用铜氧还蛋白预防癌症的组合物和方法

专利名称：用铜氧还蛋白预防癌症的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及包含铜氧还蛋白、和铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物的组合物，所述铜氧还蛋白和铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物在哺乳动物细胞、组织和动物中抑制癌前病变的发展。本发明还涉及铜氧还蛋白、和铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物作为化学预防剂在哺乳动物中抑制癌前病变的发展并最终抑制癌症的应用。背景癌症化学预防是使用天然的、合成的或生物的化学剂来逆转、抑制或预防浸润性癌症的致癌进展。最近在高风险群体中进行的预防癌症的临床试验表明，化学预防性治疗对于高风险患者来说是一种实际可行的治疗。化学预防性治疗基于多病灶区域致癌作用和多级致癌的概念。在区域性致癌中，组织区域的全身性致癌物暴露导致组织中的弥漫性上皮损伤和突变细胞的克隆性增殖。区域内的这些遗传突变增加了该区域中一种或多种癌前病变或恶性病变发生的可能。多级致癌在这些基因和表型改变的逐步累积中。阻遏多级致癌中的一个或多个步骤可阻止或预防癌症的发展。一般参见Tsao等人，CA Cancer J Clin 54 150-180(2004)。可用小鼠乳腺器官培养(MMOC)分析来评估潜在的化学预防剂对激素诱导的乳腺结构分化和DMBA诱导的腺内肿瘤发生前增生腺泡节样病变的抑制作用。来自年轻的未交配的动物的乳腺在胰岛素(I) +催乳素(P) +醛固酮㈧存在下孵育6天后可分化成完全成熟的腺体。这些腺体在形态学上类似于来自妊娠小鼠的腺体。醛固酮可以用雌激素(E) + 孕酮(Pg)来代替。向培养基中加入氢化可的松(H)刺激了乳腺的功能性分化:Mehta和 Banerjee,Acta Endocrinol. 80 501 (1975) ；Mehta禾口Moon，Breast Cancer :Treatment and Prognosis 300，300 (Basil A Stoll 编辑·，Blackwell Press 1986)。这样，在该培养系统中观察到的激素诱导的结构性和功能性分化模拟了动物的不同生理阶段过程中对激素的反应。在MMOC中，小鼠在癌症形成前表现出独特的肿瘤前阶段。C3H小鼠中的这种肿瘤前病变由小鼠乳腺肿瘤病毒诱导，或在BALB/c小鼠中由DMBA来诱导。在生长期的第3天和第4天之间将腺体暴露在2 μ g/mlDMBA下，随后使所述腺体在仅含胰岛素的培养基中复原2-3周，导致了乳房腺泡病变(MAL)的形成。Hawthorne等人，Pharmaceutical Biology 40:70-74(2002) ；Mehta 等人，Methods in Cell Science 19:19-24(1997)。并且，将从含有DMBA诱导的乳腺病变的腺体中制备的上皮细胞移植到同源宿主中导致了乳腺癌的形成。Telang等人，PNAS 76:5886-5890(1979)。这些肿瘤在病理学上类似于当同系小鼠被施用DMBA时体内观察到的那些。同前。MMOC中DMBA诱导的乳房病变形成可通过多种化学预防剂诸如类视黄醇来抑制。这些剂包含来源于诸如芸薹宁(brassinin)、白藜芦醇(resveretrol)、硫醇类、抗氧化剂、鸟氨酸脱羧酶抑制剂诸如0FM0和鱼藤素、前列腺素合成抑制剂、Ca调节剂等的天然产物的化学预防剂。Jang 等人，Science 275:218-220(1997) ；Mehta，Eur. J. Cancer 36: 1275-1282(2000) ；Metha 等人，J. Natl. Cancer Inst. 89 :212_219 (1997)。这些研究清楚地表明该器官培养系统提供了测定针对乳房致癌作用化合物的有效性的独特模型。其结果与体内施用所述化合物获得的抑制密切相关。MMOC也可经诱导形成乳房导管病变(MDL)。如果用雌激素和孕酮代替醛固酮，并在培养基中加入氢化可的松，即可诱导MDL。卵巢留类存在下腺泡结构非常小，但在组织病理学切片中可观察到导管内病变。Mehta等人，J. Natl. Cancer Inst. 93 :1103_1106 (2001)。 选择性作用于卵巢激素依赖的ER+乳腺癌的抗雌激素诸如他莫昔芬，抑制了 MDL形成而非 MAL形成。这样，该经过改良的培养物模型除了常规MAL诱导方案外现可用于评价化学治疗剂对MAL和MOL的作用。蛋白质进入哺乳动物细胞通常由蛋白质的小片段所指挥，其常被称作“蛋白质转导结构域”或PTD。可将该片段用作与外部蛋白连接的信号以协助该蛋白转导入哺乳动物细胞中。例如，在人类成纤维细胞HS68中或小鼠淋巴细胞白血病L1210细胞中，两亲性肽被用来协助DNA裂解金属卟啉的摄取而作为潜在的抗肿瘤药物(Chal0in，L.等人Bioconjugate Chem. 12 :691_700，(2001))。称作细胞渗透肽(CPP)或细胞递送载体(⑶V)的肽，诸如穿膜肽、转运肽、 Tat (氨基酸第47-57位或第48-60位)和模型两亲性肽MAP是短的、两亲性的和阳离子的肽和肽衍生物，通常含有多个赖氨酸和精氨酸残基。Fischer，P.M.，Med Res Rev, 27 755-795(2007)。它们作为多种物质的潜在的转运剂或递送载体，形成一类受到重点关注的小分子，所述多种物质包括基因治疗中的细胞毒性药物、反义寡聚核苷酸、蛋白和肽，并作为诱饵肽。Hallbrink,M.等人· Biochim. Biophys. Acta 1515:101-109(2001) ；Lindgren, M·，等人.Trends Pharmacol. Sci. 21 :99_103 (2000) ；Gusarova，等人，J Clin Invest, 117 99-111(2007) ；Melnick, A.，Biochem Soc Trans,35 :802_806(2007) ；Astriab-Fisher 等人，Pharm Res, 19 744-754 (2002) ；El-Andaloussi 等人，J Gene Med, 8 1262-1273 (2006)； Cashman 等人，MolTher，6 :813_823 (2002)。实施方案的概述
本发明涉及包含可为铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物的肽的组合物和方法，所述铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物优先进入细胞并还在哺乳动物细胞、组织和动物中抑制癌前病变的发展。本发明还涉及方法，所述方法包括通过将癌细胞与细胞毒性铜氧还蛋白相接触而杀死癌细胞，其中所述细胞毒性的铜氧还蛋白通过一种或多种胞吞途径优先进入癌细胞， 并且其中所述细胞毒性的铜氧还蛋白是天青蛋白的截短体，并且其中所述天青蛋白的截短体包含来自SEQ ID NO :2的C-末端的氨基酸的一个或多个。在一些实施方案中，天青蛋白的截短体来自铜绿假单胞菌O^seudomonas aeruginosa) 0在另一些实施方案中，天青蛋白的截短体包含SEQ ID NO :2。在又一些其它的实施方案中，天青蛋白的截短体由SEQ ID NO 2组成。在另一个实施方案中，细胞毒性的铜氧还蛋白通过胞膜窖介导的胞吞作用优先进入癌细胞。在另一个实施方案中，细胞毒性的铜氧还蛋白进入癌细胞是通过高尔基体介导的。在另一个实施方案中，细胞毒性的铜氧还蛋白包含无论癌细胞的状态如何能够与癌细胞的细胞膜接触的氨基酸。在一些实施方案中，细胞毒性的铜氧还蛋白与细胞膜上的氨基酸、细胞表面肽、和/或受体接触。在一些实施方案中，细胞毒性的铜氧还蛋白可包含位于SEQ ID NO :1的第69、70、75、76和85位的氨基酸中的每一个。在另一个实施方案中， 细胞毒性的铜氧还蛋白包含位于SEQ ID NO 1的第69、70、75、76和85位的氨基酸中的一个或多个。在这些实施方案的任何一个中，这些氨基酸可位于与SEQ ID NO :1的那些相似或同源的细胞毒性铜氧还蛋白内的位置。在另一个实施方案中，细胞毒性铜氧还蛋白包含选自由SEQ ID NO 35, SEQ ID N0:36和SEQ ID NO :37组成的组的氨基酸序列。在另一个实施方案中，细胞毒性铜氧还蛋白由选自由SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36和SEQ ID NO :37组成的组的氨基酸序列组成。本发明还涉及能够与癌细胞的细胞膜接触、通过胞膜窖介导的胞吞作用进入癌细胞并杀死癌细胞的分离的肽，其中所述分离的肽包含SEQ IDNO :2的C-末端氨基酸。在一些实施方案中，分离的肽与细胞膜上的氨基酸、细胞表面肽、和/或受体接触。在一些实施方案中，分离的肽进入癌细胞是由高尔基体介导的。在另一些实施方案中，分离的肽来自铜绿假单胞菌。在另一些实施方案中，分离的肽包含SEQ ID NO :2。在另一些实施方案中，分离的肽由SEQ ID N0:2组成。在又一些其它的实施方案中，分离的肽由SEQ ID N0:2的C-末端氨基酸组成。例如，分离的肽可包含选自由SEQ ID NO 35, SEQ ID N0:36和SEQ ID NO: 37SEQ ID NO :36组成的组的氨基酸序列。在另一个实施方案中，分离的肽由选自由SEQ ID NO :35、SEQ ID NO 36和SEQ ID NO :37SEQ ID NO :36组成的组的氨基酸序列组成。本发明还涉及能够与癌细胞的细胞膜接触、通过胞膜窖介导的胞吞作用进入癌细胞并杀死癌细胞的分离的肽，其中所述分离的肽包含位于SEQ ID N0:1的第69、70、75、76 和85位的氨基酸中的一个或多个。在另一些实施方案中，分离的肽包含位于SEQ ID NO 1 的第69、70、75、76和85位的氨基酸中的每一个。在这些实施方案中，这些氨基酸可位于与 SEQID NO :1的那些相似或同源的分离的肽内的位置。在一些实施方案中，分离的肽与细胞膜上的氨基酸、细胞表面肽、和/或受体接触。本发明还涉及包含以上所描述的分离的肽中的一个或多个的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的载体。在另一些实施方案中，其中的药学上可接受的载体适宜于静脉内施用。本发明还涉及通过向患者施用治疗有效量的本发明的药物组合物中的一个或多个而治疗哺乳动物患者的方法。在一些实施方案中，患者是人。在另一些实施方案中，患者处于高于一般群体发生癌症的较高风险。在又一些实施方案中，癌症选自黑素瘤、乳腺癌、 胰腺癌、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、肺癌、结肠直肠癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌和宫颈癌。在另一些实施方案中，患者具有至少一种高风险特征。在另一个实施方案中，患者具有癌前病变。在另一个实施方案中，患者已被治愈癌症或癌前病变。在一些实施方案中，药物组合物通过选自由静脉注射、肌内注射、皮下注射、吸入法、局部施用、透皮贴剂、栓剂、玻璃体注射和口腔组成的组的方式来施用。在一个特定的实施方案中，施用方式为通过静脉注射。本发明还涉及包含在小管中的本发明的药物组合物中的一个或多个的药盒。在一些实施方案中，药盒还包括向患者施用活性组合物的装置。本发明还涉及包含本发明的分离的肽中的一个或多个和货物化合物(cargo compound)的药物组合物。在一些实施方案中，分离的肽与货物化合物连接。在一个特定的实施方案中，货物化合物是他莫昔芬(Tamoxifen)。在另一些实施方案中，货物化合物选自由蛋白、脂蛋白、多肽、肽、多糖、核酸、染料、微粒、纳米微粒、毒素和药组成的组。在另一个实施方案中，货物化合物是可检测的物质。例如，货物化合物可以是通过X-射线CT可检测的X-射线造影剂、通过MRI可检测的磁共振成像造影剂，或超声造影剂且是通过超声可检测的。在一些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的载体。本发明还涉及包括通过将细胞与药物组合物相接触而递送货物化合物的方法，所述药物组合物包括如上所述的分离的肽中的一个或多个和如以上所描述的货物化合物。本发明的这些和其它方面、优势和特征将从以下的图和具体实施方案的详细描述中变得明显。序列简述SEQ ID NO :1.来自铜绿假单胞菌的天青蛋白的氨基酸序列(Ala Glu Cys Ser Val Asp lie Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn Thr Asn Ala lie Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val lie Ala His Thr Lys Leu lie Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys)。SEQ ID NO :2. p^的氨基酸序列，铜绿假单胞菌天青蛋白第50-77位残基 (Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO 3.来自层理席藻(Phormidium laminosum)的质体蓝素的氨基酸序列 (Glu Thr Phe Thr Val Lys Met Gly Ala Asp Ser Gly Leu Leu Gln Phe Glu Pro Ala Asn Val Thr Val His Pro Gly Asp Thr Val Lys Trp Val Asn Asn Lys Leu Pro Pro His Asn lie Leu Phe Asp Asp Lys Gln Val Pro Gly Ala Ser Lys Glu Leu Ala Asp Lys Leu SerHis Ser Gln Leu Met Phe Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Glu lie Thr Phe Ser Ser Asp Phe Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Cys Ala Pro His Arg Gly Ala Gly Met Val Gly Lys lie Thr Val Glu Gly)。SEQ ID NO :4.来自氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)
的铁硫菌蓝蛋白的氨基酸序列(GlyThrLeuAspThrThrTrpLysGluAlaThrLeu ProGlnValLysAlaMetLeuGluLysAspThrGlyLysValSerGlyAspThrValThr TyrSerGlyLysThrValHisValValAlaAlaAlaValLeuProGlyPheProPhePro SerPheGluValHisAspLysLysAsnProThrLeuGlulieProAlaGlyAlaThrVal AspValThrPhelieAsnThrAsnLysGlyPheGlyHisSerPheAsplieThrLysLys GlyProProTyrAlaValMetProVallieAspProlieValAlaGlyThrGlyPheSer ProValProLysAspGlyLysPheGlyTyrThrAspPheThrTrpHisProThrAlaGly ThrTyrTyrTyrValCysGlnlieProGlyHisAlaAlaThrGlyMetPheGlyLyslie Val
Val Lys)。SEQ ID NO :5.来自裂环无色杆菌(Achromobacter cycloclastes)的假天青蛋白的氨基酸序列(Ala Asp Phe Glu Val His Met Leu Asn Lys Gly Lys Asp Gly Ala Met Val Phe Glu Pro Ala Ser Leu Lys Val Ala Pro Gly Asp Thr Val Thr Phe lie Pro Thr Asp Lys Gly His Asn Val Glu Thr lie Lys Gly Met lie Pro Asp Gly Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys lie Asn Glu Asn Tyr Lys Val Thr Phe Thr Ala Pro Gly Val Tyr Gly Val Lys Cys Thr Pro His Tyr Gly Met Gly Met Val Gly Val Val Gln Val Gly Asp Ala Pro Ala Asn Leu Glu Ala Val Lys Gly Ala Lys Asn Pro Lys Lys Ala Gln Glu Arg Leu Asp Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Asn)。SEQ ID NO 6.来自粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)的天青蛋白的氨基酸序列
(Ala Cys Asp Val Ser lie Glu GlyAsnAspSerMetGlnPheAsnThrLysSerlie ValVal AspLysThrCysLys Glu Phe Thr lieAsnLeuLysHisThrGlyLysLeuPro LysAla AlaMetGlyHisAsn Val Val Val SerLysLysSerAspGluSerAlaValAla ThrAsp GlyMetLysAlaGly Leu Asn Asn AspTyrValLysAlaGlyAspGluArgVal lieAla HisThrSerVallie Gly Gly Gly GluThrAspSerValThrPheAspValSer LysLeu LysGluGlyGluAsp Tyr Ala Phe PheCysSerPheProGlyHisTrpSerlie MetLys GlyThrlieGluLeu Gly Ser)。
SEQIDNO '7.来自木糖氧化无色杆菌反硝化亚种I(Achromobacter
xylosoxidans ssp. denitrificans I)S WMSSIji^J (Ala Gln Cys Glu Ala
Thr lie Glu Ser Asn Asp Ala Met Gln Tyr Asn Leu Lys Glu Met Val Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val His Leu Lys His Val Gly Lys Met Ala Lys Val Ala Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Glu Ala Asp Lys Gln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met Asn Ala Gly Leu Ala Gln Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val lie Ala His Thr Lys Val lie Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ala Tyr Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Met Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Ser Asn)。 SEQ ID NO :8.来自支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)的天青蛋白的氨基酸序列(Ala Glu Cys Ser Val Asp lie Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe AspLys LysAlaIleGluVal Ser Lys Ser Cys Lys Gln PheThrValAsnLeuLysHis ThrGly LysLeuProArgAsn Val Met Gly His Asn Trp ValLeuThrLysThrAlaAsp MetGln AlaValGluLysAsp Gly lie Ala Ala Gly Leu AspAsnGlnTyrLeuLysAla GlyAsp ThrArg ValLeuAla His Thr Lys Val Leu Gly GlyGlyGluSerAspSerVal ThrPhe AspValAlaLysLeu Ala Ala Gly Asp Asp Tyr ThrPhePheCysSerPhePro GlyHis GlyAlaLeuMetLys Gly Thr Leu Lys Leu ValAsp)1 O
SEQIDNO :9.来自甲基单胞菌(Methylomonas sp.) J的天青蛋白的氨基酸序列
(Ala Ser Cys Glu Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Thr Met Thr Tyr Ser Thr Arg Ser
lie SerValProAlaSerCysAlaGluPheThrValAsnPheGluHisLysGlyHis MetPro LysThrGlyMetGlyHisAsnTrpValLeuAlaLysSerAlaAspValGlyAsp ValAla LysGluGlyAlaHisAlaGlyAlaAspAsnAsnPheValThrProGlyAspLys ArgVal lieAlaPheThrProlielieGlyGlyGlyGluLysThrSerValLysPheLys ValSer AlaLeuSerLysAspGluAlaTyrThrTyrPheCysSerTyrProGlyHisPhe SerMet MetArgGly Thr Leu LysLeuGluGlu)。 SEQ ID NO :10.来自脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)Z2491 的天青蛋
白的氨基酸序列(CysSerGlnGluProAlaAlaProAlaAlaGluAlaThrProAla AlaGlu AlaProAla SerGluAlaProAlaAlaGluAlaAlaProAlaAspAlaAlaGlu AlaPro AlaAlaGly AsnCysAlaAlaThrValGluSerAsnAspAsnMetGlnPheAsn ThrLys AsplieGln ValSerLysAlaCysLysGluPheThrlieThrLeuLysHisThr GlyThr GlnProLys ThrSerMetGlyHisAsnlieVallieGlyLysThrGluAspMet AspGly liePheLys AspGlyValGlyAlaAlaAspThrAspTyrValLysProAspAsp AlaArg ValValAla HisThrLysLeulieGlyGlyGlyGluGluSerSerLeuThrLeu AspPro AlaLysLeu AlaAspGlyGluTyrLysPheAlaCysThrPheProGlyHisGly AlaLeu MetAsnGly Lys ValThrLeuValAsp) ο SEQ ID NO :11.来自荧光假单胞菌(I^seudomonas fluorescen)的天青蛋白的氨基
酸序列(AlaGlu CysLysThrThrlieAsp Ser ThrAsp GlnMetSerPheAsnThr LysAla lieGlulie AspLysAlaCysLysThr PheThrVal GluLeuThrHisSerGly SerLeu ProLysAsn ValMetGlyHisAsnLeu VallieSer LysGlnAlaAspMetGln Prolie AlaThrAsp GlyLeuSerAlaGlylie AspLysAsn TyrLeuLysGluGlyAsp ThrArg VallieAla HisThrLysVallieGly AlaGlyGlu LysAspSerLeuThrlie AspVal SerLysLeu AsnAlaAlaGluLysTyr GlyPhePhe CysSerPheProGlyHis lieSer MetMetLys Gly Thr ValThrLeuLys) ο SEQ ID NO :12.来自绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)的天青蛋白的
