。用含有Wnt3A以及不同浓度的18R8和18R5的条件培养基处理细胞， 并随后在18小时后使用Dual-Glo荧光素酶检测报告系统(Promega)来进行测定。结果表明18R8和18R5均抑制Wnt信号传导，而且18R5的结合亲和力比18R8更高。
图4 :18R8通过多个Wnt阻断TCF信号传导。在稳定表达与荧光素酶连接的8xTCF 启动子元件的STF293细胞中进行荧光素酶报告基因测定。通过使用Fugene 6 (Roche)以编码所示Wnt蛋白的表达载体转染HEK293细胞(ATCC)来产生各种过表达Wnt的细胞。用 18R8处理STF293细胞并添加过表达Wnt的HEK293细胞，随后在18小时后使用Dual-Glo 荧光素酶检测报告系统来进行测定。
图5 18R8直接抑制Wnt与FZD的结合。在稳定表达8xTCF启动子元件的STF293 细胞中进行荧光素酶报告基因测定。在用或不用蛋白A琼脂糖微球的情况下，将如图所示含有Wnt3A条件培养基、纯化的FZD8-FC和/或18R8的混合物于4°C共温育2小时。温育后移除蛋白A琼脂糖凝胶微球并将其加至STF293细胞。18小时后使用Dual-Glo荧光素酶测定报告系统对经处理的STF293细胞进行测定。该实验显示，在无18R8的情况下Fzd8-Fc 能够抑制Wnt3A刺激信号传导的能力，但是18R8能够阻断FZD8与Wnt3A结合的能力，当使用琼脂糖A微球从共温育物中除去FZDS-Fc (和18R8)时信号传导的恢复即证明了这一点。
图6 :对18R8与突变FZD8 (与野生型FZD8相比)的结合的FACS分析。为了评估 FZD上的18R8表位，进行了表位作图研究。在瞬时转染研究中将编码GFP的表达载体与表达构建体共同使用，所述表达构建体能够表达带N端FLAG标签和C端⑶4跨膜结构域及细胞内结构域的人类FZD8的Fri结构域。还制备了该表达载体的多种变体，所述变体具有在 FZD8序列内的选定氨基酸取代，用来编码在不与18R8结合的其他特定FZD的Fri结构域中对应位置的氨基酸。随后通过流式细胞术来评估18R8结合这些FZD8序列变体的能力。如共转染(GFP阳性)细胞群中的染色降低所示，发现18R8的结合需要FZD8的某些位置的氨基酸，包括FZD8的氨基酸66 71和126 127。以线框突出了显示18R8与共转染的细胞群结合的FACS绘图区域，以粗线显示表现出显著下降的18R8结合的氨基酸取代的线框。
图7 :显示出18R5和18R8在人类FZD8上具有相似的结合表位。使用此前显示出可破坏18R8结合的一系列氨基酸变体，通过流式细胞术来评估18R5与18R8结合表位的类似表位结合的能力。如共转染(GFP阳性)细胞群中的染色降低所示，发现与18R8和18R5 结合均需要包括FZD8的氨基酸66 71和126 127在内的位置。以线框突出了显示 18R8与共转染的细胞群结合的FACS绘图区域，并且加粗了对应于表现出显著下降的18R8 和18R5结合的氨基酸取代的线框。
图8 :各人类卷曲受体Fri结构域序列的部分氨基酸序列间的比较。具有保守残基的位点以黑色阴影标出；具有相似氨基酸残基的位点以灰色阴影标出。18R8和18R5的 FZD表位包含由下划线标出且标记为“上边缘”和“下边缘”的区域。基于对Fri结构域晶体结构的细查，可认识到这些区域位于FZD蛋白表面上的裂缝两侧，术语“上边缘”和“下边缘”则反映了这种认识。所述裂缝包含多个高度保守的 残基。构成该裂缝的氨基酸由比对结果中每个对应位置上的三角形状符号突出显示。之前并未认识到该区域的特定功能。对与该区域结合的抗体的发现，对这些抗体抑制fct结合及Wnt信号传导的发现，以及本发明人对该裂缝的保守性的认识，已使得本发明人能够将该区域鉴定为FZD蛋白的关键功能性部分。
图9 FZD的生物学结合部位(BBS)。显示了 Fzd Fri结构域的结构图像。该图像基于对之前报导的小鼠FZD8晶体结构的分析(Dann CE等，Nature 412 (6842) 86-90，2001) 和使用软件程序Pymol完成的分析。在左上图中显示了 FZD Fri结构域的表面视图，其中 Fzd蛋白区域包含以白色椭圆圈出的本发明人已发现的生物学结合部位(BBS)。该区域即抗体18R8和18R5所结合的区域。该区域包含被本发明人称为“上边缘”、“下边缘”和“裂缝”的结构元件。在该图底部的分开的图像中用较深的表面着色突出显示了各所述结构元件。右上图用较深色表面突出显示了在10个人类Fzd家族成员的9个或10个中保守的残基，并且突出了以下认识在两侧为与抑制Fzd功能的抗体结合的表位的“裂缝”区域的中心内出现了这些残基的明显集群。
图10 :通过抗FZD的mAb防止Wnt依赖型肿瘤生长。每周对注射有50，000个MMTV WNTl肿瘤来源细胞的N0D/SCID小鼠和肿瘤生长进行监视，直至检测到生长，随后每周对肿瘤生长进行两次测量。用18R8或作为对照的对照抗体对10只具有已建立肿瘤的小鼠进行治疗。与在用对照抗体治疗的动物中所观察到的相比，在用18R8治疗的动物中，几乎消除了肿瘤生长。
图11 :通过18R5与依立替康的组合治疗减少0MP-C28异种移植肿瘤的生长。对 N0D/SCID小鼠注射10，000个0MP-C28结肠肿瘤细胞，在第24天，将肿瘤平均体积为129mm3 的小鼠随机分组并开始 进行所示的治疗。每周对肿瘤生长进行监视。在用18R5治疗的动物中，肿瘤生长明显减少。此外，18R5与依立替康的组合与单独使用其中任何一个药剂进行的治疗相比显示出明显的减少。
图12 :通过18R5与吉西他滨的组合治疗减少0MP-PN4异种移植肿瘤的生长。对 N0D/SCID小鼠注射50，000个0MP-PN4胰腺肿瘤细胞，在第38天，将肿瘤平均体积为约 120_3的小鼠随机分组并在2天后开始进行所示的治疗。与单独使用吉西他滨的治疗相比， 在用18R5与吉西他滨组合治疗的动物中肿瘤生长明显减少。
图13 :18R8和18R5的重链和轻链氨基酸序列，包括VH和VL序列。
图14 :编码18R8和18R5的重链和VH序列的核苷酸序列。
图15 :编码18R8和18R5的轻链和VL序列的核苷酸序列。
图16 :FZD7E⑶Fe蛋白的氨基酸序列及编码该蛋白的核苷酸序列。
图17 :人类 FZDl (SEQ ID NO 26) ,FZDl 的细胞外结构域(ECD) (SEQ ID NO :27，显示为SEQ ID NO 26中带下划线的氨基酸I 321)和FZDl的Fri结构域(SEQ IDNO 28) 的氨基酸序列。
图18 :人类 FZD2(SEQ ID NO :30)、FZD2 的细胞外结构域(ECD) (SEQ ID NO :31，显示为SEQ ID NO 30中带下划线的氨基酸I 250)和FZD2的Fri结构域(SEQ IDNO 32) 的氨基酸序列。
图19 :编码人类FZDl的核苷酸序列。
图20 :编码人类FZD2的核苷酸序列。
图21 :人类 FZD3(SEQ ID NO :34)、FZD3 的细胞外结构域(ECD) (SEQ ID NO :35，显示为SEQ ID NO 34中带下划线的氨基酸I 204)和FZD3的Fri结构域(SEQ IDNO 36) 的氨基酸序列。
图22 :人类 FZD4(SEQ ID NO :38)、FZD4 的细胞外结构域(ECD) (SEQ ID NO :39，显示为SEQ ID NO 38中带下划线的氨基酸I 224)和FZD4的Fri结构域(SEQ IDNO 40) 的氨基酸序列。
图23 :编码人类FZD3的核苷酸序列。
图24 :编码人类FZD4的核苷酸序列。
图25 :人类 FZD5(SEQ ID NO :42)、FZD5 的细胞外结构域(ECD) (SEQ ID NO :43，显示为SEQ ID NO 42中带下划线的氨基酸I 233)和FZD5的Fri结构域(SEQ IDNO 44) 的氨基酸序列。
图26 :人类 FZD6(SEQ ID NO :46)、FZD6 的细胞外结构域(ECD) (SEQ ID NO :47，显示为SEQ ID NO 46中带下划线的氨基酸I 207)和FZD6的Fri结构域(SEQ IDNO 48) 的氨基酸序列。
图27 :编码人类FZD5的核苷酸序列。
图28 :编码人类FZD6的核苷酸序列。
图29 :人类 FZD7(SEQ ID NO :50)、FZD7 的细胞外结构域(ECD) (SEQ ID NO :51，显示为SEQ ID NO 50中带下划线的氨基酸I 255)和FZD7的Fri结构域(SEQ IDNO 52) 的氨基酸序列。
图30 :人类 FZD8(SEQ ID NO :54)、FZD8 的细胞外结构域(ECD) (SEQ ID NO :55，显示为SEQ ID NO 54中带下划线的氨基酸I 277)和FZD8的Fri结构域(SEQ IDNO 56) 的氨基酸序列。
图31 :编码人类FZD7的核苷酸序列。
图32 :编码人类FZD8的核苷酸序列。
图33 :人类 FZD9(SEQ ID NO :58)、FZD9 的细胞外结构域(ECD) (SEQ ID NO :59，显示为SEQ ID NO 58中带下划线的氨基酸I 230)和FZD9的Fri结构域(SEQ IDNO 60) 的氨基酸序列。
图 34 :人类 FZDlO (SEQ ID NO 62)、FZDlO 的细胞外结构域(ECD) (SEQ IDNO :63， 显示为SEQ ID NO 62中带下划线的氨基酸I 227)和FZDlO的Fri结构域(SEQ ID NO 64)的氨基酸序列。
图35 :编码人类FZD9的核苷酸序列。
图36 :编码人类FZDlO的核苷酸序列。
图37 :用18R5抗体与紫杉醇的组合治疗减少PE-13乳腺肿瘤的生长。对N0D/SCID 小鼠注射10，000个PE-13乳腺肿瘤细胞，在第22天，将肿瘤平均体积为约120mm3的小鼠随机分组。随后用对照抗体(“对照Ab”)、18R5抗体(“抗FZD”)、紫杉醇(“Taxol”)或 18R5抗体与紫杉醇的组合(“抗FZD+Taxol”)对小鼠进行治疗。用18R5抗体与紫杉醇的组合进行的治疗具有抗肿瘤活性。
图38 :在用18R5抗体与紫杉醇进行组合治疗的个体动物中的乳腺肿瘤生长。用 18R5抗体与紫杉醇进行的组合治疗导致已建立的乳腺肿瘤的衰退。
图39 :在用对照抗体、18R5抗体、依立替康或18R5抗体与依立替康的组合进行治疗后对结肠直肠肿瘤细胞的流式细胞术分析。
图40 :在植入30、90、270或810个肿瘤细胞后的小鼠中的肿瘤生长，所述肿瘤细胞从已经用对照抗体(“对照”)、18R5抗体(“抗FZD”)、吉西他滨(“吉西他滨”)或18R5 与吉西他滨的组合(“组合”)治疗41天的小鼠中获得。
图41 :在用对照抗体(“对照Ab”)、仅用18R5抗体(“抗FZD”)、仅用吉西他滨 (“吉西他滨”)或18R5抗体与吉西他滨的组合(“组合”)进行治疗后通过有限稀释分析确定的PN-4胰腺肿瘤中的癌干细胞(CSC)频率。
