专利名称：修饰的淀粉状蛋白β肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及增强淀粉状蛋白β (下文中称为Αβ)肽的免疫应答诱发能力的方法。 更具体地，本发明涉及用于预防和治疗阿尔茨海默病的药物，其包含来源于阿尔茨海默病的致病因子A β的肽或其部分，其中加入或插入半胱氨酸或其类似物。
背景技术：
阿尔茨海默病是痴呆的一种并与作为主要症状的退化的认知功能和性格改变相关。随着老年人口的增长，阿尔茨海默病患者的数目持续增加。预计在日本、美国和欧洲的患者数目将从2004年的560万变为2014年的730万。因此，迫切需要用于预防和治疗阿尔茨海默病的药物的早期开发。阿尔茨海默病的病理学适应症包括3种特征神经元的萎缩和/或减少，由于A β 聚集和/或沉淀导致的老年斑的形成和由于异常tau蛋白导致的神经纤维改变。阿尔茨海默病分为2个主要种类，即家族性阿尔茨海默病和孤立性阿尔茨海默病。对前者已鉴定出致病的遗传突变并发现其表型说明了大脑中淀粉状蛋白β肽，尤其是由42个氨基酸残基组成的Αβ 1-42的产生的增加是疾病的主要原因。然而，被诊断患有家族性阿尔茨海默病的患者的比例在严格意义上占总患者的1%或更少。希望尽快地阐明占患者的99%的孤立性阿尔茨海默病的致病原因。认为孤立性阿尔茨海默病是由未鉴定的遗传风险因子的复制、 隐性基因的存在、环境风险因子的存在等等导致的。目前，基于在家族性阿尔茨海默病中的遗传突变普遍具有高度聚集的A β 42的最终增加的事实，认为与家族性阿尔茨海默病经历类似病理学发展的孤立性阿尔茨海默病的主要原因可能是Αβ 42的增加。此观点被称为淀粉状蛋白假说，并且目前用于治疗的研究基于此假说进行。Αβ通过膜结合的天冬氨酸蛋白酶的切割从其前体蛋白产生。β-分泌酶切割Αβ 的N-端而Y-分泌酶切割其C-端。之后，取决于突触的活性，切割的Αβ可分泌至细胞外。Αβ迅速地自动聚集从而使单体Aβ经二聚体、三聚体和可溶性寡聚体形成前纤维结构初原纤维，其之后形成和积聚成不溶的淀粉状蛋白纤维。这已经成为主流的观点，即聚集的可溶性Αβ寡聚体对神经的负面作用在阿尔茨海默病的病理条件中起重要作用。已报导了可能阻碍神经传递的多种可溶性Αβ寡聚体形式，包括二聚体，三聚体，淀粉状球状体(53 kDa的聚集物)，Αβ 56 (56 kDa的聚集物)，长达40个氨基酸的聚集物等等。目前，广泛进行了通过Αβ (其在阿尔茨海默病的发病机制中可能发挥高度重要的作用)的清除的治疗方法，其中包括使用Αβ抗体的抗体治疗研究。认为通过抗_Αβ抗体的Αβ清除作用机制包括经抗体Fc受体的小神经胶质细胞的吞噬作用，纤维状Aβ的加速溶解或抑制聚集和抗体与血液中的Aβ的结合以加速可溶性Αβ从大脑中的排除。提议了 2种方法，即主动免疫，其中通过疫苗诱发抗_Αβ抗体和被动免疫，其中施用抗-Aβ抗体本身。对前一种方法，使用A β本身作为抗原的疫苗ΑΝ1792进展到II期临床试验，但由于6%的患者在试验中患有脑脊髓膜炎而中断试验。然而，在具有增加的抗体滴度的患者和不具有增加的抗体滴度的患者之间观察到部分高级(high-order)功能的差异(非专利参考 1)。此外，检查了在临床试验中死亡的患者的大脑，发现新皮层中的老年斑消失。另外，在施用前和后的MRI显示施用组比安慰剂组展示了较小的脑容量。由此，尽管临床试验由于不良副作用中断，这仍然证明使用Αβ本身作为抗原的疫苗是有效的。未来希望开发更安全的疫苗。认为由ΑΝ1792导致的脑脊髓膜炎是由于使用了高效力佐剂QS21和由Αβ序列本身中存在的T细胞表位引起的细胞免疫。对Αβ序列本身中存在的T细胞表位进行了大量研究，发现至少在Αβ序列N-端的第1-10位残基中存在可引起体液免疫的T细胞表位但不存在可引起细胞免疫的T细胞表位(专利参考2-4)。非专利参考1: Gilman S, Roller M, Black RS, Jenkins L 等人，NEUROLOGY, 2005; 64: pl553-1562
非专利参考 2: Michael G, Agadjanyan MG 等人，Journal of Immunology, 2005; 174: pl580-1586
非专利参考 3: Bard F, Barbour R, Cannon C, Carretto R, Fox M 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003; 100: p2023_2028
非专利参考 4: Wanga CY 等人，Vaccine, 2007; 25: p3041_3052。
发明内容
(本发明待解决的技术问题)
如上所述，担忧的是在使用全长Αβ序列和高效力佐剂例如QS21的组合的阿尔茨海默病的疫苗治疗中的不良副作用。因此，希望开发用以更安全形式的Αβ肽和更安全佐剂的组合用于预防和治疗的更安全和更有效的方法。由此，本发明的一个目的是通过设计Αβ 肽的形式提供用于阿尔茨海默病的更安全的疫苗治疗的肽。(解决问题的方式)
本发明者已认真研究了用于免疫和用于增强免疫的对活体安全、有效和不昂贵的方法，结果发现可通过加入或插入半胱氨酸残基(一种组成天然存在蛋白质的氨基酸)增强目的肽诱发增强的免疫应答的能力，因此显示可通过在Αβ肽的部分加入或插入半胱氨酸分子得到诱发增强的免疫应答的性能，而不使用全长Αβ肽(PCT/JP2008/0576U)。依照本发明，进一步的研究导致以下发现，即得到针对Αβ的增强的免疫应答的方法和预期引起减少的细胞免疫应答的加入半胱氨酸分子的新Aβ肽。本发明涉及增强免疫应答的新方法，更具体地，增强免疫应答的方法的特征在于将半胱氨酸分子加入或插入免疫原性肽，并包含如下发明
(1)肽，其特征在于在淀粉状蛋白β肽的部分或来源于淀粉状蛋白β肽的序列中加入或插入半胱氨酸或半胱氨酸类似物，所述肽选自如下(A)至(F)