氨基酸序列(Ala Glu Cys Lys Val Asp Val AspSerThrAspGlnMetSerPheAsn ThrLys GlulieThr lieAspLysSerCysLysThrPheThrValAsnLeuThrHisSer GlySer LeuProLys AsnValMetGlyHisAsnTrpValLeuSerLysSerAlaAspMet AlaGly lieAlaThr AspGlyMetAlaAlaGlylieAspLysAspTyrLeuLysProGly AspSer ArgVallie AlaHisThrLyslielieGlySerGlyGluLysAspSerValThr PheAsp ValSerLys LeuThrAlaGlyGluSerTyrGluPhePheCysSerPheProGly HisAsn SerMetMetLys Gly Ala Val Val Leu Lys)。
SEQIDNO 13.来自苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)9a5c的天1f蛋白的氨基酸序列(LysThrCysAlaValThrIleSer Ala Asn Asp Gln Met LysPheAspGln AsnThr IleLyslieAlaAlaGluCysThrHisValAsnLeu ThrLeuThrHisThrGly LysLys SerAlaArgValMetGlyHisAsnTrpValLeuThr LysThrThrAspMetGln AlaVal AlaLeuAlaGlyLeuHisAlaThrLeuAlaAspAsn TyrValProLysAlaAsp ProArg VallieAlaHisThrAlalielieGlyGlyGlyGlu ArgThrSerlieThrPhe ProThr AsnThrLeuSerLysAsnValSerTyrThrPhePhe CysSerPheProGlyHis TrpAla LeuMetLysGly Thr Leu AsnPhe GlyGly)。
SEQIDNO 14.来自] 瓜(cucumis；sativus)的漆树花 f苷的氨基酸序列(MetGln SerThrValHislieVal GlyAspAsnThrGlyTrp SerValProSerSerPro AsnPhe TyrSerGlnTrpAlaAla GlyLysThrPheArgVal GlyAspSerLeuGlnPhe AsnPhe ProAlaAsnAlaHisAsnValHisGluMetGluThr LysGlnSerPheAspAla CysAsn PheValAsnSerAspAsn AspValGluArgThrSer ProVallieGluArgLeu AspGlu LeuGlyMetHisTyrPheValCysThrValGlyThr HisCysSerAsnGlyGln LysLeu SerlieAsnValValAla AlaAsnAlaThrValSer MetProProProSerSer SerPro ProSerSerValMetProProPre)Val Met Pro Pro Pro Ser Pro Ser)。
SEQIDNO 15.来自 §色绿屈:( (Chloroflexus aurantiacus) ^ ^tiffi^
的氨基画!序列(Met Lys lie Thr Leu Arg Met Met Val LeuAlaValLeuThrAlaMetAla MetValLeuAlaAlaCysGlyGlyGlyGlySerSerGlyGlySerThrGlyGlyGlySer GlySerGlyProValThrlieGlulieGlySerLysGlyGluGluLeuAlaPheAspLys ThrGluLeuThrValSerAlaGlyGlnThrValThrlieArgPheLysAsnAsnSerAla ValGlnGlnHisAsnTrplieLeuValLysGlyGlyGluAlaGluAlaAlaAsnlieAla AsnAlaGlyLeuSerAlaGlyProAlaAlaAsnTyrLeuProAlaAspLysSerAsnlie lieAlaGluSerProLeuAlaAsnGlyAsnGluThrValGluValThrPheThrAlaPro AlaAlaGlyThrTyrLeuTyrlieCysThrValProGlyHisTyrProLeuMetGlnGly LysLeuValValAsn) ο
SEQIDNO 16.来自4登色绿屈:_的橙绿屈挠素B的氨基酸序列(AlaAlaAsnAla ProGlyGlySerAsnValValAsnGluThrProAlaGlnThrValGluValArgAlaAla ProAspAlaLeuAlaPheAlaGlnThrSerLeuSerLeuProAlaAsnThrValValArg LeuAspPheValAsnGlnAsnAsnLeuGly ValGlnHisAsnTrpValLeuValAsnGly GlyAspAspValAlaAlaAlaValAsnThr AlaAlaGlnAsnAsnAlaAspAlaLeuPhe ValProProProAspThrProAsnAlaLeu AlaTrpThrAlaMetLeuAsnAlaGlyGlu SerGlySerValThrPheArgThrProAla ProGlyThrTyrLeuTyrlieCysThrPhe ProGlyHis Tyr LeuAla Gly MetLys Gly Thr Leu Thr Val Thr Pro)。
SEQIDNO 17.来自j乾瓜的黄瓜碱性蛋白的氨基I酸序列(Ala 1ValTyrValValGly GlySerGlyGlyTrpThrPheAsnThrGluSer Trp ProLysGlyLysArgPheArgAla GlyAsplieLeuLeuPheAsnTyr Asn ProSerMetHisAsnValValValValAsnGln GlyGlyPheSerThrCys AsnThrProAlaGly Ala LysValTyrThrSerGlyArgAsp Gln lie Lys Leu Pro Lys Gly Gln Ser Tyr Phe lie Cys Asn Phe Pro Gly His Cys Gln Ser Gly Met Lys lie Ala Val Asn Ala Leu)。SEQ ID NO :18.来自淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)F62 的 Laz 的氨基酸序列(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp lie Gln Val Ser Lys Ala Cys Lys Glu Phe Thr lie Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys Ala Ser Met Gly His Asn Leu Val lie Ala Lys Ala Glu Asp Met Asp Gly Val Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu lie Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Asp Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp)。SEQ ID NO :19.来自副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的天青蛋白的氨
基酸序列(Met Ser Leu Arg lie Leu Ala Ala Thr Leu Ala Leu Ala GlyLeuSer PheGly AlaGlnAlaSerAlaGluCysGluValSerlieAspAlaAsnAspMetMetGln PheSer ThrLysThrLeuSerValProAlaThrCysLysGluValThrLeuThrLeuAsn HisThr GlyLysMetProAlaGlnSerMetGlyHisAsnValVallieAlaAspThrAla Asnlie GlnAlaValGlyThrAspGlyMetSerAlaGlyAlaAspAsnSerTyrValLys ProAsp AspGluArgValTyrAlaHisThrLysValValGlyGlyGlyGluSerThrSer lieThr PheSerThrGluLysMetThrAlaGlyGlyAspTyrSerPhePheCysSerPhe Pro
Gly His Trp Ala lie Met Gln Gly Lys Phe Glu Phe Lys)。SEQ ID NO :20.来自橙色绿屈挠菌的橙绿屈挠素B的第57_89位氨基酸的氨基酸序列(His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp)。SEQ ID NO :21.来自丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)天青蛋白的第 51-77 位氨基酸的氨基酸序列(Ser Lys Lys Ala Asp Ala Ser Ala lie Thr Thr Asp Gly Met Ser Val Gly lie Asp Lys Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :22.来自脑膜炎奈瑟球菌Laz的第89-115位氨基酸的氨基酸序列(lie Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly lie Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :23.来自副溶血性弧菌天青蛋白的第52_78位氨基酸的氨基酸序列 (Ala Asp Thr Ala Asn lie Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :24.来自支气管炎博德特菌天青蛋白的第51_77位氨基酸的氨基酸序列(Thr Lys Thr AlaAsp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly lie Ala Ala Gly LeuAspAsn Gln Tyr Leu Lys Ala GlyAsp)。SEQ ID NO :25.来自pl8的氨基酸序列，铜绿假单胞菌天青蛋白第50-67位残基 (Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val ThrAsp Gly Met Ala Ser Gly)。SEQ ID NO :26.来自铜绿假单胞菌天青蛋白第36-88位氨基酸的氨基酸序列(ProGly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val lie Ala His Thr Lys Leu lie Gly)。SEQ ID NO :27.来自铜绿假单胞菌天青蛋白第36-77位氨基酸的氨基酸序列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp) οSEQ ID NO :28.来自铜绿假单胞菌天青蛋白第36_89位氨基酸的氨基酸序列(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val lie Ala His Thr Lys Leu lie Gly Ser)。SEQ ID NO :29.来自铜绿假单胞菌天青蛋白第36-1 位氨基酸的氨基酸序列 (Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val lie Ala His Thr Lys Leu lie Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys)。SEQ ID NO :30.来自铜绿假单胞菌天青蛋白第53-70位氨基酸的氨基酸序列(Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys)。SEQ ID NO :31.来自铜绿假单胞菌天青蛋白第53-64位氨基酸的氨基酸序列 (AlaAlaAsp Met Gln Gly Val Val ThrAsp Gly Met)。SEQ ID NO :32.氨基酸序列 DGXXXXXDXXYXKXXD。SEQ ID NO :33.氨基酸序列 DGXXX)(DXX^(KX)(D。SEQ ID NO :34. ρ 18b的氨基酸序列，铜绿假单胞菌天青蛋白第60_77位残基(Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :35. p28的C-末端12个氨基酸的序列，铜绿假单胞菌天青蛋白第66-77 位残基(ρ 12) (Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :36p28的C-末端10个氨基酸的序列，铜绿假单胞菌天青蛋白第68_77 位残基(Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :37p28的C-末端11个氨基酸的序列，铜绿假单胞菌天青蛋白第67-77 位残基(Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :38.是天青蛋白截短体p28的变体的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Ala Val Val Thr Asp Thr Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :39.是天青蛋白截短体p28的变体的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Leu Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Leu Ala Ser Gly Leu AspLys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :40.是天青蛋白截短体p28的变体的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Val Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Val Ala Ser Gly Leu Asp LysAsp Tyr LeuLys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :41.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Asp Asp Pro Lys Leu Tyr Asp Lys Asp Leu Gly Ser Ala Met Gly Asp Thr Val Val Gly Gln Met Asp Ala Ala Thr Ser Leu)。SEQ ID NO :42.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(乙酰化-Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp-酰胺化)。SEQ ID NO :43.是六肽的氨基酸序列(Val Ser Pro Pro Ala Arg)。SEQ ID NO :44.是六肽的氨基酸序列(Tyr Thr Pro Pro Ala Leu)。SEQ ID NO :45.是六肽的氨基酸序列(Phe Ser Phe Phe Ala Phe)。SEQ ID NO :46.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Thr Pro Gly Cys)。SEQ ID NO :47.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Aia Asp Cys Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Aspノ。SEQ ID NO :48.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Cys Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :49.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Cys Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :50.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Thr Met Gln Cys Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :51.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Thr Met Gln Gly Cys Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :52.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Aia Asn Thr Gln Gly Cys Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp;。SEQ ID NO :53.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Aia Asn Thr Gln Gly Val Cys Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp;。SEQ ID NO :54.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Aia Asp Met Thr Ala Val Cys Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp)。SEQ ID NO :55.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Thr Ala Val Val Cys Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr LeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :56.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Thr Val Val Cys Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :57.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Thr Val Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :58.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Ala Thr Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :59.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Ala Thr Val Thr Asp Cys Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :60.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Gly Val Thr Ala Asp Cys Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :61.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Gly Val Thr Ala Asp Gly Cys Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :62.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Gly Val Val Thr Asn Gly Cys Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :63.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Gly Val Val Thr Ala Thr Met Gly Ser Gly LeuCys LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :64.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Gly Val Val Thr Asp Leu Thr Ala Ser Gly Leu Cys LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :65.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(LeuSerTrpAlaAla AspMetGln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :66.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetTrp Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :67.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys ProAspAsp) ο
SEQID NO :68.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(LeuSerThrAlaAla AspMetGln Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp LysAspTyrLeuLys Pro Ala Asp Lys Pro Ala Asp Lys Pro Ala Asp Lys Pro Ala Asp Lys Pro Ala Asp Lys Pro Ala Asp Lys Pro Ala Asp Lys Pro Ala Asp Asp X9),
Leu Tyr Ser X9)。SEQ ID NO :78.是pUC19_azu 的引物(5，-CGGGATCCCC GGCA ACCTGC CGA AGA ACGT CATGGGC-3')。SEQ ID NO :79.是 pUC19_azu 的弓| 物(5' -CGGAATTCGCATCACTTCAGG GTCAGGG-3，)。SEQ ID NO :80.是 AACCGCCGCC GACATGCAG-3，)。SEQ ID NO :81.是 ACAGTACCCA GTTGTGGCC-3')。SEQ ID NO :82.是 GTGTCATCGC CCACACC-3，)。SEQ ID NO :83.是
Asp SEQ Met Asp SEQ Met Asp SEQ Met Asp SEQ Met Asp SEQ Met Asp SEQ Met Asp SEQ Met Asp SEQ
Asp) ο
ID NO :69.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Leu Trp Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp) ο
ID NO :70.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Leu Gln Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp) ο