图42 :在已用对照抗体(“LZ-1”)、仅用18R5抗体(“18R5”)、仅用吉西他滨(“吉西他滨”)或吉西他滨与18R5的组合(“组合”)进行治疗的胰腺肿瘤细胞中的嗜铬粒蛋白 (Chromatogram)基因表达。
图43 :用抗FZD抗体18R5进行的治疗促使肿瘤细胞分化为非增殖粘液性细胞。对N0D/SCID小鼠注射50，000个0MP-PN13胰腺肿瘤细胞，在第23天，将肿瘤平均体积为约 107mm3的小鼠随机分组并在4天后开始用对照抗体或18R5进行治疗。20天后收集肿瘤并切片。来自经18R5治疗的小鼠或经对照抗体治疗的小鼠的肿瘤切片用阿尔新蓝染料进行染色以显示粘液性细胞，并通过用ki67的抗体的免疫组化显示增殖细胞。用箭头突出显示了示例性的粘液性细胞和增殖细胞。
图44:单独使用抗FZD抗体18R5或与Taxol (紫杉醇)组合使用的抗FZD 抗体18R5抑制0MP-LU24异种移植肿瘤的生长。用对照抗体(“对照Ab”)、抗FZD的 18R5( “18R5”)、Taxol ( “Taxol”)或 18R5 与Taxol 的组合(“ 18R5+Taxol”)对携带有 0MP-LU24人类肺肿瘤的小鼠进行治疗。
图45 :单独使用抗FZD抗体18R5或与Avastin (贝伐单抗)组合使用的抗FZD抗体18R5抑制0MP-LU33异种移植肿瘤的生长。用对照抗体(方形)、Avastin (指向上方的三角形)、抗FZD的18R5(指向下方的三角形)或18R5与Avastin 的组合(圆形)对携带有0MP-LU33人类肺肿瘤的小鼠进行治疗。
图46 -M FZD抗体18R5与Herceptin (曲妥单抗)的组合抑制T3异种移植肿瘤的生长。用对照抗体(方形)、抗FZD的18R5 (三角形)、Herceptin (实心圆)或18R5与 Herceptin 的组合(空心圆)对携带有T3人类乳腺肿瘤的小鼠进行治疗。
图47 :18R5和44R24的Fzd结合图谱。表示每个mAb与Fzdl、2、5、7和8的结合的剂量响应曲线(Dose-reponse curve)
图48 18R5和44R24对STF细胞中Wnt3a所诱发的报告基因活性的抑制作用(剂量响应曲线)。
图49 18R5和44R24对axin2基因表达的本底水平的抑制作用。
图50 :对经18R5和44R24治疗的0MP-PN13肿瘤中的Mucl6的IHC检测。
图51 :对经18R5治疗的胰腺肿瘤中平滑肌肌动蛋白的抑制作用。A.通过微阵列检测到的ACTA2基因表达水平。B.对经对照mAb (上图)和18R5 (下图)治疗的0MP-PN4 肿瘤的SMA检测。
图52 :测试经18R5诱导的Mucl6+0MP_PN13细胞的致瘤性。A.进行Mucl6染色的 Iin消减的(lin-cbpleted)0MP-PN13肿瘤细胞的FACS作图。两个分选的群用圆圈圈出。 B.因注射Mucl6-(上图)和Mucl6+(下图)细胞而产生的肿瘤的代表图。C.肿瘤生长曲线。
图53 :在PE13乳腺肿瘤异种移植物中抗FZD的mAb 18R5对肿瘤复发的抑制作用。
图54 :抗FZD的mAb 18R5使乳腺的癌干细胞频率降低。
图55 :在PM胰腺肿瘤异种移植物中抗FZD的mAb 18R5对肿瘤复发的抑制作用。
图56 :在PM胰腺肿瘤异种移植物中抗FZD的mAb 44R24与吉西他滨的组合对肿瘤生长的抑制作用。
图57 :抗FZD的mAb 44R24与突变FZD8 (相对于野生型FZD8)的结合的FACS分析。用线框突出了显示44R24与共转染的细胞群结合的FACS图区域。箭头标出了那些显示出显著下降的44R24结合的氨基酸取代的线框。
图58 :在C25结肠肿瘤异种移植物中抗FZD的抗体44R24和18R5的抗肿瘤活性。
图59 :在用抗FZD的抗体44R24或18R5治疗过的C28结肠肿瘤异种移植物中的细胞角蛋白7表达的诱导。
具体实施方式
本发明提供新型药剂，包括但不限于与一种或多种人类卷曲受体(FZD)结合的多肽(例如抗体)。还提供了相关多肽和多核苷酸、含有FZD结合药剂的组合物以及制备所述 FZD结合药剂的方法。另外提供了该新型FZD结合药剂的使用方法，例如抑制肿瘤生长和/ 或治疗癌症的方法。
本发明在部分上基于对人类卷曲受体中的一个区域的鉴定，所述区域是结合FZD 的抗癌药剂的适合靶标。发现两种抗FZD抗体，18R8和18R5，与FZD7特异性地结合，还与 FZD1、FZD2、FZD5和FZD8发生交叉反应(下文实施例1和2)。用18R8抗体进行的体外实验表明该抗体能够抑制fct信号传导(下文实施例3)并抑制Wnt配体与FZD8的结合(下文实施例4)。在基于细胞的测定中，还已显示18R5抗体同样能够抑制Wnt信号传导(下文实施例3和20)。用18R5抗体进行的体内实验表明该抗体能够抑制肿瘤生长或复发(下文实施例7、17和23)。本发明人还展示了抗FZD抗体18R5能够降低肿瘤中的癌干细胞频率(下文实施例8和23)并诱发肿瘤细胞的分化和/或降低肿瘤细胞致瘤性(下文实施例 16、21、22和25)。用这些活性18R8和18R5抗体进行的表位作图实验表明这些抗体均可与 FZD8中的序列GLEVHD (SEQ IDNO :25)的至少一部分和序列YGFA (SEQ ID NO 74)的至少一部分结合(下文实施例5)。根据所展示的这两种抗体的生物活性，对小鼠卷曲蛋白8的晶体结构(Dann等，Nature，412 :86-90(2001))进行了分析，并将包含这些此前并未认为有任何特殊功能的序列的卷曲蛋白的细胞外区域首次鉴定为在FZD生物学和Wnt信号传导中起到重要功能性作用(实施例6)。人类卷曲受体的称为生物学结合部位(BBS)的这一区域是抗癌治疗的适合祀标。
此外，发现第三种抗体44R24特异性地结合人类FZD5和FZD8 (下文实施例19)。已另外显示，该抗体能够在基于细胞的测定中抑制fct信号传导(下文实施例20)并在体内具有抗肿瘤效用(下文实施例23和25)。和用抗FZD抗体18R8和18R5进行的治疗相同， 用44R24对肿瘤进行的治疗致使该肿瘤中的分化标记物水平升高(下文实施例25)。表位作图还已显示，抗FZD抗体44R24的表位与抗FZD抗体18R8和18R5的表位存在重叠。更具体而言，已显示44R24与BBS中的区域YGFA (SEQ IDNO 74)的至少一部分结合(下文实施例24)。
1.定义
为了便于理解本发明，下文定义了多个术语和短语。
术语“抗体”指免疫球蛋白分子，其通过在该免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别部位识别并特异性地结合靶标，例如蛋白、多肽、肽、糖类、多核苷酸、脂质或其组合。本文所用的术语“抗体”涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段(例如Fab、 Fab’、F(ab’)2和Fv片段)、单链Fv (scFv)突变物、从至少两种完整抗体产生的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、含有抗体的抗原决定部位的融合蛋白以及含有抗原识别部位的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体显示出所需的生物活性即可。根据抗体的重链恒定域(分别称为α、δ、ε、Y和μ)，抗体可以是5种主要类别的免疫球蛋白(IgA、IgD, IgE, IgG和IgM)或其亚类(同型)(例如IgGUIgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)中的任何一种。不同类别的免疫球蛋白具有不同且公知的亚基结构和三维构造。抗体可以是裸抗体，或者与诸如毒素、放射性同位素等其他分子偶联。
术语“抗体片段”指完整抗体的一部分，和指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、线状抗体、单链抗体以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“单克隆抗体”指参与高特异性地识别并结合单一抗原决定簇或表位的同源抗体群。与之相反的多克隆抗体则通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体。术语“单克隆抗体”涵盖完整全长单克隆抗体和抗体片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(scFv)突变物、含有抗体部分的融合蛋白以及含有抗原识别部位的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子。另外，“单克隆抗体”指以包括但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物的多种方式制成的此类抗体。
术语“人源化抗体”指含有最少的非人类(例如鼠类)序列的非人类(例如鼠类) 抗体形式，所述形式有特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段。通常，人源化抗体是人类免疫球蛋白，其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的CDR的具有所需的特异性、亲和力和能力的残基所替换(Jones等，1986， Nature,321 :522-525 ；Riechmann 等，1988, Nature, 332 :323-327 ；Verhoeyen 等，1988， Science, 239 :1534-1536)。在一些情况中，用来自非人类物种的具有所需的特异性、亲和力和能力的抗体的残基替换人类免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)的相应残基。通过在Fv骨架区和/或已替换的非人类残基中进行附加残基的取代，可以进一步修饰人源化抗体，从而改进和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。一般而言，人源化抗体会基本上完整地包含至少一个、通常为两个或三个可变区，所述可变区含有全部或基本上全部与非人类免疫球蛋白对应的CDR区，然而全部或基本上全部FR区都属于人类免疫球蛋白共有序列。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白(通常为人类免疫球蛋白) 的恒定区或结构域(Fe)的至少一部分。在美国专利第5，225，539号中描述了用来产生人源化抗体的方法的实例。
术语“人类抗体”指由人类产生的抗体，或者是用任何本领域已知的技术制备的具有与人类所产生的抗体对应的氨基酸序列的抗体。人类抗体的这种定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一个人类重链和/或轻链多肽的抗体(例如包含鼠类轻链和人类重链多肽的抗体)。
