专利名称：利用球虫病疫苗的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于接种禽类的方法和组合物。
背景技术：
球虫病是世界上极为重要的一种鸡类疾病。据估计该病仅对肉鸡(broiler)产业造成的损失就超过每年10亿美元。球虫病是由顶复门(apicomplexan)的原生动物寄生物艾美球虫属(Eimeria)七个物种的感染造成的。在这七个物种中，柔嫩艾美球虫、巨型艾美球虫和堆形艾美球虫被认为是问题最严重的。球虫病的症状包括倦怠、贫血、水泻或血性腹泻(取决于感染的物种)、体重减少和饲料转化比不高。艾美球虫属寄生物的生长和扩散在鸡类中尤其普遍，因为这些禽类通常在拥挤条件下饲养，使得卫生控制的保持非常困难。在这样的条件下使用抗球虫药效果不佳，原因在于一是会产生耐药性，二是此类药物不容易在狭窄的饲养环境里持续施用。此外，球虫药还有抗细菌作用，而含于饲料中的(in-feed)抗生素的使用被认为是不理想的。美国农业部(USDA)已经承认，美国和全世界的肉鸡产业严重依赖于抗球虫药的使用，抗球虫药被添加到家禽饲料中，以阻止艾美球虫在鸡肠道内的细胞内发育阶段。在鸡被送到市场上之前大约一周时从饲料中去除药物，以防止药物在肉产品中残余。虽然抗球虫药仍然是防止禽类球虫病的主要手段，但USDA已经声明，由于艾美球虫属寄生物能够对这样的药物产生抗药性，需要开发替代性的控制手段。抗击球虫病的一个替代解决方案是开发有效的疫苗。虽然人们已经想到了施用低剂量的有毒力或减毒的艾美球虫属物种卵囊的混合物，但其实际作为有效的干预手段尚待证明。由于鸡可产生对艾美球虫属的免疫力，人们正在花费相当的努力来开发针对球虫病的“亚单位”疫苗。这样的疫苗可以使用基因工程技术来产生艾美球虫属寄生物的蛋白质组分。这种途径的理论依据是，可以利用无害的实验室细菌菌株生产“重组”蛋白质，该蛋白质可以用来免疫鸡，或是以胚胎内方式(在鸡蛋中)或是在孵出时(at hatch)。如果成功， 鸡会对后来的艾美球虫属感染具有抗性，因为它们已经被用该寄生物表面上通常存在的蛋白质进行了免疫。然而，据USDA称，迄今为止这些努力都没有获得成果，而且，迄今为止还没有商品化的用于预防禽类球虫病的亚单位疫苗。CoxAbic 是一种在产业上正在得以应用的疫苗，它是基于使用分离自巨型艾美球虫发育的大配子母细胞(雌性有性)阶段的三种主要的亲和纯化的全长天然抗原 (56kDa、82kDa和230kDa)，在产蛋母鸡的产蛋期即将开始前对其进行接种。CoxAbic 可引发针对影响肉鸡的球虫物种的交叉免疫力，包括针对堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的免疫力。它被用来在产蛋开始(point oflay)之前免疫小母鸡(pullet)。有免疫力的产蛋鸡通过卵黄将特异性抗体传递给肉鸡，并且在它们孵出后生命的早期，当它们天然地暴露于农场内的球虫时为它们提供防护。这样的暴露在母体保护的过程中带来免疫力，并将其传递给肉鸡，在肉鸡生命周期的早期内持续存在。保护性母体抗体通过卵黄被传递给后代小鸡，小鸡孵出时即具有高效价的母体抗体。在鸡生长期的头2-3周内，母体抗体起减少卵囊脱落(oocyst shedding)的作用。这继而导致每窝卵囊数峰值(peak litter oocyst counts)降低60-80%，通常在3-5周龄时发生。然而，尽管这种疫苗能够将母体免疫力传递给肉鸡，而且肉鸡可以在其饲料中不含球虫的条件下养育，但是这种免疫力是一种间接免疫力，因为它是在肉鸡的生命周期的早期由母亲传给肉鸡的。没有一种机制来保证肉鸡可保持这种免疫力，而且目前还没有可用的疫苗能够在孵化后直接施用给肉鸡或者小鸡。这就使得在那些没有从母亲获得足够免疫力的肉鸡，或者丧失了该免疫力而需要增强免疫力的更年长的肉鸡中球虫病有扩散的可能。事实上，CoxAbic 的制造商称CoxAbic仅用于接种产蛋母鸡和保护它们的小肉鸡。母体免疫力根据ELISA法测定可持续大约14天或稍长。如果禽只在生命周期中更晚的年龄暴露于艾美球虫属的不同物种，母体免疫不再存在，这些更年长的禽只就处于没有保护的状态。CoxAbic 疫苗还有一个缺点，即其是通过注射施用给产蛋鸡(breeder chicken)的。在CoxAbic 的接种时间表中，小母鸡(PUllet)在养育过程中必须注射两次该疫苗，两次注射之间的时间间隔至少为4周。第一次注射可以在12到15周龄进行；第二次注射在18-21周龄进行。因此，这种疫苗的接种模式不容易适用于对大的肉鸡鸡群的直接施用。如上所述，产业上存在获得用于处理肉鸡(broiler chicken)的疫苗的动机。必须注射到鸡体内的疫苗对大鸡群的施用是不适用的。因此，需要这样的疫苗，它可以容易地施用给肉鸡，以产生针对球虫病的不良作用的保护效应。发明概述在某些方面，本发明为了解决对于球虫病疫苗的需求而提供一种用于保护家禽以对抗艾美球虫属感染的球虫病疫苗，所述疫苗包含重组禽腺病毒载体，所述载体包含该与启动子可操作连接的包含编码膜锚定域的核酸的疏水性信号序列，用于插入可读框(ORF) 以允许ORF与所述疏水性信号序列合框地插入的多克隆位点，聚腺苷酸化信号；以及禽腺
病毒基因组。在特定的实施方案中，感兴趣的ORF编码巨型艾美球虫的截短型r56抗原。在其他实施方案中，感兴趣的ORF编码巨型艾美球虫的截短型TFP250抗原。在另外的实施方案中，感兴趣的ORF编码巨型艾美球虫的截短型82kDa抗原。在某些其他的示例性实施方案中，所述多克隆位点含有编码与巨型艾美球虫的截短型TFP250抗原和/或巨型艾美球虫的截短型82kDa抗原组合的巨型艾美球虫的截短型r56抗原的0RF。所述球虫病疫苗可以自任何禽类病毒制备。优选地，所述球虫病疫苗利用选自FAV UFAV 2、FAV 3、FAV 4、FAV 5、FAV 6、FAV 7、FAV 8、FAV 9、FAV 10、FAV 11 禾口 FAV 12 的基因组的禽腺病毒基因组。在特定的实施方案中，所述禽腺病毒基因组是FAV8基因组。所述重组禽腺病毒载体还可以包含位于所述用于插入感兴趣的ORF的克隆位点之紧邻上游的切割序列，其中来自所述载体的表达产物产生可溶性产物。在示例性的实施方案中，所述编码截短型r56的核酸包含如SEQ ID NO :14所示的全长r56序列的核苷酸70-1035的序列，但不编码如SEQ ID NO 2所示的完整r56蛋白序列。由残基70-1035编码的核苷酸序列如SEQ ID NO 13所示。全长巨型艾美球虫R56编码序列亦示于SEQ ID NO 14，该序列包含在SEQ ID NO 1内，其中atg起始位点可见于残基103-106。