ID NO :71.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Leu Gln Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp) ο
ID NO :72.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Leu Trp Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp) ο
ID NO :73.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Leu Trp Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp) ο
ID NO :74.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Leu Gln Gly Val Val Trp Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp) ο
ID NO :75.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(Leu Trp Gly Val Val Trp Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp) ο
ID NO :76.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(X1
Ser Trp Ala Asp Tyr Leu
Ser Trp Ala Asp Tyr Leu
Ser Trp Ala Asp Tyr Leu
Ser Thr Ala Asp Tyr Leu
Ser Thr Ala Asp Tyr Leu
Ser Thr Ala Asp Tyr Leu
Ser Trp Ala Asp Tyr Leu
Ser X2 Ala
X3 X4 X5 Val Val X6 Asp X7 X8 Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro
SEQ ID NO :77.是经修饰的铜氧还蛋白来源的肽的氨基酸序列(X1 Asp Pro Lys Asp Lys Asp Leu Gly Ser Ala X2 X3 Asp X4 Val Val X5 X6X7 Asp Ala Ala X8
pGST-azu36-50的弓丨物(5， -GGCCACAACTGGGTACTGTG
pGST-azu36-50的弓丨物(5， -CTGCATGTCGGCGGCGGTTC
pGST-azu36-77的弓丨物(5， -CCTGAAGCCCGACGACTGAC
pGST-azu36-77的弓丨物(5， -GGTGTGGGCGATGACACGTCAGTCGTCGGG CTTCAGG-3，)。SEQ ID NO :84.是 pGST-azu GAGAAGGACT CGGTGACC-3’ )。SEQ ID NO :85.是 pGST-azu ACGAGCCGAT CAGCTTGG-3，)。SEQ ID NO :86.是 azu50_77 的引物(5，-CGGGATCCTGAGCACCGCCG CCGACATGCA GGG-3，)。SEQ ID NO :87.是 azu 67-77 的引物(5，-CGGGATCCCC GGCCTGGACA AGGATTACCT GAAGCCCG-3，)。SEQ ID NO :88.是反向引物(5，-CGGAATTCGC ATCACTTCAG GGTCAGGG-3，)。SEQ ID NO :89.是 pGST-azu-50-66 的弓丨物(5，-GACGGCATGG CTTCCTGACT GGACAAGGAT TACC-3')。SEQ ID NO :90.是 pGST-azu-50-66 的弓丨物(5，-GGTAATCCTT GTCCAGTCAG GAAGCCATGC CGTC-3，)。SEQ ID NO :91.是正向引物(5，-CGGGATCCCC ATGGTGAGCA AGGGCG-3，)。SEQ ID NO :92.是反向引物(5，-CGGAATTCCT TGTACAGCTC GTCCATGCCG-3，)。SEQ ID NO :93.是 pGST-azu-50-77 的弓丨物(5，-CCGCTCGAGC CTGAGCACCG CCGCCATGCA GGG-3')。SEQ ID NO :94.是 pGST-azu-50-77 的弓丨物(5，-TTTTCCTTTT GCGGCCGCTC AGTCGTCGGG CTTCAGGTAA TCC-3’ )。SEQ ID NO :95.是多聚精氨酸或Arg8的氨基酸序列(ArgArgArgArg ArgArgArgArg)。SEQ ID NO :96.是 pl8 的片段的氨基酸序列(Ser Gly Leu Asp Lys Asp)。附图简述

图1.图1描绘了对所有腺体进行!^8和天青蛋白的效力的评价的照片。图IA显示了 DMBA处理的腺体中腺泡病变的代表性照片，和其与利用DMBA联合化学预防剂处理的腺体进行的对比。图1B-1F显示了 M8对腺泡病变的发展的作用的代表性照片。图2.图2描绘了显示p^针对DMBA诱导的乳房泡病变的效力的图。图3.图3描绘了导管病变的代表性切片和P^的作用的照片。图4.图4描绘了显示出针对DMBA诱导的导管病变的M8的效力的图。图5.显示α-螺旋在wt-天青蛋白中以及在wt-天青蛋白第50-77位蛋白质转导结构域中定位的图。指出了天青蛋白50-77结构域中的三个氨基酸被脯氨酸残基所替代。图6(A)、(B)和(C). (A)图显示了 GST-GFP-azu 50-77 融合蛋白的构建。将 gfp 基因导入到gst基因的3'端(用于GST-GFP)并将azu 50-77片段连接到gfp基因的3' 端框内以产生GST-GFP-azu 50-77融合蛋白。将GST-GFP-azu 50-77作为单一融合蛋白从细胞裂解物中纯化。将纯化的蛋白在SDS-PAGE上进行电泳并通过考马斯蓝染色进行检测 (6(B)和还通过利用抗天青蛋白抗体的蛋白质印迹来检测(6(C))。图7 (A)、(B)和(C).显示GST-绿色荧光蛋白(GFP)和GST-GFP-天青蛋白融合蛋白的内化的动力学研究的图。在利用不同浓度的GST-GFP (10 (a))或GST-GFP-azu
36-89 的弓丨物(5，-CCAAGCTGATCGGCTCGTGA 36-89 的弓丨物(5，-GGTCACCGAGTCCTTCTCTC50-77 (10(b))在37°C下处理1小时的J774细胞中分析绿色荧光。利用流式细胞术对 10，000个细胞进行分析。(c)GST-GFP-azu 50-77的内化的时间依赖。在37°C下将J774细胞与200 μ g/ml的GST-GFP-azu 50-77孵育指定的时间并通过流式细胞术进行分析。图8(A)、(B)和(C). (A)图显示了如前关于GST-GFP融合所描述的， 与GST(GST-PEDIII)融合的外毒素A结构域III (第405-613位氨基酸)，以及结构域Ib(第381-404位氨基酸)的部分。然后利用PCIUfazu 50-77片段连接到 GST-PEDIIKGST-PEDIII-azu 50-77)的羧基末端。(B)通过谷胱甘肽琼脂糖4B柱凝胶过滤柱层析纯化融合蛋白，并在SDS-PAGE上电泳以测定大小。(C)图显示了如PEDIII介导的细胞毒性所测定的，GST-PEDII I-azu 50-77融合蛋白在UIS0_Mel_2癌细胞中和正常成纤维(FBT)细胞中的作用。如所指出的，不同浓度的GST-PEDIII和GST-PEDIII-azu 50-77 与UISO-Mel-2细胞和FBT细胞孵育M小时，之后通过MTT分析测定细胞存活率。图9.显示GST-PEDIII-铁硫菌蓝蛋白融合蛋白对UIS0-Mel-2癌细胞和FBT 细胞的PEDIII-介导的细胞毒性的图。如所指出的，将不同浓度的GST-PEDIII和 GST-PEDIII-azu 50-77与UIS0-Mel-2细胞和FBT细胞孵育M小时，其后通过MTT分析来测定细胞存活率。图10，(A)、⑶和(C).描绘了显示天青蛋白来源的肽，pl8和p^渗透到不同组织发生的癌细胞系中以及它们的正常对应物的照片。(A)显示37°C下2小时后Alexafluor 568标记的!^8或？18的穿透的照片。使用阳离子Arg8(SEQ ID NO :95)作为对照。(B)描绘37°C下2小时后Alexafluor 568标记的p^或pl8穿透到同样细胞系中的流式细胞术分析的图。(C)描绘比来自正常细胞的荧光成倍增加的图。？观或？18进入到4个黑素瘤细胞系中的相似的观察显示了比来自正常细胞的荧光的几倍增加。图 11，(A)和(B).描绘了显示 azu 60-77 (pl8b)和 azu 66-77 (pl2)进入到癌细胞和正常细胞中的照片。利用alexafluor 568标记的pl8b (A)或pl2 (B)在37°C下孵育细胞2小时，并通过共聚焦显微术来记录图像。图12，(A)和(B).描绘了天青蛋白和它的肽的细胞膜毒性的图。㈧在37°C下暴露于不同浓度的P28、pl8和天青蛋白10分钟的UISOMel-2细胞的LDH泄漏分析。包括作为阳性对照的标准裂解缓冲液(cytotox-one试剂)。在λ ex 560nm和λ em 590nm处测量暴露后的荧光的改变。将裂解缓冲液定义为100% LDH释放。数据代表对照的阳性荧光的百分比。数据显示为平均值士SEM。(B)从与p28、pl8和天青蛋白共同孵育的人红细胞中的血红蛋白泄露。在37°C下利用肽孵育人红细胞30分钟，并测定了 540nm处的吸光度。 0. 1% Triton X_100后的血红蛋白释放定义为100%血红蛋白释放。数据代表了三份重复测定的平均值士SEM。图13，(A)、(B)、(C)和(D).描绘了显示 p28 和 pl8 进入 UISO-Mel-2 细胞的温度依赖和竞争性内化的照片。在不同的温度下通过共聚焦显微术来评价Alexafluor 568 标记的P^ (A)或pl8⑶在201IM时的渗透。(C)和⑶在未标记的肽的存在/不存在下 (200倍过量)，在37°C下30分钟后Alexafluor 568标记的p28 (C)或pl8 (D)以5μΜ进入 UIS0-Mel-2细胞的共聚焦分析。图14，(A)、(B)、(C)和(D). (A)描绘了显示在硫酸肝素的存在/不存在下 (100 μ g/ml)，在 37 °C 下 1 小时后 ρ28、ρ18(20μΜ)和 Arg8 (SEQ ID NO :95) (10 μ Μ)进入UISO-Mel-2细胞的共聚焦分析的照片。(B)显示在抑制物存在下M8或pl8进入的流式细胞术分析的图。认为抑制物不存在下的细胞荧光强度(对照)为100%。(C)描绘在抑制物存在下M8和P18进入成纤维细胞的FRCS分析的图。(D)描绘了显示pl8和M8与窖蛋白1(套组1)的共定位的照片。在37°C下利用Alexafluor 568标记的pl8或p28 (20 μ M) 或培养基孵育UISO-Mel-2细胞2小时。固定细胞并对其进行抗窖蛋白1免疫染色处理。 在37°C下2小时后Alexafluor568标记的pl8或p^ (20 μ Μ)进入UIS0-Mel-2细胞，随后进行抗高尔基体蛋白97抗体处理的共聚焦分析(套组幻。Alexafluor 568标记的天青蛋白、P^和pl8(红色)与线粒体示踪物(mitotracker)染料(绿色)(套组幻和溶酶体示踪物(Lysotracker)(绿色)染料(套组4)在UISO-Mel-2细胞中的共定位。在37°C下利用20 μ M的天青蛋白、ρ^、ρ18或仅培养基来孵育细胞。90分钟孵育后，加入线粒体示踪物 /溶酶体示踪物探针并孵育细胞30分钟。用DAPI (蓝色)对细胞进行复染色。天青蛋白、 Ρ28或ρ18的共定位表现为黄色荧光。图15，(A)和(B).描绘在37°C下与渐增浓度的天青蛋白、？观或？18共同孵育72 小时的UISO-Mel-2细胞的图。MTT(A)；直接细胞计数(B)。认为对照孔中的细胞存活率 (MTT)或细胞数目为100%。数据代表平均值士 SEM。图16，(A)至(H).描绘了用蛋白和/或缓冲液处理细胞之后利用共聚焦显微镜拍摄的显示细胞摄取化合物的照片。(A)用20 μ M未标记的蛋白或PBS缓冲液预处理人类脑肿瘤LN-2^细胞2小时，然后用PBS缓冲液洗涤三次。弃去所有缓冲液且然后加入20 μ M 的Alex568-Paz，在37°C下持续30分钟。(B)然后在37°C下用20 μ M未标记的蛋白或PBS 缓冲液和20 μ M的Alex568-Paz处理细胞30分钟。(C)用10 μ M未标记的蛋白或 PBS缓冲液预处理另一组人类脑肿瘤LN-2^细胞2小时，然后用PBS缓冲液洗涤三次。弃去所有缓冲液，然后加入10 μ M的Alex568-Paz，在37°C下持续30分钟。(D)然后在37°C下用10 μ M未标记的蛋白或PBS缓冲液和10 μ M的Alex568-Paz处理细胞30分钟。 (E)在37°C下用20 μ M的未标记的蛋白或PBS缓冲液和20 μ M的Alex568_Paz处理人类脑肿瘤LN-2^细胞30分钟。(F)在37°C下用20 μ M的Alex568_H. 8处理人类脑肿瘤
细胞30分钟。(G)在37°C下用20 μ M的Alex568_蛋白处理人类脑肿瘤细胞30分钟。(H)在37°C下用20 μ M的Alex568-蛋白处理人类乳腺癌MCF-7细胞30分钟。图17，(A)至(C).描绘肽结合和进入细胞的曲线和图表。(A)将UISO-Mel-2细胞或成纤维细胞(3xl05个细胞)悬浮在不含酚红的MEME培养基中。通过加入10、50、100、 150、250、300 和 400 μ M 的 Alexaf luor568_ 轭合的 p^ 在冰上持续 30、60、90 和 120 秒来起始反应。通过流式细胞术来分析细胞。(B)通过将肽浓度(PM)对比速率(MFI/秒)绘制曲线而计算K1^nvmaxt5 (C)利用Mel2全细胞(50，000细胞/ml)来测定肽结合和进入，在存在/不存在1000倍过量的未标记的p28，或天青蛋白的情况下，在37°C下将细胞与渐增浓度(0-175nM)的放射性标记的天青蛋白孵育30分钟，利用γ计数器计算保留在细胞沉淀中的放射性。认为与单独的125I天青蛋白孵育的细胞中的放射性为总结合；认为未标记的天青蛋白或M8存在下的放射性为非特异性结合。通过从总结合中减去非特异性结合而测定特异性结合，并生成斯卡恰特图(katchard plots)。图18，(A)至(C).描绘了对患有黑素瘤MEL-23肿瘤的小鼠注射250yL扫描中的 60 μ M浓度的P^染料复合物后和注射对照PBS后(A) 24小时和(B) 48小时拍摄的小鼠侧面和背面照片。(C)描绘了对患有黑素瘤MEL-23肿瘤的小鼠注射200μΜ浓度的？观后对小时和48小时拍摄的小鼠的侧面和背面照片。图19，(A)至(C).描绘了对患有黑素瘤MEL-23肿瘤的小鼠注射601^浓度的？18 后(A) 17小时、(B)M小时和(C)46小时拍摄的小鼠侧面和背面照片。(C)还描绘了注射 ρ18后46小时所拍摄的小鼠器官的照片，包括心脏、肺、肝、肾、脾和脑。图20，(A)和(B). (A)描绘了对患有肿瘤的小鼠注射60 μ M浓度的ρ18、ρ^和 arg-8 (SEQ ID NO. 95)后12小时拍摄的小鼠的侧面和背面照片。(B)描绘了注射pl8、p28 和arg-8(SEQ ID NO. 95)后12小时所拍摄的小鼠器官的照片，包括小鼠脑。图21，(A)和(B). (A)描绘了对患有黑素瘤MEL-6肿瘤的小鼠注射600 μ M浓度的 ρ18和arg-8 (SEQ ID NO. 95)到尾静脉后40小时后所拍摄的小鼠的侧面和背面照片。pl8 处理的动物接受了 500，000个细胞，arg-8 (SEQ ID NO. 95)处理的动物接受了 1，000, 000个细胞。(B)描绘了注射600 μ M浓度的ρ18和arg-8 (SEQ ID NO. 95)后40小时所拍摄的小鼠器官的照片。图22，(A)和⑶.㈧描绘了对患有黑素瘤MEL-23肿瘤的小鼠注射60 μ M浓度的 p^、pl8*arg-8(SEQ ID NO. 95)后16小时所拍摄的小鼠的侧面和背面照片。(B)描绘了对患有黑素瘤MEL-23肿瘤的小鼠注射60 μ M浓度的ρ28、ρ18和arg-8 (SEQ ID NO. 95)后 24小时所拍摄的小鼠的侧面和背面照片。图23.描绘了将60 μ M浓度的!^8和ρ 18染料肽复合物注射到具有黑素瘤MEL-23 的小鼠后48小时所拍摄的小鼠器官的照片。图24.描绘了将60 μ M浓度的ρ^注射到具有MEL-23肿瘤的小鼠和器官后M小时所拍摄的小鼠器官的照片。图25.描绘了对患有黑素瘤MEL-23肿瘤的小鼠注射60 μ M浓度的ρ^和 arg-8 (SEQ ID NO. 95)后16小时所拍摄的小鼠的侧面和背面照片。图26.描绘了对患有黑素瘤MEL-23肿瘤的小鼠注射60 μ M浓度的ρ18后16小时所拍摄的小鼠的侧面和背面照片。图27.描绘了利用240 μ M浓度的ρ18、ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)对具有肿瘤的小鼠进行高剂量处理之后10小时和M小时所拍摄的小鼠的侧面照片。图 28.描绘了利用 240 μ M 浓度的口18、口沘和 arg-8 (SEQ ID NO. 95)对患有 MCF-7 肿瘤的小鼠和器官进行高剂量处理后观小时所拍摄的小鼠和器官的侧面和背面照片。还描绘了利用240 μ M浓度的ρ18、ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)对具有MCF-7的小鼠器官进行高剂量处理后观小时所拍摄的小鼠器官的照片。图29.描绘了利用240 μ M浓度的ρ18、ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)对具有肿瘤的小鼠进行高剂量处理之后50小时所拍摄的小鼠的侧面和背面照片。图30.描绘了将120 μ M浓度的pl8、p^和arg-8 (SEQ ID NO. 95)注射到具有 HCT-116肿瘤的小鼠的尾静脉和器官中后M小时所拍摄的小鼠器官的照片。图 31，(A)和(B). (A)描绘了将 120 μ M 浓度的 pl8、p^ 和 arg_8 (SEQ ID NO. 95) 注射到具有HCT-116肿瘤的小鼠的尾静脉和器官中后M小时所拍摄的小鼠器官的照片。 (B)将120 μ M浓度的ρ18、ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)注射到具有HCT-116肿瘤的小鼠的尾静脉中后21小时所拍摄的小鼠的侧面照片。
图32，㈧和(B). (A)描绘了将1，000，000个细胞注射到尾静脉后47天，用120 μ M 浓度的Μ8注射具有HCT-116肿瘤的小鼠后M小时，小鼠的侧面和背面照片。(B)描绘了将1，000，000个细胞注射到尾静脉后47天，将120 μ M浓度的ρ^注射到具有HCT-116的小鼠后4小时，所拍摄的小鼠器官的照片。图33.描绘了利用120μM浓度的pl8、p 和arg-8(SEQ ID NO. 95)处理后M小时所拍摄的取自MEL-6小鼠的器官的照片。图34，(A)和(B). (A)描绘了注射 120 μ M 浓度的 ρ18、ρ28 和 arg_8 (SEQ ID NO. 95)，和6060 μ M浓度的arg-8 (SEQ ID NO. 95)后22小时所拍摄的MEL-6小鼠的侧面和背面照片。(B)描绘了利用120 μ M浓度的pl8、p^和arg-8 (SEQ ID NO. 95)，和60 μ M浓度的arg-8 (SEQ IDN0. 95)处理后MEL-6小鼠器官的照片。图 35，(A)和(B). (A)描绘了利用 60 禾口 120 μ M 浓度的 pl8、p^ 和 arg_8 (SEQ ID NO. 95)处理后22小时所拍摄的取自HT-1080小鼠的器官的照片。(B)描绘了利用60和 120 μ M浓度的ρ18、ρ28和arg-8 (SEQID NO. 95)处理后22小时所拍摄的取自HT-1080小鼠的脑的并列照片，表明将摄取P18和p^到脑中的差异。图36.描绘了在阿霉素(Doxorubicin)对比口8的研究过程中，在利用60和 120 μ M浓度的ρ18、ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)处理后16小时拍摄的HT-1080小鼠的侧面和背面照片。图 37，(A)禾口(B). (A)描绘了利用 60 和 120 μ M 浓度的 M8 和 arg_8 (SEQ ID NO. 95) 处理后22小时所拍摄的取自HT-1080小鼠的器官的照片。⑶描绘了利用60和120μΜ浓度的ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)处理后22小时所拍摄的取自HT-1080小鼠的脑的并列照片。图 38，(A)和(B). (A)描绘了利用 60 和 120 μ M 浓度的 ρ 18 和 arg_8 (SEQ ID NO. 95) 处理后22小时所拍摄的取自HT-1080小鼠的器官的照片。⑶描绘了利用60和120 μ M浓度的ρ18和arg-8 (SEQ ID NO. 95)处理后22小时所拍摄的取自HT-1080小鼠的脑的并列照片。图39，(A)至(E).描绘了以㈧腹膜内施用:3mg/kg阿霉素，3次处理⑶每天腹膜内施用5mg/kg p28 ； (C)PBS对照，每天腹膜内施用PBS ； (D)每天腹膜内施用10mg/kg P28 ； (E)每天腹膜内施用20mg/kg，通过其尾静脉进行处理的具有肺转移的HT-1080小鼠的照片。图40，(A)和(B). (A)描绘了动物研究中取自HT-1080小鼠的器官的照片，其中通过将IxlO6个细胞注射到尾静脉中(43天)，且所有处理的小鼠均具有肺转移，拍摄自将 60 μ M浓度的M8注射到尾静脉中后M小时和沈小时。拍摄时动物6982是死亡的。(B) 描绘了动物研究中ΗΤ-1080小鼠的侧面和背面的照片，其中通过将IxlO6个细胞注射到尾静脉中(43天)，拍摄自将60 μ M浓度的ρ^注射到尾静脉中后22小时。拍摄时动物6982 是死亡的。图41.描绘了动物研究中ΗΤ-1080小鼠的侧面和背面的照片，其中通过将IxlO6个细胞注射到尾静脉中(43天)，拍摄自将60 μ M浓度的ρ^注射到尾静脉中后沈小时。图42，(A)和(B).描绘了 Balb-C肽研究中㈧取自小鼠的器官和⑶小鼠的后视图的照片，拍摄自利用60和120 μ M浓度的？18、？观和arg-8 (SEQ ID NO. 95)处理后12小时。图43，(A)和(B).描绘了 Balb-C肽研究中(A)取自小鼠的器官和(B)小鼠的侧视图的照片，拍摄自利用60和120 μ M浓度的ρ18、ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)处理后24 小时。图44.描绘了尾静脉注射60 μ M浓度的ρ 18和arg_8 (SEQ ID NO. 95)后16小时 MEL-6小鼠(通过尾静脉注射500，000个细胞)的侧面和背面照片。图45，(A)至(D).描绘了用pl8和M8处理后，小鼠器官特别是小鼠脑的照片。图 46.描绘了用 ρ28、ρ 18 和 arg-8 (SEQ ID NO. 95)处理后 24 小时取自 MEL-6 小鼠的器官的照片。图47，(A)至(C). (A)描绘了注射 60 μ M 浓度的 pl8、p^ 和 arg_8 (SEQ ID NO. 95) 后3小时MEL-6小鼠的侧面和背面照片。(B)描绘了注射60 μ M浓度的ρ 18、ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)后22小时所拍摄的，MEL-6小鼠的侧面和背面照片，和取自MEL-6小鼠的器官的照片。(C)描绘了注射60 μ M浓度的P18、ρ28和arg-8 (SEQ ID NO. 95)后M小时取自 MEL-6小鼠的器官的照片。图48，(A)和(B).描绘了将pl8和p28摄取到(A)小鼠脑中和(B)小鼠器官中。图49.描绘了研究中MEL-6小鼠的侧面和背面照片，其通过将500，000个细胞静脉注射到尾静脉中(44天后)，拍摄自将M μ M浓度的pl8和arg-8 (SEQ ID NO. 95)注射到尾静脉后120小时。图50.描绘了利用ρ 18处理后168小时取自MEL-6小鼠的器官的照片。图51.描绘了在注射细胞41天后，arg-8 (SEQ ID NO. 95)和pl8注射后72小时所拍摄的MEL-6小鼠的侧面和背面照片。图52.描绘了注射arg-8 (SEQ ID NO. 95)和pl8后所拍摄的小鼠的照片。图53.描绘了注射arg-8和pl8后3小时、M小时和48小时所拍摄的小鼠的侧面和正面照片。图54.描绘M8对人类乳腺癌细胞生长抑制的图。在37°C下将MCF-7细胞与 p28 (0-200 μ Μ)孵育24、48和72小时。