术语“嵌合抗体”指免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两种或更多种物种的抗体。 通常，其轻链和重链的可变区对应于源自一种哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需的特异性、亲和力和能力的抗体的可变区，而恒定区则与源自另一物种(通常为人类)的抗体中的序列同源，从而避免在该物种中引起免疫应答。
术语“表位”或“抗原决定簇”在本文中可互换使用，指能够被特定抗体识别并特异性地结合的抗原的部分。当抗原是多肽时，表位能够由连续氨基酸构成，也能够由通过蛋白的三级结构折叠而并置的不连续氨基酸构成。由连续氨基酸构成的表位通常在蛋白变性时得以保留，然而通过三级结构折叠形成的表位通常在蛋白变性时丢失。表位通常包括具有独特空间构象的至少3个、更常见为至少5个或8 10个氨基酸。
抗体“特异性地结合”表位或蛋白是指该抗体与表位或蛋白的反应或联结比替代性物质(包括无关蛋白)更频繁、更快速、时间更长、亲和力更强或上述情况的某些组合。在某些实施方式中，“特异性地结合”是指，例如，抗体与蛋白结合的Kd值为约O.1mM以下，但更常见为小于约ΙμΜ。在某些实施方式中，“特异性结合”指抗体与蛋白结合的Kd有时为至少约O.1 μ M以下，而在其他时候为至少约O. 01 μ M以下。由于不同物种中同源蛋白之间的序列同一性，特异性结合可以包括对多于一种的物种中的特定蛋白(例如卷曲受体)进行识别的抗体。同样，由于不同FZD受体(例如，FZD5和FZD8)之间在这些受体多肽序列的某些区域中存在同源性，特异性结合可以包括对多于一种的卷曲受体进行识别的抗体(或其他多肽或药剂)。应了解的是，与第一靶标特异性结合的抗体或结合部分，可以与或可以不与第二靶标特异性结合。如此而言，“特异性结合”不必需要(虽然其可以包括)排他性结合，即与单一靶标结合。因此，在某些实施方式中，抗体可以特异性结合多于一种的靶标 (例如人类FZDl、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8)。在某些实施方式中，抗体上的相同抗原结合部位可以结合多个靶标。举例而言，在某些情况中，抗体可以含有两个相同的抗原结合部位，其中每个部位都特异性地结合两种或更多种人类卷曲受体(例如人类FZD1、FZD2、 FZD5、FZD7和/或FZD8)。在某些替代性实施方式中，抗体可以是双特异性的，并且含有特异性不同的至少两个抗原结合部位。以非限制性的实例而言，双特异性抗体可以具有一个识别一种卷曲受体(例如人类FZD5)上的表位的抗原结合部位，并且还具有识别第二种卷曲受体(例如人类FZD8)上的不同表位的 另一不同的抗原结合部位。一般而言，但不必需， 述及结合是指特异性结合。
“已分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是指处于非自然发现形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。已分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括经纯化达到不再处于其在自然中所发现形式的程度的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。在一些实施方式中，已分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物基本纯净。
本文所用的“基本纯净”指为至少50%纯净(即无杂质)、更优选为至少90%纯净、 再优选为至少95%纯净、再更优选为至少98%纯净、进一步优选为至少99%纯净的材料。
术语“癌症”和“癌症的”是指或用于描述哺乳动物的生理病症，其中一群细胞的特征在于失调的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌肿、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症更特定的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状上皮肿瘤、腹膜癌、肝细胞癌(h印atocellular cancer)、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜瘤或子宫瘤、唾液腺瘤、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝脏癌(hepatic carcinoma)以及各类型的头颈部癌症。
“肿瘤”和“赘生物”是指因过度细胞生长或增殖而产生的任何良性(非癌性)或包括癌前病灶在内的恶性(癌性)组织团块。
术语“癌干细胞”、“肿瘤干细胞(tumor stem cell) ”或“实体瘤干细胞(solid tumor stem cell) ”在本文中可互换使用，是指来自实体瘤的具有下述特征的细胞群(I)具有较强的增殖能力；(2)能够进行非对称细胞分裂从而产生一种或多种具有减弱的增殖或发育潜能的分化的后代；和(3)能够进行对称分裂用于自我更新或自我维持。在对免疫功能低下的小鼠进行连续移植时，“癌干细胞”、“肿瘤干细胞”或“实体瘤干细胞”的这些性质使这些癌干细胞与大多数不能形成肿瘤的肿瘤细胞相比能够形成可触知的肿瘤。相对于分化，癌干细胞以无序的方式进行自我更新，从而形成具有异常细胞类型的肿瘤，所述异常细胞类型在发生突变时能够随时间发生变化。
术语“癌细胞”、“肿瘤细胞”和语法上等价的词语是指源自肿瘤或癌前病灶的总细胞群，包括非致瘤性细胞(其包括大量的肿瘤细胞群)和致瘤干细胞(癌干细胞)。在仅述及缺少更新及分化能力的那些肿瘤细胞时，以术语“非致瘤”修饰本文所用的术语“肿瘤细胞”，从而将这些肿瘤细胞与癌干细胞区分开。
术语“致瘤性”是指实体瘤干细胞的功能性特征，其包括自我更新性质(产生额外的致瘤性癌干细胞)和增殖以产生使实体瘤干细胞形成肿瘤的全部其他肿瘤细胞(产生分化的因而不具有非致瘤性的肿瘤细胞)的性质。在对免疫功能低下的小鼠进行连续移植时，这些自我更新和增殖以产生全部其他肿瘤细胞的性质使得癌干细胞与非致瘤性肿瘤细胞相比能够形成可触知的肿瘤，所述非致瘤性肿瘤细胞在进行连续移植时不能形成肿瘤。 已观察到，在从实体瘤获得肿瘤细胞后对免疫功能低下的小鼠进行初次移植时，非致瘤性肿瘤细胞可以形成肿瘤，但是进行连续移植时，这些非致瘤性肿瘤细胞不产生肿瘤。
术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长动物和啮齿动物等，其将是特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在述及人类受试者时可在本文中互换使用。
“制药上可接受的盐”是指在制药上可接受的化合物的盐，其具有母化合物的所需药理学活性。
“制药上可接受的赋形剂、运载体(carrier)或佐剂”是指能够与本发明的至少一种抗体一起对受试者进行施用、不破坏其药理学活性而且在以足以递送治疗量的化合物的剂量施用时无毒性的赋形剂、运载体或佐剂。
“制药上可接受的载质”是指与本发明的至少一种抗体一起施用的稀释剂、佐剂、 赋形剂或 运载体。
术语“治疗有效量”是指用来有效地“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症的抗体、多肽、多核苷酸、有机小分子或其他药物的量。对于癌症，治疗有效量的药物能够减少癌细胞数量；减小肿瘤尺寸；抑制或阻止癌细胞浸润至周边器官，所述浸润包括例如癌扩散至软组织和骨中；抑制并阻止肿瘤转移；抑制或阻止肿瘤生长；一定程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率；提高生命质量；降低肿瘤的致瘤性、致瘤率或致瘤能力；减少肿瘤中癌干细胞的数量或频率；使致瘤性细胞分化为非致瘤状态；或者这些效果的组合。对于药物防止生长和/或杀死已存在的癌细胞的情况，可称之为细胞抑制和/或细胞毒性。
诸如“治疗，，(“treating，，或“treatment，，或“treat”)或“减轻，，(“alleviating” 或“alleviate”)等术语是指I)治愈、缓解、减少已诊断出的病理状态或病症的症状和/ 或使所述病理状态或病症停止进展的治疗措施，和(2)预防和/或减缓目标病理状态或病症的发展的预防性或防止性措施。因此，需要治疗的对象包括已经患有病症的对象、易于患有病症的对象和要防止病症的对象。在某些实施方式中，如果患者显示出一种或多种的下述现象，则根据本发明的方法对受试者成功地进行了癌症“治疗”，所述现象为癌细胞数量减少或完全消失；肿瘤尺寸减小；癌细胞向周边器官的浸润受到了抑制或消失，所述浸润包括例如癌扩散至软组织和骨中；使肿瘤转移受到了抑制或消失；使肿瘤生长受到了抑制或消失；使与特定癌症相关的一种或多种症状减轻；发病率和死亡率降低；提闻生命质量； 肿瘤的致瘤性、致瘤率或致瘤能力降低；肿瘤中癌干细胞的数量或频率减少；致瘤性细胞分化为非致瘤状态；或者这些效果的某种组合。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA 和RNA。所述核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物、或者能够通过DNA聚合酶或RNA聚合酶引入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在对核苷酸结构的修饰，其可以在聚合物装配之前或之后进行。非核苷酸成分可以中断核苷酸序列。在聚合后可以进一步对多核苷酸进行修饰，例如通过与标记成分偶联。其他类型的修饰包括例如“封端”;用类似物取代一种或多种天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如具有无电荷键的修饰(例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸酯等)和带电键的修饰(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有悬突部分(pendant moiety)例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚L-赖氨酸等)的修饰、以嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)进行的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、带有经修饰键(例如α异头核酸等)的修饰；以及多核苷酸的未修饰形式。另外，对于通常存在于糖中的任何羟基，可以将其置换为例如膦酸酯基团、磷酸酯基团，可以用标准保护基对其进行保护，或者可以将其激活从而制备与其他核苷酸的额外键，或者可以使其与固体支持物偶联。可以用胺或含有I 20个碳原子的有机封端基团部分来取代或磷酸化5’端和3’ 端0Η。还可以使其他羟基衍生为标准保护性基团。多核苷酸还可以包含本领域中公知的核糖或脱氧核糖的类似物形式，包括例如2' -O-甲基核糖、2' -O-烯丙基核糖、2'-氟代核糖、2’ -叠氮基核糖、碳环糖类似物、α异头糖、差向异构糖(例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物以及非碱基核苷类似物(例如甲基核糖苷)。 可以用替代性连接基团来置换一个以上的磷酸二酯键。这些替代性连接基团包括但不限于下述实施方式其中用P (O) S ( “硫代酯”)、P (S) S ( “二硫代酯”)、” (O) NR2 ( “酰胺化物”)、 P (O) R、P (O) 0R’、CO或CH2 ( “甲乙缩醛”)置换磷酸酯，其中R或R’各自独立 地为H或者为具有取代基或不具有取代基的烷基(I 20C)并可选地包含醚(一0—)键、芳基、链烯基、 环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。在一个多核苷酸中并不需要所有键都相同。以上描述对本文述及的所有多核苷酸(包括RNA和DNA)都适用。