在其他实施方案中，所述编码截短型r56的核酸编码由SEQ ID NO 2的氨基酸 M-345或者SEQ ID NO :2的氨基酸M-345的片段组成的截短型R56片段。在特定的备选实施方案中，所述编码截短型TFP250的核酸包含如SEQ ID NO :16所示的全长TFP250序列的核苷酸6448-7083的序列，但不编码如SEQ ID NO :4所示的完整TFP250蛋白序列。更具体地，所述编码截短型TFP250的核酸由SEQ ID NO 16的核苷酸6448-7083的核酸序列组成。由残基6448-7083编码的核苷酸序列示于SEQ ID NO :15。全长巨型艾美球虫TFP250 编码序列亦示于SEQ ID NO 16，该序列包含在SEQ ID NO :3内，其中atg起始位点可见于残基 231-233。本文还考虑了用于保护家禽以对抗艾美球虫感染球虫病疫苗的组合物和使用方法，所述疫苗包含重组禽腺病毒载体，所述载体包含与启动子可操作连接的包含编码膜锚定域的核酸的疏水性信号序列，与所述疏水性信号序列合框地插入的、编码由SEQ ID NO 2 的氨基酸对-345或SEQ ID NO 2的氨基酸M-345的片段组成的截短型r56的核酸，聚腺苷酸化信号；以及禽腺病毒基因组。另一个实施方案教导了用于保护家禽以对抗艾美球虫属感染的球虫病疫苗的制备和用途，所述疫苗包含重组禽腺病毒载体，所述载体包含与启动子可操作连接的包含编码膜锚定域的核酸的疏水性信号序列，和与所述疏水性信号序列合框地插入的、由SEQ ID NO 16的核苷酸6448-7083的核酸序列组成的编码截短型TFP250的核酸，聚腺苷酸化信号；以及禽腺病毒基因组。另一个实施方案涉及用于保护家禽以对抗艾美球虫属感染的球虫病疫苗的组合物和使用方法，所述疫苗包含重组禽腺病毒载体，所述载体包含与启动子可操作连接的包含编码膜锚定域的核酸的疏水性信号序列，和与所述疏水性信号序列合框地插入的、编码巨型艾美球虫的截短型82kDa抗原的核酸，聚腺苷酸化信号；以及禽腺病毒基因组。本发明还考虑了多价球虫病疫苗制备物，其包含上述球虫病疫苗组合物的组合。此外，所述多价球虫病疫苗制备物还可以包含选自下组的免疫原马莱克氏病病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡贫血病毒(CAV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽流感(Al)、呼肠孤病毒、禽逆转录病毒、家禽腺病毒、火鸡鼻气管炎病毒、 沙门氏菌属菌种(Salmonella spp.)和大肠杆菌(E. coli)。本发明的示例性方法涉及针对柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)、巨型艾美球虫、 堆形艾美球虫(Eimeria acervulina)、毒害艾美球虫(Eimeria necatrix)、早熟艾美球虫 (Eimeria praecox)、禾口缓艾美球虫(Eimeria mitis)或布氏艾美球虫(Eimeria brunetti) 感染免疫受试者的方法，包括对受试者施用本发明的疫苗的步骤。在特定的实施方案中，其中与用包含全长r56或全长TFP250抗原或全长82kDa抗原的FAV载体免疫所述受试者时所见的免疫力相比，所述施用弓I发提高的免疫力水平。所述方法优选地用于处理选自下组的禽类物种鸡、火鸡、鹅、鸭、矮脚鸡、鹌鹑和鸽。优选地，所述禽类物种是鸡。在特定的实施方案中，所述鸡是成年肉鸡(adult broiler chickens)0
施用可以通过任何常规的施用途径，包括例如用所示疫苗对所述受试者喷雾，将所述疫苗在食物中饲与所述受试者，以及在所述受试者的供饮中提供所述疫苗。本发明的另一种方法包括用于为鸡群提供抗柔嫩艾美球虫、巨型艾美球虫、堆形艾美球虫、毒害艾美球虫、早熟艾美球虫、和缓艾美球虫、或布氏艾美球虫的保护性免疫力的组合接种疗法，包括对受试者本发明的任何疫苗和对所述鸡群施用CoxAbic 的步骤。所述组合疗法是这样的将CoxAbic 施用给产蛋母鸡以赋予孵出的小鸡免疫力，并在孵出后第1天及之后将所述本发明的疫苗施用给所述群的小鸡及成年肉母鸡。本发明的其他方面描述一种禽腺病毒载体，其包含禽腺病毒基因组，该基因组包含异源启动子、异源疏水性信号序列、多克隆位点、和聚腺苷酸化序列，其中所述启动子和所述疏水性信号序列位于多克隆位点的上游，其中在所述多克隆位点中插入感兴趣的ORF 将产生能够在所述启动子的控制下与所述信号序列合框地表达所述感兴趣的ORF的表达载体。在特定的实施方案中，所述疏水性信号序列包含切割位点，以容许从表达了所述感兴趣的ORF的表达产物的宿主细胞中分泌该表达产物。在其他实施方案中，所述信号序列不包含切割位点，从而导致所述感兴趣的ORF锚定于宿主细胞的细胞表面的融合表达产物的表达。还考虑了一种重组禽腺病毒载体，其包含与启动子可操作连接的包含编码膜锚定域的核酸的疏水性信号序列，用于插入感兴趣的可读框(ORF)以允许感兴趣的ORF与所述疏水性信号序列合框地插入的多克隆位点，聚腺苷酸化信号；以及禽腺病毒基因组。该载体在某些实施方案中可以进一步包含位于所述用于插入感兴趣的ORF的克隆位点之紧邻上游的切割序列，其中来自所述载体的表达产物产生可溶产物。还公开了一种重组禽腺病毒载体，其包含与启动子可操作连接的疏水性分泌信号序列及切割位点，编码巨型艾美球虫的截短型r56蛋白的核酸，聚腺苷酸化信号，和禽腺病
毒基因组。另一个实施方案涉及一种重组禽腺病毒载体，其包含与启动子可操作连接的疏水性分泌信号序列及切割位点，编码巨型艾美球虫的截短型TFP250蛋白的核酸，聚腺苷酸化信号，和禽腺病毒基因组。又一个实施方案涉及一种重组禽腺病毒载体，其包含与启动子可操作连接的疏水性分泌信号序列及切割位点，编码巨型艾美球虫的截短型82kDa蛋白的核酸，聚腺苷酸化信号，和禽腺病毒基因组。还有一个实施方案涉及一种重组禽腺病毒载体，其包含与启动子可操作连接的包含编码膜锚定域的核酸的信号序列，编码巨型艾美球虫的截短型r56蛋白的核酸，聚腺苷酸化信号，和禽腺病毒基因组。其他的实施方案描述一种重组禽腺病毒载体，其包含与启动子可操作连接的包含编码膜锚定域的核酸的信号序列，编码巨型艾美球虫的截短型TFP250蛋白的核酸，聚腺苷酸化信号，和禽腺病毒基因组。还考虑了一种重组禽腺病毒载体，其包含与启动子可操作连接的包含编码膜锚定域的核酸的信号序列，编码巨型艾美球虫的截短型82kDa蛋白的核酸，聚腺苷酸化信号，和禽腺病毒基因组。