细胞计数(A)和MTT分析(B)。使用阿霉素(10 μ Μ)作为阳性对照。认为对照孔的细胞数目或存活率为100%。数据代表对照的平均值％ 士SEM。 *，ρ < 0. 05。(C)p^对MCF-7异种移植生长的抑制。对每组的最少10只小鼠，在10天、 14天、21天和25天利用15 μ mol/kg的紫杉醇腹腔内进行处理，或每天用5或10mg/kg的 P28腹腔内处理，持续30天。柱形代表平均值士SEM。*，ρ < 0. 05。图55. (A)和(B)是描绘细胞周期的FACS分析和p^穿透乳腺癌细胞的图。利用p28 (50 μ Μ)对MCF-7细胞(A)和MDD2细胞(B)处理48小时和72小时。如Yamada,等人·，Proc Natl Acad Sci USA, 101 :4770-4775(2004)中所描述的，用碘化丙啶染色细胞并通过流式细胞术进行分析。指出了 G1期、S期、G2/M期和亚-G1期(凋亡)中的细胞的百分比。(C)包括的图像描绘了在无酚红的MEM中在盖玻片上过夜培养的MCF-7细胞和MDD2 细胞，用20 μ M p28或10 μ M的阳离子(阳性对照)肽、八精氨酸(Arg8)，(SEQ ID N0. 95) 在37°C下对其处理2小时。红色-Alexa fluor 568标记的p28，蓝色-DAPI (核)。图56. p28与p53的相互作用。(A)-(D)是描绘细胞中p53水平和p^水平的照片。(A)与!^8孵育后随时间推移MCF-7细胞中的p53水平。相对于紧接处理前p53水平的(% )增高(0小时作为100% )0 (B)GSTpu 11-down分析表明GST_p28和p53之间复合物的形成。从左到右为GST-p28 (10和20 μ g/反应)、GST_MDM2和单独的GST。利用抗p53 抗体通过免疫印迹(IB)检测p53。(C)在摩尔过量的p^存在下(上方)，p53被GST-MDM2 拉下。在M8存在下，三种不同的抗P53抗体，Pab 1801(第32-79位氨基酸)、ab 2433 (第 277-296位氨基酸)和Pab 1802 (第306-393位氨基酸)与GST_p53固定化珠子反应。利用抗P^抗体(下方)通过IB检测p28。(D)摩尔过量的p^片段pl2、pl8和pl8b与p^ 竞争对GST-p53的结合。结合的相对量(单独的P^表示为100% )。M :p28标记物。(E) 是描绘暴露于P^或天青蛋白后MCF-7核提取物中p53DNA结合的图。H2A处理的MCF-7细胞的核提取物作为内对照。利用抗P53的单克隆抗体对p53-寡聚核苷酸复合物定量。数据表示为三个重复的平均值士SEM。图57.描绘M8诱导细胞周期蛋白(CDK和CDKI)级联反应的照片。MCF-7细胞 (A)和MDD2细胞(B)暴露于p28 (50 μ Μ) 24小时、48小时和72小时，并通过免疫印迹测定蛋白质水平。将MCF-7细胞在盖玻片上与Μ8培养72小时，p21(C)和细胞周期蛋白Bl (D) 的胞内定位和相对水平。利用相应的特异性抗体染色P21和细胞周期蛋白B。(E)利用抗 p-cdc2抗体(Santa Cruz Biotechnology, CA)评价磷酸化的cdc2。所有结果通过作为内部对照的肌动蛋白来标准化。图58.描绘蛋白质结构的图。A)具有α-螺旋结构的天青蛋白截短体；B)70ns模拟的结果；C)模拟结构中基于Ca原子之间的距离对硫醚桥位置的测量。发明详述定义如本文所用的，除非特别描述为“单个细胞”，术语“细胞”包括该术语的单数或复数形式。如本文所用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质，，可交替使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还应用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”也包括修饰，所述修饰包括但不局限于糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的Y羧化、羟基化和ADP核糖基化。应理解地是，多肽并不总是全部是直链的。例如，作为泛素化的结果，多肽可以是支链的，并且一般作为翻译后事件(包括天然处理事件和非天然的人工操作引起的事件)的结果，多肽可以是环形的(具有或没有支链)。环状、支链和支链环状的多肽可通过非翻译天然方法来合成，以及通过完全合成的方法来合成。如本文所用的，术语“药理学活性”表示药物或其它化学物质对生物系统的作用。 化学物质的作用可以是有利的(治疗性的)或有害的(毒性的)。纯的化学物质或混合物可以是天然来源的(植物、动物或矿物)，或可以是合成的化合物。如本文所用的，术语“癌前”意为癌变前的，或不受控制的异常细胞分裂前。如本文所用的，术语“病变”意为异常组织的区域。如本文所用的，术语“病理状况”包括解剖上和生理上偏离正常，其构成活体动物或其部分之一的正常状态的损害、干扰或改变身体机能的表现，并且是对各种因素(如营养不良、工业危害或气候)、对特定的传染物(如蠕虫、寄生原生动物、细菌或病毒)、对生物体内在缺陷(如遗传异常)、或对这些因素的组合的反应。
如本文所用的，术语“病症”包括解剖上和生理上偏离正常，其构成活体动物或其部分之一的正常状态的损害，干扰或改变身体机能的表现。如本文所用的，术语“患有”包括，目前表现出病理状况的症状，尽管没有可观察到的症状但具有病理状况，处于病理状况的恢复中或已从病理状况中恢复。如本文所用的，术语“化学预防”是指药物、维生素或其它天然的或合成的生物的或化学的剂的使用，以试图降低癌症的发展或复发的风险、预防、抑制、逆转或延迟癌症的发展或复发。如本文所用的，术语“细胞毒性”指对细胞具有毒性的性质。例如，“细胞毒性铜氧还蛋白”是对包括癌细胞的细胞具有毒性的铜氧还蛋白或其变体、衍生物、截短体或结构等价物。如本文所用的，术语“治疗”包括预防、降低、停止或逆转与正在治疗的病症相关的病症或症状的进展或严重度。因此，术语“治疗”视情况包括药物施用、治疗性和/或预防性治疗。治疗还可包括防止或减轻病症诸如癌症的发展。如本文所用的，术语“抑制细胞生长”意为减缓或停止细胞分裂和/或细胞扩增。 该术语还包括抑制细胞发育或增加细胞死亡。“治疗有效量”是有效防止、降低、停止或逆转正在治疗对象的特定疾病的发展、或部分地或整体地减轻特定疾病的现有症状的量。治疗有效量的测定在本领域技术人员能力范围之内。如本文所用的，术语“基本上纯的”，当用于修饰本发明的蛋白或其它细胞产物时， 指的是例如从生长培养基或细胞内容物分离的蛋白形式为基本上没有或基本上未掺杂其它蛋白和/或其它化合物。术语“基本上纯的”指因子的量以干重计是分离组分的至少约 75%，或至少“75%基本上纯的”。更具体地，术语“基本上纯的”是指化合物以干重计是分离组分的至少约85%，或至少“85%基本上纯的”。最具体地，术语“基本上纯的”是指化合物以干重计是分离组分的至少约95%，或至少“95%基本上纯的”。术语“基本上纯的”也可用于修饰本发明的合成的蛋白或化合物，其中，例如，合成的蛋白从合成反应的试剂和副产物中分离。如本文所用的，术语“药物级，，当指本发明的肽或化合物时，是基本上或实质上从组分分离的肽或化合物，该组分通常伴随在天然状态发现的该物质，包括合成试剂和副产物，以及基本上或实质上从可能损坏其药用的成分分离。例如，“药物级”肽可与任何致癌物分离。在某些情况下，“药物级”可以通过想要施用的方法来修饰，例如“静脉药物级”，来指定基本上或实质上从任何可能使组合物不适于向患者施用的物质中分离的肽或化合物。例如“静脉药物级”肽可从去垢剂诸如SDS和抗菌剂诸如叠氮化物中分离。术语“分离的”、“纯化的”或“生物上纯的”指的是物质基本上没有或实质上没有通常在该物质的天然状态中伴随该物质的组分。因此，根据本发明的分离的肽优选地不含有在肽的原位环境中通常与肽有关的物质。多肽的“分离的”区域是指不包括该区域所来源的多肽的整个序列的区域。“分离的”核酸、蛋白或其相应的片段已基本上从其体内环境中移出，从而其可由有经验的技术人员来操作，诸如但不限于，核苷酸测序、限制性消化、定点诱变和亚克隆到用于核酸片段的表达载体中以及获得基本上纯的量的蛋白或蛋白片段。本文中关于肽所用的术语“变体”，是指与野生型的多肽相比，具有氨基酸替代、缺失或插入的氨基酸序列变体。变体可以是野生型肽的截短体。“缺失”是从多肽内部去除一个或多个氨基酸，而“截短体”是从多肽的一端或两端去除一个或多个氨基酸。因此，可通过操作编码多肽的基因来生成变体肽。变体可通过改变多肽的基本组成或特征，但不改变其至少某些药理学活性而生成。例如，天青蛋白的“变体”可以是保留其抑制哺乳动物癌前细胞生长的能力的突变的天青蛋白。在一些情况下，变体肽是利用非天然氨基酸(例如 ε -(3，5-二硝基苯甲酰基)-Lys 残基)来合成的。Ghadiri & Fernholz，J. Am. Chem. Soc.， 112 :9633-9635 (1990)。在一些实施方案中，与野生型肽或其部分相比，变体具有的替代、 缺失或插入的氨基酸不超过20个。在一些实施方案中，与野生型肽或其部分相比，变体具有的替代、缺失或插入的氨基酸不超过15个。在一些实施方案中，与野生型肽或其部分相比，变体具有的替代、缺失或插入的氨基酸不超过10个。在一些实施方案中，与野生型肽或其部分相比，变体具有的替代、缺失或插入的氨基酸不超过6个。在一些实施方案中，与野生型肽或其部分相比，变体具有的替代、缺失或插入的氨基酸不超过5个。在一些实施方案中，与野生型肽或其部分相比，变体具有的替代、缺失或插入的氨基酸不超过3个。在另一些实施方案中，变体是利用本文所公开的方法和技术来构建的。如本文所用的，术语“氨基酸”是指包含任何天然存在的或非天然存在的或合成的氨基酸残基的氨基酸部分，即，包含至少一个羧基和与一个、两个、三个或更多个碳原子，通常为一个(α)碳原子直接连接的至少一个氨基的任何部分。本文中关于肽所用的术语“衍生物”是指衍生自目标肽的肽。衍生包括肽的化学修饰而使肽仍保留其某些基本功能。例如，天青蛋白的“衍生物”可以，例如是化学修饰的天青蛋白，其仍保留了天青蛋白抑制哺乳动物细胞中血管生成的能力。感兴趣的化学修饰包括但不局限于，肽的酰胺化、乙酰化、硫酸化、聚乙二醇(PEG)修饰、磷酸化或糖基化，或本文所公开的其它方法和技术。此外，衍生肽可以是多肽或其片段与化学化合物的的融合， 所述化学化合物诸如但不局限于，另一肽、药物分子或其它治疗剂或药剂或可检测探针。术语“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为当比对两个序列时，多肽中与候选序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了测定氨基酸同一性％，比对序列， 并且如果需要，引入空位来实现最大的序列同一性％ ；保守性替代不被认为是序列同一性的部分。测定百分比同一性的氨基酸序列比对方法是本领域技术人员熟知的。通常，使用公众可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件来比对肽序列。在具体的实施方案中，使用长复杂性过滤器(long complexity filter)、预期 (expect) 10、字大小(word size)3、存在性(existence) 11 和延伸(extension) 1 的缺省参数来使用Blastp (可从美国国立生物技术信息中心，Bethesda MD获得)。当进行氨基酸序列比对时，给定的氨基酸序列A同、与或相对给定的氨基酸序列B 的氨基酸序列同一性％ (其可选地可表达为给定氨基酸序列A具有或包含同、与或相对给定氨基酸序列B的一定的％氨基酸序列同一性)可按如下来计算%氨基酸序列同一性=X/Y*100，其中X是氨基酸残基的数目，其通过A和B的序列比对程序或算法的比对评分为相同匹配，和Y是B中氨基酸残基的总数目。
如果氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，A对B的％氨基酸序列同一性不等于B对A的％氨基酸序列同一性。当对比较长的序列与较短的序列时，较短序列将为“B”序列。例如，当对比截短的肽与相应的野生型多肽时，截短的肽将是“B”序列。MM在一些实施方案中，本发明提供了包含铜氧还蛋白、铜氧还蛋白的变体、衍生物、 截短体和结构等价物的组合物，以及在哺乳动物中预防癌症发展的方法。在另一些实施方案中，本发明提供了包含优先进入包括癌细胞的哺乳动物细胞的铜氧还蛋白，和铜氧还蛋白的变体、衍生物、截短体和结构等价物的组合物。另一些实施方案提供了在哺乳动物中保持预防癌症的发展或癌症的复发的能力的铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物。特定的实施方案提供了包含铜绿假单胞菌天青蛋白、天青蛋白的变体、衍生物和结构等价物的组合物，和它们用来治疗患者、特别是处于比一般群体高的发生癌症的风险的患者的用途。本发明的另一些实施方案包括直接和/或优先渗透癌细胞的方法。本发明的又一些实施方案包括直接和/或优先渗透癌细胞和正常细胞并在那里具有化学预防作用的方法。另一些实施方案提供了将治疗性化合物优先递送到癌细胞的方法。最后，本发明提供了通过在诱导癌前病变之前或之后将细胞与铜氧还蛋白，或其变体、衍生物、截短体或结构等价物相接触，并观察癌前细胞和/或癌细胞的发展，从而研究哺乳动物细胞、组织和动物中癌症的发展的方法。又一些其它实施方案将从本文公开内容中变得明显。优先进入细胞先前已知由铜绿假单胞菌加工的氧化还原蛋白，铜氧还蛋白天青蛋白，选择性地进入J774肺癌细胞而非进入正常细胞中，并诱导凋亡。Zaborina等人，Microbiology 146 2521-2530(2000)。天青蛋白还可选择性地进入并杀死人黑素瘤UIS0_Mel_2细胞或人乳腺癌 MCF-7 细胞。Yamada 等人·，PNAS 99 :14098-14103(2002) ；Punj 等人，Oncogene 23 2367-2378(2004)。来自铜绿假单胞菌的天青蛋白优先进入J774小鼠网状细胞肉瘤细胞中，与肿瘤抑制蛋白P53形成复合物并使其稳定，提高了 p53的细胞内浓度，并诱导了凋亡。 Yamada 等人，hfection and Immunity 70 :7054-7062(2002) 对天青蛋白分子的不同结构域的详细研究显示氨基酸50-77 (p28) (SEQ ID NO :2)代表蛋白质转导结构域(PTD)，其对于内化和随之的凋亡活性很重要。Yamada等人.，Cell. Microbial. 7 1418-1431 (2005)。现已知天青蛋白，和来源于天青蛋白的肽，诸如P^和ρ 18，具有化学预防性质。现已知天青蛋白和其衍生物M8在小鼠乳腺器官培养中预防癌前肿瘤前病变的形成。在小鼠乳腺器官培养模型中，发现50 μ g/ml的天青蛋白将腺泡病变的形成抑制了 67%。同样地， 发现25 μ g/ml的p^将腺泡病变的形成抑制了 67%。参见实施例1。并且，发现50 μ g/ ml的天青蛋白将导管病变的形成抑制了 79%，和25 μ g/ml的p^将导管病变的形成抑制了 71%。参见实施例1。共聚焦显微术和FAC显示了天青蛋白和M8进入正常小鼠乳腺上皮细胞(MM3MG)和乳房癌细胞GTl)。P^还以温度、时间和浓度依赖的方式进入了人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)并以剂量依赖的方式抑制了培养在Matrigel 上的HUVEC的毛细管形成。共聚焦显微术和FAC也显示pl8选择性地进入人类黑素瘤细胞系(Mel-2、7、29)、 乳腺癌细胞系(MCF-7)、卵巢癌细胞系(SK-0V3)、胰腺癌细胞系(CAPAN-2)、成胶质细胞瘤细胞系(LN-2^)、星形细胞瘤细胞系(CCF-STTG1)、前列腺癌细胞系(LN-CAP)和肾癌细胞系(ACHN-CRL1611)。此外，在具有异种移植的黑素瘤肿瘤的无胸腺小鼠中，标记红外线染料(Aeffl 800nm)的pl8的成像明显地表明了原发皮下肿瘤和远位器官转移中的选择性摄取， 而不在正常器官和组织中累积。因此现已知天青蛋白和天青蛋白的变体可用来在哺乳动物患者中抑制癌前肿瘤前病变的形成，并从而抑制癌症且尤其是乳腺癌的发展。标准癌症治疗方法，包括放射疗法和化学疗法，涉及损伤癌细胞的DNA。正常DNA 损伤的细胞反应包括DNA修复的激活、细胞周期停滞和致死(Hall，Radiobiology for the Radiologist (用于放射学家的放射学)，Harper和Row，1988)。例如DNA双链断裂的诱导导致致死性染色体畸变，包括缺失、双中心粒、环和分裂后期桥(Hall，Radiobiology for the Radiologist (用于放射学家的放射学)，Harper和Row，1994)。由于肿瘤细胞和多种癌细胞对本发明的肽的选择性摄取，这些肽，包括一个实施方案中的P18，可用作将物质导入到肿瘤细胞和癌细胞中的非病毒载体。例如，本发明的肽可用来将DNA或RNA片段导入到癌细胞中，从而对肿瘤细胞或癌细胞提供治疗性的DNA或RNA片段治疗。蛋白质转导结构域(PTD)基于其结构特性、阳离子残基或两亲性α-螺旋而分为两组，但有些同时属于两个种类。通常，阳离子肽通过与带负电的表面糖蛋白结合而起始与原核物种和真核物种的细胞膜相互作用，协助有效进入到宽泛范围的正常细胞系和恶性肿瘤细胞系中。Kondejewski，L. H.，等人，J Biol Chem 277 :67-74(2002) ；Fuchs, S. M.和 Raines, R. Τ.，Biochemistry, 43 :2438-2444(2004)。阳离子肽与 HS 的结合与它们对于 HS 的高度亲和性(Kd-109nM)相符，该值远远超过以下关于天青蛋白、pl8和p^的例子中所报道的。Tran，D.等人，Proc Natl Acad Sci USA 84:7957-7961(1987)。天青蛋白和来源于其的肽(例如，P^和pl8)具有优先进入癌细胞并通过细胞抑制机制和细胞毒性机制抑制癌细胞增殖的独特性质。氧化还原蛋白通常不归为细胞渗透肽(CPP)或抗增殖剂。认为天青蛋白、？观和？18的进入与阳离子CPP的进入不同。两亲性的天青蛋白片段P18和p^含有天青蛋白的第M-67位氨基酸的α -螺旋结构以及部分片层结构。一些细胞表面受体，包括整合素和粘附蛋白，其上异常的N-糖基化与多种组织发生的癌症的进展和转移中的变化相关，表明仍未知的N糖基化的细胞表面蛋白在天青蛋白、Ρ18和!^8渗透的起始步骤中具有作用。Partridge，Ε.Α.，等人，Science 306 120-124(2004) Jeales，E. C.，等人，Cancer Res65 :4645-4652(2005) 支持胞吞组分的细胞渗透的阳离子CPP的温度依赖的进入反映在天青蛋白和天青蛋白的第50-77位氨基酸片段(p28)的进入上。Yamada, T.，等人，Cell Microbiol 7 1418-1431(2005)。天青蛋白的第50-67位氨基酸(pl8)进入正常细胞和恶性肿瘤细胞相对于P^表现得加速。P18的较低Km和较高Vmax表明天青蛋白的50-67位氨基酸当与磷脂膜结合时限定了两亲性结构，所述两亲性结构更加贴近地代表了天青蛋白的实际PTD。然而，能量依赖的胞吞过程或孔相关的过程似乎并不是这些肽唯一可获得的进入方式。例如， 代谢和膜潜在抑制物叠氮化钠和乌本苷(Na+Κ+ΑΤΡ酶抑制物)，其抑制了阳离子肽的进入， 并不削弱P18或p^进入到UISO-Mel-2细胞或成纤维细胞(图14B、C)，表明每个肽可直接渗透细胞膜。与其它阳离子肽的细胞渗透的推测的途径(即大胞饮)相比，天青蛋白来源的肽一般利用不同的渗透途径，沿肌动蛋白纤丝或微管分布至次级内体或溶酶体，并在特定的细胞周期阶段进行渗透，这是因为这些途径中的每一个的抑制物非常无效的(图14B、C)。 Pl8,p28和天青蛋白以描述为不依赖发动蛋白的网格蛋白依赖的载体介导的方式透过质膜并到达与胞膜窖结合的次级内体、溶酶体和高尔基体。KirWiam，M.和Part0n，R. G. ,Biochem Biophys Acta 1746 :349-363 ^00 。诺可唑对渗透的显著抑制和破坏肌动蛋白丝的细胞松弛素-D对抑制的相对减弱，显示了胞膜窖介导的进入。同前。已关于整体细胞表面组分和看似不同的分子描述了这种进入方式，所述看似不同的分子即，葡聚糖，和同样利用胞膜窖来绕开经典胞吞途径的广泛的病原体或其产物。利用甲基环糊精、菲律宾菌素或制霉菌素从质膜去除胆固醇以破坏脂筏，其为提供液体平台以分离膜组分并将膜区域化的质膜结构域，显著抑制了 Pl8(50% )和ρ28( 60% )渗透到UISO-Mel-2细胞和成纤维细胞中(分别为35%和42%)，表明？18和!^8通过胞膜窖渗透到质膜中的显著的百分比( 60%)。胞膜窖是质膜的脂筏内陷的50至IOOnm的Ω形亚群，由起信号转导的调节子的作用的窖蛋白特异蛋白(窖蛋白-1、-2或- 所界定。布雷菲德菌素A破坏了高尔基体并抑制了 pl8累积。因此，该通路，和高尔基体也用于P18和p^进入和胞内转运。pl8和p^通过胞膜窖进行的细胞渗透与证据一致 N-糖基化的抑制物在UISO-Mel-2细胞中使细胞进入减少了 60 %，且在成纤维细胞中使细胞进入分别减少了 25%和35%。进入之间的百分比差异与癌细胞对比正常细胞中的N-糖基化膜结构的数目相关，并且!^8和？18的进入的相关途径经由该机制。图 14B、C。相对于许多其它潜在的抗癌肽，天青蛋白、p^和pl8均以高亲和性和高容量与癌细胞结合。结合后，该蛋白/受体复合物定位在胞膜窖中并被内化，最终移向(通过小窝体(caveosome))高尔基体、ER和核。除胞膜窖介导的进入外，动力学分析还表明M8和 P18通过非网格蛋白胞膜窖介导的过程渗透质膜。非网格蛋白依赖的通路和非窖蛋白依赖的通路作为组成型内化机制而存在，比如用于白细胞介素2受体和用于某些糖基-磷脂酰肌醇(GPI)锚定的蛋白。Lamaze，C，等人，Mol Cell 7 :661-671(2001) ；Sabharanjak, S.，等人，Dev Cell，2 :411-423 0002)。不依赖网格蛋白和窖蛋白的胞吞作用也可被病原体用来侵入细胞，对于鼠多瘤病毒是唯一途径，或对于流感病毒的情况与常规途径相组合。 Ewers，H.，等人，Proc Natl Acad Sci USA 102 :15110-15115(2005) ；Sieczkarski, S. B.和 ffhittaker, G. R. ,JVirol, 76 =10455-10464(2002)。癌细胞中窖蛋白_1表达高于正常细胞不太可能为天青蛋白、P^和P18优先进入癌细胞的唯一依据。成纤维细胞和许多其它正常细胞在其表面也具有大量胞膜窖。 实施例18- 显示了 pl8 (天青蛋白的第50-67位氨基酸)和p^ (天青蛋白的第50-77位氨基酸)通过胞吞介导的途径、小窝体介导的途径和不依赖小窝体的途径优先渗透癌细胞。因为对于癌细胞的优先性，P18和？观的细胞渗透与所有目前CPP相比是独特的。令人惊奇地，p28 (SEQ ID NOS :35、36和37)的C-末端第10-12位氨基酸包括主要负责细胞周期抑制和凋亡活性/细胞毒性的结构域。并且，该相同结构域极可能与细胞膜上的特定残基接触，而无论细胞状况如何，并从而协助进入；具体地，天青蛋白的第69、70、 75、76和85位氨基酸提供了对细胞膜的接触。具有相同的氨基酸或相似结构的氨基酸的肽应该具有接触特定细胞膜残基并进入细胞的相同或相似能力，所述相似结构的氨基酸位于肽链中的相同位置，或肽链中与天青蛋白的第69、70、75、76和85位氨基酸的位置相似或等价的位置。经内化后，P^通过细胞抑制机制初步抑制癌细胞增殖。这样，负责天青蛋白优先进入人类癌细胞并分别是天青蛋白对人类癌细胞的大部分抗增殖活性和细胞毒性活性的原因。除进入癌细胞之外，如图16至53所示，ρ 18和!^8能够进入肿瘤和哺乳动物器官， 所述肿瘤和哺乳动物器官是利用实施例31中所公开的方法获得的。令人惊奇地是，pl8和 P^还能够渗透血脑屏障并进入哺乳动物脑中，如通过诸如以下中所证实的图20A、20B、 21B、23、24、28、30、31A、32B、33、34B、35A-B、37A-C、38A-C、40A、42A、43A、45A-D、46、47B、 48A-B 和 50。本发明的肽可用来将其它分子或化合物，诸如DNA或RNA片段导入到哺乳动物癌细胞中。以下描述了非限制性的示例性技术和/或可利用本发明的肽(在一个实施方案中为P18)来导入的特定DNA或RNA片段，所述肽协助相连接分子进入哺乳动物癌细胞。例如， 可优先进入细胞的本发明的化合物可与基因疗法、RNAi方法、造血基因转移、同源重组、核酶技术、反义技术、肿瘤免疫疗法和肿瘤抑制物、翻译研究、反基因疗法(反义，siRNA &核酶)、凋亡、免疫学和免疫疗法、DNA合成和修复一起使用。基因疗法包括将外源基因转移到癌细胞中，例如在适宜于基因表达的条件下，转移肿瘤抑制物或凋亡诱导物。经表达后，基因产物通过减缓肿瘤细胞生长、抑制其转移可能性或将其完全杀死而对肿瘤细胞产生有利作用。历史上，癌基因疗法的临床有效性受以下所局限1)缺乏肿瘤中治疗性基因表达的调控，和幻载体对肿瘤的选择性靶向。本发明的化合物提出了肿瘤细胞的选择性靶向。并且，已提出了关于调控基因表达的一些策略。