抗体的“可变区”可以单独指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，也可以指其组合。重链和轻链的可变区各自由4个框架区(FR)组成，所述4个框架区由三个互补决定区(⑶R)(也称高变区)连接。FR使每个链中的⑶R近距离地聚集在一起，所述⑶R与另一条链的CDR—起促成抗体的抗原结合部位的形成。至少有两种用于确定CDR的技术(I) 基于跨物种序列变异性的方法(即Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest,(第 5 版，1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.));和(2)基于对抗原-抗体复合体的晶体学研究的方法(ΑΙ-lazikani等，(1997) J. Molec. Biol. 273 927-948)。此外，在本领域中有时使用这两种方法的组合来确定⑶R。
术语“载体”是指能够在宿主细胞中传递、优选表达一种或多种所感兴趣的基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝缩剂(cationic condensing agent)联结的DNA或RNA表达载体、包裹在脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核生物细胞(例如产病毒细胞(producer cell))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，用来指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是链状或分枝状，可以包含经修饰的氨基酸，并且可以由非氨基酸中断。该术语还涵盖经天然修饰或干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键的形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰(例如与标记成分偶联)。本定义还包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其他修饰的多肽。应了解的是，因为本发明的多肽以抗体为基础，在某些实施方式中，该多肽可以作为单个的链或联结的链出现。
在述及两个以上核酸或多肽时，术语“同一的”或百分比“同一性”是指在进行比较和比对(如有必要则引入空位)以获得最大对应时，两个以上的序列或子序列相同或具有特定比例的相同核苷酸或氨基酸残基，且未将任何保守性氨基酸取代考虑为序列同一性的一部分。使用序列比较软件或算法或者通过目视检查，可以测量百分比同一性。可以用来获得对氨基酸或核苷酸序列的比对的各种算法和软件在本领域中是已知的。序列比对算法的一个这种非限制性实例是在Karlin等，1990，Proc. Natl. Acad. Sci,87 =2264-2268 中描述的算法，并在 Karlin 等，1993，Proc. Natl. Acad. Sci,90 :5873-5877 中对其进行了修改，且整合到了 NBLAST 和 XBLAST 程序中(Altschul 等，1991，Nucleic Acids Res. ,25 3389-3402)。在某些实施方式中，可以使用在 Altschul 等，1997, Nucleic Acids Res., 25 :3389-3402 中所描述的空位 BLAST (Gapped BLAST)。BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul 等，1996, Methods in Enzymology, 266 :460-480)、ALIGN、ALIGN-2 (G enentech, South San Francisco, California)或Megalign (DNASTAR)是能够用来进行序列比对的其他公用软件程序。在某些实施方式中，使用GCG软件中的GAP程序(例如，使用NWSgapdna. CMP矩阵， 且空位权重为40、50、60、70或90，长度权重为1、2、3、4、5或6)来确定两个核苷酸序列间的百分比同一'I"生。在某些替代性实施方式中，可以使用整合有Needleman和Wnsch的算法 (J. Mol. Biol. (48) =444-453(1970))的GCG软件包中的GAP程序来确定两个氨基酸序列间的百分比同一性(例如，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，且空位权重为16、14、12、 10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5)。作为另一种选择，在某些实施方式中，使用Myers和 Miller算法(CABI0S，4 :11-17 (1989))来确定核苷酸或氨基酸序列间的百分比同一性。举例而言，可以使用ALIGN程序(2. O版)来确定百分比同一性，其中使用带残基表的PAM120， 且空位长度罚分为12，空位罚分为4。本领域技术人员能够确定适合的参数来获得特定比对软件的最大比对。在某些实施方式中，使用比对软件的缺省参数。在某些实施方式中，第一氨基酸序列相对于第二序列氨基酸的百分比同一性“X”用IOOX (Y/Z)计算，其中Y是在第一和第二序列的比对(通过目视检查或特定序列比对程序所做的比对)中评分为相同匹配的氨基酸残基数，而Z是第二序列中的残基总数。如果第一序列的长度长于第二序列，则第一序列相对于第二序列的百分比同一性将长于第二序列相对于第一序列的百分比同一性。
作为非限制性的实例，在某些实施方式中，使用Bestfit程序(Wisconsin SequenceAnalysis Package,版本 8(用于 Unix 平台)，Genetics Computer Group,UniversityResearch Park, 575 Science Drive,Madison, WI 53711)能够确定任何特定的多核苷酸是否具有相对于参照序列的某个百分比的序列同一性(例如，至少80%同一性、 至少85%同一性、至少90%同一性、以及在一些实施方式中至少95%、96%、97%、98%或 99% 同一性)。Bestfit 使用 Smith 和 Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489(1981)的局部同源性算法来发现两个序列间的最佳同源性片段。当使用Bestfit 或任何其他序列比对程序来确定特定序列与本发明的参照序列是否具有例如95%同一性时，对参数进行设置从而使得基于参照核苷酸序列的全长来计算同一性的百分比，并且允许同源性中的空位最多为参照序列中核苷酸总数的5%。
在一些实施方式中，本发明的两种核酸或多肽基本一致，即在进行比较和比对以获得最大对应时，通过用序列比较算法或目视检查来测量的其核苷酸或氨基酸残基同一性为至少70 %、至少75 %、优选至少80 %、更优选至少85 %、进一步优选至少90 %以及在一些实施方式中为至少95%、96%、97%、98%、99%。优选的是，同一性存在于长度至少为约10 个残基、优选为约20个残基、更优选为约40 60个残基或其间任何整数值的序列区域，优选存在于长于60 80个残基的区域，更优选为至少约90 100个残基的区域，并且最优选为与所对比的序列全长基本相同的序列(例如核苷酸序列的编码区)。
“保守性氨基酸取代”是用具有相似侧链的另一氨基酸残基置换某个氨基酸残基的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已有界定，其包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。举例而言，用苯丙氨酸取代酪氨酸是保守性取代。优选的是，本发明的多肽和抗体序列中的保守性取代并不会使含有该氨基酸序列的多肽或抗体与抗原(即，该多肽或抗体所结合的一种或多种人类卷曲受体)的结合消失。鉴定不会消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守性取代的方法已为本领域所公知(参见例如Brummell等，Biochem. 32 :1180-1187(1993)； Kobayashi 等，Protein Eng. 12(10) :879-884 (1999)；和 Burks 等，Proc. Natl. Acad. Sci USA 94 . 412-417(1997))。
如在本公开和权利要求中所用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、 “一个”和“一种”包括复数形式。
应了解的是，在本文中用词语“包括”来描述实施方式的任何情况下，还提供了用 “由…组成”和/或“基本由…组成”描述的其他类似的实施方式。
本文中在诸如“A和/或B”等短语中使用的术语“和/或”意在包括“A和B”、“A 或B”、“A”和“B”。同样地，在诸如“A、B和/或C”等短语中使用的术语“和/或”意在涵盖每种下述实施方式:A、B和C ;A、B或C ;A或C ;A或B ;B或C ;A和C ;A和B ;B和C ;仅A ; 仅B ;以及仅C。