在上文列出的疫苗中，编码截短型r56的核酸包含如SEQ ID N0:14中所示的全长 r56序列的核苷酸70-1035的序列，但不编码如SEQ ID NO :2所示的完整r56蛋白序列。更具体地，编码截短型r56的核酸由SEQ ID NO 14的核苷酸70-1035的核酸序列，或者SEQ ID NO 14的核苷酸70-1035的片段组成。例如，编码截短型r56的核酸编码由SEQ ID NO 2的氨基酸M-345或者SEQ ID NO 2的氨基酸M-345的片段组成的截短型r56片段。在其他实施方案中，编码截短型TFP250的核酸包含如SEQ ID NO 3中所示的全长 TFP250序列的核苷酸6448-7083的序列，但不编码如SEQ ID NO 4所示的完整TFP250蛋白序列。更具体地，编码截短型TFP250的核酸由SEQ ID NO 16的核苷酸6448-7083的核酸序列组成。产生分泌的重组禽腺病毒载体可包含任何分泌信号序列。在特定的实施方案中， 分泌信号序列选自鸡Y干扰素、猪Y干扰素、和人流感H1N2的分泌信号序列。产生锚定的产物的重组禽腺病毒载体可以包含任何膜锚定信号序列。在特定的实施方案中，膜锚定信号序列选自禽流感HA抗原的分泌信号序列。所描述的任何表达载体可以容易地配制成疫苗来用于本文中描述的方法。示例性的方法包括在禽类群体中引发免疫应答的方法，包括对所述群体施用这样的疫苗。优选地接种家禽群体对抗球虫病的方法包括施用包含本发明的重组禽腺病毒载体的疫苗，其中与施用包含全长r56或全长TFP250的疫苗相比，所述疫苗的施用引发提高的免疫应答。还考虑的包含本文所述的重组禽腺病毒载体的分离的细胞。任何重组禽腺病毒载体都可以有利地与合适的赋形剂组合来制备用于治疗动物， 尤其是禽类的药物组合物。附图简要说明
图1显示的是本发明的基于FAV的载体的示意图。图2显示的是各种包含r56蛋白的FAV构建物(天然、膜锚定或分泌形式)的 Western印迹分析。图3显示的是各种包含TFP250蛋白的FAV构建物(天然、膜锚定或分泌形式)的 Western印迹分析。图4显示的是自Heijne Eur. J. Biochem 133，17-21 (1983)的附图1复制过来的一组真核信号序列。将这些序列根据它们已知的或者预测的切割位点(以星号(*)表示) 比对。在这里示出的序列是SEQ ID NO :35-1240图5显示的是表达盒的化学合成的示意图。图6显示的是制备构建体的PCR扩增的示意图。图7显示的是用于插入序列的多克隆位点的使用的示意图。图8显示的是带有Y干扰素的分泌信号的CMVP-TFP250-pA/10M(FAV RHE)的质粒结构，其先前在附件中显示为“pl232entire”。全序列在本文SEQ ID NO: 17中示出。在该序列中，分泌信号序列是由SEQ ID NO :18(其位于SEQ ID NO :17的核苷酸56 . . 5712)编码的，并被翻译为蛋白质SEQ ID NO :19。截短型TFP250插入序列由序列SEQ ID NO :20(其位于SEQ ID NO 17的核苷酸5713至6348)编码，并被翻译成序列SEQ ID N0:21。该质粒在位置4965. . . 5623具有CMV启动子序列。该图中描述的信息以及相关的序列信息先前已在优先权在先申请美国临时专利申请第61/122，596号的附件中提出，该申请于2008年12 月15日递交(通过引用将其完整并入本文)。图9显示的是带有γ干扰素的分泌信号的MLP-R56-pA-pA/10M(FAV RHE)的质粒结构，其先前在附件中显示为“pl223entire”。全序列在本文SEQ ID N0:22中示出。在该序列中，分泌信号序列是由SEQ ID NO :23(其位于SEQ ID NO :22的核苷酸5381. . M61) 编码的，并被翻译为蛋白质SEQ ID NO :6。截短型R56插入序列由序列SEQ ID NO :24(其位于SEQ ID NO 22的核苷酸M62至6430)编码，并被翻译成序列SEQ ID NO :25。该质粒在位置5381. . . 5461具有MLP序列。该图中描述的信息以及相关的序列信息先前已在优先权在先申请美国临时专利申请第61/122，596号的附件中提出，该申请于2008年12月15 日递交(通过引用将其完整并入本文)。图IOA到IOC显示的是巨型艾美球虫的82kDa蛋白的序列。该图中显示的序列是 SEQ ID NO :26(上边一条链)，SEQ ID NO :27(下边一条)和 SEQ ID NO :28(蛋白序列)。图11显示的是巨型艾美球虫的R56序列(SEQ ID NO 2)、柔嫩艾美球虫的R56序列(SEQ ID NO 29)的比较。还示出了缺少信号序列的截短型R56的序列(SEQ ID NO :30)。 该图的下部显示了来自柔嫩艾美球虫的截短型R56 (SEQ ID NO 31)与来自巨型艾美球虫的截短型R56(SEQ ID NO :32)的比对。该序列信息图先前已在优先权在先申请美国临时专利申请第61/122，596号的附件中提出，该申请于2008年12月15日递交(通过引用将其完整并入本文)。图12显示的是巨型艾美球虫(SEQ ID NO 33)和柔嫩艾美球虫(SEQ ID NO 34)的变短形式的R56。该序列信息图先前已在优先权在先申请美国临时专利申请第61/122，596 号的附件中提出，该申请于2008年12月15日递交(通过引用将其完整并入本文)。发明详述本发明涉及制造和使用能够施用于肉鸡群体以实现这些禽类针对球虫病的保护性免疫力的重组病毒疫苗组合物的方法。这种疫苗可以在孵化后施用给这些禽类，并且不需要通过注射来施用，而是可以口服、通过食物供应、供饮、或者甚至作为气溶胶喷雾来施用。本发明的疫苗构建体的一个优点是它们指导被投递的免疫原表达到受感染细胞的细胞外的部位，而不是该免疫原的内部表达。在本文中描述的疫苗的情况下，免疫原相应地被投递到粘膜细胞(即鼻道、呼吸道、胃肠道、肠粘膜等中的粘膜细胞)的外表面，从而将免疫原提供到可以令免疫应答快速产生的位置与之相对的是，投递的免疫原在细胞内表达时，免疫原可能不会与合适的免疫应答机制发生高效的接触。现有的疫苗不满足本领域中对于有效的球虫病疫苗的长期需求，原因有若干。首先，目前可用的治疗球虫病的疫苗CoxAbic 只对母体提供免疫力，并依赖于该免疫力经由卵黄传递给肉鸡群体。母源性免疫力(maternal immunity)持续的时间相对较短，约为卵孵化后的前14天。因此对于引发长期的应答，尤其是在肉鸡中的长期应答而言它不是一种有效的疫苗。此外，这种疫苗是通过注射接种的。同样，这又使得这种疫苗对于更大群的年长禽只的效果不好。为了应对现有的球虫病治疗的问题，本发明人开发了一种用于赋予肉鸡保护性免疫力的新疫苗。该疫苗是基于一种在提供艾美球虫抗原在亚单位疫苗中的表达的禽腺病毒表达系统。该抗原与疏水性信号序列合框表达，并且或者呈现在施用了该疫苗的鸡体内病毒感染的细胞的细胞表面上，或者，当该表达载体中疏水性信号序列还包含切割信号时，分泌到这样的受感染鸡的细胞外区域。