一个策略是转录靶向，其中调控治疗基因的启动子通过肿瘤选择性转录因子来激活。例子包括乳腺癌中MUC-I启动子的使用和结肠癌中CEA启动子的使用(Kurihara 等人，“Selectivity of a replication-component adenovirus for human breast carcinoma cells expressing the MUCl antigen (用于表达 MUCl 抗原的人类乳腺癌细胞的复制组分腺病毒的选择)，“J Clin. Invest. 106(6) :763-771,2000 ；Konishi ^ 人， “Transcriptionally targeted in vivo gene therapy for carcinoembrionic antigen-producing adenocarcinoma (产生癌胚抗原的腺癌的体内基因治疗中的转录靶向)，“J Med. Sci,48(3) :79-89,1999) 反义技术基于将核酸分子导入到细胞中，所述核酸分子通常与所选择的基因表达的mRNA互补。反义分子通常抑制mRNA分子的翻译并阻止基因所编码的多肽的表达。反义技术的修改形式可通过反义分子与基因的DNA结合而形成三股螺旋从而阻止所选择基因的转录。根据本发明可使用的一种特定的反义药物是G3139(也称作oblimersen ；由Genta， Inc.，Lexington, MA生产)。可使用的另一个特定的反义分子是G4460(也称作c-myb反义，由 Genta, Berkeley Heights, NJ 生产)。基于RNA干扰(RNAi)的分子还可与本发明的肽连接。RNAi通常受双链 RNA( “如1 ^”)、短发夹1 ^( "shRNA")或其它具有相似特性的核酸分子所调节。这些核酸分子由包括切丁酶和Drosha的细胞酶类所加工或切成较小片段。然后核酸分子的较小片段可被介导mRNA降解的蛋白复合物(RISC复合物)所摄取。RISC复合物将降解与其所摄取的核酸分子的碱基对互补的mRNA。以这种方式，mRNA被特异性地破坏，从而阻止了所编码蛋白的生成。核酶技术基于将核酸分子导入到表达该核酸分子所结合的RNA分子的细胞中，并催化所述靶RNA分子的选择性裂解。靶RNA分子通常是mRNA分子，但其可以是，例如，逆转录病毒RNA分子。由同源重组导致的靶向基因缺失，其需要两个基因失活事件(每个等位基因一个事件)，这也是可用于本发明的策略。与本发明的化合物联合施用的特定疗法也可针对调控对癌症发展具有关键作用的蛋白的表达的癌症特异性转录复合物(CSTC)。参见，例如，美国专利申请第 2008/0027002号，其关于针对CSTC的癌症疗法的教导在此通过引用并入。由于铜氧还蛋白之间的高度结构相似性，可能地是，除天青蛋白之外的铜氧还蛋白和其截短体也能够通过非胞吞途径和胞吞途径优先进入癌细胞，并还能够在哺乳动物中抑制癌前病变的形成。这样的铜氧还蛋白可发现于诸如细菌或植物中。已知一些铜氧还蛋白具有与来自铜绿假单胞菌的天青蛋白相似的药物代谢动力学活性。例如，来自氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)的铁硫菌蓝蛋白(SEQ ID NO 4)也可进入巨噬细胞并诱导凋亡。Yamada 等人，Cell Cycle 3:1182-1187(2004) ；Yamada 等人，Cell. Micro. 7 1418-1431(2005)。来自层理席藻(Phormidium laminosum)的质体蓝素(SEQ ID NO 3)和来自裂环无色杆菌(Achromobacter cycloclastes)的假天青蛋白(SEQ ID NO 5)也具有针对巨噬细胞的细胞毒性。美国专利公开第20060040269号，于2006年2月23日公布。因此认为其它铜氧还蛋白也可用于本发明的组合物和方法中。并且，保留在哺乳动物中抑制癌症的形成的能力的铜氧还蛋白的变体、衍生物、截短形式和结构等价物也可用于本发明的组合物和方法中。这些变体和衍生物可包括，但不局限于本文所公开的铜氧还蛋白的截短体、氨基酸的保守置换形式和蛋白质修饰形式，包括但不局限于，聚乙二醇化和α螺旋的全烃化稳定。经由ρ53的化学预防研究了天青蛋白的氨基酸50-77 (p28，SEQ ID NO 2)和ρ53的相互作用并在以下实施例沈-30中进行描述。如本文所公开的，P^渗透人乳腺癌细胞并由ρ53介导对人乳腺癌细胞表现出抗增殖作用，Ρ53是肿瘤抑制子蛋白，其在应激时具有功能活性并触发细胞周期停止或细胞死亡。利用一系列的GST-pull down分析、甘油梯度离心、微量量热法实验、 单分子力光谱分析和计算机建模进行的实验显示，天青蛋白在P53的N末端或DNA结合结构域中结合并提高了其胞内水平。本文实施例26-30和图M-57所公开的结果将p28的结合位点限定到P53的N末端和DNA结合结构域，第1-17位、第24-31位、第80-276位或第 297-305位氨基酸中。天青蛋白对于p53的结合结构域包括由天青蛋白Met44和Met64所勾勒出的疏水面，这一推论受到该证据的支持被破坏的疏水面突变体(突变体天青蛋白M44KM64E)对人黑素瘤(Mel-2)细胞的毒性比野生型天青蛋白要小。这显示了天青蛋白分子的p53结合结构域包围着疏水面。一项最近的分子模拟研究显示了相对于野生型天青蛋白，突变体复合物的相互作用自由能的 75kJ/mol的显著减少，再次表明包围残基Met44和Met64的天青蛋白的疏水面对于与P53的相互作用是重要的。因为Met64残基在p28的p53结合位点内 (P^的第15位氨基酸)，竞争分析、突变体研究和对接实验明显显示了其为天青蛋白与p53 结合的结构域。肿瘤抑制蛋白p53是重要的核蛋白，其为包括21kDa蛋白p21/Waf 1/Cipl的许多基因的转录调节子和细胞周期进程的抑制子。利用P^处理MCF-7细胞提高了 P53的水平，导致了 P21的较高的胞内水平，p21是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)活性(尤其是分别在&期和(；2/^期调节细胞周期进程的cdc2和CDI^)的强抑制子。在通过&/M期的进程中，cdc2和CDK2激酶主要分别在与细胞周期蛋白B和细胞周期蛋白A的结合中被激活。 在&/M期停滞的细胞中，CDK抑制子p21与细胞周期蛋白A有效结合，虽然在同样条件下， 细胞周期蛋白Bl不与p21结合，并且细胞周期蛋白Bl的水平继续增高。这显示了 p^在 MCF-7细胞中诱导的&/M停滞与CDK2和细胞周期蛋白A的抑制相关(图57A)。MCF-7细胞中p^诱导的p21的增高还伴随着p27的时间依赖性增高，p27是Cip/ Kip⑶KI家族的另一成员。Hsu等人，2008最近证实根据由荧光素酶分析所测定的，对p53 的诱导提高了 p21 和 p27 启动子活性。Cellular and Molecular Life Sciences (CMLS)， 2008。此外，p21启动子和p27启动子的p53DNA结合活性由p53诱导子，孕酮所激活，这意味着不仅P21受p53的转录调控，p27也受到p53的转录调控。总之，数据显示了 P^使 P53水平的增高随之上调了 p21和p27，包括在MCF-7细胞中诱导了胞内⑶K2水平和细胞周期蛋白A水平的显著降低并在&/M期抑制了细胞周期(图57A)。已报道的细胞周期蛋白Bl和p21之间无结合或无效结合，表明暴露于P^后细胞周期蛋白B/cdc2活性的增高可能反映了遵循M8诱导的P21的增加的相似模式。暴露于M8后磷酸化的cdc2(失活形式)的增加伴随细胞周期蛋白Bl的增高的细胞水平，表明cdc2-细胞周期蛋白B复合物的增加通过cdc2磷酸化的增高来体现。诺可唑在MCF-7和MDA-MB-468人乳腺癌细胞中诱导了相似的&停滞，伴随高水平的胞质细胞周期蛋白Bi，诺可唑是已知的微管破坏剂，和p21 的转录和翻译激活剂。分化剂诸如全反式视黄酸(ATRA)和丁酸钠(SB)在口腔鳞状癌细胞中产生了相似的生长抑制现象和G1停滞，其与G1期细胞周期调控蛋白⑶K6、p21和p27的诱导，和&期细胞周期调控蛋白CDK2的抑制相关。由于M8在MDD2细胞中没有使p21增高，且P27在这些细胞中表现为不存在，⑶K2和细胞周期蛋白A的水平没有显著改变(图 57B)且没有发生细胞周期抑制。关于P^诱导CDK2和细胞周期蛋白A复合物(人类细胞中cdc2活性的关键调节物)降低而导致G1和&/M停滞的其它证据发现于对HeLa细胞进行细胞周期蛋白A RNAi引入后的( 延迟中，该引入使CDK2-细胞周期蛋白A复合物失活而导致细胞周期停滞在&/M。虽然Cip/Kip家族蛋白诸如p21和p27是细胞周期蛋白A依赖的⑶K2的有效抑制物，但它们还可作为细胞周期蛋白D依赖性激酶的阳性调节物来行使作用。Cip/Kip家族蛋白能够稳定⑶K4和⑶K6。⑶K4在多种肿瘤中扩增和过表达，所述肿瘤包括乳腺癌、胶质瘤、肉瘤和子宫颈癌，而⑶K6基因在某些类型的恶性肿瘤中扩增，包括鳞状细胞癌、胶质瘤和淋巴瘤。虽然CDK6的起始水平或对照水平低于CDK4，但在暴露于p28的MCF-7细胞中⑶K6的水平是持续增高的，而⑶K4并非如此。而且，响应于p28时，MDD2细胞中的⑶K4 和CDK6没有改变，其中p53和p21没有增高(图57B)。Ink4组，CDKI的pl6Ink4a、pl5Ink4b、 PlS1nk4c和pl9Ink4d与在G1调节细胞周期进程的⑶K4和⑶K6特异性结合并将其抑制。因为 pl6Ink4a基因在MCF-7细胞中为纯合缺失，⑶KI蛋白应对⑶K6表现出与对⑶K4相比较小的抑制作用，这为CDK6中所观察到的在CDK4水平基本上稳定的情况下CDK6的增加提供了合理解释。总体而言，这些结果表明了 p^结合p53，提高了 p53的水平，随之通过p21和p27 失活CDK2-细胞周期蛋白A复合物增强了抗增殖活性，导致体外MCF-7乳腺癌细胞中的( /M细胞周期停滞，并在无胸腺小鼠中抑制了 MCF-7异种移植物的生长。本发明的组合物在一些实施方案中，本发明提供了为在哺乳动物细胞、组织和动物中抑制癌前病变的发展的铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、截短体、衍生物或结构等价物的肽。在另一些方面，本发明还提供了为在哺乳动物细胞、组织和动物中抑制癌症的发展的铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、截短体、衍生物或结构等价物的肽。在一些实施方案中，肽包含p28(SEQ ID NO 2)的 C-末端，比如 SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36 或 SEQ ID NO :37。在另一些实施方案中，肽在与天青蛋白的位置相同或相似的位置中包含位于SEQ ID而1的第69、70、 75,76和85位的氨基酸中的一个或多个。本发明的一些实施方案还提供了为优先进入癌细胞的铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、截短体、衍生物或结构等价物的肽。在另一些方面，本发明提供了为通过胞吞途径优先进入细胞并在那里具有化学预防作用的铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、截短体、衍生物或结构等价物的肽，所述胞吞途径包括胞膜窖介导的途径和高尔基体介导的途径。在另一些实施方案中，肽包含P28的C-末端或由p^的C-末端组成，诸如SEQ IDN0. 35、SEQ ID NO. 36或SEQ ID NO. 37。在另一些实施方案中，肽在与天青蛋白的位置相同或相似的位置中包含位于SEQ ID N0:1的第69、70、75、76和85位的氨基酸中的一个或多个。在另一些实施方案中，肽在与天青蛋白的位置相同或相似的位置中包含位于SEQ ID N0:1的第 69、70、75、76和85位的氨基酸。在一些实施方案中，肽是分离的。在一些实施方案中，肽是基本上纯的或药物级的。在另一些实施方案中，肽在包含所述肽或基本上由所述肽组成的组合物中。在另一个具体的实施方案中，肽是非抗原性的并且在哺乳动物中，且更具体地在人中，不引起免疫反应。在一些实施方案中，肽小于全长铜氧还蛋白，且保留了铜氧还蛋白的一些药理学活性。 具体地，在一些实施方案中，肽可能保留了在小鼠乳腺器官培养中抑制癌前病变的发展的能力。在另一些实施方案中，肽保留了通过诸如胞膜窖介导的胞吞作用直接和优先进入细胞的能力。在另一些实施方案中，肽保留了直接和优先进入细胞并在那里具有化学预防作用的能力。在其它方面，本发明还提供了包含为能够优先进入癌细胞的铜氧还蛋白，或铜氧还蛋白的变体、衍生物、截短体或结构等价物的至少一种肽的组合物，具体地在药物组合物中。在具体的实施方案中，设计所述药物组合物以用于特定的施用模式，例如但不局限于， 口服施用、腹膜内施用或静脉施用。这样的组合物可在水中水合，或可被干燥(例如通过冻干)以用于以后的水合。这样的组合物可以在除水以外的溶剂中，例如但不局限于，乙醇。本发明的某些实施方案还提供了包含肽的组合物，所述肽为在哺乳动物细胞、组织和动物中优先进入癌细胞和/或肿瘤的铜氧还蛋白的变体、衍生物、截短体或结构等价物。在一些实施方案中，肽是P28的C-末端，比如SEQ ID NO. 35或SEQ ID NO. 36。在一些实施方案中，肽是具有SEQ IDN0. 25的pl8。在一些实施方案中，肽是pl8的变体、衍生物或结构等价物。在一些实施方案中，组合物是与DNA或RNA偶联的pl8。在一些实施方案中，DNA或RNA是基因或基因的部分。在一些实施方案中，DNA或RNA经递送后具有治疗性作用。在一些实施方案中，肽是具有SEQ IDN0.2的p28。在一些实施方案中，肽是M8的变体、衍生物或结构等价物。在一些实施方案中，组合物是与DNA或RNA偶联的p28。在一些实施方案中，DNA或RNA是基因或基因的部分。在一些实施方案中，DNA或RNA经递送后具有治疗性作用。由于铜氧还蛋白之间的高度结构同源性，考虑了铜氧还蛋白将具有与天青蛋白和 P^相同的化学预防性质。在一些实施方案中，铜氧还蛋白是，但不局限于，天青蛋白、假天青蛋白、质体蓝素、铁硫菌蓝蛋白、橙绿屈挠素、漆树蓝蛋白、黄瓜碱性蛋白或Laz。在具体的特定的实施方案中，天青蛋白来源于铜绿假单胞菌、粪产碱菌、木糖氧化无色杆菌反硝化亚种I、支气管炎博德特菌、甲基单胞菌、脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、荧光假单胞菌、绿针假单胞菌、苛养木杆菌、百日咳石莼菌(Ulva pertussis)和副溶血性弧菌。在一个实施方案中，天青蛋白来自铜绿假单胞菌。在另一些具体的实施方案中，铜氧还蛋白包含SEQ ID NO :1、3-19的氨基酸序列。本发明的方面包括为氨基酸序列变体的肽，其与野生型铜氧还蛋白相比具有氨基酸替代、缺失或插入。本发明的变体可以是野生型铜氧还蛋白的截短体。在一些实施方案中，本发明的肽包含小于全长野生型多肽的铜氧还蛋白的区域。在一些实施方案中，本发明的肽包含截短的铜氧还蛋白的约10个以上的残基、约15个以上的残基或约20个以上的残基。在一些实施方案中，肽包含截短的铜氧还蛋白的不超过约100个残基、不超过约50个残基、不超过约40个残基、不超过约30个残基或不超过约20个残基。在一些实施方案中， 铜氧还蛋白与肽，且更具体地为SEQ ID N0:l、3-19与本发明的肽具有至少约70%的氨基酸序列同一性、至少约80%的氨基酸序列同一性、至少约90%的氨基酸序列同一性、至少约95%的氨基酸序列同一性或至少约99%的氨基酸序列同一性。在具体的实施方案中，铜氧还蛋白的变体包含铜绿假单胞菌天青蛋白残基 50-77 (p28，SEQ ID NO :2)、天青蛋白残基 50-67 (pl8，SEQ IDNO :2 或天青蛋白残基 36-88 (SEQ ID NO :26)。在另一些实施方案中，铜氧还蛋白的变体由铜绿假单胞菌天青蛋白残基50-77(SEQ ID NO :2)、天青蛋白残基50-67 (SEQ ID NO 25)或天青蛋白残基 36-88 (SEQ ID NO 26)组成。在另一些具体的实施方案中，变体由天青蛋白以外的铜氧还蛋白的等价残基组成。还考虑了可设计其它铜氧还蛋白变体，其具有与天青蛋白残基 50-77 (SEQ ID NO 2)或天青蛋白残基36-88 (SEQ ID NO 26)相似的药理学活性。为实现此目的，利用BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign (DNASTAR)将目标铜氧还蛋白氨基酸序列与铜绿假单胞菌天青蛋白序列进行比对，相关残基位于铜绿假单胞菌天青蛋白氨基酸序列上，在目标铜氧还蛋白序列上寻找等价残基，从而设计等价肽。在本发明的一个实施方案中，铜氧还蛋白变体包含橙色绿屈挠菌的橙绿屈挠素的至少第57-89位氨基酸(SEQ ID NO :20)。在另一个实施方案中，铜氧还蛋白变体包含铜绿假单胞菌天青蛋白的至少第50-67位氨基酸(SED ID NO 25)。在本发明的另一个实施方案中，铜氧还蛋白变体包含丁香假单胞菌O^seudomonas syringae)天青蛋白的至少第51-77 位氨基酸(SEQ ID N0:21)。在本发明的另一个实施方案中，铜氧还蛋白变体包含脑膜炎奈瑟球菌天青蛋白的至少第89-115位氨基酸(SEQ ID NO :22)。在本发明的另一个实施方案中，铜氧还蛋白变体包含副溶血性弧菌天青蛋白的至少第52-78位氨基酸(SEQ ID NO 23)。在本发明的另一个实施方案中，铜氧还蛋白变体包含支气管炎博德特菌天青蛋白的至少第51-77位氨基酸(SEQ ID NO 24)。变体还可包括由合成的而非天然存在的氨基酸形成的肽。例如，可将非天然存在的氨基酸整合到该变体肽中以延长或优化组合物在血流中的半衰期。这样的变体包括，但不局限于D、L-肽类(非对映异构体)(例如Futaki等人，J.Biol. Chem. 276(8) 5836-40(2001) ；Papo 等人，Cancer Res. 64(16) :5779-86(2004) ；Miller 等人， Biochem. Pharmacol. 36(1) 169-76，(1987).；含有非天然氨基酸的肽类(例如 Lee 等人，J. Pept. Res. 63(2) :69-84^)04))，接有烃类环钩的含烯烃的非天然氨基酸(例如 khafmeister 等人，J. Am. Chem. Soc. 122 :5891-5892(2000) ；Walenski 等人，Science305 1466-1470(2004)),以及包含ε -(3,5- 二硝基苯甲酰基)-Lys残基的肽。在另外的实施方案中，本发明的肽是铜氧还蛋白的衍生物。铜氧还蛋白的衍生物是化学修饰的肽，从而肽仍保留其某些基本活性。例如，天青蛋白的“衍生物”可以是化学修饰的天青蛋白，其保留了通过胞吞途径或非胞吞途径优先进入癌细胞的能力，以及在哺乳动物细胞、组织或动物中抑制癌前病变发展的能力。感兴趣的化学修饰包括但不局限于， 肽的烃稳定、酰胺化、乙酰化、硫酸化、聚乙二醇(PEG)修饰、磷酸化和糖基化，以及本文所公开的其它方法。此外，衍生的肽可以是铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物与化学化合物的融合物，所述化合物例如但不局限于，另一肽、药物分子或其它治疗剂或药剂或可检测的探针。感兴趣的衍生物包括例如通过本领域技术人员熟知的一些方法进行化学修饰，通过实施修饰本发明的肽和组合物在血流中的半衰期可以被延长或优化，所述方法包括但不局限于环化肽(例如Monk等人，BioDrugs 19(4) =261-78, (2005) ；DeFreest等人，J. Pept. Res. 63 (5) :409-19 (2004))、N-末端和 C-末端修饰(例如 Labrie 等人，Clin. Invest. Med. 13(5) :275-8, (1990))、和接有烃类环钩的含烯烃的非天然氨基酸(例如 Schafmeister 等人，J. Am. Chem. Soc. 122 :5891-5892 (2000) ；Walenski 等人，Science 305 1466-1470(2004))ο在一些实施方案中，可利用方法对铜氧还蛋白进行改变，所述方法包括但不局限于，降低肽的水解的方法、降低肽的脱酰胺作用的方法、降低氧化的方法、降低肽的免疫原性和/或提高肽的结构稳定性的方法。在一些实施方案中，可利用增强铜氧还蛋白优先进入癌细胞和/或在那里产生细胞毒性作用的方法来对铜氧还蛋白进行修饰。认为本文所描述的两种或多种修饰可在一种被修饰的铜氧还蛋白来源的肽中进行组合，以及为提高药物代谢动力学性质而将本文所描述的一种或多种修饰与其它修饰进行组合是本领域中的技术人员所熟知的。设计这样的变体和衍生物的许多方法是本领域中所熟知的。生物转化提高肽的药物代谢动力学性质的一种方法是构建对生物转化较不敏感的铜氧还蛋白来源的肽的变体和衍生物。生物转化可能降低肽的药理活性并提高其从患者体内消除的速率。实现该目的的一个途径是测定最可能被生物转化的氨基酸和/或氨基酸序列，并将这些氨基酸用对该特定转化过程不敏感的氨基酸来替代。在一些实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽可包括非天然氨基酸或修饰的氨基酸。 在一些实施方案中，某些非天然氨基酸的导入增强了铜氧还蛋白来源的肽的药物代谢动力学活性。这样的导入可以是位点特异性的并且可进行这样的导入以避免体内的一些生物化学修饰。示例性的非天然氨基酸包括b-氨基酸(例如，b3和1^2)、同源氨基酸、环状氨基酸、 芳香族氨基酸、脯氨酸和焦谷氨酸衍生物、3-取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环取代的苯丙氨酸和酪氨酸衍生物、线性核心氨基酸和二氨基酸。可通过定点修饰、核糖体翻译、或通过肽的化学合成将这样的非天然氨基酸整合到肽中。这些方法中的每一种均可用于合成铜氧还蛋白来源的肽。例如，修饰的来源于铜氧还蛋白的肽可通过使用具有非天然氨基酸结构的野生型氨酰基tRNA合成酶(AARQ来合成以用于产生非天然铜氧还蛋白变体。参见， Hartman,等人，PLoS One, 2 (10) :e972(2007) ；Miranda,等 A, J. Am. Chem. Soc. 129 13153-13159(2007)。核糖体翻译机器的特异性限制了利用核糖体翻译可整合到肽中的非天然氨基酸的多样性。已报道作为AARS底物的90种以上的非天然结构单元包括侧链和骨架类似物。Hartman，等人，PLoS One, 2 (10) :e972(2007)。可利用全酶翻译系统高效地将 50种以上的非天然氨基酸整合到肽中，所述肽含有达13种不同的非天然氨基酸。Hartman， 等人，PLoS One, 2 (10) :e972(2007)。在一些实施方案中，可将这样的氨基酸整合到铜氧还蛋白来源的肽中。化学修饰铜氧还蛋白或细胞色素c551或其变体、衍生物、截短体或结构等价物的一种方法可遵循设计抗HIV小蛋白——具有提高的药学性质的CCL-5(RANTEQ所采取的步骤，该方法通过，例如，疏水性N-末端修饰、总蛋白-聚合物轭合化学物质合成、编码的和非编码的氨基酸诱变、肽骨架工程和位点特异性聚合物连接来进行。抗HIV蛋白可通过在不同的连接位置将天然和非天然氨基酸残基整合到含有CCL-5类似物的聚合物替代物中来设计。研究表明聚合物修饰的CCL-5衍生物的体外抗HIV活性与CCR-5信号传递相关联，因此对肽的改变应该不会破坏CCR-5活性。Miranda，等人，J. Am. Chem. Soc. 129 13153-13159(2007)，其公开内容在此以其整体通过引用并入。其它修饰可包括利用旋光性的α -氨基酸。旋光性的α _氨基酸及其衍生物在药物、农业化学品和作为手性配体中的用途正在扩展。尤其是，手性甘氨酸和丙氨酸等价物具有重要作用。已提出了用于构建α-氨基酸的至少一种立体选择性策略，在预定的立体 it^^r^-M^Mt α-MSSIo Lu, ^A "Asymmetric Synthesis of α -amino acids Preparation and alkylation of monocyclic iminolactones derived from α -Methyl trans-cirmamaldehydda -氨基酸的不对称合成来源于a -甲基反式肉桂醛的单环亚胺内酯的制备和烷基化)”于2008年9月11日在网上出版(在J. Org. Chem.中待出版)，其公开内容在此通过引用并入。修饰的铜氧还蛋白来源的肽可利用旋光性的α-氨基酸来合成以产生富含对映体的重复。在含天冬氨酸的肽中水解常为一个问题。天冬氨酸易于脱水而形成环状亚胺中间物，导致天冬氨酸转化成可能失活的异天冬氨酸类似物，并最终裂解肽链。例如，在肽序列中存在天冬氨酸-脯氨酸的情况下，环状亚胺中间物的酸催化的形式可能导致肽链裂解。 类似地，在肽序列中存在天冬氨酸-甘氨酸的情况下，环状中间物可被水解为原始天冬氨酸形式(无害的)或异天冬氨酸类似物。最终，所有的天冬氨酸形式可完全转化为异天冬氨酸类似物。具有丝氨酸的相似的序列也可被水解以形成能够裂解肽链的环状亚胺中间物。 