“高严谨度条件”可以通过以下条件来确定(1)采用低离子强度和高温度来洗涤，例如O. 015M氯化钠/0. 0015M柠檬酸纳/0.1 %十二烷基硫酸钠，50°C ； (2)在杂交过程中采用变性剂(例如甲酰胺)，例如含0.1%牛血清白蛋白的50% (体积/体积)甲酰胺 /0. 1%聚蔗糖(Ficoll)A). 1%聚乙烯吡咯烷酮/含750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠的50mM磷酸纳缓冲液(ρΗ6· 5),42°C ;或(3)于 42°C采用 50% 甲酰胺、5XSSC(O. 75MNaCl，O. 075M 柠檬酸钠)、50mM磷酸纳(pH6. 8)、0. 1%焦磷酸钠、5XDenhardt溶液、经超声处理的鲑鱼精子DNA (50 μ g/ml)、O. 1% SDS和10%硫酸葡聚糖，并且于42 °C进行洗涤，于55 °C置于O.2 XSSC (氯化钠/柠檬酸钠)和50%甲酰胺中，随后于55 °C进行由含有EDTA的O.1XSSC 组成的高严谨度洗涤。
I1. FZD结合药剂
本发明提供与一种或多种人类卷曲受体(FZD)特异性地结合的药剂。在本文中将这些药剂称为“FZD结合药剂”。在某些实施方式中，所述药剂特异性地结合两种、三种、 四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种卷曲受体。所述药剂所结合的人类卷曲受体可以选自由 FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9 和 FZDlO 组成的组。在某些实施方式中，所述一种或多种人类卷曲受体包括FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。在某些实施方式中，所述一种或多种人类卷曲受体包括FZD7。在某些实施方式中，所述一种或多种人类卷曲受体包括FZD5和/或FZD8。在某些实施方式中，所述药剂特异性地结合 FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8。FZDl FZDlO的全长氨基酸(aa)和核苷酸(nt)序列在本领域中已知，并且还在本文中提供为SEQ ID NO 26 (FZDI aa)、SEQ ID NO 30(FZD2 aa)、 SEQ ID NO 34(FZD3 aa)、SEQ ID NO 38(FZD4 aa)、SEQ ID NO 42 (FZD5 aa)、SEQ ID NO: 46(FZD6aa)、SEQ ID NO 50(FZD7 aa) ,SEQ ID NO 54(FZD8 aa) ,SEQ ID NO 58(FZD9 aa)、 SEQ ID NO 62(FZD10 aa)、SEQ ID NO 29 (FZD I nt)、SEQ ID NO 33(FZD2 nt)、SEQID NO: 37 (FZD3 nt)、SEQ ID NO 41(FZD4 nt),SEQ ID NO 45(FZD5 nt),SEQ IDNO 49 (FZD6 nt)、 SEQ ID NO 53(FZD7 nt) ,SEQ ID NO 57(FZD8 nt) ,SEQ ID NO 61(FZD9 nt)和 SEQ ID NO: 65(FZD10 nt)。
在某些实施方式中，本文所述的抗体或其他多肽或药剂特异性地结合FZD7。在某些实施方式中，该抗体、 多肽或药剂还可以与一种或多种其他人类卷曲受体特异性地结合或发生交叉反应。
在某些实施方式中，本文所述的抗体或其他多肽或药剂特异性地结合FZD5。在某些实施方式中，该抗体、多肽或药剂还可以与一种或多种其他人类卷曲受体特异性地结合或发生交叉反应。
在某些实施方式中，所述药剂特异性地结合两种或更多种人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述两种或更多种人类卷曲受体选自由FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组。 在某些实施方式中，所述两种或更多种人类卷曲受体包括FZDl和选自由FZD2、FZD5、FZD7 和FZD8组成的组的第二种人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述两种或更多种人类卷曲受体包括FZD2和选自由FZD1、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的第二种卷曲受体。在某些实施方式中，所述两种或更多种人类卷曲受体包括FZD5和选自由FZD1、FZD2、FZD7和FZD8组成的组的第二种卷曲受体。在某些实施方式中，所述两种或更多种人类卷曲受体包括FZD5 和FZD8。在某些实施方式中，所述两种或更多种人类卷曲受体包括FZD7和选自由FZD1、 FZD2、FZD5和FZD8组成的组的第二种人类卷曲受体。
在某些实施方式中，所述药剂特异性地结合三种或更多种人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述三种或更多种人类卷曲受体包括选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的三种或更多种卷曲受体。在某些实施方式中，所述药剂还特异性地结合一种或多种其他人类卷曲受体。
在某些实施方式中，所述药剂或抗体特异性地与其所结合的一种或多种人类卷曲受体中的细胞外结构域(ECD)结合。每种人类卷曲受体的细胞外结构域的序列在本领域中已知，且还将其提供为 SEQ ID NO 27 (FZD I ECD)、SEQ ID NO 31(FZD2 ECD)、SEQ ID NO: 35 (FZD3 ECD)、SEQ ID NO 39(FZD4 ECD)、SEQ ID NO :43 (FZD5ECD)、SEQ ID NO 47(FZD6 ECD)、SEQ ID NO 51(FZD7 ECD)、SEQ ID NO :55 (FZD8ECD)、SEQ ID NO 59(FZD9 ECD)和 SEQ ID NO 63(FZD10 ECD)。
在某些实施方式中，所述药剂或抗体特异性地与其所结合的人类卷曲受体中的 Fri结构域(FRI)(亦称富含半胱氨酸的结构域(CRD))结合。每种人类卷曲受体的Fri结构域的序列在本领域中已知，且还将其提供为SEQ ID NO 28 (FZDI FRI)、SEQ IDNO 32(FZD2 FRI)、SEQ ID NO 36(FZD3 FRI)、SEQ ID NO 40 (FZD4 FRI)、SEQ IDNO :44 (FZD5 FRI)、SEQ ID NO 48 (FZD6 FRI)、SEQ ID NO 52(FZD7 FRI)、SEQ IDNO 56(FZD8 FRI)、SEQ ID NO: 60 (FZD9 FRI)和 SEQ ID NO 64 (FZD10 FRI)。
在某些实施方式中，本文所述的FZD结合抗体或多肽的单个抗原结合部位结合或能够结合一种、两种、三种、四种或五种(或更多种)人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述FZD结合抗体或多肽的单个抗原结合部位能够特异性地结合选自由FZDl、FZD2、FZD5、 FZD7和FZD8组成的组一种、两种、三种、四种或五种人类卷曲受体。在某些实施方式中，所述抗体或多肽的单个结合部位特异性地结合至少FZD5和FZD8。
在某些实施方式中，所述FZD结合药剂或抗体结合一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种或四种或更 多种)人类卷曲受体，且其解离常数(Kd)为约IyM或更低、 约IOOnM或更低、约40nM或更低、约20nM或更低或者约IOnM或更低。举例而言，在某些实施方式中，本文所述的与一种或多种FZD结合的FZD结合药剂或抗体，与这些FZD结合的Kd 为约IOOnM或更低、约20nM或更低或者约IOnM或更低。在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体与FZDU FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的一种或多种(例如，1、2、3、4或5种)的每一种结合的解离常数为约40nM或更低。在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体与FZDl、 FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的一种或多种的每一种结合的解离常数为约IOnM或更低。在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的每一种结合的解离常数为约IOnM或更低。在某些实施方式中，所述药剂或抗体与特定FZD结合的解离常数是通过使用固定在Biacore芯片上的FZD-Fc融合蛋白而确定的解离常数，所述融合蛋白含有FZD细胞外结构域或Fri结构域。
在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体结合一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种)人类卷曲受体，且其EC5tl为约I μ M或更低、约IOOnM或更低、 约40ηΜ或更低、约20ηΜ或更低、约IOnM或更低或者约InM或更低。举例而言，在某些实施方式中，本文所述的与多于一种FZD结合的FZD结合药剂或抗体相对于这些FZD的EC5tl为约40ηΜ或更低、约20ηΜ或更低或者约IOnM或更低。在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体相对于FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的一种或多种(例如，1、2、3、4或5种)的EC50 为约20nM或更低。在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体相对于FZD1、FZD2、FZD5、FZD7 和FZD8中的一种或多种(例如，1、2、3、4或5种)的EC50为约IOnM或更低。在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体对于结合FZD5和/或FZD8的EC5tl为约40nM或更低或者20nM或更低。
在某些实施方式中，FZD结合药剂(例如抗体)与下述表位结合所述表位与具有包含SEQ ID NO 10的重链可变区和包含SEQ ID NO : 12或SEQ ID NO 14的轻链可变区的抗体(例如，18R5或18R8IgG抗体)的表位相同或重叠。在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体与下述表位结合所述表位与具有包含SEQ ID NO: 11的重链和包含SEQ ID NO 13 或SEQ ID NO :15的轻链的抗体的表位相同或重叠。在某些实施方式中，FZD结合药剂与下述表位结合所述表位与具有包含SEQ ID NO 85的重链可变区和包含SEQ ID NO 86的轻链可变区的抗体(例如,44R24 IgG抗体)的表位相同或重叠。