(A)由下述组成的肽(a)由SEQ ID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸残基组成的肽或由SEQ ID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸残基的部分组成的肽和(b)由在SEQ ID NO: 1的N-端的第28至第42位氨基酸残基内的包含SEQ ID NO: 1的N-端的第28至第36 位氨基酸残基的9个或更多个氨基酸残基组成的肽，肽(a)和肽(b)彼此结合，其中半胱氨酸或半胱氨酸类似物与得到的肽(a)和肽(b)的组合的C-端结合；(B)由下述组成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第沈位或第1至第27位氨基酸残基，其中在N-端第18和第19位氨基酸残基之间插入半胱氨酸或半胱氨酸类似物；
(C)由下述组成的肽SEQID NO: 1的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的部分，其中在N-端第18和第19位氨基酸残基之间插入半胱氨酸或半胱氨酸类似物，并且其中半胱氨酸或半胱氨酸类似物与所述肽的C-端结合；
(D)由下述组成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸残基或由SEQ ID N0:1 的N-端第1至第18位氨基酸残基的部分，其C-端与半胱氨酸或半胱氨酸类似物结合，其进一步与由SEQ ID NO: 1的N-端第28至第42位氨基酸残基组成的肽或由SEQ ID NO: 1 的N-端第观至第42位氨基酸残基的部分组成的肽结合，所述由SEQ ID N0:1的N-端第观至第42位氨基酸残基组成的肽或由SEQ ID NO: 1的N-端第观至第42位氨基酸残基的部分组成的肽的C-端任选地与半胱氨酸或半胱氨酸类似物结合；
(E)由下述组成的肽SEQID NO: 1的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的部分，其C-端与半胱氨酸类似物结合；
(F)由下述组成的肽2条或多条由SEQID NO: 1的氨基酸序列组成的肽或由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的部分组成的肽，其C-端与半胱氨酸或半胱氨酸类似物结合，所述2条或多条肽通过所述半胱氨酸或所述半胱氨酸类似物之间的二硫键彼此结合。(2)如上第(1)项的肽，其中如上(A) (a)的肽选自由SEQ ID N0:1的N-端第1至第10，第2至第10，第3至第10，第1至第9，第2至第9，第1至第18位氨基酸残基组成的肽，和如上㈧(b)的肽选自由SEQ ID NO: 1的N-端第28至第36，第28至第37， 第观至第38，第观至第39，第观至第40，第观至第41，第观至第42位氨基酸残基组成的肽。(3)如上第(1)项的肽，其中如上(C)的肽为由下述组成的肽SEQ ID N0:1的 N-端第1至第观位氨基酸残基，其中在N-端第18和第19位氨基酸残基之间插入半胱氨酸或半胱氨酸类似物，并且其中半胱氨酸或半胱氨酸类似物与所述肽的C-端结合。(4)如上第(1)项的肽，其中如上(D)的肽为由下述组成的肽SEQ ID N0:1的 N-端第1至第18位氨基酸残基，其C-端与半胱氨酸或半胱氨酸类似物结合，其进一步与由SEQ ID NO: 1的N-端第28至第37位氨基酸残基组成的肽结合，所述由SEQ ID NO: 1的 N-端第28至第37位氨基酸残基组成的肽的C-端任选地与半胱氨酸或半胱氨酸类似物结
I=I ο(5)如上第(1)项的肽，其中如上(E)的肽为由下述组成的肽SEQ ID N0:1的 N-端第1至第28位氨基酸残基，其C-端与半胱氨酸类似物结合。(6)如上第(1)项的肽，其中如上(F)的肽为由下述组成的肽由2条或多条由SEQ ID NO: 1的N-端第1至第观位氨基酸残基组成的肽，其C-端与半胱氨酸或半胱氨酸类似物结合，其中所述2条或多条肽通过所述半胱氨酸或所述半胱氨酸类似物之间的二硫键彼
此结合。(7)如上第(1)至(6)项中任一项的肽，其中所述半胱氨酸类似物为高半胱氨酸。(8)如上第(1)至(7)项中任一项的肽，其中所述肽为选自下述的肽 SEQ ID N0:2 至 SEQ ID N0:19 中任一种的肽；
由2条肽组成的肽，其中每条肽由SEQ ID N0:20组成并通过二硫键彼此结合；肽，其由SEQ ID NO:20组成的肽和由SEQ ID NO:21组成的肽组成，每条肽通过二硫键彼此结合；
由2条肽组成的肽，其中每条肽由SEQ ID NO:21组成并通过二硫键彼此结合； 由多条肽组成的肽，其中每条肽由SEQ ID NO:21组成并通过二硫键彼此结合。(9)增强对淀粉状蛋白β的免疫应答的方法，其特征在于使用如上第(1)至(8) 项中任一项的肽。(10)用于预防和治疗阿尔茨海默病的药物，其特征在于所述药物包含如上第(1) 至(8)项中任一项的肽作为活性成分。(11)对预防和治疗阿尔茨海默病有效的DNA疫苗，其特征在于所述疫苗包含编码如上第(1)至(8)项中任一项的肽的氨基酸序列的基因片段。本发明还涉及在哺乳动物中预防和治疗阿尔茨海默病的方法，其包括对所述哺乳动物施用药学上有效量的本发明的肽，以及在哺乳动物中预防和治疗阿尔茨海默病的方法，其包括对所述哺乳动物施用药学上有效量的编码本发明的肽的氨基酸序列的基因片段。本发明还涉及本发明的肽在制造用于预防和治疗阿尔茨海默病的药物中的用途以及编码本发明的肽的氨基酸序列的基因片段在制造用于预防和治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。发明效果