肽的裂解可导致降低的血浆半衰期以及降低的肽的特定药理活性。考虑到在铜氧还蛋白来源的肽中用其它氨基酸取代天冬酰胺和/或丝氨酸可能导致具有改善的药物代谢动力学性质(比如肽的较长的血浆半衰期和提高的药理活性的特异活性)的肽。在一个所考虑的变体中，铜氧还蛋白来源的肽的一个或多个天冬酰胺残基可被另一氨基酸残基所替代，且具体地为被谷氨酸残基所替代。在另一个所考虑的变体中，铜氧还蛋白来源的肽的一个或多个丝氨酸残基可被另一氨基酸残基所替代，且具体地为被苏氨酸残基所替代。在铜氧还蛋白来源的肽的一些变体中，一个或多个天冬酰胺残基和一个或多个丝氨酸残基是取代的。在一些实施方案中，进行了保守性替代。在另外的实施方案中，进行了非保守性替代。生物转化中的氨基酸残基的脱酰胺作用是一个特殊问题。这种碱催化的反应通常发生在含天冬酰胺-甘氨酸或谷氨酰胺-甘氨酸的序列中，并遵循与以上的天冬氨酸-甘氨酸序列类似的机制。天冬酰胺-甘氨酸序列的脱酰胺作用形成了环状亚胺中间物，所述环状亚胺中间物随后水解形成天冬氨酸或天冬酰胺的异天冬氨酸类似物。此外，环状亚胺中间物可导致D-天冬氨酸或天冬酰胺的D-异天冬氨酸类似物的外消旋作用，所有这些均可能导致肽的失活形式。考虑了铜氧还蛋白肽中的脱酰胺作用可通过利用另一种氨基酸来替代铜氧还蛋白的天冬酰胺-甘氨酸或谷氨酰胺-甘氨酸序列的甘氨酸、天冬酰胺和/或谷氨酰胺来阻止，并可能导致具有改良的药物代谢动力学性质(比如肽的较长的血浆半衰期和提高的药理活性的特异活性)的肽。在一些实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽的一个或多个甘氨酸残基被另一氨基酸残基所替代。在具体的实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽的一个或多个甘氨酸残基被苏氨酸或丙氨酸残基所替代。在一些实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽的一个或多个天冬酰胺或谷氨酰胺残基被另一氨基酸残基所替代。在具体的实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽的一个或多个天冬酰胺或谷氨酰胺残基被丙氨酸残基所替代。在另外的具体的实施方案中，铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的残基58和/或63处的甘氨酸， 或其它铜氧还蛋白的等价甘氨酸，被丙氨酸或苏氨酸所替代。在另外的具体的实施方案中， 铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的残基59处的甲硫氨酸，或另一个铜氧还蛋白来源的肽的等价的甲硫氨酸残基，被丙氨酸残基所替代。在其它的具体的实施方案中，铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ IDNO=I)残基63处的甘氨酸，或另一个铜氧还蛋白来源的肽的等价甘氨酸残基，被苏氨酸残基所替代。在一些实施方案中，进行了保守性替代。在另外的实施方案中，进行了非保守性替代。在具体的实施方案中，本发明的经修饰的铜氧还蛋白来源的肽包含以下序列，其中下划线的氨基酸被置换到野生型铜绿假单胞菌P^序列中LSTAADMQAVVTDTMASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO 38)氨基酸的可逆氧化和不可逆氧化是另外的生物转化过程，其也可产生可能降低药理活性、和/或铜氧还蛋白来源的肽的血浆半衰期的问题。半胱氨酸和甲硫氨酸残基是经历可逆氧化的主要残基。在较高PH下加速了半胱氨酸的氧化，其中的硫醇更易于去质子化并易于形成链内或链间二硫键。这些二硫键通过利用二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基膦)盐酸盐(TCEP)来处理可易于在体外逆转。甲硫氨酸通过化学途径或光化学途径氧化而形成甲硫氨酸亚砜并进而形成甲硫氨酸砜，二者均几乎不可能逆转。考虑了铜氧还蛋白来源的肽中的氧化可通过用其它残基替代甲硫氨酸和/或半胱氨酸残基来防止。在一些实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽中的一个或多个甲硫氨酸和/ 或半胱氨酸残基被另一氨基酸残基所替代。在具体的实施方案中，甲硫氨酸残基被亮氨酸或缬氨酸残基所替代。在其它的具体的实施方案中，铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的残基56和64处的一个或多个甲硫氨酸，或其它的铜氧还蛋白来源的肽中的等价的甲硫氨酸残基，被亮氨酸或缬氨酸所替代。在一些实施方案中，进行了保守性替代。在另外的实施方案中，进行了非保守性替代。在具体的实施方案中，本发明的铜氧还蛋白肽包含以下序列其中之一，其中下划线的氨基酸被置换到野生型铜绿假单胞菌P^序列中LSTAADLQGVVTDGLASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO :39)或LSTAADVQGVVTDGVASGLDKDYLKPDD(SEQ ID NO :40).可能影响铜氧还蛋白来源的肽的药理活性、(诸如优先进入细胞的能力)，血浆半衰期和/或免疫原性的另一生物转化过程是二酮哌嗪和焦谷氨酸形成。当甘氨酸在自N-末端的第三位时，且更特别地当脯氨酸或甘氨酸在第1位或第2位时，通常发生二酮哌嗪形成。该反应涉及第二和第三氨基酸之间的酰胺羰基上的N-末端氮的亲核攻击，其导致前两个氨基酸裂解形成二酮哌嗪。另一方面，如果谷氨酰胺在N-末端时，焦谷氨酸形成可能是几乎不可避免的。这是类似的反应，其中N末端氮攻击谷氨酰胺的侧链羰基碳而形成脱酰胺的焦谷氨酰肽类似物。该转化还发生于N-末端含天冬酰胺的肽中，但程度小得多。考虑了通过利用另一氨基酸残基来替代铜氧还蛋白来源的肽中的来自N-末端的第1位、第2位或第3位中的甘氨酸、来自N-末端的第3位中的脯氨酸或肽的N-末端的天冬酰胺而减少二酮哌嗪和焦谷氨酸形成。在一些实施方案中，来自铜氧还蛋白来源的肽的 N-末端的第1位、第2位或第3位中的甘氨酸被另一氨基酸残基所替代。在特定的实施方案中，甘氨酸残基被苏氨酸或丙氨酸残基所替代。在另一个实施方案中，来自铜氧还蛋白来源的肽的N-末端的第3位上的脯氨酸被另一氨基酸残基所替代。在特定的实施方案中，脯氨酸被丙氨酸残基所替代。在另一个实施方案中，N-末端的天冬酰胺被另一氨基酸残基所替代。在特定的实施方案中，天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基所替代。在一些实施方案中，进行了保守性替代。在另外的实施方案中，进行了非保守性替代。可能影响铜氧还蛋白来源的肽的药理活性、血浆半衰期和/或免疫原性的另一生物转化过程是外消旋作用。该术语不严谨地用于指氨基酸或肽的手性完整性的整体丢失。 外消旋作用涉及氨基酸的一个对映体(通常是L-形式)碱催化的转化为L-对映体和D-对映体的1 1混合物。通常一个提高肽的稳定性的途径是通过生成逆反(D-异构体)肽。肽结构的双翻转通常使侧链的表面拓扑结构保持完整并被广泛用于稳定生物活性肽。Snyder 等人，PLoS Biol. 2 =0186-0193(2004)。D-氨基酸取代的Tat如同L-氨基酸一样被内化到细胞中。Futaki 等人，J. Biol. Chem. 276 :5836-5840 (2001) ；Huq 等人，Biochemistry 38: 5172-5177(1999)。在一些实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽的一个或多个氨基酸残基被该氨基酸残基的D-异构体所替代。在另外的实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽的所有氨基酸残基均被这些残基的D-异构体所替代。在一个实施方案中，经修饰的铜氧还蛋白来源的肽是铜氧还蛋白来源的肽的逆反(D-异构体)形式。在一个具体的实施方案中，经修饰的铜氧还蛋白来源的肽是DDPKLYDKDLGSAMGDTWGQMDAATSL (SEQ ID NO 41)保护铜氧还蛋白来源的肽不受生物转化降解的其它方法为N-乙酰化和C-酰胺化。这些衍生物可保护肽不被降解并可使铜氧还蛋白来源的肽更精确地模仿天然蛋白中的 α氨基和羧基的荷电状态。具有N-乙酰化和/或C-酰胺化的肽可通过商业供应商来提供。在本发明的一个实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽的N-末端可以被乙酰化。在本发明的另一个实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽的C-末端可以被酰胺化。在一个具体的实施方案中，经修饰的铜氧还蛋白来源的肽是
乙酰化-LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD-酰胺化(SEQ ID NO 42)。环化是生物转化的另一方式，其对包括本文所描述的铜氧还蛋白的治疗性肽可能是有益的。环化可稳定治疗性肽，使其贮存更长时间，以更低剂量来施用和较小频率来施用。已证明环化保护肽不受肽酶和蛋白酶降解。可用化学方法或酶促方法来进行环化。一般酶促环化比化学环化问题较少，因为化学环化可能缺少区域和立体专一性，可能导致多聚化而非环化，并可能需要复杂的多步骤过程。事实上，已显示对于蛋白水解酶硫醚环化比二硫键更具保护性且更稳定。在含羊毛硫抗生素_(甲基)羊毛硫氨酸的细菌肽中已展示了酶促环化。E.g.， R. Rink,等人·，“Lantibiotic Structures as Guidelines for the Design of Peptides That Can Be Modified by Lantibioitic Enzymes (羊毛硫抗生素结构作为设计可被羊毛硫抗生素酶修饰的肽的指南广，44Biochem. ,8873-82(2005) ；R. Rink，等人，“I^roduction of Dehydroamino Acid-Containing Peptides by Lactococcus lactis (通过季L酸iLi求菌产生含脱氢氨基酸的肽)，，73 :6Applied and Environmental Microbiology, 1792-96 (2007)； R. Rink, 等人.,"NisC, the Cylcase of the Lantibiotic Nisin, Can Catalyze Cyclization of Designed Nonlantibiotic P印tides (羊毛硫抗生素乳链菌肽的环化酶， NisC,可催化所设计的非羊毛硫抗生素肽的环化)” 46BioChem.，13179-89 (2007)(其每一项均在此通过引用并入)。羊毛硫抗生素由革兰氏阳性细菌产生并抑制革兰氏阳性细菌的生长。在羊毛硫抗生素中，通过酶介导的丝氨酸和苏氨酸残基的脱水作用而产生了脱氢丙氨酸和脱氢酪氨酸。且然后通过酶促方法将半胱氨酸偶联到脱水的丝氨酸和苏氨酸残基上而形成硫醚环化。天然存在的羊毛硫抗生素显示了残基间通过硫醚键的这种偶联，所述残基的间距达19个残基。硫醚环形成取决于前导肽。环化的位置取决于环化酶介导的区域和立体专一性闭环作用和可脱水的丝氨酸残基和苏氨酸残基的位置。最为详细描述的羊毛硫抗生素是乳链菌肽——一种由乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)产生的五环肽抗生素。乳链菌肽由4个甲基羊毛硫氨酸、1个羊毛硫氨酸、2个脱氢丙氨酸、1个脱氢α -氨基丁酸和26个未修饰的氨基酸组成。乳链菌肽的5个硫醚交联是通过将半胱氨酸残基添加到源于丝氨酸和苏氨酸的脱氢丙氨酸和脱氢酪氨酸上而形成。乳链菌肽含有通过膜相关酶复合物翻译后引入的含硫醚的氨基酸。该酶复合物包括运载体 NisT、丝氨酸和苏氨酸脱氢酶NisB和环化酶NisC。NisB使丝氨酸残基和苏氨酸残基脱水， 使其分别转化为脱氢丙氨酸和脱氢酪氨酸。然后MsC催化半胱氨酸的对映体选择性与所形成的脱氢残基偶联。NisT协助经修饰的前乳链菌肽(prenisin)的转运。另一种酶NisP 从前乳链菌肽裂解乳链菌肽前导肽。环化酶NisC 已被详细描述。Li 等人，"Structure and Mechanism of the Lantibiotic Cylclase Involved in Nisin Biosynthesis (nisin 生物合成中的羊毛硫抗生素的结构和机制)，，311Science，1464-67(2006)(其全部内容在此通过引用并入)。羊毛硫抗生素中环化的分析已引导对肽中易于环化的氨基酸序列和特性的鉴定。 已显示NisB酶更经常使位于丝氨酸残基和苏氨酸残基侧面的某些氨基酸脱水。已显示环化更经常发生于其中疏水残基、非芳香性残基邻近丝氨酸残基和苏氨酸残基的羊毛硫抗生素前肽中。经修饰的半胱氨酸的侧面残基通常比经修饰的苏氨酸和丝氨酸的侧面残基具有更少疏水性。已发现的例外包括六肽VSPPAR(SEQ ID NO 43)、YTPPAL(SEQ ID NO 44)禾口FSFFAF (SEQ ID NO :4 。六肽表明在第3位或第4位存在脯氨酸或在两侧具有苯丙氨酸可防止脱水。通常通过将脱水残基与位于C-末端的半胱氨酸相偶联而形成环。然而，可通过将脱水残基与位于N末端的半胱氨酸偶联来形成环。还已显示乳链菌肽脱水和转运酶并不是对乳链菌肽特异的，而事实上可用来修饰非乳链菌肽的肽(和非羊毛硫抗生素肽)。已显示当诸如人类肽激素的肽的N末端与羊毛硫抗生素前导肽融合时，NisB使所述肽中的丝氨酸残基和苏氨酸残基脱水。在非羊毛硫抗生素肽上，应用了相似的环形成特性；即，脱水的程度可通过可脱水的丝氨酸残基和苏氨酸残基的侧翼区域的氨基酸组成来控制。丝氨酸和苏氨酸周围疏水侧翼残基(例如，丙氨酸和缬氨酸)的存在使得完全脱水并因此增强了硫醚环形成。N-末端天冬氨酸和C末端侧翼的精氨酸的存在阻止了脱水。还显示，脯氨酸残基和苯丙氨酸残基的存在不利于脱水。通常，亲水侧翼残基的存在阻止了丝氨酸残基和苏氨酸残基的脱水。疏水侧翼利于脱水；亲水侧翼不利于脱水。研究已显示在脱水发生处，丝氨酸和苏氨酸的侧翼残基的平均疏水性为正——N末端侧链上为0.40且C-末端侧链上为0. 13。而且，未经脱水的丝氨酸和苏氨酸侧翼残基的平均疏水性为负——N末端侧链上为-0. 36且C-末端侧链上为-1. 03。脱水不受一系列侧翼的苏氨酸残基的存在所限制并且不受乳链菌肽前导肽和待脱水的残基之间的距离所限制。已显示NisC在与天然存在的羊毛硫抗生素无关的肽中催化区域专一性的硫醚环的形成。通常，必须将这样的肽与乳链菌肽前导肽融合。在一些例子中，硫醚环可自发形成， 例如其中脱氢丙氨酸由两个来自半胱氨酸的氨基酸所间隔。与自发环化所不同的是，NisC 催化的环化对脱水的前乳链菌肽具有立体专一性。因此乳链菌肽中的甲基羊毛硫氨酸和羊毛硫氨酸为DL构型。据认为非羊毛硫抗生素肽中的环化也将是立体专一性的。可将这些原理应用于本文所描述的化合物中，包括铜氧还蛋白及其变体和截短体。硫醚桥事实上，存在桥下具有达19个氨基酸的羊毛硫抗生素酶诱导的硫醚桥。桥下具有 2-4个氨基酸的硫醚桥是高丰度的。在一些实施方案中，铜氧还蛋白可通过将硫醚键引入结构中来进行修饰。例如， 天青蛋白截短体p28 (SEQ ID NO : 可利用这种方法来修饰。利用软件包GROMACS (www. gromacs.org)进行的延长的分子动力学模拟(70ns)表明，在37°C下，来自第6位至第16 位的MSci螺旋的区域是不稳定的，且肽易于采用β折叠构象。图58，A和B。这连同事实——所推测的负责与Ρ53相互作用的分子的部分保持溶剂接触，表明P^肽的该区域中引入硫醚桥可能不影响其功能性。ρ28的氨基酸序列是SEQ ID NO 2(LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD)。已知作为 ρ18 的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 25 (LSTAADMQGVVTDGMASG)。序列 SGLDKD (SEQ ID NO. 96)可与 p53 相互作用。硫醚桥可在 N-侧的丝氨酸/苏氨酸和C侧的半胱氨酸之间形成。丝氨酸/苏氨酸被脱水且随后与半胱氨酸偶联。苏氨酸是优选的，因为其比丝氨酸更易于脱水。通常，苏氨酸的疏水侧翼残基 (至少一个)是优选的，因为它们提高了脱水的程度。作为侧翼残基的带负电荷的氨基酸， 谷氨酸和天冬氨酸对脱水具有强烈的负电效应。通常，亲水侧翼残基，尤其是甘氨酸，不利于脱水。在半胱氨酸之前，对带电荷的亲水残基具有轻微偏好性，尤其是谷氨酸/天冬氨酸。参与成环的氨基酸的数量取决于硫醚环的大小。在一个实施方案中，截短体天青蛋白序列为LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLTPGC (SEQ ID NO :46)。硫醚桥在口8 的第 25 位和第 28位之间形成，且将对羧肽酶进行完全防御。第2位、第3位和第25位将被脱水，但导入序列和认为与同P53相互作用相关的序列均未受硫醚环导入的影响。同样地，肽活性不应改变。苏氨酸位于两个疏水氨基酸之间且因此预期完全被脱水酶MsB所脱水，根据特定指导。参见Rink等人，Biochemistry 2005。同样的指导还预测了通过环化酶NisC进行的涉及第25位和第28位的环化，尤其由于天冬氨酸位于半胱氨酸之前。在另一个实施方案中，截短的天青蛋白序列为LSTAADCQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD (SEQ ID NO :47)并且硫醚桥在第 3 位和第 7 位之间形成。第3位和第7位之间的环与乳链菌肽的环A相像，并利用了第2位上存在的苏氨酸。第6位上的天冬氨酸将利于环化。在另一个实施方案中，截短的天青蛋白序列为，LSTAACMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD (SEQ ID NO 48)，且利用了第 2 位的苏氨酸来形成硫醚桥。在另一个实施方案中，以上段落中所描述的截短的天青蛋白中的硫醚桥中的两个或多个在一个肽中组合。在另一个实施方案中，可生成许多截短的天青蛋白序列并通过分析在硫桥下具有 1个羊毛硫氨酸和2-3个其它氨基酸的环的肽而筛选苏氨酸环。这可能包括以下序列中的一个或多个组合LSTACDMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO49)
LSTAATMQCVVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO50)
LSTAATMQGCVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO51)
LSTAANTQGCVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO52)
LSTAANTQGVCTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO53)
LSTAADMTAVCTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO54)
LSTAADMTAWCDGMASGLDKDYLKPDD (SEQIDNO55)
LSTAADMQTWCDGMASGLDKDYLKPDD (SEQIDNO56)
LSTAADMQTVVTCGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO57)
LSTAADMQATVTCGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO58)
LSTAADMQATVTDCMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO59)
LSTAADMQGVTADCMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO60)
LSTAADMQGVTADGCASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO61)
LSTAADMQGWTNGCASGLDKDYLKPDD (SEQIDNO62)
实践方法可基因生成大量这样的序列并以修饰的程度和生产的水平为依据选择
用于纯化的组。 在另一个实施方案中，在p28 (SEQ ID NO 2)的第12位的苏氨酸和肽的c_末端之间形成了硫醚桥。第13位的Ca和第28位的天冬氨酸之间的距离可能为17. 52埃，大于1.5纳米，暗示了肽的结构的显著改变。图58C。在另一个实施方案中，肽序列为LSTAADMQGVVTATMGSGLCKDYLKPDD (SEQ ID NO 63)，硫醚桥从第 14 位至第 2 位距离 4. 38埃。第13位的天冬氨酸到丙氨酸的突变利于第14位的苏氨酸的脱水。第16位的丙氨酸突变为甘氨酸完全阻止了第17位的丝氨酸的脱水并增强了环化。在另一个实施方案中，肽序列为LSTAADMQGWTDLTASGLCKDYLKPDD (SEQ ID NO :64)，硫醚桥从第 15 位至第 20 位距离5. 83埃。在这种情况下，第14位的甘氨酸到亮氨酸的突变利于第15位的苏氨酸的脱水。三级结构稳定铜氧还蛋白来源的肽的三级结构的稳定性将影响药物代谢动力学的大多方面， 除其它外，包括药理活性、血浆半衰期和/或免疫原性。参见Kanovsky等人.，Cancer Chemother. Pharmacol. 52 :202-208(2003) ；Kanovsky 等人，PNAS 23 :12438-12443(2001)。 肽螺旋常常分离成无规卷曲，变得对蛋白酶攻击更敏感且可能不能很好地渗透细胞膜。 Schafmeister 等人，J. Am. Chem. Soc. 122 :5891-5892 (2000)。因此，一个稳定肽的整体结构的方式是稳定肽的α-螺旋结构。与螺旋形成相关的分子内氢键键合减少了极性酰氨基骨架的暴露，因此在转运肽中减少了膜渗透的障碍，且从而提高了相关的药理活性并提高了肽对蛋白酶裂解的抗性。同上。铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO :1)在残基53-56、 58-64和68-70上具有α -螺旋。一个稳定α -螺旋的方法是将α -螺旋中的螺旋断裂氨基酸残基，诸如甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和天冬氨酸，或螺旋中性氨基酸残基比如丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、 天冬酰胺、半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸或精氨酸，替代为螺旋形成残基，诸如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、色氨酸和甲硫氨酸或螺旋倾向氨基酸残基替代，例如α-氨基-异丁酸(Aib)。参见 Miranda 等人，J. Med. Chem.，51，2758-2765 (2008)，其公开内容在此通过引用并入。考虑了铜氧还蛋白来源的肽的α-螺旋可通过利用其它氨基酸来替代一个或多个甘氨酸残基、脯氨酸残基、丝氨酸残基和/或天冬氨酸残基来稳定。在具体的实施方案中，甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸和/或精氨酸残基被亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、 酪氨酸、色氨酸、Aib和/或甲硫氨酸残基所替代。参见Lee等人，Cancer Cell Intl. 11 21 0005)。在另外的具体的实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽的α-螺旋中的一个或多个丝氨酸残基或谷氨酰胺残基可以是取代的。在又一些更具体的实施方案中，铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的残基53-56、58-64和68-70中的丝氨酸和/或谷氨酰胺残基， 或其它铜氧还蛋白来源的肽的等价残基，可被替代。在另一个具体的实施方案中，铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO :1)氨基酸残基57处的谷氨酰胺残基，或另一个铜氧还蛋白来源的肽的等价残基可被替代，更具体地为被色氨酸所替代。在另一个具体的实施方案中，铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的氨基酸残基52处的苏氨酸残基，或另一铜氧还蛋白来源的肽的等价残基可被替代，更具体的为被色氨酸所替代。在另一具体的实施方案中，铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的氨基酸残基61处的苏氨酸残基，或另一铜氧还蛋白来源的肽的等价残基可被替代，更具体地为被色氨酸所替代。在另一个具体的实施方案中，铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)氨基酸残基63处的甘氨酸残基，或另一铜氧还蛋白来源的肽的等价残基可被替代，更具体地被色氨酸所替代。在另一个具体的实施方案中，铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)氨基酸残基52、57、61或63处的一个或多个苏氨酸、谷氨酰胺、或甘氨酸残基，或另一铜氧还蛋白来源的肽的等价残基可被替代，更具体地为被色氨酸所替代。在具体的实施方案中，铜氧还蛋白肽包含以下序列其中之一，其中下划线的氨基酸被置换到野生型铜绿假单胞菌M8序列中LSffAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:65)
LSTAADMWGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:66)
LSTAADMQGVVffDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:67)
LSTAADMQGVVTDWMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:68)
LSWAADMWGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:69)
LSffAADMQGVVffDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:70)
LSWAADMQGVVTDWMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:71)
LSTAADMWGVVWDGMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:72)
LSTAADMWGVVTDWMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:73)
LSTAADMQGVVWDWMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:74)
LSWAADMWGVVffDWMASGLDKDYLKPDD(SEQIDNO:75)在另一些实施方案中，其它铜氧还蛋白来源的肽中的等价氨基酸被色氨酸所替代。稳定α -螺旋三级结构的另一方法包括使用能够π -堆积的非天然氨基酸残基。 例如，在 Andrews 和 Tabor (Tetrahedron 55:11711-11743(1999))中，成对的 ε-(3，5_ 二硝基苯甲酰基)-赖氨酸残基被置换到不同间距的肽的α-螺旋区域中。整体结果显示了 i、(i+4)间距是最有效的稳定排列。提高水的百分比，至90%，提高了肽的螺旋含量。同样 i、(i+4)间距中的ε-酰基-赖氨酸残基对没有稳定作用，表明稳定的大部分由JI-Ji相互作用而产生。在一个实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽可被修饰而使赖氨酸残基被ε _(3， 5-二硝基苯甲酰基)-赖氨酸残基所替代。在一个特定的实施方案中，赖氨酸残基可以i、 (i+4)间距被ε-(3，5-二硝基苯甲酰基)-赖氨酸所替代。另一稳定α-螺旋三级结构的方法使用了 α-螺旋中侧链间的静电相互作用。当将His-Cys或His-His残基对以i，(i+4)排列替代入肽中时，在添加Cu、Si或Cd离子后， 肽从约50%螺旋变化到约90%螺旋。当将钌(Ru)盐添加到His-His肽中时，形成了惰性交换复合物，大环cis-[RU-(NH3)4L2]3+复合物，其中L2是两个组氨酸的侧链，其提高了螺旋稳定性。Ghadiri 和 Fernholz，J.Am. Chem. Soc. 112,9633-9635(1990)。在一些实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽可包含大环ci S- [Ru- (NH3) 4L2]3+复合物，其中L2是两个组氨酸的侧链。在一些实施方案中，一个或多个组氨酸-半胱氨酸或组氨酸-组氨酸残基对可以i， (i+4)排列替换入铜氧还蛋白来源的肽的α-螺旋中。在另外的实施方案中，一个或多个组氨酸-半胱氨酸或组氨酸-组氨酸残基对可以i，(i+4)排列替代入铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的残基53-56、58-64和68-70中，或其它铜氧还蛋白来源的肽的等价残基中。在一些实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽还可包含Cu、Zn、Cd和/或Ru离子。稳定α -螺旋三级结构的另一方法涉及α -螺旋的侧链间的二硫键形成。还可通过肽序列中分离的残基之间的形式共价键来稳定螺旋结构。常用的自然方法是使用二硫键。Pierret 等人.，htl. J. Pept. Prot. Res.，46 :471-479 (1995)。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基对被置换到铜氧还蛋白来源的肽的α-螺旋中。在另外的实施方案中，在铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的残基53-56、58-64和68-70处、或其它铜氧还蛋白来源的肽的等价残基被替代为一个或多个半胱氨酸残基对。稳定α-螺旋三级结构的另一方法涉及侧链内酰胺桥的使用。内酰胺是环状酰胺，其能够自氨基酸的环化而形成。侧链到侧链桥已成功用作多种肽和肽类似物中的限制约束，比如两亲性或模型α -螺旋肽、催产素拮抗剂、促黑素类似物、胰高血糖素和SDF-I肽类似物。例如，胰高血糖素样肽-I(GLP-I)在某些利于螺旋的条件下逐渐呈螺旋构象并可利用内酰胺桥来稳定。Miranda等人，J. Med. Chem. , 51, 2758-2765 (2008) 这些内酰胺桥可在大小、影响稳定性和结合亲和性上不同。同前。这种修饰提高了血浆中化合物的稳定性。同前。依据环化位点间的间距和残基的选择的不同，内酰胺桥可用来诱导和稳定转角或螺旋构象。在一些实施方案中，利用相近的氨基酸(比如i至i+4谷氨酸-赖氨酸限制) 之间的内酰胺桥制备了一个或多个铜氧还蛋白或变体类似物。在一些实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽可包含这种修饰以提高α-螺旋含量。稳定α-螺旋三级结构的另一方法是全碳交联方法。已证明全烃交联方法提高了螺旋结构的稳定性、蛋白酶抗性和细胞穿透性。Walensky等人，Science，305， 1466-1470(2004)。含携带烯烃的系链(tether)的α，α -双取代的非天然氨基酸被整合到肽中。钌催化的烯烃复分解生成了全烃“环钩”以交联螺旋。Schafmeister等人，J.Am. Chem. Soc, 122，5891-5892 (2000) ；Walensky等人，同前。含携带烯烃的系链的非天然氨基酸可根据 khafmeister 等人(同前)和 Williams 和 Ln (J.Am· Chem. Soc, 113 :9276-9286(1991)) 中所提供的方法来合成。在一些实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽通过全烃环钩来稳定。 在特定的实施方案中，对应于天然氨基酸的含携带烯烃的系链的一个或多个成对的α， α-双取代的非天然氨基酸被置换到铜氧还蛋白来源的肽的α-螺旋中。在另外的实施方案中，对应于天然氨基酸的含携带烯烃的系链的一个或多个成对的α，α-双取代的非天然氨基酸被置换到铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的残基53-56、58-64和68-70中、 或被置换到其它铜氧还蛋白来源的肽的等价残基中。在一些实施方案中，经修饰的铜氧还蛋白来源的肽可包含Χ#)(2ΑΑ0Χ3Χ4Χ5ννΧ60Χ7)(8 Asgldkdylkpdx9(seq id no :76)，其中 ^c1 是 l 或乙酰化的 l，& 是 τ 或 w，& 是 m、L 或 v，X4 是Q或W，&是G或Α，&是T或W，X7是G、T或W，&是M、L或V，和知是D或酰胺化的-D。 在另外的实施方案中，经修饰的铜氧还蛋白来源的肽可由XiSAAAKy^AVVXeDXA^SGLDKDY LKPDX9 (SEQ ID NO 76)组成，其中&是L或乙酰化的L，&是T或W，&是M、L或V，&是Q 或W，&是G或A，&是T或W，X7是G、T或W，&是M、L或V，且知是D或酰胺化的D。在另外的实施方案中，经修饰的铜氧还蛋白来源的肽可包含X1DPKLLGSAX2X3DX4W X5X6X7DAAX8SX9 (SEQ ID NO :77)，其中 & 是 D 或乙酰化的 D，& 是 M、L 或 V，& 是 G、T 或 W, X4 是T或W，&是G或A，&是Q或W，X7是M、L或V，&是T或W，和知是L或酰胺化的L。在另外的实施方案中，经修饰的铜氧还蛋白来源的肽可由^C1DPKLYDKDLGSAX2X3DX4VVX5X6X7DAAX 8SX9 (SEQ ID NO 77)组成，其中X1是D或乙酰化的D，&是M、L或V，&是G、T或W，&是T 或W，&是G或A，&是Q或W，X7是M、L或V，&是T或W，和X9是L或酰胺化的L。感兴趣的具体的肽列于表3中。
聚乙二醇化PEG与具有治疗和诊断价值的药物的共价连接已延长了体内药物的血浆半衰期，和/或降低了它们的免疫原性和抗原性。Harris和Chess，Nature Reviews Drug Discovery 2:214-22^2003)。例如，PEG连接已提高了许多治疗性蛋白的药物代谢动力学性质，除其它外，包括白介素(Kaufman 等人，J. Biol. Chem. 263 :15064(1988) ；Tsutsumi 等人，J. Controlled Release33 :447 (1995))、干扰素(Kita 等人，Drug Des. Delivery 6 157(1990))、过氧化氢酶(Abuchowski 等人，J. Biol. Chem. 252 :3582 (1977))、超氧化物歧化酶(Beauchamp 等人，Anal. Biochem. 131 :25(1983))和腺苷脱氨酶(Chen 等人，Biochem. Biophys. Acta 660 :293(1981))。FDA已批准在食物、美容剂和药物中将PEG用作载体或基质，所述药物包括可注射制剂、局部制剂、直肠制剂和鼻制剂。PEG显示了微弱的毒性，并且通过肾(对于PEG < 30kDa)或在粪便中(对于PEG > 20kDa)从体内完整地清除。PEG在水中是高度可溶的。治疗性肽的聚乙二醇化，可用于通过减少肾超滤作用来提高肽在患者的血流中的存在时间，并从而减少药物从体内的消除。电荷屏蔽可影响肾渗透。电荷屏蔽可能是蛋白可离子化官能团，即胺或羧基的药物化学修饰的结果。特别地，用于产生蛋白-PEG衍生物的最常见方法包括将蛋白氨基基团转化成具有随之的正电荷减少的酰胺，并且这可能改变蛋白超滤作用。因为已发现肾超滤作用清除阴离子巨分子比清除中性巨分子或阳性巨分子要慢，可以预期PEG与氨基基团的轭合延长了聚乙二醇化的肽在血流中的持久性。分子大小和球状超滤也可影响治疗肽的肾超滤作用。认为天然球状蛋白的肾清除的分子量界限约为70kDa，其接近血清白蛋白的分子量。这样，具有超过70kDa分子量的蛋白主要通过除肾超滤作用以外的途径从体内清除，所述途径比如肝脏摄取、蛋白水解消化和通过免疫系统的消除。因此，通过聚乙二醇化提高治疗性肽的大小可降低该肽从患者的血流中的肾超滤作用。此外，治疗性肽的聚乙二醇化可降低肽的免疫原性，并保护肽避免蛋白水解酶、吞噬细胞和需要与治疗性肽直接接触的其它因子。已特别发现对于接近蛋白水解酶、抗体、吞噬细胞等，伞状结构的分支PEG比线性PEG提供了更好的保护作用。Caliceti和Veronese， Adv. Drug. Deliv. Rev. 55 :1261-12778(2003)。在一些实施方案中，本发明的铜氧还蛋白来源的肽被修饰以使一个或多个PEG分子与半胱氨酸分子共价结合。共价结合不必是从PEG分子到铜氧还蛋白来源的肽的直接共价结合，而可以是共价结合至一个或多个接头分子，所述接头分子进而彼此共价结合和 /或与铜氧还蛋白来源的肽共价结合。在一些实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽具有位点特异性的聚乙二醇化。在特定的实施方案中，PEG分子可以与铜绿假单胞菌天青蛋白(SEQ ID NO 1)的半胱氨酸残基3、沈和/或112共价结合。在另外的实施方案中，可将一个或多个半胱氨酸残基置换入铜氧还蛋白来源的肽中并对其进行聚乙二醇化。在一些实施方案中，对铜氧还蛋白来源的肽进行聚乙二醇化的方法除其它以外可以是NHS、还原性氨基化、 malimid或环氧化物。在另外的实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽可于一个或多个赖氨酸、 半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸、或N-末端的氨基基团或C-末端的羧酸上进行聚乙二醇化。在更具体的实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽可于一个或多个赖氨酸或N-末端氨基基团上进行聚乙二醇化。在另外的实施方案中，可将一个或多个赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基置换入铜氧还蛋白来源的肽中并进行聚乙二醇化。在另外的实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽可于一个或多个氨基基团上进行聚乙二醇化。在另外的实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽可以随机的、非位点特异性的方式来进行聚乙二醇化。在一些实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽的基于PEG的聚合物可具有约200道尔顿至约100，000道尔顿、约2，000道尔顿至约20，000道尔顿、或约2，000道尔顿至约5，000道尔顿的平均分子量。在另外的实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽可由一种或多种分支的PEG分子组成，尤其是约50kDa的分支的PEG分子。在另外的实施方案中，铜氧还蛋白来源的肽可包含一个或多个线性PEG分子， 尤其是约5kDa的线性PEG分子。在另一个实施方案中，肽是铜氧还蛋白、或其变体、结构等价物或衍生物，其为特异性结合葡萄糖调节的蛋白78(GRP78)并被内化到癌细胞中的13-mer环状低聚肽P印42 的轭合物。根据 Yoneda 等人，“A cell-penetrating peptidic GRP78ligand for tumor cell-specific prodrug therapy，(用于肿瘤细胞特异性前药治疗的细胞渗透肽GRP78配体)，，Bioorganic Medicinal Chemistry Letters 18 :1632-1636(2008)中所公开的合成方法，可将铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、结构等价物或衍生物与Pep42轭合，其公开内容在此通过引用整体并入。在另一个实施方案中，肽是铜氧还蛋白的结构等价物。测定铜氧还蛋白和其它蛋白之间的显著结构同源性的研究的例子包括Toth等人.(Developmental Cell 1 82-92(2001))。具体地，铜氧还蛋白和结构等价物之间的显著结构同源性可通过利用 VAST 算法来测定。Gibrat 等人，Curr Opin Struct Biol 6:377-385(1996) ；Madej 等人， Proteins 23:356-3690(1995)。在特定的实施方案中，来自铜氧还蛋白与结构等价物的结构对比的VAST ρ值可能小于约10_3，小于约10_5，或小于约10_7。在另一些实施方案中，铜氧还蛋白和结构等价物之间的显著结构同源性可通过利用DALI算法来测定。Holm & Sander， J. Mol. Biol. 233 123-138 (1993)。在特定的实施方案中，成对结构对比的DALI Z评分为至少约3. 5，至少约7. 0，或至少约10. 0。考虑了本发明的组合物的肽，可以是超过一种的铜氧还蛋白的多个变体、衍生物、 截短体和/或结构等价物。例如，肽可以是已被聚乙二醇化而使其成为变体和衍生物的天青蛋白的截短体。在一个实施方案中，利用含烯烃的系链的α，α-双取代的非天然氨基酸，随后通过钌催化的烯烃复分解进行全烃“环钩”而合成本发明的肽。Scharmeister等人， J.Am. Chem. Soc. 122 :5891-5892(2000) ；Walensky 等人，Science 305 :1466-1470(2004)。 此外，作为天青蛋白的结构等价物的肽可与其它的肽相融合，从而使肽成为结构等价物和衍生物。这些实例仅为了示例而并不限制本发明。铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物可与铜结合或可不与铜结合。在一些实施方案中，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物具有铜绿假单胞菌天青蛋白且尤其是P28的一些药理学活性。在一个特定的实施方案中，铜氧还蛋白和铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物可抑制或阻止哺乳动物细胞、组织或动物，且具体为但不局限于乳腺细胞中的癌前病变的发展。本发明还提供了铜氧还蛋白和铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物，其可具有抑制哺乳动物癌前病变的发展的能力，所述哺乳动物癌前病变具体为但不局限于黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、肺癌、结肠直肠癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤和子宫颈癌细胞。对癌细胞的发展的抑制是癌前病变的发展的任何与对照治疗相比统计学显著的减少、或增加的速率的降低。因为现在已知铜氧还蛋白能够优先通过胞吞途径进入癌细胞，并且还能够抑制哺乳动物细胞、组织或动物、且具体为乳腺细胞、且更具体为小鼠乳腺细胞中癌前病变的发展并最终抑制癌症的发展，现在可能设计保留这种活性的铜氧还蛋白的变体和衍生物。这样的变体、衍生物和结构等价物可通过以下方法来生成，例如，构建铜氧还蛋白和铜氧还蛋白来源的肽的多种变体、衍生物和结构等价物的“文库”，且然后利用本领域中已知的多种方法其中之一，比如实施例1中示例的方法来检验每一个的优先进入和/或化学预防活性，且具体为在小鼠乳腺器官培养中的优先进入和/或化学预防活性。考虑了所得的具有化学预防活性和/或优先进入细胞的能力的铜氧还蛋白的变体、衍生物和结构等价物可用于本发明的方法中，代替或补充天青蛋白或P28。在一些特定的实施方案中，铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物可将小鼠乳腺器官培养物(MMOC)中7，12_ 二甲基苯并蒽(DMBA)诱导的癌前病变发展抑制到统计学上不同于未处理的对照的程度。通过利用实施例1中或Mehta等人(J Natl Cancer Inst 93 :1103-1106(2001))和 Mehta 等人.(Meth Cell Sci 19:19-24(1997))描述的 MMOC 模型系统，可检验肽的这种活性。其它用于确定癌症发展是否被抑制的方法也是本领域中熟知的，也可以使用。在一些特定的实施方案中，铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物在MMOC模型中抑制乳腺腺泡病变(MAL)的发展至统计学上不同于未处理的对照的程度。在一些特定的实施方案中，铜氧还蛋白的变体、衍生物或结构等价物在MMOC模型中抑制乳腺导管病变 (MDL)的发展至统计学上不同于未处理的对照的程度。通过利用如实施例1中所描述的 DMBA诱导形成癌前病变的MMOC模型系统，可以检测肽的这些活性。对MMOC模型系统中癌前病变的发展评价可通过如实施例1中提供的形态学分析或组织病理学分析确定。在一些特定的实施方案中，变体、衍生物或结构等价物能够在哺乳动物细胞、组织和动物中优先进入癌细胞和/或肿瘤中。在一些实施方案中，变体是P18的衍生物或结构等价物。在一些实施方案中，变体、衍生物或结构等价物能够在哺乳动物细胞、组织和动物中选择性地进入癌细胞和/或肿瘤和递送DNA或RNA。在一些实施方案中，DNA或RNA是基因或基因的部分。在一些实施方案中，DNA或RNA经递送后具有治疗作用。在一些实施方案中，变体是P28的衍生物或结构等价物。在一些实施方案中，变体、衍生物或结构等价物能够在哺乳动物细胞、组织和动物中选择性地进入癌细胞和/或肿瘤和递送DNA或RNA。在一些实施方案中，DNA或RNA是基因或基因的部分。在一些实施方案中，DNA或RNA经递送后具有治疗作用。铜氧还蛋白这些小的蓝铜蛋白(铜氧还蛋白)是电子传递蛋白(10-20kDa)，其参与细菌电子传递链或具有未知功能。铜离子单独被蛋白基质结合。两个组氨酸和一个半胱氨酸配体围绕铜的特殊的扭曲三角形平面排列产生金属位点很奇特的电子特性和深色的蓝颜色。很多铜氧还蛋白以结晶学上中到高的分辨率被表征。通常铜氧还蛋白具有低序列同源性但具有高的结构同源性。Gough &Clothia, Structure 12 :917-925(2004) ；De Rienzo 等人，Protein Science9 1439-1454 Q000)。例如，天青蛋白的氨基酸序列与橙绿屈挠素B的氨基酸序列为31%相同，与铁硫菌蓝蛋白的氨基酸序列为16. 3%相同，与质体蓝素的氨基酸序列为20. 3%相同，与假天青蛋白的氨基酸序列为17. 3%相同。参见表1。然而，这些蛋白质的结构相似性更显著。天青蛋白与橙绿屈挠素B的结构对比的VAST ρ值为10_7 4，天青蛋白与铁硫菌蓝蛋白的结构对比的VAST P值为10_5，天青蛋白与质体蓝素的结构对比的VAST ρ值为10_5 6，天青蛋白与假天青蛋白的结构对比的VAST ρ值为10_41。所有的铜氧还蛋白具有八-链回形拓扑结构(Greek key) β -桶或β -夹层折叠， 并具有高度保守的位点结构。De Rienzo等人，Protein Science9 :1439-1454(2000) 由于很多长链脂肪族残基诸如甲硫氨酸和亮氨酸的存在，显著的疏水区存在于天青蛋白、花青苷、蓝细菌质体蓝素、黄瓜碱性蛋白的铜位点周围，且小范围存在于假天青蛋白和真核质体蓝素。同前。疏水区也小范围发现于漆树花青苷和铁硫菌蓝蛋白铜位点，但是具有不同的特征。同前。表1.利用VAST算法将来自铜绿假单胞菌的天青蛋白(IJZG)与其它蛋白进行序列和结构比对。
PDB比对长度1%氨基酸同一性P-值2评分3RMSD4描述IAOZ A 28218.310e-712.21.9抗坏血酸氧化酶IQHQA1133110e-7.412.11.9橙绿屈挠素B1V54 B 17920.310e-6.011.22.1细胞色素C氧化酶1GY2A9216.310e-5.011.11.8铁较υ菌蓝蛋白3MSPA748.110e-6.710.92.5活动的主要精子蛋白5IIUZ7420.310e-5.610.32.3质体蓝素IKGYE905.610e-4.610.13.4肝配蛋白b2IPMY7517.310e-4.19.82.3假天青蛋白1比对长度叠加在两个结构之间的相同C-α原子对的数量，即多少残基用于计