下面对于这些特征以及使用重组禽腺病毒球虫病疫苗所用的方法和组合物进行更详细的说明。广义上说，本发明的疫苗包含(is comprised of)这样的表达载体，其由(is made of)禽腺病毒基因组形成，并具有如图1所示的结构。禽类或称禽类腺病毒(FAV)是本领域技术人员公知的，其性质已经得到大量的描述。例如，已经有人描述了一种禽腺病毒， 称为禽腺病毒1型CELO (表示“鸡胚致命性孤儿”)株(Chiocca，S. et al.，J. Virol. 70 2939-49(1996) ；Li, P. et al. , J. Gen. Virol. 65 (Pt 10) :1817-25(1984) ；May, J. Τ. et al. ，Virology 68 :483-9(1975) ；Lehrmann, H. ，Cotton, Μ. ， J. Virol. 73 :6517-25(1999)； Chiocca, S. et al. ,J.Virol. 71 :3168-77 (1997))。CELO 用于形成基因治疗用载体，以及用于人和动物，尤其是禽类的抗感染性疾病疫苗的用途和操作方法也已经得到了大量描述， 例如在美国专利6，335，016中。CELO (FAV 1或FAV A)的完整基因组序列可以通过Genbank 登录号 U46933 ；NC 001720 和 AC 000014 找到。在特定的实施方案中，在本文中描述的方法和组合物中使用的禽类腺病毒载体是禽类腺病毒载体(FAV)，例如美国专利申请序列号08/448，617和09/272，032中描述的(本文通过引用纳入它们的内容)。在一个特别优选的实施方案中，所述载体包含FAV血清型 8(下面称“ 々￥8”)的右手端。FAV8的全核苷酸序列在本文中表示为SEQ ID NO :5。FAV8 表达载体的全核苷酸序列也包含在GenBank登录号AF155911中。用于分离和生产FAV8的方法在美国专利6，296, 852中有说明(本文通过引用将其全部并入)。FAV9 (又称 FAVD)在 Cao et al.，J. Gen. Virol. 79 (Pt 10)，2507-2516 (1998)中有记载，且其完整基因组示于GenBank登录号AF083975和NC 000899。考虑本领域技术人员已知的FAV的序列的教导，可以使用FAV 1、FAV 2、FAV 3、 FAV 4、FAV 5、FAV 6、FAV 7、FAV 8、FAV 9、FAV 10、FAV 11、FAV 12 或任何后来分离的禽腺病毒血清型(病毒分类参见 Monreal,G. Adenoviruses and adeno-associated viruses of Poultry. Poultry Science Rev. 4，p. 1-27 (1992))容易地制备本发明的疫苗。如美国专利6，296，852所述，FAV CFA20 (其是一种FAV血清型10)、CFA15 (血清型10)和CFA 40 和CFA 44 (均为血清型8)，以及FAV CFA15与CFA19 (血清型9)可能是对疫苗制备而言特别有用的。在本发明制备的疫苗中使用的启动子可以是任何能够驱动FAV构建体中感兴趣的异源编码区的表达的启动子。这样的启动子包括但不限于禽腺病毒主要晚期启动子 (MLP)，CMVp, PGK-, El-、SV40早期启动子(SVG2)，SV40晚期启动子，SV-40立即早期启动子，iM晚期启动子，和HSV-I TK(疱疹病毒1型胸苷激酶)基因启动子，RSV(劳氏肉瘤病毒)LTR(长末端重复)和PGF (磷酸甘油酸激酶)基因启动子。FAV MLP的DNA序列示于美国专利6，296, 852的图5。许多其他哺乳动物或禽类启动子是本领域技术人员已知的并且也可以使用。在本文中描述的疫苗中使用的启动子驱动疏水性信号序列与感兴趣的可读框或编码区的核酸序列合框连接而成的合框融合物(in-frame fusion)的表达。所述疏水性信号序列可以是任何能够用来将感兴趣的可读框或编码区的表达靶定于或者特异性引导到感染了禽类腺病毒表达载体的宿主细胞的外膜的序列。在本发明中，基于FAV的表达载体意图用于感染鸡。FAV典型地感染鸡的粘膜、肝和上皮细胞，例如可以在鸡的肠道、呼吸道或者胃肠道中发现。因此，疏水性信号序列将感兴趣的可读框或者编码区的表达转移到这些粘膜细胞的细胞表面。通过如此将感兴趣的可读框或编码区呈现在动物中的粘膜细胞的细胞表面，本发明的疫苗能够最有效地将抗原投递到相对于在动物的细胞内表达(此时其协助产生免疫应答的有效性可能较低)而言能够有效产生免疫应答的体内部位。与用野生型免疫原制备抗体的情形相比，利用这里描述的疫苗使得表达产物分泌到细胞外，可导致更强的抗体免疫应答和抗体产生。在真核细胞中，分泌蛋白质被疏水性信号序列靶定到内质网膜。本发明利用这种性质来采用异源疏水性信号序列来引导疫苗中给定的蛋白质表达到细胞表面。这里所使用的病毒载体是重组载体，原因在于它们包含这样的多核苷酸构建物 其含有编码修饰型ORF的核酸，其中该ORF的表达产物容许截短型ORF蛋白在表达后即被分泌(从受感染的细胞)或者直接将该蛋白表达在受感染细胞的表面上。例如，感兴趣的 0RF2与来自鸡γ干扰素、猪Y干扰素、或流感病毒HA蛋白的信号序列合框表达。其他可以使用的信号序列包括例如下列的信号序列乳清磷蛋白信号序列、α "I酸性糖蛋白、α -促甲状腺素；来自八目鳗类(hagfish)的胰岛素、来自琵琶鱼(anglerfish)的胰岛素、人胰岛素、大鼠胰岛素I或II、绵羊β-酪蛋白、绵羊X-酪蛋白、绵羊α-乳清蛋白、绵羊β-乳球蛋白、绵羊α-si酪蛋白、和绵羊a-s2酪蛋白；VS病毒糖蛋白、小公鸡VLDL-11、蜜蜂蜂毒肽、大鼠乳糖(Iactin)、人胎盘催乳激素、人β -绒毛膜促性腺激素、人α -绒毛膜促性腺激素、兔子宫珠蛋白(uteroglobin)、大鼠生长激素、人生长激素、人、牛生长激素、牛甲状旁腺素、大鼠松弛素、大鼠血清白蛋白、人血清白蛋白、大鼠肝白蛋白、鸡原弹性蛋白B、鸡卵类粘蛋白、鸡溶菌酶、鸡伴清蛋白、人α-l抗胰蛋白酶、大鼠前列腺结合蛋白、大鼠前列腺结合蛋白c2、AD病毒糖蛋白、大鼠载脂蛋白Al、狂犬病毒糖蛋白、人流感Victoria血凝素、人流感Jap血凝素、禽流感FPV血凝素、人白细胞干扰素、人免疫干扰素、人成纤维细胞干扰素、 小鼠X-免疫球蛋白、小鼠λ-免疫球蛋白、小鼠X-免疫球蛋白、小鼠H-链免疫球蛋白、 小鼠胚胎VH-免疫球蛋白、小鼠H-链免疫球蛋白、猫胰蛋白酶原1、猫胰蛋白酶原2+3、猫糜蛋白酶原2、猫羧肽酶Al、猫淀粉酶、小鼠淀粉酶、大鼠淀粉酶、兔α-乳清蛋白、猪α-乳清蛋白、大鼠羧肽酶Α、牛ACTH- β -LPH前体、猪ACTH- β -LPH前体、人ACTH- β -LPH前体、 猪胃蛋白酶、小鼠颤蛋白、锥虫糖蛋白、鲶鱼促生长素抑制素、琵琶鱼促生长素抑制素、大鼠降钙素、和琵琶鱼胰高血糖素。