本发明提供了诱发对A β肽的增强和充分的免疫应答的免疫原性肽，即使其被单独使用而不加佐剂。根据本发明，仅仅通过在Αβ肽的部分或来源于Αβ肽的序列中加入或插入半胱氨酸分子可增强免疫原性肽的抗体产生。因此，不具有与使用佐剂相关的缺点，使药物制剂的设计更容易。当对活体施用时，本发明的诱发对Αβ肽的增强的免疫应答的免疫原性肽可迅速和充分地在血液中诱发特异性针对所述肽的抗体。已知半胱氨酸是没有毒性的，而已知半胱氨酸和其相关物质在活体中具有抗毒性作用，因此本发明的诱发增强的免疫应答的免疫原性肽可非常安全地在体内使用。本发明的诱发增强的免疫应答的免疫原性肽可通过无需生物合成的通过化学合成的非生物程序制备，因此比传统成分疫苗具有更高的一致性。此外，可提供具有最低风险的毒性、感染和由于污染导致的质量下降的更安全的疫苗。不仅可通过注射例如皮下或肌肉内施用包含本发明的诱发对Αβ肽增强的免疫应答的免疫原性肽的肽制品，而且可通过口服、经鼻或经皮施用所述肽制品，这可避免由注射器针头导致的压力和医疗事故。
图1显示了加入半胱氨酸的通过二硫键彼此结合的观个氨基酸残基的Αβ肽的结构。本发明的最佳实施方式
依照本发明，可将半胱氨酸分子或其衍生物直接加入或插入肽或可选地将表达半胱氨酸的序列加入或插入DNA或RNA序列。只要可得到对A β肽的免疫应答增强作用，不具体限制加入和插入半胱氨酸的位置。待插入的半胱氨酸分子的数目可为一个或多个。当插入多个半胱氨酸分子时，可连续地或不连续地插入半胱氨酸分子。最简单的结构可为Aβ肽的一部分，其N-端或C-端与一个半胱氨酸结合。在预防和治疗阿尔茨海默病中有效的本发明的肽可包括由第1至第42位氨基酸残基组成的Aβ 肽(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA: SEQ ID Ν0:1)的部分或来源于其的肽，其中加入半胱氨酸(Cys)或其类似物。这些肽的实例包括在下文中所列的那些肽。如本文中使用的半胱氨酸类似物指半胱氨酸的前体和代谢物并通常包括高半胱氨酸。(A)肽,其包含(a)由SEQ ID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸残基组成的肽或由SEQ ID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸残基的部分组成的肽和(b)由在SEQ ID N0:1 的N-端的Il 28至Il 42位氨某酸残某内的句,含SEQ ID NO: 1的N-端的Il 28至Il 36
9 顿缠某麵細flt (a) ^Pflt (b)彼此齢，#Φ辅細鮮胱氡剛_辅至_仏綱太(漏船白化㈱齢
(1)由下述组成的肽SEQID Ν0:1的N-端第1至第10位氨基酸残基，其C-端结合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第42位氨基酸残基组成的肽，所述SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第42位氨基酸残基组成的肽的C-端加入半胱氨酸(1-10 28-42AACys)
N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMVGGWIA￡ (SEQ ID NO:2)
(2)由下述组成的肽SEQID N0:1的N-端第1至第10位氨基酸残基，其C-端结合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第41位氨基酸残基组成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第41位氨基酸残基组成的肽C-端加入半胱氨酸(1-10 28-41AACys)
N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMVGGWK (SEQ ID N0:3)
(3)由下述组成的肽SEQID N0:1的N-端第1至第10位氨基酸残基，其C-端结合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第40位氨基酸残基组成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第40位氨基酸残基组成的肽的C-端加入半胱氨酸(1-10 28-40AACys)
N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMVGGW￡ (SEQ ID NO:4)
(4)由下述组成的肽SEQID N0:1的N-端第1至第10位氨基酸残基，其C-端结合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第39位氨基酸残基组成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第39位氨基酸残基组成的肽的C-端加入半胱氨酸(1-10 28-39AACys)
N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMVGGV￡ (SEQ ID NO:5)
(5)由下述组成的肽SEQID N0:1的N-端第1至第10位氨基酸残基，其C-端结合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第38位氨基酸残基组成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第38位氨基酸残基组成的肽的C-端加入半胱氨酸(1-10 28-38AACys)
N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMVGG￡ (SEQ ID N0:6)