在某些实施方式中，在竞争性结合测定中FZD结合药剂与抗体竞争对人类卷曲受体的特异性结合，其中所述抗体具有包含SEQ ID NO :10的重链可变区和包含SEQID NO 12 或SEQ ID NO :14的轻链可变区。在某些实施方式中，FZD结合药剂与具有包含SEQ ID NO: 11的重链和包含SEQ ID N0:13或SEQ ID NO : 15的轻链的抗体竞争，以获得与人类卷曲受体的特异性结合。在某些实施方式中，与所述药剂竞争对人类卷曲受体的特异性结合的抗体是18R5IgG抗体。在某些替代性实施方式中，所述抗体是18R8 IgG抗体。
在某些实施方式中，在竞争性结合测定中FZD结合药剂与抗体竞争对人类卷曲受体的特异性结合，其中所述抗体具有包含SEQ ID NO :85的重链可变区和包含SEQID NO 86 的轻链可变区。
在某些实施方式中，所述FZD结合药剂或抗体与被本发明人命名为生物学结合部位(BBS) 的人类卷曲受体的至少一部分区域结合(图9，实施例6)。在人类FZD8 (SEQID NO 54)中，所述BBS由下述(a)、(b)和(c)组成(a)由氨基酸72 (F)、74 75 (PL)、78 (I)、 92 (Y) ,121 122 (LM)和 129 132(WPDR(SEQ ID NO :70))构成的构象表位(图 8 和图 9 中所示的BBS的“裂缝”)；(b)由序列GLEVHQ (SEQ ID NO 25)组成的FZD8的区域(图8和图9中所示的BBS的“上边缘”)；和(c)由序列YGFA(SEQ ID NO 74)组成的FZD8的区域 (图8和图9中所示的BBS的“下边缘”)。位于FZDl FZD7、FZD9和FZDlO上的BBS的相应残基在下表I和图8中示出。在某些实施方式中，阻断配体(例如Wnt)与FZD结合的药剂抑制该配体与BBS的结合。应了解的是，在某些实施方式中，与BBS的至少一部分结合的药剂还结合人类卷曲受体上的一种或多种其他区域(即，在BBS之外)。换言之，在某些实施方式中，FZD结合药剂或抗体所结合的表位是位于FZD受体细胞外结构域中与BBS重叠但并不完全包含于BBS中的区域。在某些替代性实施方式中，FZD结合药剂或抗体所结合的表位完全包含于BBS中(即，BBS包含FZD结合抗体或其他药剂所结合的整个表位)。
表1:FZD受体的生物学结合部位(BBS)。
人类卷ft 受偉 (aa序列)抅威生物学结合部位(BBS)的氨基酸残基FZDl (SEQIDNO:26)147-153 (GLEVHQF), 155456CPL), 159(￥), 173(Υ)7 201-202([Μ), 205-212(FGFQWPDT)FZD2 (SEQ JD N0:30)70-76{GLEVHQF), 78-79(PL), 82(￥), 96(Y), 124-125(LM), 128-135 (FGFQWPER)FZD3 (SEQ Π) NO:34)59-65(Af.AMEPF), 67-68{PM), 71(L), 85(Y)5 1134 W(LM)j 11.7424 (FGWWPED)FZD4 (SEQ ID NO:38)79-85(ELQf,TTF)5 87-88{PL), 91(Y), IOS(Y)5 134435(VL), 138-145(FGFAWPES)FZD5 (SEQIDNO:42)64-70(GLEVHQF), 72-73(PL), 76(1) 90fY), 119420(LM) 123-130(YGFAWPER)j FZD6 (SEQ ID NO:46)55-61(AVEMEHF), 63-64(PL), 67(1,), 81(F), 109-'I IO(IJ), 113-120(FGIRWPEE)I FZD (SEQ ID N0:50)80-86(GLEVHQF), 88~89(PL), 92(V) 106(Y), I34-135(LM), 138-145(FGFQWPER )1-ZD8 (SEQ ID NO:54)66^72{GLEVHQF), 74-75(PL), 78(1), 92(Y), 121-122(LM), and 125-132(YGFAWPDR)FZD9 (SEQ ID NO58)70-76(AABLAEF), 78-79(PL), 82(Y), 96(Y), I25~126(IM)S 129-136(FNFGWPDS)FZDlO (SEQ ID NO:62)65.-71(AIQLHEF), 73-74(PL), 91 (Y)3 120-121(服)，124-Ol(FNFKWPDS)
并非受理论束缚,据信BBS含有可能的配体结合部位，例如结合Wnt的部位。在 FZD8上，所述可能的配体结合部位包含由氨基酸72 (F), 74 75 (PL), 78 (I)、92 (Y)、121 122 (LM)和129 132(WPDR(SEQ ID NO :70))构成的构象表位(图8和图9中所示的BBS 的“裂缝”)。所述可能的配体结合部位在FZDl FZD7、FZD9和FZDlO上的相应残基在图 8的序列比对中示出。在某些实施方式中，阻断配体(例如Wnt)与BBS结合的药剂抑制该配体与所述构象表位的结合。应了解的是，在某些实施方式中，与该配体结合部位的至少一部分结合的药剂还结合人类卷曲受体上的其他区域(例如，在BBS之外的区域)。在某些替代性实施方式中，所述药剂不与FZD的所述构象表位之外的任何部分结合。
在某些实施方式中，如果所述人类卷曲受体为FZD8，则所述药剂与人类卷曲受体中的序列QDEAGLEVHQFWPL (SEQ ID NO :67)的至少一部分结合，或如果所述人类卷曲受体为FZDl FZD7、FZD9或FZD10，则所述药剂与对应序列的至少一部分结合。位于FZD上的该区域包含图8和图9中所示的BBS的“上边缘”。在各种卷曲受体中与FZD8的表位 QDEAGLEVHQFWPL (SEQ ID NO :67)对应的序列在下表2中示出，并且从图8的比对中也明显可见。在某些实施方式中，所述药剂特异性地结合选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的人类卷曲受体，并且所述药剂与人类卷曲受体中的序列Q (DE/ED) AGLEVHQF (Y/W) PL(SEQ ID NO :24)的至少一部分结合。在某些实施方式中，所述药剂与人类卷曲受体FZD1、 FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8中的序列AGLEVHQF (SEQ ID NO :68)的至少一部分特异性地结合。在某些实施方式中，所述药剂与FZD3、FZD4、FZD6、FZD9和/或FZDlO中的与FZD8 的序列AGLEVHQF (SEQ ID NO :68)对应的序列的至少一部分结合。在某些实施方式中，所述药剂与人类卷曲受体FZDl、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8中的序列GLEVHQ (SEQ ID NO 25)的至少一部分特异性地结合。该序列是图9中所示的BBS的“上边缘”。在某些实施方式中，所述药剂与FZD3、FZD4、FZD6、FZD9和/或FZDlO中的与FZD8中的序列GLEVHQ (SEQ ID NO 25)对应的序列 的至少一部分结合。与FZD8的序列GLEVHQ(SEQ ID NO 25)对应的序列在下表2的第二列和第三列中用下划线标出，并且从图8的序列比对中明显可见。在某些实施方式中，与FZD8中的SEQ ID N0:67或SEQ ID NO :68的至少一部分结合的药剂或者与其他FZD中的对应表位结合的药剂抑制配体(例如Wnt)与FZD (例如，与FZD的BBS) 的结合。在某些实施方式中，与上文指出的区域结合的药剂还可以结合人类卷曲受体上的额外的其他(即，在上文指明的区域之外的)区域。
表2 :人类卷曲受体上的对应区域。
权利要求
1.一种特异性地结合人类卷曲受体的药剂，所述人类卷曲受体选自由FZD1、FZD2、 FZD5、FZD7和FZD8组成的组，其中，所述药剂(a)与所述人类卷曲受体中的序列Q(DE/ED)AGLEVHQF(Y/W)PL(SEQID NO :24)的至少一部分结合；和/或(b)与所述人类卷曲受体中的序列(K/Q)(F/Y)GF(Q/A) (SEQ ID NO :69)的至少一部分彡口口
2.如权利要求1所述的药剂，所述药剂特异性地结合选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和 FZD8组成的组的多于一种的人类卷曲受体。
3.如权利要求1或2所述的药剂，所述药剂与所述人类卷曲受体中的序列GLEVHQ(SEQ ID NO 25)的至少一部分结合。
4.如权利要求2或3所述的药剂，其中，所述药剂所结合的所述人类卷曲受体包括 FZD5 和 FZD8。
5.一种在竞争性结合测定中与抗体竞争对人类FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8 的特异性结合的药剂，其中，所述抗体具有包含SEQ ID NO : 10的重链可变区和包含SEQ ID NO : 12或SEQ ID NO 14的轻链可变区。
6.一种在竞争性结合测定中与抗体竞争对人类FZD5和/或FZD8的特异性结合的药剂，其中，所述抗体具有包含SEQ ID NO :85的重链可变区和包含SEQ ID N0:86的轻链可变区。
7.一种特异性地结合人类FZD8的药剂，其中，所述药剂(a)与FZD8中的序列GLEVHQ(SEQID NO 25)的至少一部分结合；和/或(b)与FZD8中的序列QYGFA(SEQID NO 66)的至少一部分结合。
8.如权利要求7所述的药剂，所述药剂还特异性地结合人类FZD1、FZD2、FZD5和/或 FZD7。
9.一种特异性地结合三种或多于三种人类卷曲受体的药剂，其中，所述三种或多于三种人类卷曲受体包括FZDl、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。
10.如权利要求9所述的药剂，其中，所述三种或多于三种人类卷曲受体还包括FZD3、 FZD4、FZD6、FZD9 和 / 或 FZDlO。
11.如权利要求9或10所述的药剂，其中，所述三种或多于三种人类受体包括FZD5和 FZD8。
12.如权利要求11所述的药剂，其中，所述三种或多于三种人类卷曲受体包括FZD1、 FZD2、FZD5、FZD7 和 FZD8。
13.一种特异性地结合人类卷曲受体的药剂，其中，所述药剂与所述人类卷曲受体中的生物学结合部位(BBS)的至少一部分结合。