所有上述这些信号序列都显示在von Heijne et al. Eur. J. Biochem 13317-21 (1983)的图1中，并且可以容易地适用于本文。图2中再现了来自上述参考文献的图1的信号序列。对于给定的蛋白质，这些和其他信号序列可以容易地利用本领域技术人员已知的方法来确定。例如，可以使用SignalP 3. O服务器端(Bendtsen，J. D.，Nielsen, H.， von Heijne, G. & Brunak, S. (2004)Improved prediction of signal peptides :SignalP 3. 0. J. Mol. Biol. 340,783-795)来预测信号肽位点。此外，还可以利用帮助确定信号肽序列的站点，参见，例如http://www. cbs. dtu. dk/services/SiRnalP/0所使用的信号肽的具体身份是不重要的，只要它是能够将表达的产物运输到细胞表面的疏水性序列即可。在优选的实施方案中，信号序列包含切割位点，该位点使得信号序列能够被切割，并容许搭接的蛋白质被分泌到这样的细胞的胞外空间。在特别优选的实施方案中， 本发明的这个方面是使用来自鸡YlFN的信号序列来演示的，所述信号序列包含序列 MTCQTYNLFVLS VIMIYYGHTASSLNL (SEQ ID NO 6)，由 DNA 序列 ATG ACT TGC CAG ACT TAC AAC TTG TTT GTT CTG TCT GTC ATC ATG ATT TAT TAT GGA CAT ACT GCA AGT AGT CTA MT CTT (SEQ ID NO :7)编码；猪 γ IFN 的疏水性信号序列是MSYTTYFLAFQLCVTLCF SGSYC(SEQ ID NO :8)，其由 DNA 序列 ATG AGT TAT ACA ACT TAT TTC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ACT TTG TGT TTT TCT GGC TCT TAC TGC (SEQ ID NO :9)编码；人流感病毒H1N2 的疏水性信号序列是MKVKLLILLCTFTATYADTI (SEQ ID NO 10)，由序列 atg aaa gta aaa cta ctg ate ctg tta tgt aca ttt aca get aca tat gca gac aca ata (SEQ ID NO :11)编码。 例性序列各自还包含切割位点，信号肽酶作用于此类位点，导致表达的ORF被释放。除了启动子和疏水性信号序列(可以或可以不含有切割位点)，表达载体还包含聚腺苷酸化序列。PolyA尾保护mRNA分子不被细胞质中的外切核酸酶降解，并且帮助转录终止、mRNA自细胞核的输出、以及翻译。几乎所有的真核mRNA都是聚腺苷酸化的。本领域技术人员常规上均为蛋白质的重组表达添加PolyA尾序列。插入本发明的载体中的ORF或其他外源序列可以是任何期望通过使用本文所述的FAV载体来表达的ORF或其他外源序列。这些其他外源序列可以由一个或多个感兴趣的 ORF或者表达产物、或者其他不是基因但具有其他治疗上有价值的功能的核苷酸序列所组成。然而，在特定的实施方案中，本发明描述了要用作亚单位疫苗来对鸡进行抗球虫病接种的疫苗。在此语境中，感兴趣的ORF是编码顶复门(apicomplexan)原生动物寄生物艾美球虫属的抗原的0RF。更具体地说，ORF选自如美国专利7，423，137(通过引用并入本文)所述的56kDa、82kDa和230kDa抗原。更具体地，本发明人已经发现，将56kDa (本文中又称其为r56)或230kDa (本文中又称其为TPF250)抗原的全长序列整合到FAV中不会产生有效的疫苗。然而，当使用截短的r56序列时，疫苗可以有效地引发免疫应答。r56的全长氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，该蛋白质序列由SEQ ID NO :1的序列所编码，编码r56的全长基因也在SEQ ID NO :14中示出。此外，编码56kDa抗原的质粒由Australian Government Analytical Laboratories，Pymble，Australia 以保藏号 NM01/22400 向公众提供。从同一保藏机构还可以以保藏号NM01/2M01获得用56kDa抗原转化的细菌细胞。因此，在特定的实施方案中，使用截短型的r56来制备球虫病疫苗。r56的序列包含SEQ ID NO 2的氨基酸M-345，其可以由SEQ ID NO 14的70-1035的序列所编码。在本发明的一种优选的球虫病疫苗中，截短的r56序列与疏水性信号序列合框，所述信号序列可将所述截短型r56锚定在受感染的细胞的细胞表面。在本发明的另一种优选的球虫病疫苗中，截短的r56序列与包含切割位点的疏水性信号序列合框，使得运输到膜的细胞外侧后，截短型r56即被释放到细胞的细胞外空间中。在优选的实施方案中，提供这样的球虫病疫苗，其中被锚定的r56 蛋白通过禽流感HA抗原的疏水性信号序列被锚定到细胞表面。在其他的具体实施方案中， 提供这样的球虫病疫苗，其中含有切割位点的疏水性信号序列选自鸡Y干扰素、猪Y干扰素、和人流感病毒H1N2。在某些实施方案中，可以制备球虫病疫苗组合物，其同时包含两种类型的疫苗，即容许截短型r56的细胞表面表达的疫苗，和将表达的r56释放到细胞外空间的疫苗。
在其他的示例性实施方案中，使用截短型TFP250来制备球虫病疫苗。TFP250的全长序列如SEQ ID NO 4所示，并由SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 16编码。编码250kDa的质粒可以从 Australian Government AnalyticalLaboratories, Pymble, Australia 以保藏号NM01/22396公开获得。可以从同一保藏机构以保藏号NM01/22397获得用这种抗原转化的细菌细胞。在本文中优选的疫苗中使用的TFP250的序列包含SEQ ID NO :4的氨基酸2149-2361或氨基酸2150-2361，其分别可以由SEQ ID NO 16的序列6444-7083和 2149-2361编码。在本发明的优选的球虫病疫苗中，截短的TFP250序列与疏水性信号序列合框，所述疏水性信号序列将截短型TFP250锚定到受感染细胞的细胞表面。