(6)由下述组成的肽SEQID N0:1的N-端第1至第10位氨基酸残基，其C-端结合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第37位氨基酸残基组成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第37位氨基酸残基组成的肽的C-端加入半胱氨酸(1-10 28-37AACys)
N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMVG￡ (SEQ ID NO:7)
(7)由下述组成的肽SEQID N0:1的N-端第1至第10位氨基酸残基，其C-端结合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第36位氨基酸残基组成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第28至第36位氨基酸残基组成的肽的C-端加入半胱氨酸(1-10 28-36AACys) N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMV￡ (SEQ ID NO:8)
(8)由下述组成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第9位氨基酸残基，其C-端结合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第37位氨基酸残基组成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第37位氨基酸残基组成的肽的C-端加入半胱氨酸(1-9 28-37AACys)
N-端-DAEFRHDSGKGAIIGLMVG￡ (SEQ ID NO:9)
(9)由下述组成的肽SEQID N0:1的N-端第2至第10位氨基酸残基，其C-端结合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第37位氨基酸残基组成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第37位氨基酸残基组成的肽的C-端加入半胱氨酸O-IO 28-37AACys)
N-端-AEFRHDSGIGAIIGLMVG￡ (SEQ ID NO: 10)
(10)由下述组成的肽SEQID N0:1的N-端第3至第10位氨基酸残基，其C-端结合由SEQ ID NO: 1的N-端第28至第37位氨基酸残基组成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第洲至第37位氨基酸残基组成的肽的C-端加入半胱氨酸(3-10 28-37AACys)
N-端-EFRHDSGYKGAIIGLMVG￡ (SEQ ID NO:11)
(11)由下述组成的肽SEQID NO: 1的N-端第2至第9位氨基酸残基，其C-端结合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第37位氨基酸残基组成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第37位氨基酸残基组成的肽的C-端加入半胱氨酸28-37AACys)
N-端-AEFRHDSGKGAIIGLMVG￡ (SEQ ID NO:12)
(12)由下述组成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸残基，其C-端结合由SEQ ID NO: 1的N-端第28至第42位氨基酸残基组成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第观至第42位氨基酸残基组成的肽的C-端加入半胱氨酸(1-18 28-42AACys)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVGGWIA￡ (SEQ ID NO: 13)。(B)由下述组成的肽SEQ ID NO: 1的N-端第1至第26位或第1至第27位氨基 11 , ^^ N-端H 18 禾nn 19 ^Mgil^g^J^ilA^EMilaK^EMil^M^
(1)由下述组成的肽SEQID N0:1的N-端第1至第27位氨基酸残基(在下文中称为“27-氨基酸Αβ肽”)，其中在N-端第18和第19位氨基酸残基之间插入半胱氨酸 (l-18Cysl9-27AA)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLV￡FFAEDVGSN (SEQ ID NO:14)
(2)由下述组成的肽SEQID N0:1的N-端第1至第沈位氨基酸残基(在下文中称为“26-氨基酸Αβ肽”)，其中在N-端第18和第19位氨基酸残基之间插入半胱氨酸 (l-18Cysl9-26AA)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLVQFFAEDVGS (SEQ ID NO:15)。(C)由下述组成的肽SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成的肽或由SEQ ID N0:1的氨序歹！丨的部分， Φ^ΗΝ-端H 18禾nn 19位氨, !! ;^旬插入半胱氨或半胱Mil^l
^m ^ H.^^^EMii^^EMii^i^ii^^jta^ c-端结合
(1)由下述组成的肽SEQ ID NO: 1的N-端第1至第观位氨基酸残基(在下文中称为 “28-氨基酸A β肽”)，其中在N-端第18和第19位氨基酸残基之间插入半胱氨酸，并且其中半胱氨酸与所述肽的C-端结合(l-18CyS19j8AACyS)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLV￡FFAEDVGSNK￡ (SEQ ID NO:16)。