14.如权利要求13所述的药剂，其中，所述人类卷曲受体是FZD8，并且所述药剂与下述(a)、(b)和/或(c)的至少一部分结合(a)由氨基酸72(F)、74 75 (PL) ,78(1) ,92 (Y) ,121 122 (LM)和 129 132 (WPDR) 构成的构象表位；(b)由序列QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID NO :67)组成的区域；(c)由序列QYGFA(SEQID NO 66)组成的区域。
15.一种特异性地结合人类卷曲受体的药剂，其中(a)如果所述人类卷曲受体是FZD8，所述药剂与FZD8的由序列QDEAGLEVHQFWPL(SEQ ID NO 67)组成的区域的至少一部分结合；和(b)如果所述人类卷曲受体是FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD9 或 FZDIO， 所述药剂与所述人类卷曲受体的一个区域的至少一部分结合，所述区域与FZD8的由序列 QDEAGLEVHQFWPL (SEQ ID NO :67)组成的区域对应。
16.如权利要求15所述的药剂，其中(a)如果所述人类卷曲受体是FZD8，所述药剂还与FZD8的由序列QYGFA(SEQIDNO :66) 组成的区域的至少一部分结合；和(b)如果所述人类卷曲受体是FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD9 或 FZDIO， 所述药剂还与所述人类卷曲受体的一个区域的至少一部分结合，所述区域与FZD8的由序列QYGFA(SEQ ID NO 66)组成的区域对应。
17.一种特异性地结合人类卷曲受体的药剂，其中(a)如果所述人类卷曲受体是FZD8，所述药剂与FZD8的由序列QYGFA(SEQ IDNO 66) 组成的区域的至少一部分结合；和(b)如果所述人类卷曲受体是FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD9 或 FZDIO， 所述药剂与所述人类卷曲受体的对应于FZD8的所述区域的区域的至少一部分结合。
18.如权利要求13或15 17中任一项所述的药剂，其中，所述人类卷曲受体选自由 FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8及其组合组成的组。
19.如权利要求13 18中任一项所述的药剂，所述药剂特异性地结合至少两种人类卷曲受体。
20.如权利要求19所述的药剂，其中，所述至少两种人类卷曲受体中的每一种选自由 FZD1、FZD2、FZD5、FZD7 和 FZD8 组成的组。
21.如权利要求20所述的药剂，其中，所述至少两种人类卷曲受体包括FZD5和FZD8。
22.如权利要求19或21所述的药剂，所述药剂特异性地结合至少三种人类卷曲受体。
23.如权利要求22所述的药剂，其中，所述至少三种人类卷曲受体中的每一种选自由 FZD1、FZD2、FZD5、FZD7 和 FZD8 组成的组。
24.如权利要求1 23中任一项所述的药剂,所述药剂不是抗体。
25.如权利要求1 23中任一项所述的药剂，所述药剂是抗体。
26.如权利要求25所述的药剂，所述药剂包含与所述人类卷曲受体特异性地结合的抗原结合部位。
27.一种与选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的人类卷曲受体特异性地结合的抗体，其中，所述抗体具有重链可变区，所述重链可变区包含(a)重链CDR1，所述重链CDRl包含GFTFSHYTLS(SEQID NO 1)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体；重链CDR2，所述重链CDR2包含VIS⑶GSYTYYADSVKG(SEQ ID NO :2)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体；和重链⑶R3，所述重链⑶R3包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO 3)或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体；和/或(b)轻链CDR1，所述轻链 CDRl 包含S⑶KLGKKYAS(SEQ ID NO 4)或 S⑶NIGSFYVH(SEQ ID NO :7)，或者SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :7的具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；轻链 CDR2，所述轻链 CDR2 包含EKDNRPSG(SEQID NO :5)或 DKSNRPSG (SEQ ID NO 8), 或者SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 8的具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和轻链 CDR3，所述轻链CDR3包含SSFAGNSLE(SEQ ID NO :6)或QSYANTLSL (SEQ ID NO :9)，或者 SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 9的具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体。
28.一种与选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的人类卷曲受体特异性地结合的抗体，其中，所述抗体具有(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO :1)的重链 CDR1、包含 VIS⑶GSYTYYADSVKG(SEQ ID NO 2)的重链 CDR2 和包含 NFIKYVFAN(SEQ IDNO 3)的重链 CDR3 ;和 / 或(b)包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO 7)的轻链 CDRl、包含 DKSNRPSG (SEQ IDNO 8)的轻链 CDR2 和包含 QSYANTLSL (SEQ ID NO :9)的轻链 CDR3。
29.一种与选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的人类卷曲受体特异性地结合的抗体，其中，所述抗体具有(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO 1)的重链 CDR1、包含 VIS⑶GSYTYYADSVKG(SEQ ID NO 2)的重链 CDR2 和包含 NFIKYVFAN(SEQ IDNO 3)的重链 CDR3 ;和 / 或(b)包含SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO 4)的轻链 CDR1、包含 EKDNRPSG(SEQID NO 5)的轻链 CDR2 和包含 SSFAGNSLE (SEQ ID NO 6)的轻链 CDR3。
30.一种与选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的人类卷曲受体特异性地结合的多肽，其中，所述多肽含有(a)与SEQID NO 10具有至少约80%的序列同一性的多肽；和/或(b)与SEQID N0:12或SEQ ID NO :14具有至少约80%的序列同一性的多肽。
31.一种与选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8组成的组的人类卷曲受体特异性地结合的多肽，其中，所述多肽含有(a)具有SEQID NO 10的氨基酸序列的多肽；和/或(b)具有SEQID NO : 12或SEQ ID NO 14的氨基酸序列的多肽。
32.如权利要求30或31所述的多肽，所述多肽是抗体。
33.如权利要求27 32中任一项所述的抗体或多肽，所述抗体或多肽特异性地结合 FZD5 和 FZD8。
34.如权利要求33所述的抗体或多肽，所述抗体或多肽特异性地结合人类FZD1、FZD2、 FZD5、FZD7 和 FZD8。
35.一种特异性地结合人类FZD5和/或FZD8的抗体，其中，所述抗体具有(a)重链CDRl，所述重链 CDRl 包含 GFTFSSYYIT (SEQ ID NO 77)或其具有 1、2、3 或 4 个保守性氨基酸取代的变体；重链⑶R2，所述重链⑶R2包含TISYSSSNTYYADSVKG(SEQ ID NO :78)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和重链⑶R3，所述重链⑶R3包含 SIVFDY (SEQ ID NO 79)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或(b)轻链CDRl，所述轻链 CDRl 包含 SGDALGNRYVY(SEQ ID NO 80)或其具有 1、2、3 或 4 个保守性氨基酸取代的变体；轻链⑶R2，所述轻链⑶R2包含SG(SEQID NO :81)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和轻链⑶R3，所述轻链⑶R3包含GSWDTRPYPKY (SEQ ID NO 82)或其具有1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体。
36.一种特异性地结合人类FZD5和/或FZD8的抗体，其中，所述抗体具有(a)包含GFTFSSYYIT (SEQ ID NO :77)的重链 CDR1、包含 TISYSSSNTYYADSVKG(SEQ ID NO 78)的重链 CDR2 和包含 SIVFDY (SEQ IDNO :79)的重链 CDR3 ;和 / 或(b)包含SGDALGNRYVY (SEQ ID NO :80)的轻链 CDRl、包含 SG (SEQ ID NO :81)的轻链 CDR2 和包含 GSWDTRPYPKY (SEQ ID NO :82)的轻链 CDR3。
37.一种特异性地结合FZD5和/或FZD8的多肽，其中，所述多肽含有(a)与SEQID NO 85具有至少约80%同一性的多肽；和/或(b)与SEQID NO :86具有至少约80%同一性的多肽。
38.一种特异性地结合FZD5和/或FZD8的多肽，其中，所述多肽包含(a)具有SEQID NO 85的氨基酸序列的多肽；和/或(b)具有SEQID NO 86的氨基酸序列的多肽。
39.如权利要求37或38所述的多肽，所述多肽是抗体。
40.一种与 18R8、18R5、18R4605 或 18R4805 竞争对人类 FZD1、FZD2、FZD5、FZD7 和 / 或 FZD8的特异性结合的抗体。
41.一种与44R24竞争对人类FZD5和/或FZD8的特异性结合的抗体。