在本发明的另一种优选的球虫病疫苗中，截短的TFP250序列与包含切割位点的疏水性信号序列合框，使得运输到膜的细胞外侧后，截短型TFP250即被释放到细胞的细胞外空间中。在特定的实施方案中，提供这样的球虫病疫苗，其中被锚定的r56蛋白通过禽流感HA抗原的疏水性信号序列被锚定到细胞表面。在其他的具体实施方案中，提供这样的球虫病疫苗，其中含有切割位点的疏水性信号序列选自鸡Y干扰素、猪Y干扰素、和人流感病毒H1N2。在某些实施方案中，可以制备球虫病疫苗组合物，其同时包含两种类型的疫苗，即容许截短型TFP250的细胞表面表达的疫苗，和将表达的TFP250释放到细胞外空间的疫苗。类似地，还考虑到所述疫苗也可以和表达艾美球虫属82kDa抗原的疫苗结合制备。公众可以从抗原 Australian Government Analytical Laboratories, Pymble, Australia以保藏号NM01/22398获得82kDa(本文中又称gam82)抗原，而且从同一保藏单位还可以获得用82kDa抗原转化的细菌细胞，其保藏号为NM01/22399(在本文附件中有示明)。本发明的任何疫苗均可以结合已有的接种程序使用。例如，本文所描述的疫苗可以与 CoxAbic 结合使用以在产蛋鸡(breeders)、小鸡和更年长的鸡中产生保护性免疫力。虽然本文中描述的许多实例涉及的是从巨型艾美球虫抗原制备的疫苗，但显而易见的是技术人员可以使用来自其他艾美球虫属物种的同源序列来制备这样的疫苗。技术人员使用常规的分子生物学技术，借助与上文的来自巨型艾美球虫的可读框的序列的同源性，能够容易地鉴定出这样的合适的DNA序列。因此，具体考虑了来自其他艾美球虫属物种，例如柔嫩艾美球虫、堆形艾美球虫、毒害艾美球虫、早熟艾美球虫、和缓艾美球虫或布氏艾美球虫的巨型艾美球虫r56、TFP250及82kDa ORF的同源物用于制备本文所描述的球虫病疫苗。关于这一点，SEQ ID N0:12提供了柔嫩艾美球虫的r56的序列。考虑到柔嫩艾美球虫和巨型艾美球虫的r56序列被显示有效，技术人员能够容易地鉴定来自其他艾美球虫属物种的r56的同源物来用于本文所述的方法和组合物。在优选的实施方案中，本发明的疫苗被用来提供一种针对由柔嫩艾美球虫、巨型艾美球虫、堆形艾美球虫、毒害艾美球虫、早熟艾美球虫、和缓艾美球虫、或布氏艾美球虫导致的感染免疫受试者的方法，或者提供表达免疫学交叉反应性抗原的微生物，包括对所述受试者施用主题发明的疫苗。在特别优选的实施方案中，受试者是禽类物种，包括但不限于选自下组的禽类物种鸡、火鸡、鹅、鸭、矮脚鸡、鹌鹑和鸽。在特别优选的实施方案中，所述禽类物种是鸡，更具体地是肉鸡。所述疫苗可以通过任何通常用于接种的途径施用，包括但不限于全身(例如静脉内、气管内、血管内、肺内、腹膜内、鼻内、胃肠外、肠道、肌肉内、皮下、肿瘤内或颅内)、通过口服施用、通过气溶胶化或肺内滴注。施用可以作为单剂进行，或者作为经过一定时间间隔重复一次或多次的剂量进行。合适的施用途径和剂量将视情况(例如接受治疗的个体、要治疗的疾患、或感兴趣的多肽的片段或0RF)而变化，但本领域技术人员能够确定它们。疫苗可以按照常规的施用方案来施用，例如通过与给药剂型相容的方式单次或重复施用，且采取将在预防上有效的施用量，即，将可在禽类(尤其是家禽)中诱导出对抗有毒力的艾美球虫属寄生物攻击的免疫力的致免疫抗原(immunizing antigen)或者能够表达所述抗原的重组微生物的量。免疫力定义为在禽类群体中，在接种后与未经接种的组相比，显著水平的保护作用。在特定的实施方案中，所赋予的免疫力是增强的免疫力，其中本发明的疫苗在接种后在禽类群体中诱导出如此水平的保护作用，其相比于用包含全长r56 或全长TFP250抗原或全长82kDa抗原的亚单位FAV载体接种所述禽类时见到的保护作用更有效。观察到这种更有效的接种的原因是这里的亚单位疫苗比自全长序列制备的亚单位疫苗具有更大的稳定性。本发明的疫苗可以降低受感染动物排出的卵囊的数目。通常情况下，排出的卵囊会感染群体中其他的动物。这样，排出的卵囊数目减少也将使得随后被感染的动物数目的降低，而且，排出的卵囊数目减少还会降低感染负荷。在特定的实施方案中，本发明的疫苗降低禽类在后续被艾美球虫属感染攻击时的盲肠病灶数(number of cecal lesions)。典型地，活病毒载体疫苗每只鸡的剂量率(dose rate)可从IO2-IOuiPfu不等(但即使< IOOOpfu亦可能足够，例如对于HVT而言)。本发明的疫苗还可以与同一和/或其他艾美球虫属物种的其他抗原性组分，和/ 或与源自家禽病原性病毒或微生物的额外的免疫原，和/或编码这些免疫原的核酸序列有效地混合。这样的组合疫苗能够减少鸟群的寄生物负荷，并且能够增加针对球虫病的保护水平，还可针对其他家禽病原体提供保护。这样的其他免疫原可以包括，例如选自下组的家禽病原性病毒或微生物马莱克氏病病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒 (IBV)、鸡贫血因子(CM)、呼肠孤病毒、禽逆转录病毒、家禽腺病毒、火鸡鼻气管炎病毒、沙门氏菌属菌种(Salmonella spp.)或大肠杆菌(E. coli)。因此，本发明涵盖多价疫苗。尤其优选的多价疫苗是如下所述的本发明的球虫病疫苗其包含与上文所述的表达TFP250的禽腺病毒疫苗组合，和/或与上文所述的表达82kDa抗原的禽腺病毒疫苗组合的上文所述的表达r56的载体。对于本发明的自巨型艾美球虫的截短型抗原制备的、在基于FAV的亚单位疫苗中表达的疫苗而言，它们的一个特别优点是它们能够通过气溶胶喷雾或者通过滴眼液，或者甚至通过在饮水中、胚中(in ovo)、或在肉禽(broiler bird)的禽饲料中施用，或者配制为凝胶基质以供禽只摄入，这样使得这些疫苗即使在典型的过度拥挤条件下仍可以适用于对肉禽的大规模接种。因此，优选地，可以用有助于疫苗的喷洒以实现其施用的赋形剂来制备疫苗。本发明的这些疫苗可以喷洒于或者饲与新孵化的小鸡；类似地，可以将它们喷洒于或者饲与更年长的禽只。本发明的疫苗能够保护家禽以对抗艾美球虫属感染的致病作用，较之于用r56全长序列或TFP250全长序列制作的类似疫苗产生更显著的(pronounced)免疫应答并赋予更好的免疫力。依照本发明的疫苗可以通过例如仅将如上所述的禽腺病毒载体与药学药学上可接受的担载体(carrier)掺混来制备。药学上可接受的担载体理解为这样的化合物，其不会对要接种的动物的健康产生不良影响，至少不良影响不会达到比不免疫动物时动物患病而导致的影响更坏的程度。药学上可接受的担载体可以是例如灭菌水或者灭菌的生理盐溶液。在更复杂的形式中，所述担载体可以是例如缓冲液。或者，本发明的球虫病疫苗还可以包含佐剂。佐剂一般性地包括以非特异性的方式加强宿主的免疫应答的物质。