(D)由下沭组成的肽SEQ ID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸残基或由SEQ ID NO 1的N-端H 1 ^ll 18位的部分，IC-端与半胱氡半胱氡勿结合， 其讲一步与由SEQ ID NO: 1的N-端第28至第42位氨基酸残基组成的肽或由SEQ ID N0:1 ^Ν-2842imMm^m^Am^mm^,^^SEQ ID NO:I的Ν-端h 28 42 WMMm^mW ^AtgK^ SEP ID NO: 1 ^ N- 28 42 ^M^if M· __ C-職態辟胱細鮮胱氡
(1)由下述组成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸残基，其C-端结合半胱氨酸，其进一步结合由SEQ ID NO: 1的N-端第观至第37位氨基酸残基组成的肽 (l-18Cys28-37AA)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLV￡KGAIIGLMVG (SEQ ID NO:17)
(2)由下述组成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸残基，其C-端结合半胱氨酸，其进一步结合由SEQ ID NO: 1的N-端第观至第37位氨基酸残基组成的肽， 所述由SEQ ID NO: 1的N-端第观至第37位氨基酸残基组成的肽的C-端结合半胱氨酸 (l-18Cys28-37AACys)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLV￡KGAIIGLMVG￡ (SEQ ID NO:18)。(E)由下沭组成的肽SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成的肽或由SEQ ID N0:1的氨歹丨丨_仉1； C-躺辅細鮮胱氡
(1)由下述组成的肽SEQ ID NO: 1的N-端第1至第观位氨基酸残基，其C-端结合高半胱氨酸08AA-高半胱氨酸)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKX (SEQ ID N0:19) (X:高半胱氨酸)。(F)由下述组成的肽由2条或多条由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成的肽或由 SEQ ID N0:1的氨序歹I丨的部分組成的HHC-端ij半胱氨或半胱
Φ戶斤沭2 I或多Ijfeil丄寸所沭半胱氨或所沭半胱氨勿t丨旬的二硫Hlt皮此结合
(1)加入半胱氨酸的28-氨基酸Aβ肽Q8AAC)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK￡ (SEQ ID Ν0:20)
(2)加入2个半胱氨酸的28-氨基酸Aβ肽Q8AACC)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK￡￡ (SEQ ID Ν0:21)。由经二硫键彼此结合的^AAC和^AAC组成的肽Q8AAC 二硫^AAC)，由经二硫键彼此结合的^AAC和^AACC组成的肽Q8AAC二硫^AACC)，由经二硫键彼此结合的^AACC 和^AACC组成的肽Q8AACC 二硫^AACC，包括具有在各个N-端半胱氨酸之间形成的二硫键的肽，具有在各个C-端半胱氨酸之间形成的二硫键的肽，具有在N-端半胱氨酸和C-端半胱氨酸之间形成的二硫键的肽，具有在各N-端半胱氨酸之间和在各C-端半胱氨酸之间形成的二硫键的肽，和具有各在N-端半胱氨酸和C-端半胱氨酸之间形成的二硫键的肽)， 和由多个经二硫键彼此结合W^AACC组成的肽Q8AAC(^28AAC)-结合产物)。图1显示了这些肽的结构。在如上所述的加入或插入半胱氨酸的A β肽中，由缺失其氨基酸序列的部分并加入半胱氨酸的Αβ 肽组成的肽，例如 1-10 28-42AACys (SEQ ID NO:2), 1-10 28-4IAACys (SEQ ID NO:3), 1-10 28-40AACys (SEQ ID NO:4), 1-10 28-39AACys (SEQ ID NO:5), 1-10 28-38AACys (SEQ ID NO:6), 1-10 28-37AACys (SEQ ID NO:7), 1-10 28-36AACys(SEQ ID NO:8)， 1-9 28-37AACys (SEQ ID NO:9)， 2-10 28-37AACys (SEQ ID NO:10) 和1-18 28-42AACys (SEQ ID NO: 13)；由28-氨基酸A β肽并加入或插入半胱氨酸组成的肽，例如 l-18Cysl948AACys (SEQ ID NO: 16)，l_18Cysl9_27AA (SEQ ID NO: 14)， l-18Cysl9-26AA (SEQ ID NO: 15), l-18Cys28-37AA (SEQ ID NO: 17)；由沘-氨基酸 Αβ 肽并加入高半胱氨酸组成的肽，例如^AA-高半胱氨酸(SEQ ID NO: 19)；以及^AAC 二硫 28AAC和^AAC 二硫^AACC可引起特别增强的免疫应答，因此可有效用于预防和治疗阿尔茨海默病。根据本发明，可通过将半胱氨酸或半胱氨酸类似物加入或插入Αβ肽的部分或来源于Aβ肽的序列制备可诱发增强的免疫应答的肽。可通过使用常规技术用所述肽免疫小鼠和测定在血液中的抗-Αβ IgG抗体滴度证实加入或插入半胱氨酸后得到的肽是否发挥了免疫应答增强作用。因此，本发明也提供了增强免疫应答的方法，其特征在于使用了通过将半胱氨酸或半胱氨酸类似物加入或插入Aβ肽的部分或来源于Aβ肽的序列得到的肽。