42.如权利要求1 41中任一项所述的药剂、抗体或多肽，所述药剂、抗体或多肽是所述人类卷曲受体的拮抗剂。
43.如权利要求1 42中任一项所述的药剂、抗体或多肽，所述药剂、抗体或多肽是 IgGl或IgG2抗体。
44.如权利要求]体片段。
45.如权利要求]克隆抗体。
46.如权利要求1 类抗体。
47.如权利要求]源化抗体。
48.如权利要求1 47中任一项所述的药剂、多肽或抗体，所述药剂、多肽或抗体抑制 Wnt与所述人类卷曲受体的结合。
49.如权利要求1 48中任一项所述的药剂、多肽或抗体，所述药剂、多肽或抗体抑制经典Wnt信号传导。
50.如权利要求1 49中任一项所述的药剂、多肽或抗体，所述药剂、多肽或抗体抑制肿瘤生长。
51.如权利要求1 50中任一项所述的药剂、多肽或抗体，所述药剂、多肽或抗体结合所述人类卷曲受体的细胞外结构域。
52.如权利要求51所述的药剂、多肽或抗体，所述药 剂、多肽或抗体结合所述人类卷曲受体的Fri结构域。
53.如权利要求1 52中任一项所述的药剂、多肽 或抗体， 所述药剂、多肽或抗体以约 IOOnM或更低的Kd与所述人类卷曲受体结合。
54.一种由质粒的序列编码的抗体，所述质粒保藏于 且保藏号为PTA-9540或42中任一项所述的药剂、抗体或多肽，所述药剂、抗体或多肽是抗 43中任一项所述的药剂、抗体或多肽，所述药剂、抗体或多肽是单 43中任一项所述的药剂、抗体或多肽，所述药剂、抗体或多肽是人 43中任一项所述的药剂、抗体或多肽，所述药剂、抗体或多肽是人PTA-9541。
55.如权利要求1 54中任一项所述的药剂、多肽或抗体，所述药剂、多肽或抗体是分离的药剂、多肽或抗体。
56.如权利要求55所述的药剂、多肽或抗体，所述药剂、多肽或抗体是基本纯净的药剂、多肽或抗体。
57.一种分离的细胞，所述细胞产生权利要求1 54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
58.一种药物组合物，所述药物组合物包含制药上可接受的载质和权利要求1 54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
59.一种药物组合物，所述药物组合物包含第二抗癌药剂和权利要求1 54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
60.一种试剂盒,所述试剂盒包含第二抗癌药剂和权利要求1 54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
61.—种抑制细胞中的经典Wnt信号传导的方法,所述方法包括用权利要求1 54中任一项所述的药剂、多肽或抗体接触所述细胞。
62.如权利要求61所述的方法，其中，所述细胞是肿瘤细胞。
63.一种抑制受试者的肿瘤生长的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的权利要求1 54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
64.一种减小受试者的含有癌干细胞的肿瘤的致瘤性的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的权利要求1 54中任一项所述的药剂、多肽或抗体，其中所述肿瘤中癌干细胞的频率通过施用所述药剂、多肽或抗体而减小。
65.一种诱使受试者的肿瘤中的细胞分化的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的权利要求1 54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
66.如权利要求65所述的方法，其中，所述肿瘤是胰腺肿瘤或结肠肿瘤。
67.如权利要求62 65中任一项所述的方法,其中，所述肿瘤是选自由结肠直肠肿瘤、 胰腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、胃肠肿瘤、黑色素瘤、 子宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、成胶质细胞瘤和头颈部肿瘤组成的组的肿瘤。
68.如权利要求67所述的方法，其中，所述肿瘤是结肠直肠肿瘤、乳腺肿瘤或胰腺肿瘤。
69.一种治疗受试者的癌的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的权利要求I 54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
70.如权利要求69所述的方法，其中，所述癌是选自由结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑色素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤和头颈部癌组成的组的癌。
71.如权利要求70所述的方法，其中，所述癌是结肠直肠癌、乳腺癌或胰腺癌。
72.如权利要求63 71中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述受试者施用第二抗癌药剂。
73.如权利要求72所述的方法，其中，所述第二抗癌药剂是化疗剂。
74.如权利要求73所述的方法，其中，所述化疗剂是抗代谢物。
75.如权利要求74所述的方法，其中，所述化疗剂是吉西他滨。
76.如权利要求72所述的方法，其中，所述化疗剂是拓扑异构酶抑制剂。
77.如权利要求76所述的方法，其中，所述化疗剂是依立替康。
78.如权利要求72所述的方法，其中，所述化疗剂是抗有丝分裂剂。
79.如权利要求78所述的方法，其中，所述药剂包括紫杉烷类化合物。
80.如权利要求79所述的方法，其中，所述紫杉烷类化合物是紫杉醇。
81.如权利要求72所述的方法，其中，所述第二抗癌药剂是血管发生抑制剂。
82.如权利要求81所述的方法，其中，所述血管发生抑制剂是抗VEGF的抗体。
83.如权利要求72所述的方法，其中，所述第二抗癌药剂是Notch信号传导的抑制剂。
84.如权利要求83所述的方法，其中，所述Notch信号传导的抑制剂是抗Notch的抗体或抗DLL4的抗体。
85.一种治疗受试者的疾病的方法，其中，所述疾病与Wnt信号传导的活化有关，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的权利要求1 54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
86.如权利要求85所述的方法，其中，所述Wnt信号传导是经典Wnt信号传导。
87.一种治疗受试者的病症的方法，其中，所述病症的特征是干细胞和/或祖细胞的水平升高，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的权利要求1 54中任一项所述的药剂、多肽或抗体。
88.如权利要求63 87中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。
89.一种分离的多肽，所述多肽包含选自由SEQ ID NO: 10 15和SEQ ID N0:85 86 组成的组的序列。
90.一种分离的多核苷酸,所述多核苷酸包含编码权利要求89所述的多肽的多核苷酸。
91.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自由SEQ ID N0:17 22、87 90、92 和94 95组成的组的序列。
92.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含在高严谨度条件下与下述(a)或(b)杂交的多核苷酸(a)选自由SEQID吣17、19、21、87 90、92和94 95组成的组的多核苷酸；(b)编码选自由序列SEQID NO: 10、12、14和85 86组成的组的多肽的多核苷酸。
93.—种载体,所述载体包含权利要求90 92中任一项所述的多核苷酸。
94.一种分离的细胞，所述细胞包含权利要求90 92中任一项所述的多核苷酸。
95.一种筛选具有抗癌干细胞活性的药剂的方法，所述方法包括将第一实体瘤中的一种或更多种分化标记物的水平与第二实体瘤中的一种或更多种分化标记物的水平进行比较，所述第一实体瘤已暴露于所述药剂，所述第二实体瘤未暴露于所述药剂。
96.一种筛选具有抗癌干细胞活性的药剂的方法，所述方法包括(a)使第一实体瘤暴露于所述药剂，而第二实体瘤不暴露于所述药剂；(b)评估所述第一实体瘤和第二实体瘤中的一种或更多种分化标记物的水平；和 (C)比较所述第一实体瘤和第二实体瘤中的所述一种或更多种分化标记物的水平。
97.如权利要求95或96所述的方法，其中，所述药剂特异性地结合一种或更多种人类卷曲受体。
98.如权利要求95或96所述的方法，其中，所述第一实体瘤中的一种或更多种分化标记物的水平相对于第二实体瘤的升高表明了抗实体瘤干细胞效用。
99.如权利要求95或96所述的方法，其中，所述实体瘤是胰腺肿瘤。
100.如权利要求99所述的方法，其中，所述一种或更多种分化标记物包括(a)—种或更多种粘液素或(b)嗜铬粒蛋白A(CHGA)。
101.如权利要求100所述的方法，其中，所述一种或更多种分化标记物包括粘液素 16(Muc 16)。
102.如权利要求95或96所述的方法，其中，所述实体瘤是结肠肿瘤。
103.如权利要求102所述的方法，其中，所述一种或更多种分化标记物包括细胞角蛋白7。
104.如权利要求95或96所述的方法，其中，所述药剂是特异性地结合一种或更多种人类卷曲受体的抗体。
105.一种减少实体瘤基质中的成肌纤维细胞活化的方法，所述方法包括用有效量的权利要求I 54中任一项所述的药剂、多肽或抗体接触所述基质。
106.一种诱使肿瘤中的细胞分化的方法，所述方法包括用有效量的抗体接触所述肿瘤，所述抗体与人类卷曲受体特异性地结合并且是所述人类卷曲受体的拮抗剂。
107.一种减少实体瘤基质中的成肌纤维细胞活化的方法，所述方法包括用有效量的抗体接触所述基质，所述抗体与人类卷曲受体特异性地结合并且是所述人类卷曲受体的拮抗剂。
全文摘要
本发明提供了与人类卷曲受体结合的新型抗癌药剂，所述药剂包括但不限于抗体。还鉴定了人类卷曲受体中的适合作为抗癌药剂靶标的新型表位。另外还提供了使用所述药剂或抗体的方法，例如使用所述药剂或抗体来抑制Wnt信号传导和/或抑制肿瘤生长的方法。
文档编号A61K39/395GK103002911SQ200980147347
公开日2013年3月27日 申请日期2009年9月28日 优先权日2008年9月26日
发明者奥斯丁·L·格尼, 阿龙·肯·萨拓, 富米考·塔卡达·阿克塞尔罗德, 蒂莫西·查尔斯·霍伊, 桑吉维·H·萨蒂亚尔, 萨蒂亚吉特·苏伊特·库马尔·米特拉 申请人:昂考梅德药品有限公司