本领域中有若干不同的佐剂是已知的。佐剂的例子包括弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，维生素E，非离子型嵌段共聚物，以及多胺诸如硫酸右旋糖酐、卡波普(carbopol)和吡喃。同样特别适合的还有表面活性物质如斯盘(Span)、吐温 (Tween)、十六烷基胺、溶血卵磷脂、甲氧基十六烷基甘油(methoxyhexadecylglycerol)、 和皂苷诸如Quill A 。此外，肽类，如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸、促吞噬素(tuftsin)等， 经常被使用。除了这些佐剂外，优选地可以使用免疫刺激性复合物(ISCOMQ、矿物油例如Bayol 或Markol 、植物油或其乳液，以及Diluvac Forte。疫苗还可以包含“运载体”(vehicle)。运载体是这样的化合物，多肽附着于它，但不和它共价结合。常用的运载体化合物有例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、或氧化铝，二氧化硅，高岭土，和膨润土。此类运载体的一种特殊形式，其中抗原被部分地包埋于运载体中，是所谓的ISC0M(EP 109. 942,EP 180. 564，EP 242. 380)。疫苗组合物还可以包含稳定剂，例如为了保护容易降解的多肽不被降解、延长疫苗的货架期，或改善冻干效率。有用的稳定剂包括脱脂乳、明胶、牛血清白蛋白、碳水化合物例如山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或者葡萄糖，蛋白质如白蛋白或酪蛋白或其降解产物，以及缓冲剂，诸如碱金属磷酸盐。冻干的材料可以保存多年并维持活力。冻干材料的保存温度可以大大高于零度而不会对材料产生损害。在某些方面中，所述疫苗是冻干的。
实施例下面的实施例演示依照本发明的疫苗的生产。在这些实施例中，使用了禽腺病毒血清型8 (FAV8)。使用这种递送系统的一个主要好处在于它能够利用减毒的FAB8作为载体用于对合适靶组织(在这里是肠粘膜)的亚单位疫苗投递。实施例1 构建体的制备和分析在本实施例中，将来自艾美球虫属寄生物的大配子母细胞阶段的最具免疫原性的蛋白质之一，重组蛋白r56。克隆到FAV8载体中。此外，将另一种来自艾美球虫属卵块发育期的免疫原性蛋白，重组蛋白-TFP250，单独克隆到另一 FAV8载体中。这种TFP2500RF编码一种微线体(与寄生物侵袭有关的一种细胞器)蛋白的一部分，这种蛋白在先前的研究中被证明也可诱导针对艾美球虫属感染攻击的部分保护性免疫。形成的表达构建体显示于下面的两个表中。球虫病构建体中用到
权利要求
1.一种用于保护家禽以对抗艾美球虫属(Eimeria)感染的球虫病疫苗，所述疫苗包含重组禽腺病毒载体，该载体包含与启动子可操作连接的包含编码膜锚定域的核酸的疏水性信号序列，用于插入可读框(ORF)以允许ORF与所述疏水性信号序列合框地插入的多克隆位点，聚腺苷酸化信号；以及禽腺病毒基因组。
2.权利要求1的球虫病疫苗，其中感兴趣的ORF编码选自下组的抗原巨型艾美球虫 (Eimeria maxima)的截短型r56抗原、巨型艾美球虫的截短型TFP250抗原、和巨型艾美球虫的截短型82kDa抗原。
3.权利要求1的球虫病疫苗，其中所述多克隆位点含有0RF，所述ORF编码与巨型艾美球虫的截短型TFP250抗原和/或巨型艾美球虫的截短型82kDa抗原组合的巨型艾美球虫的截短型r56抗原。
4.权利要求1的球虫病疫苗，其中所述禽腺病毒基因组选自FAVUFAV 2、FAV 3、FAV 4、FAV 5、FAV 6、FAV 7、FAV 8、FAV 9、FAV 10、FAV 11 禾口 FAV 12 的基因组。
5.权利要求1的球虫病疫苗，其中所述禽腺病毒基因组是FAV8基因组。
6.权利要求1的球虫病疫苗，其中所述重组禽腺病毒载体还包含位于所述用于插入感兴趣的ORF的克隆位点之紧邻上游的切割序列，其中来自所述载体的表达产物产生可溶产物。
7.权利要求2的球虫病疫苗，其中所述编码抗原的核酸选自下组a)截短型R56，包含如SEQID NO :13所示的全长r56序列的核苷酸70-1035，但不编码如SEQ ID NO 2所示的全长r56蛋白序列；b)截短型r56，编码由SEQID NO 2的氨基酸M-345或者SEQ ID NO 2的氨基酸 24-345的片段组成的截短型R56片段；c)截短型TFP250，包含如SEQID NO 16所示的全长TFP250序列的核苷酸6448-7083 的序列，但不编码如SEQ ID NO 4所示的完整TFP250蛋白序列；禾口d)截短型TFP250，其由SEQID NO 6的核苷酸6448-7083的核酸序列组成。
8.一种用于保护家禽以对抗艾美球虫属感染的球虫病疫苗，所述疫苗包含重组禽腺病毒载体，该载体包含与启动子可操作连接的包含编码膜锚定域的核酸的疏水性信号序列， 与所述疏水性信号序列合框地插入的、编码由SEQ ID N0:2的氨基酸 -345或SEQ ID NO: 2的氨基酸M-345的片段组成的截短型r56的核酸，聚腺苷酸化信号；以及禽腺病毒基因组。
9.一种用于保护家禽以对抗艾美球虫属感染的球虫病疫苗，所述疫苗包含重组禽腺病毒载体，该载体包含与启动子可操作连接的包含编码膜锚定域的核酸的疏水性信号序列， 与所述疏水性信号序列合框地插入的、由SEQ ID NO 16的核苷酸6448-7083的核酸序列组成的编码截短型TFP250的核酸，聚腺苷酸化信号；以及禽腺病毒基因组。
10.一种用于保护家禽以对抗艾美球虫属感染的球虫病疫苗，所述疫苗包含重组禽腺病毒载体，该载体包含与启动子可操作连接的包含编码膜锚定域的核酸的疏水性信号序列，与所述疏水性信号序列合框地插入的、编码巨型艾美球虫的截短型82kDa抗原的核酸， 聚腺苷酸化信号；以及禽腺病毒基因组。
11.一种多价球虫病疫苗制备物，其包含权利要求7的球虫病疫苗以及球虫病疫苗，其包含重组禽腺病毒载体，该载体包含与启动子可操作连接的包含编码膜锚定域的核酸的疏水性信号序列，和与所述疏水性信号序列合框地插入的由SEQ ID NO 16的核苷酸6448-7083的核酸序列组成的编码截短型TFP250的核酸，聚腺苷酸化信号；以及禽腺病毒基因组；和/或球虫病疫苗，其包含重组禽腺病毒载体，该载体包含与启动子可操作连接的包含编码膜锚定域的核酸的疏水性信号序列，与所述疏水性信号序列合框地插入的编码巨型艾美球虫的截短型82kDa抗原的核酸，聚腺苷酸化信号；以及禽腺病毒基因组。