含有通过本发明得到的加入半胱氨酸的肽的肽制品可通过任意施用途径例如皮下、经皮、肌肉内、口服或经鼻施用。最优选地，其通过皮下或肌肉内施用。尽管即使本发明的加入半胱氨酸的免疫原性肽单独施用而不加佐剂时，其也可提供足够的免疫，但是如果与佐剂组合其可提供更充分的免疫。在本文中可使用的佐剂包括可优先激活体液免疫而不刺激细胞免疫的佐剂，并且通常为铝盐。此外，可使用包含编码诱发增强的免疫应答的肽的基因片段的载体作为DNA疫苗用于有效预防和治疗阿尔茨海默病，所述肽通过将半胱氨酸或半胱氨酸类似物加入或插入 Αβ肽的部分或来源于Αβ肽得到。编码半胱氨酸的核苷酸序列包括例如tgt，但可为任意序列，只要其编码半胱氨酸。下面描述编码由上述42个氨基酸残基组成的Αβ肽的基因片段。然而，下面描述的核苷酸序列代表Αβ肽的典型基因序列，但是可应用任意基因序列， 只要其编码相同的氨基酸序列。gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc atagcg (SEQ ID N0:22)。编码通过将半胱氨酸(Cys)加入或插入Αβ肽的部分或来源于Αβ肽的序列得到的肽的基因片段实例包括下面描述的那些。尽管下面描述的核苷酸序列代表编码上述各个肽的典型基因序列，但是可应用任意基因序列，只要其编码相同的氨基酸序列。编码1-10 28-42AACys的基因片段
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc
ggtgttgtca tagcgtgt (SEQ ID N0:23)
编码1-10 28-4IAACys的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat ggtgttgtca tatRt (SEQ ID N0:24)
编码1-10 28-40AACys的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat RRtRttRtct Rt (SEQ ID N0:25)
编码1-10 28-39AACys的基因片段
aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc
aaaggtgcaa tcattggact catggtgggcgatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc Rgtgtttgt (SEQ ID NO:26)
编码1-10 28-38AACys的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc RRttRt (SEQ ID NO:27)
编码1-10 28-37AACys的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc tRt (SEQ ID NO:28)
10 编码1-10 28-36AACys的基因片段
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgtgt (SEQ ID NO:29)
编码1-9 28-37AACys的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggaaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt (SEQ ID NO:30)
编码2-10 28-37AACys的基因片段 gcagaattcc gacatgactc aggatataaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt (SEQ ID N0:31)
编码3-10 28-37AACys的基因片段 gaattccgac atgactcagg atataaaggt gcaatcattg gactcatggt gggctgt (SEQ ID N0:32)
编码2-9 28-37AACys的基因片段 gcagaattcc gacatgactc aggaaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggctgt (SEQ ID NO :33)
编码1-18 28-42AACys的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt gtcatagcgt gt (SEQ ID NO:34) 编码l-18Cysl9-27AA的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc tttgcagaag atgtgggttc(SEQ ID NO :35)
编码l-18CyS1946AA的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgt_g^tttc tttgcagaag atgtgggttc a (SEQ ID NO:36) 编码l-18Cysl9j8AACys的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgt_g^tttc tttgcagaag atgtgggttc aaacaaatgt (SEQ ID NO:37) 编码l-18Cys28-37AA的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgt￡t_aaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggc (SEQ ID NO:38) 编码l-18Cys28-37AACys的基因片段gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt RgtRtRtaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt (SEQ ID NO:39)0通过以下实施例更详细的解释本发明，但不应理解为受其限制。实施例1
日 白·本碰育P匕力·愧:Αβ1 ■ 10_某_某继
个不同的C-端flt结合并在后者的C-端力D入半胱氡_ (1)加入半胱氨酸的A β肽的制备
加入半胱氨酸的1-10+30-42氨基酸A β肽(1-10 30-42AACys) N-端-DAEFRHDSGYAIIGLMVGGWIA￡ (SEQ ID NO:40)
加入半胱氨酸的1-10+29-42-氨基酸Αβ肽(1-10 29-42AACys) N-端-DAEFRHDSGYGAIIGLMVGGWIA￡ (SEQ ID NO:41)
加入半胱氨酸的1-10+28-42-氨基酸Αβ肽(1-10 28-42AACys) N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMVGGWIA￡ (SEQ ID NO:2)
1-10+28-42-氨基酸 Αβ 肽(1-10 28-42ΑΑ) N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMVGGWIA (SEQ ID NO:42)
合成上面的肽(Sigma Aldrich Japan)并用盐溶液稀释以得到5mg/mL的储液。向 100 μ L储液中加入900 μ L盐溶液以得到0. 5mg/mL的浓度，将混合物分装至1. 5mL小管 (immunogen)中并在_80°C或更低温度下储存直至使用。(2)免疫小鼠
雄性C57BL/6小鼠(7周大，SPF)购自日本Charles River Co.，Ltd.并在SPF环境下培养。(3)免疫组
将16只小鼠分为4组，每组包含4只小鼠对组1施用1-10 30-42AACys ；对组2施用 1-10 29-42AACys ；对组 3 施用 1-10 28-42AACys 和对组 4 施用 1-10 ^_42AA。(4)免疫和时间表
使用ImL结核菌素注射器(Terumo，SS-01T2613S)在腹部皮内或皮下对小鼠施用各 200 μ L/小鼠的免疫原(每只小鼠的剂量100μ g)。免疫小鼠3次，每次间隔2周。(5)血液取样
在最后第三次免疫后第7天，在用戊巴比妥钠(Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentyl)麻醉下从所有小鼠的腹主动脉收集血液。将采集的血液转移至Microtainer (Becton Dickinson Co.，Ltd)，在室温下进行充分的凝血，然后在5，000 rpm离心10 min。 将各个分离的血清分装至2个0. 5mL小管并在-80°C下储存直至测量。(6)抗-A β IgG抗体的测量
将 A β 肽(1-40 位氨基酸序列Ν-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV V (SEQ ID Ν0: 43)由 Hokkaido System Science Co.，Ltd.合成)用 0. IM 碳酸缓冲液 (ρΗ9· 6)稀释成 10μ g/mL 并以 100μ L/孔加入 8-孔带(Nalge Nunc K. K. , Immobilizer Amino)中，置于4°C孵育过夜以固定。第二天，用300 μ L含0. 05% Tween20的PBS (PBST) 洗各孔3次，以300 μ L/孔加入IOmM乙醇胺并置于室温孵育1小时。1小时后，将IOmM乙醇胺完全去除并将用PBST稀释50至10000倍的样品以100 μ L/孔加入各孔。在室温反应1小时后，去除加入的稀释的血清并用300 μ L/孔的PBST 洗各孔3次。洗涤后，将孔里的洗涤液完全去除，以IOOyL/孔加入用稀释样品的溶液稀释 2000倍的HRP-标记的抗小鼠IgG山羊抗体(American Curlex, A131PS)，之后在室温反应 1小时。反应后，去除用于稀释标记抗体的溶液，用300 μ L/孔的PBST洗各孔2次，用等量的蒸馏水洗2次，向各孔中加入100 μ L/孔的显色底物溶液TMB+ (Dako Inc.)，之后在室温避光反应30min。然后加入100 μ L/孔的IN硫酸以终止显色并在450nm处测量光密度 (0D450 值)。使用市售的针对Aβ的单克隆抗体(CHEMI-CON Corporation,ΜΑΒ1560)作为标准血清。用PBST将标准血清稀释至0. 156,0. 3125,0. 625,1. 25,2. 5,5,10ng/mL以制备用于抗体滴度测量的标准品。测定了各个鼠血清样品的抗_Αβ IgG抗体并同时测量了各个稀释的样品的0D450值。使用得到的标准品单位和0D450值的标准曲线计算了各个鼠血清样品的抗-A β IgG抗体滴度。表1显示了在各个免疫组中的鼠血清的计算的抗_Αβ IgG抗体滴度。如表1所示，在施用1-10 28-42AACys的组和施用1-10 28-42AA的组中观察到针对A β的抗体的诱发(induction)。并且，与用不加入半胱氨酸的Aβ肽片段(1_10 28-42ΑΑ)的免疫相比，用加入半胱氨酸的Αβ肽片段(1-10 28-42AACys)的免疫提供了针对Αβ的较高抗体滴度。
权利要求