12.权利要求11的多价球虫病疫苗制备物，还包含选自下组的免疫原马莱克氏病病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡贫血病毒(CAV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽流感(Al)、呼肠孤病毒、禽逆转录病毒、家禽腺病毒、火鸡鼻气管炎病毒、 沙门氏菌属菌种(Salmonella spp.)和大肠杆菌(E. coli)。
13.一种免疫受试者以对抗由柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)、巨型艾美球虫、堆形艾美球虫(Eimeria acervulina)、毒害艾美球虫(Eimeria necatrix)、早熟艾美球虫 (Eimeria praecox)、禾口缓艾美球虫(Eimeria mitis)或布氏艾美球虫(Eimeria brunetti) 导致的感染的方法，其包括对受试者施用权利要求1的疫苗。
14.权利要求13的方法，其中与用包含全长r56或全长TFP250抗原或全长82kDa抗原的FAV载体免疫所述受试者时所见的免疫力相比，所述施用引发提高的免疫力水平。
15.权利要求13的方法，其中所述受试者是选自下组的禽类物种鸡、火鸡、鹅、鸭、矮脚鸡、鹌鹑和鸽。
16.权利要求15的方法，其中所述禽类物种是鸡。
17.权利要求16的方法，其中所述鸡是成年肉鸡。
18.权利要求13的方法，其中所述施用包括用所述疫苗对所述受试者喷雾，将所述疫苗在食物中饲与所述受试者，以及在所述受试者的供饮中提供所述疫苗。
19.一种用于为鸡群提供抗柔嫩艾美球虫、巨型艾美球虫、堆形艾美球虫、毒害艾美球虫、早熟艾美球虫、和缓艾美球虫、或布氏艾美球虫的保护性免疫力的组合接种疗法，包括对受试者施用权利要求1的疫苗和对所述鸡群施用CoxAbic 的步骤。
20.权利要求19的组合接种疗法，其中将所述CoxAbic 施用给产蛋母鸡以赋予孵出的小鸡免疫力，并将所述权利要求1的疫苗在孵出后第1天及之后施用给所述群的小鸡并施用给成年肉母鸡。
21.—种重组禽腺病毒载体，其包含禽腺病毒基因组，该基因组包含异源启动子、异源疏水性信号序列、多克隆位点、和聚腺苷酸化序列，其中所述启动子和所述疏水性信号序列位于多克隆位点的上游，其中在所述多克隆位点中插入感兴趣的ORF将产生能够在所述启动子的控制下与所述信号序列合框地表达所述感兴趣的ORF的表达载体。
22.权利要求21的重组禽腺病毒载体，其中所述疏水性信号序列包含切割位点，以容许从表达所述感兴趣的ORF的表达产物的宿主细胞中分泌该表达产物。
23.权利要求21的重组禽腺病毒载体，其中所述信号序列不包含切割位点，从而导致所述感兴趣的ORF锚定于宿主细胞的细胞表面的融合表达产物的表达。
24.一种重组禽腺病毒载体，包含与启动子可操作连接的包含编码膜锚定域的核酸的疏水性信号序列，用于插入感兴趣的可读框(ORF)以允许感兴趣的ORF与所述疏水性信号序列合框地插入的多克隆位点，聚腺苷酸化信号；以及禽腺病毒基因组。
25.权利要求M的重组禽腺病毒载体，还包含位于所述用于插入感兴趣的ORF的克隆位点之紧邻上游的切割序列，其中来自所述载体的表达产物产生可溶ORF产物。
26.—种重组禽腺病毒载体，其包含与启动子可操作连接的a)疏水性分泌信号序列及切割位点，或者包含编码膜锚定域的核酸的信号序列，b)编码巨型艾美球虫的截短型r56蛋白的核酸，c)聚腺苷酸化信号，和d)禽腺病毒基因组。
27.—种重组禽腺病毒载体，其包含与启动子可操作连接的a)疏水性分泌信号序列及切割位点，或者包含编码膜锚定域的核酸的信号序列，b)编码巨型艾美球虫的截短型TFP250蛋白的核酸，c)聚腺苷酸化信号，和d)禽腺病毒基因组。
28.—种重组禽腺病毒载体，其包含与启动子可操作连接的a)疏水性分泌信号序列及切割位点，或者包含编码膜锚定域的核酸的信号序列，b)编码巨型艾美球虫的截短型82kDa蛋白的核酸，c)聚腺苷酸化信号，和d)禽腺病毒基因组。
29.权利要求沈的重组禽腺病毒载体，其中所述编码截短型r56的核酸包含如SEQID NO 14所示的全长r56序列的核苷酸70-1035的序列，但不编码如SEQ ID NO 2所示的完整r56蛋白序列。
30.权利要求沈的重组禽腺病毒载体，其中所述编码截短型r56的核酸编码由SEQID NO 2的氨基酸M-345或者SEQ ID NO 2的氨基酸M-345的片段组成的截短型R56片段。
31.权利要求沈的重组禽腺病毒载体，其中所述编码截短型TFP250的核酸包含如SEQ ID NO 16所示的全长TFP250序列的核苷酸6448-7083的序列，但不编码如SEQ ID NO 4 所示的完整TFP250蛋白序列。
32.权利要求沈的重组禽腺病毒载体，其中所述编码截短型r56的核酸编码由SEQID NO 4的氨基酸2150-2361组成的截短型r56片段。
33.权利要求27的重组禽腺病毒载体，其中所述编码截短型TFP250的核酸包含如SEQ ID NO 16所示的全长TFP250序列的核苷酸6444-7083的序列，但不编码如SEQ ID NO 4 所示的完整TFP250蛋白序列。
34.权利要求27的重组禽腺病毒载体，其中所述编码截短型TFP250的核酸编码由SEQ ID NO 4的氨基酸2149-2361组成的截短型TFP250片段。
35.权利要求沈的重组禽腺病毒载体，其中所述分泌信号序列选自鸡Y干扰素、猪Y 干扰素、及人流感H1N2的分泌信号序列。
36.权利要求沈的重组禽腺病毒载体，其中所述膜锚定信号序列选自禽流感HA抗原的分泌信号序列。
37.一种疫苗，其包含权利要求沈的重组禽腺病毒载体。
38.一种在禽类群体中引发免疫应答的方法，包括对所述群体施用权利要求38的疫田ο
39.一种接种家禽群体以对抗球虫病的方法，包括施用包含权利要求M的重组禽腺病毒载体的疫苗，其中与施用包含全长r56或全长TFP250的疫苗相比，所述疫苗的施用引发提高的免疫应答。
40.一种分离的细胞，包含权利要求M的重组禽腺病毒载体。
41.一种药物制剂，包含权利要求M的重组禽腺病毒载体和合适的赋形剂。
全文摘要
本发明涉及用于接种家禽抗艾美球虫属感染的球虫病疫苗，该疫苗包含重组禽腺病毒载体，该载体包含合框的与(异源)启动子连接的用于膜锚定的疏水性信号序列，或与(异源)启动子连接的用于允许分泌的疏水性分泌信号和切割位点；用于合框插入艾美球虫属抗原ORF(如源自r56、82kDa和/或TFP250抗原的多克隆位点；聚腺苷酸化信号；和禽腺病毒基因组。
文档编号A61K39/012GK102333877SQ200980156725
公开日2012年1月25日 申请日期2009年12月14日 优先权日2008年12月15日
发明者M.G.谢波德 申请人:维克托根有限公司