1.一种肽，其特征在于在淀粉状蛋白β肽的部分或来源于淀粉状蛋白β肽的序列中加入或插入半胱氨酸或半胱氨酸类似物，所述肽选自如下(A)至(F)(A)由下述组成的肽(a)由SEQID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸残基组成的肽或由SEQ ID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸残基的部分组成的肽和(b)由在SEQ ID NO: 1的N-端的第28至第42位氨基酸残基内的包含SEQ ID NO: 1的N-端的第28至第36 位氨基酸残基的9个或更多个氨基酸残基组成的肽，肽(a)和肽(b)彼此结合，其中半胱氨酸或半胱氨酸类似物与得到的肽(a)和肽(b)的组合的C-端结合；(B)由下述组成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第沈位或第1至第27位氨基酸残基，其中在N-端第18和第19位氨基酸残基之间插入半胱氨酸或半胱氨酸类似物；(C)由下述组成的肽SEQID NO: 1的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的部分，其中在N-端第18和第19位氨基酸残基之间插入半胱氨酸或半胱氨酸类似物，并且其中半胱氨酸或半胱氨酸类似物与所述肽的C-端结合；(D)由下述组成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸残基或由SEQ ID N0:1 的N-端第1至第18位氨基酸残基的部分，其C-端与半胱氨酸或半胱氨酸类似物结合，其进一步与由SEQ ID NO: 1的N-端第28至第42位氨基酸残基组成的肽或由SEQ ID NO: 1 的N-端第观至第42位氨基酸残基的部分组成的肽结合，所述由SEQ ID N0:1的N-端第观至第42位氨基酸残基组成的肽或由SEQ ID NO: 1的N-端第观至第42位氨基酸残基的部分组成的肽的C-端任选地与半胱氨酸或半胱氨酸类似物结合；(E)由下述组成的肽SEQID NO: 1的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的部分，其C-端与半胱氨酸类似物结合；(F)由下述组成的肽2条或多条由SEQID NO: 1的氨基酸序列组成的肽或由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的部分组成的肽，其C-端与半胱氨酸或半胱氨酸类似物结合，所述2条或多条肽通过所述半胱氨酸或所述半胱氨酸类似物之间的二硫键彼此结合。
2.权利要求1的肽，其中(A)(a)的肽选自由SEQ ID NO: 1的N-端第1至第10，第2 至第10，第3至第10，第1至第9，第2至第9，第1至第18位氨基酸残基组成的肽，和(A) (b)的肽选自由SEQ ID N0:1的N-端第观至第36，第观至第37，第观至第38，第观至第39，第观至第40，第观至第41，第观至第42位氨基酸残基组成的肽。
3.权利要求1的肽，其中(C)的肽为由下述组成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第观位氨基酸残基，其中在N-端第18和第19位氨基酸残基之间插入半胱氨酸或半胱氨酸类似物，并且其中半胱氨酸或半胱氨酸类似物与所述肽的C-端结合。
4.权利要求1的肽，其中(D)的肽为由下述组成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第 18位氨基酸残基，其C-端与半胱氨酸或半胱氨酸类似物结合，其进一步与由SEQ ID N0:1 的N-端第观至第37位氨基酸残基组成的肽结合，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第观至第 37位氨基酸残基组成的肽的C-端任选地与半胱氨酸或半胱氨酸类似物结合。
5.权利要求1的肽，其中(E)的肽为由下述组成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第观位氨基酸残基，其C-端与半胱氨酸类似物结合。
6.权利要求1的肽，其中(F)的肽为由下述组成的肽2条或多条由SEQID N0:1的 N-端第1至第观位氨基酸残基组成的肽，其C-端与半胱氨酸或半胱氨酸类似物结合，其中所述2条或多条肽通过所述半胱氨酸或所述半胱氨酸类似物之间的二硫键彼此结合。
7.权利要求1至6中任一项的肽，其中所述半胱氨酸类似物为高半胱氨酸。
8.权利要求1至7中任一项的肽，其中所述肽为选自下述的肽 SEQ ID NO:2 至 SEQ ID NO: 19 中任一种的肽；由2条肽组成的肽，其中每条肽由SEQ ID NO:20组成并通过二硫键彼此结合； 肽，其由SEQ ID NO: 20组成的肽和由SEQ ID NO: 21组成的肽组成，其中每条肽通过二硫键彼此结合；由2条肽组成的肽，其中每条肽由SEQ ID NO:21组成并通过二硫键彼此结合； 由多条肽组成的肽，其中每条肽由SEQ ID NO:21组成并通过二硫键彼此结合。
9.一种增强对淀粉状蛋白β的免疫应答的方法，其特征在于使用如权利要求1至8中任一项所述的肽。
10.一种用于预防和治疗阿尔茨海默病的药物，其特征在于所述药物包含如权利要求 1至8中任一项所述的肽作为活性成分。
11.一种对预防和治疗阿尔茨海默病有效的DNA疫苗，其特征在于所述疫苗包含编码如权利要求1至8中任一项所述的肽的氨基酸序列的基因片段。
全文摘要
提供了含有淀粉状蛋白β作为基础序列的肽，所述肽作为阿尔茨海默病的预防和治疗剂是安全的并可有效增强免疫应答。其中加入或插入半胱氨酸或半胱氨酸类似物的淀粉状蛋白β肽或其部分肽，和使用所述肽增强针对淀粉状蛋白β的免疫应答的方法。使用增强免疫应答的淀粉状蛋白β肽的阿尔茨海默病的预防和治疗剂。预期具有同样效果并含有编码其中加入或插入半胱氨酸的淀粉状蛋白β肽或来源于其的肽的基因的DNA疫苗。
文档编号A61K39/00GK102245629SQ200980150209
公开日2011年11月16日 申请日期2009年10月16日 优先权日2008年10月16日
发明者上仲一义, 松田纯一, 野崎周英 申请人:一般财团法人化学及血清疗法研究所