算3D重叠。2P值VAST ρ值是所述对比的显著性的量度，表示为概率。例如，如果P值为 0. 001，则纯随机性地看见该性质相符的几率为1/1000。运用MMDB数据库中有500个独立和不相关的域的假定，调整VAST的ρ值是为了多重比较的效果。因而被500除后，所述ρ 值符合每个域对成对比较的P值。3评分VAST结构相似性评分。该数字与二级结构重叠元素的数字以及重叠的质量相关。较高的VAST评分与较高的相似性相关联。4RMSD 以埃为单位的均方根重叠残基。在两个结构最佳重叠之后这一数字被计算，作为等价C-α原子之间均方距离的方根。注意RMSD值随结构比对的范围而标定，当使用RMSD描述整个结构相似性时，必须考虑其大小。5线虫(C. elegans)主要精子蛋白被证明在卵母细胞成熟中是一种肝配蛋白拮抗物。Kuwabara, Genes and Development 17:155-161 (2003)。天青蛋白天青蛋白是具有1 个氨基酸残基的含铜蛋白，其属于铜氧还蛋白家族，在某些细菌中参与电子传递。天青蛋白包括来自铜绿假单胞菌(PA) (SEQ ID N0:1)、木糖氧化产碱菌(A. xylosoxidans)和反硝化产碱菌的那些。Murphy等人.，J. Mol. Biol. 315 859-871(2002)。天青蛋白之间的氨基酸序列同一性在60-90%之间变化，这些蛋白显示了高的结构同源性。所有天青蛋白具有特征性的具有回形拓扑结构模体的夹层，并且单个铜原子总是位于该蛋白的同一区域。此外，天青蛋白在铜位点周围具有基本中性的疏水区。同前。质体蓝素质体蓝素是蓝藻细菌、藻类和植物的可溶性蛋白，其在每个分子中含有一个分子的铜，并且它们的氧化型为蓝色。它们出现在叶绿体中，作为电子载体发挥作用。自从在 1978年测定了白杨质体蓝素的结构，藻类(栅藻(kenedesmus)、浒苔(^iteromorpha)、衣藻(Chlamydomonas))和植物(法国菜豆(French bean))质体蓝素的结构已通过晶体学或 NMR方法进行了测定，且已将白杨结构精确到1.33A的分辨率。SEQ ID NO :3显示了来自层理席藻，一种喜温蓝藻类细菌的质体蓝素的氨基酸序列。感兴趣的另一质体蓝素来自百日咳石莼菌。虽然藻类和维管植物之间的质体蓝素序列趋异(例如衣藻蛋白和白杨蛋白之间的序列同一性为62%)，但三维结构是保守的(例如在衣藻蛋白和白杨蛋白之间Ca位置的0.76A rms偏差)。结构特征包括位于八链反平行β _桶的一个末端的扭曲四面体型铜结合位点、显著的负电区和平坦的疏水表面。铜位点对于其电子传递功能是优化的，负电和疏水区被设想参与生理反应配偶体的识别。化学修饰、交联和定点诱变试验已证实负电和疏水区在与细胞色素f的结合相互作用中的重要性，并验证了质体蓝素中的两个功能重要的电子传递通路的模型。一条假定的电子传递通路是相对短的(约4A)，并包括疏水区中暴露于溶剂的铜配体His-87，而另一条更长(约12-15A)，包括负电区中近保守的残基 Tyr_83。 Redinbo 等)κ, J. Bioenerg. Biomembr. 26 :49-66 (1994)。铁硫菌蓝蛋白铁硫菌蓝蛋白是获自硫杆菌属(现在被称作酸硫杆状菌属)含铜蓝的单链多肽。 利用多波长不规则衍射对来自氧化亚铁硫杆菌的极其稳定和高氧化性的铜氧还蛋白铁硫菌蓝蛋白(SEQ ID NO 4)的氧化型进行X-射线晶体结构测定，分辨率精确到1.9A。铁硫菌蓝蛋白由核心夹层折叠构成，所述核心夹层折叠由六链和七链b-片层构成。与其它铜氧还蛋白类似，铜离子同分布于扭曲四面体的四个保守残基(His 85、Cysl38、Hisl43、 Metl48)组成的簇相配位。Walter, R. L.等人，J. Mol. Biol. 263 :730-51 (1996)。假天青蛋白假天青蛋白是含蓝铜的单链多肽家族。SEQ ID NO :5显示了获自裂环无色杆菌的假天青蛋白的氨基酸序列。假天青蛋白的X-射线结构分析显示了其与天青蛋白具有相似的结构，尽管这些蛋白之间具有低序列同源性。假天青蛋白和天青蛋白的整体结构之间存在两个主要区别。相对于天青蛋白，假天青蛋白具有由两个α-螺旋组成的羧基末端延伸。在中部肽区域，天青蛋白包含伸长的环，而在假天青蛋白中具有缩短的环，其形成含有短α-螺旋的瓣(flap)。在铜原子位点上唯一的主要不同是，MET侧链构象和Met-S铜键长度，其在假天青蛋白中明显短于在天青蛋白中。植物花青苷(Phytocyanin)可鉴定为植物花青苷的蛋白质包括但不局限于黄瓜碱性蛋白、漆树花青苷、 mavicyanin、香辣根花青素、黄瓜剥皮铜氧还蛋白、推定的豌豆荚中的蓝铜蛋白，以及一种来自拟南芥(Arabidopsis thaiiana)的蓝铜蛋白。除黄瓜碱性蛋白和豌豆荚蛋白的所有其它蛋白中，通常位于轴向蓝铜位点的甲硫氨酸配体被谷氨酰胺所替换。橙绿屈挠素从嗜热绿色滑动光合细菌橙色绿屈挠菌分离得到三种小型蓝铜蛋白，命名为橙绿屈挠素A、橙绿屈挠素B-I和橙绿屈挠素B-2。两种B型是糖蛋白，并且性质几乎彼此相同，但与A型不同。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示其表观单体分子量分别为 14 (A)、18 (B-2)和 22(B-I)kDa。橙绿屈挠素A的氨基酸序列已被测定并显示橙绿屈挠素A为一个具有139个残基的多肽。Van Dreissche 等人，Protein Science 8:947-957(1999)。如果在已知的小铜蛋白质体蓝素和天青蛋白中均为进化上保守的金属配体的话，那么His58、Cysl23、HisUS和 Metl32以预期方式被分隔。二级结构预测也指出橙绿屈挠素具有与铜绿假单胞菌天青蛋白和白杨叶质体蓝素相似的普通桶状结构。但是，橙绿屈挠素看起来具有小铜蛋白序列类的序列特征。天青蛋白的共有序列的总体相似性大体上与质体蓝素的共有序列的总体相似性相同，即总体相似性为30. 5%。橙绿屈挠素N端序列区域1-18显著地富含甘氨酸和羟基氨基酸。同前，参见来自橙色绿屈挠菌的橙绿屈挠素的A链的示例性氨基酸序列SEQ ID NO 15 (NCBI蛋白质数据库登录号ΑΑΜ12874)。橙绿屈挠素B分子具有标准的铜氧还蛋白折叠。已研究了来自橙色绿屈挠菌的橙绿屈挠素B的晶体结构。Bond等人，J. Mol. Biol. 306 :47-67(2001).除了一个额外的N-端链以外，其分子与细菌铜氧还蛋白天青蛋白非常相似。如同在其它铜氧还蛋白中一样，其中一个铜配基位于多肽的链4上，其它三个沿着链7和链8之间的大环。参照后面三个配基之间的氨基酸间隔讨论了铜位点的几何学。橙绿屈挠素B的晶体学特征的铜结合域可能被N端尾部限于细胞膜的外周胞质侧，该N端尾部显示出与其它几个膜相关电子传递蛋白中已知的链显著的序列同一性。B型的氨基酸序列呈现于McManus等人J. Biol. Chem. 267 6531-6540(1992)中。参见来自橙色绿屈挠菌的橙绿屈挠素链B的示例性氨基酸序列SEQ ID NO 16 (NCBI蛋白质数据库登录号1QHQA)。漆树花青苷漆树花青苷是植物花青苷的一个亚类，是植物铜氧还蛋白的遍在家族。本文包括了作为漆树花青苷的示例性序列SEQ ID N0:14。来自山葵根的一种漆树花青苷——香辣根花青素的晶体结构(Koch等人，J.Am. Chem. Soc. 127 :158-166(2005))和黄瓜漆树花青苷的晶体结构(Hart等人.，ftOtein Science 5:2175-2183(1996))也是已知的。该蛋白具有与其它植物花青苷相似的总折叠。肝配蛋白B2蛋白胞外域三级结构具有与漆树花青苷显著的相似性。Toth等人，Developmental Cell 1:83-92(2001)。漆树花青苷的示例性氨基酸序列可在国立生物技术信息中心蛋白数据库登录号1JER，SEQ ID NO :14中找到。黄瓜碱性蛋白
本文包括了来自黄瓜碱性蛋白的示例性氨基酸序列SEQ ID NO :17。已将黄瓜碱性蛋白(CBP)，I型蓝铜蛋白的晶体结构分辨率精确到1.8A。该分子类似其它蓝铜蛋白，具有回形拓扑β桶状结构，但桶状结构在一侧开口，最好描述为“β-三明治”或“β-玉米面豆卷”。Guss等人，J. MoL Biol. 262 :686-705(1996)。肝配蛋白B2蛋白胞外域三级结构与黄瓜碱性蛋白具有高度相似性(50个α碳rms偏差1.5Α)。Toth等人，Developmental Celll :83-92(2001)。铜原子具有通常的蓝铜NNSS ‘配位，其键长为Cu-N(His39) = 1.93 A,
Cu-S(Cys79) = 2.16 A,Cu-N(His84) = 1.95 A,Cu-S(Met89) = 2.61 Α。二硫化物连
接，(Cys52)-S-S-(Cys85)，在稳定分子结构中具有重要作用。在蓝铜蛋白的亚家族(植物花青苷)，以及一种非金属蛋白豚草过敏原Ra3中，多肽折叠是典型的，且CBP与其具有高度序列同一性。目前可鉴定为植物花青苷的蛋白是CBP、漆树花青苷、mavicyanin、香辣根花青素、黄瓜剥皮铜氧还蛋白、推定的豌豆荚中的蓝铜蛋白、以及来自拟南芥的蓝铜蛋白。在除CBP和豌豆荚蛋白以外的其它所有蛋白中，通常位于轴向蓝铜位点的甲硫氨酸配体被谷氨酰胺所替代。黄瓜碱性蛋白的示例性序列可在NCBI蛋白数据库登录号2CBP，SEQ ID NO 17中找到。使用方法本发明提供了在其他的健康患者中阻止恶性肿瘤的方法，所述方法包括向患者施用为如以上所描述的铜氧还蛋白，或其变体、衍生物或结构等价物的至少一种肽。化学预防治疗基于阻断癌发生相关进程可预防癌症的发展的假说。现已知铜氧还蛋白铜绿假单胞菌天青蛋白和截短的天青蛋白肽M8通过抑制癌前病变的初始形成，或杀死或抑制所呈现的癌前病变的生长抑制了癌前病变的发展。因此考虑了可将如以上所描述的具有抑制癌前病变的发展的能力的铜氧还蛋白， 或其变体、截短体、衍生物或结构等价物在其它健康的患者中用于化学预防治疗。在一些实施方案中，所述其它健康的患者指比一般人群具有发生癌症的较高风险的患者。可通过利用本发明的组合物治疗来预防的癌症包括但不局限于，黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、肺癌、结肠癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌和宫颈癌。在一些实施方案中，患者可以是人。在另一些实施方案中，患者非人。本发明还包括优先进入癌细胞的组合物和方法。现已知铜氧还蛋白，尤其是天青蛋白衍生物P18和p^通过本文所描述的某些机制进入癌细胞，所述机制包括胞膜窖介导的胞吞作用，且可由高尔基体来介导。因此考虑了可使用铜氧还蛋白或其变体、衍生物、或结构等价物进入癌细胞并杀死癌细胞，并还可使用其穿越细胞膜转导物质。本发明还包括研究癌症的发展的方法，所述方法包括将哺乳动物细胞在致癌物诱导前或诱导后与包含铜氧还蛋白或其变体、衍生物、截短体或结构等价物的组合物相接触， 并观察细胞发展。在一些实施方案中，细胞是小鼠乳腺细胞，而在另一些实施方案中，细胞是可能在哺乳动物中变为恶性细胞的其它细胞。比一般群体处于发生癌症的较高风险的患者可以是具有高风险特征的患者、具有癌前病变的患者和其初始癌症已被治愈或其癌前病变已被明确治疗的患者。一般参见Tsao 等人，CA Cancer J Clin 54:150-18(^2004)。高风险特征可以是患者的行为因素、遗传因素、环境因素或生理因素。使患者易患多种类型的癌症的行为因素包括，但不局限于，吸烟、不良饮食、饮酒、激素替换治疗、较高的体重指数、未经产、槟榔使用、频繁漱口剂的使用、暴露于人乳头瘤病毒、儿童和慢性日光照射、首次性交的早期年龄、多个性伴侣和口服避孕药的使用。使患者易患多种类型的癌症的遗传因素包括，但不局限于癌症的家族史、BRCAl 和BRCA2的基因携带者身份、乳腺瘤的病史、家族性腺瘤性息肉病(FAP)、遗传性非息肉性结肠直肠癌(HNPCC)、红色或金黄色毛发和浅肤色表型、着色性干皮病和种族。使患者易患多种类型的癌症的环境特征包括，但不局限于，暴露于氡、多环芳香烃类、镍、铬酸盐、砷、石棉、氯甲基醚、苯并[a]芘、辐射和来自橡胶或涂料的职业性暴露的芳香胺类。使患者易患多种类型的癌症的其它混杂因素包括，但不局限于，具有气流阻塞的慢性阻塞性肺疾病、慢性膀胱感染、血吸虫病、老龄和免疫受损状况。此外，处于发生癌症的较高风险的患者可通过使用多种已建立的用于某些类型的癌症的风险模型来测定。例如，易患乳腺癌的患者可利用，除其它以外，feil风险模型或 Claus 模型来测定。参见 Gail 等人，J Natl Cancer Inst 81 :1879-1886(1989) ；Cuzick, Breast 12 :405-411(2003) ；Huang 等人，Am J Epidemiol 151:703-714 0000)。具有癌前病变的患者比一般群体处于发生癌症的较高风险。患者中的癌前病变的存在可通过本领域技术人员熟知的多种方法来测定。可在患者中测量源自癌前病变的中间标记物或生物标记物，以测定患者是否具有癌前病变。染色体畸变发生于绝大多数癌症患者中的肿瘤细胞中和邻近的组织学正常的组织中。染色体畸变的进程与癌前病变到浸润性癌症的表型进程平行。Thiberville等人，Cancer Res. 55 :5133-5139 (1995)。因此可将与癌症相关的染色体畸变用作检测患者中癌前病变的中间标记物。与癌症相关的常见染色体畸变包括，但不局限于，肿瘤抑制子基因的等位缺失或杂合丢失(LOH)，所述肿瘤抑制子基因诸如3p (FHIT和其它)、9p (pl6INK4、pi. 5INK4B和pl9層的9p21)、17p (p53基因和其它基因的17pl3)和13q(视网膜母细胞瘤基因Rb和其它基因的13ql4)。3p和9p中的缺失与吸烟和肺癌的早期阶段相关。Mao等人，J. Natl. Cancer Inst. 89 :857-862 (1997)。影响3p、 5q、8p、17p和18q的缺失在上皮癌中是常见的改变。一般参见Tsao等人.，CA Clin. Cancer J. Clin. 54:153 0004)。与癌症相关的其它染色体突变包括激活癌基因的那些。其存在可用作中间标记物的癌基因包括，但不局限于，Ras、c-myc、表皮生长因子、erb_B2和细胞周期蛋白E、Dl和Bi。一般参见同前巧4处。其它中间标记物可以是癌前细胞和癌症细胞中上调的基因的产物。在癌前细胞中可能上调的基因包括，但不局限于环氧合酶C0X-1和C0X-2、端粒酶。癌症细胞和一些癌前细胞的其它生物标记物包括，但不局限于，P53、表皮生长因子受体(GFR)、增殖细胞核抗原 (PCNA)、RAS、C0X-2、Ki-67、DNA 异倍体、DNA 聚合酶-α、ER、Her2neu、E_ 钙粘着蛋白、RAR β、 hTERT、pl6INK4a、FHIT (3pl4)、Bcl_2、VEGF-R、HPV 感染、L0H9p21、LOH 17p、p_AKT、hnRNPA2/ Bi、RAF、Myc, c_KIT、细胞周期蛋白 Dl、E 和 Bi、IGFU bcl_2、pl6、LOH 3p21. 3、L0H3p25、 L0H9p 2 ULOH 17p 13、LOH 13 q、L0H8p、hMSH2、APC、DCC、DPC4、JV18、BAX、PSA、GSTP1、NF-kB、 API、D3S2、HPV 感染、LOH 3pl4、L0H4q、LOH 5p、膀胱肿瘤抗原(BTA)、BTK TRAK(Alidex, Inc. ,Redmond WA)、尿道基质蛋白22、纤维蛋白降解产物、自分泌运动因子受体、BCLA-4、细胞角蛋白20、透明质酸、CYFRA 21-l、BCA、i3-人绒毛膜促性腺激素和组织多肽抗原(TPA)。 一般参见同前155-157处。其初始癌症已被治愈或其癌前病变已被明确治疗的患者也比一般群体处于发生癌症的较高风险。第二原发性肿瘤指具有癌症史的患者中的新型原发性癌。第二原发性肿瘤是头颈癌中死亡的首要原因。同前150处。第二原发性肿瘤与转移的不同之处在于前者新生而后者源自已有的肿瘤。乳腺癌、头颈癌、肺癌和皮肤癌的癌症或癌前病变已被治愈的患者处于发生第二原发性肿瘤的极高风险中。可将包含铜氧还蛋白或其变体、衍生物、截短体或结构等价物的组合物通过本领域技术人员熟知的多种途径和在多种方案中施用给患者。在特定的实施方案中，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物被静脉施用、肌内施用、皮下施用、局部施用、口腔施用或通过吸入来施用。可通过将肽递送到处于发生癌症风险的患者中的部位的任何方式来向患者施用组合物。在特定的实施方案中，铜氧还蛋白或其变体、衍生物、截短体或结构等价物是静脉施用的。在一个实施方案中，方法可包括向患者共施用一个单位剂量的包含铜氧还蛋白或铜氧还蛋白的变体、衍生物、截短体或结构等价物的组合物和一个单位剂量的包含另一化学预防药物的组合物，以任何顺序在大约同时施用，或在施用其它之后的大约给定时间内来施用，例如，施用其它药物后的大约1分钟至大约60分钟，或施用其它药物后的大约1小时至大约12小时。感兴趣的化学预防药物包括，但不局限于，他莫昔芬、芳香酶抑制物诸如来曲唑和阿纳托唑(Arimidex ),类视黄醇类诸如N-[4-羟苯基]维胺酯0-HPR，芬维 A胺)、非甾体抗炎剂(NSAID)诸如阿司匹林(aspirin)和舒林酸(sulindac)、塞来考昔 (celecoxib) (C0X-2抑制物)、二氟甲基鸟氨酸(DFMO)、熊去氧胆酸、3_羟基_3_甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制物、EKI-785 (EGFR抑制物)、贝伐单抗(bevacizumab) (VEGF受体的抗体)、西妥昔单抗(cetuximab) (EGFR的抗体)、视黄醇诸如维生素Α、β -胡萝卜素、13-顺式视黄酸、异维甲酸和棕榈酸视黄酯、α -生育酚、干扰素、溶瘤腺病毒dll520(0NYX-015)、 吉非替尼(gefitinib)、依曲替酯(etretinate)、非那司提(finasteride)、吲哚_3_甲醇、 白藜芦醇(resveratrol)、氯原酸、雷洛昔芬和奥替普拉(oltipraz)。用于协助化合物进入癌细胞和肿瘤的组合物本发明涉及用于递送货物化合物进入细胞的方法和材料。根据本发明的货物化合物的递送通过使用适宜的转运多肽来完成。在本发明的一个实施方案中，所述货物化合物与转运多肽连接。适宜的转运肽包括铜氧还蛋白，或含有“铜氧还蛋白进入结构域”的铜氧还蛋白的片段。术语“铜氧还蛋白进入结构域”指包含铜氧还蛋白进入哺乳动物癌细胞所需要的氨基酸序列的铜氧还蛋白的片段。通过本发明递送的货物化合物包括但不限于蛋白质、脂蛋白、多肽、肽、多糖、核酸，包括RNA、DNA和反义核酸、染料、荧光和放射性标签、微粒或纳米微粒、毒素、无机分子和有机分子、小分子和药物(例如，化学预防药物)。在一些实施方案中，所述药物和毒素杀死肿瘤细胞。在本发明的一个实施方案中，铜氧还蛋白是天青蛋白，比如来自铜绿假单胞菌的天青蛋白(SEQ ID NO :1)。在本发明的另一些实施方案中，铜氧还蛋白尤其是质体蓝素、铁硫菌蓝蛋白或假天青蛋白。在特定的实施方案中，天青蛋白尤其来自铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、副溶血性弧菌或支气管炎博德特菌。在一个实施方案中，递送货物化合物以杀死细胞或延迟细胞周期进程，所述细胞比如癌细胞。这样的癌细胞可以是，例如尤其是骨肉瘤细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、淋巴瘤细胞、白血病细胞、软组织肉瘤细胞或乳腺癌细胞、肝癌细胞、膀胱癌细胞或前列腺癌细胞。例如，所述货物化合物可以尤其是细胞周期调控蛋白，例如P53 ；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物，比如pl6、p21或p27 ；自杀蛋白，诸如胸苷激酶或硝基还原酶；细胞因子或其它免疫调节蛋白，诸如白细胞介素1、白细胞介素2或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)； 或毒素，诸如铜绿假单胞菌外毒素A。在其它实施方案中，递送了上述化合物种类之一的生物活性片段。在另一个实施方案中，递送货物化合物以生成靶组织的图像。例如，所述靶组织可以是癌症，且货物化合物可以是常用于生成用于X-射线计算机断层摄影(CT)、磁共振成像(MRI)和超声的检测的图像的化合物。在这些实施方案中，所述货物化合物是伽马射线或正电子发射放射同位素、磁共振成像造影剂、X射线造影剂或超声造影剂。本发明还包括将DNA或RNA选择性地导入到哺乳动物癌细胞的方法。在这样的实施方案中，所述DNA或RNA是货物化合物。在一些实施方案中，该方法包括提供与DNA或 RNA偶联的pl8或p28，并将所述化合物导入哺乳动物体内。在一些实施方案中，所述DNA 或RNA是基因或基因片段。在一些实施方案中，所述DNA或RNA经导入到哺乳动物细胞后具有治疗性作用。铜氧还蛋白进入结构域本发明提供了一种蛋白质转导结构域，其允许肽优先进入到癌细胞中，以及将相连接的货物转运到哺乳动物癌细胞中而不是非癌细胞中。已发现铜氧还蛋白包含蛋白质转导结构域，铜氧还蛋白进入结构域，其可促进相连接的货物进入哺乳动物癌细胞。在一些实施方案中，可使用完整的铜氧还蛋白来协助转运相连的货物选择性地进入癌细胞。在另一些实施方案中，可使用铜氧还蛋白的部分转运相连的货物进入癌细胞。在一些实施方案中，所述铜氧还蛋白进入结构域由铜氧还蛋白的区域组成，该区域长度小于全长的野生型蛋白。在一些实施方案中，所述铜氧还蛋白进入结构域由铜氧还蛋白的超过约10个残基、 约15个残基或者约20个残基组成。在一些实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域由铜氧还蛋白的不超过约50个残基、约40个残基或者约30个残基组成。在一些实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域与铜氧还蛋白具有至少约90%的氨基酸序列同一性、至少约95%的氨基酸序列同一性或者至少约99%的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，所述铜氧还蛋白进入结构域是天青蛋白进入结构域。在本发明的一个实施方案中，天青蛋白进入结构域至少含有铜绿假单胞菌天青蛋白的第50-77位氨基酸，P^(SEQ ID NO :2)。在本发明另一些实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域至少含有铜绿假单胞菌天青蛋白的第36-77位氨基酸(SEQ ID NO :27)。在本发明的另一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域至少含有铜绿假单胞菌天青蛋白的第36-89位氨基酸(SEQ ID NO 28)。在本发明另一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域至少含有铜绿假单胞菌天青蛋白的第36-1 位氨基酸(SEQ ID NO :29)。在本发明的又一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域至少含有铜绿假单胞菌天青蛋白的第50-67位氨基酸(SEQ ID N0:25)。在本发明另一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域至少含有铜绿假单胞菌天青蛋白的第53-70位氨基酸(SEQ ID N0:30)。在本发明又一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域至少含有铜绿假单胞菌天青蛋白的第53-64位氨基酸(SEQID NO 31)。本文所描述的实施例，特别是实施例19，表明在pl8上不存在的p^的C-末端区域(第50-67位氨基酸)极可能与细胞膜上的特定的残基接触并提供通向细胞的通道。就此，在本发明的另一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域是至少含有P^的第66-77位氨基酸(SEQ ID NO. 35)的天青蛋白进入结构域。在本发明的另一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域是至少含有P28的第68-77位氨基酸(SEQ ID NO. 36)的天青蛋白进入结构域。 在本发明的另一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域是至少含有P28的第67-77位氨基酸(SEQ ID NO. 37)的天青蛋白进入结构域。在本发明的另一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域包含位于SEQ IDN0. 2的第69、70、75、76和85位的氨基酸中的一个或多个。在另一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域包含位于SEQ ID NO. 2的第69、70、75、76和85位的氨基酸。 在本发明另一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域是来自除铜绿假单胞菌天青蛋白之外的铜氧还蛋白的进入结构域。在不同的实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域可以是来自蓝细菌层理席藻的质体蓝素(SEQ ID NO :3)、来自氧化亚铁硫杆菌的铁硫菌蓝蛋白 (SEQ ID NO 4)；来自裂环无色杆菌的假天青蛋白(SEQ ID NO :5)、来自丁香假单胞菌的天青蛋白(SEQ ID NO :21)、来自脑膜炎奈瑟氏球菌的天青蛋白(SEQ ID N0:10)、来自副溶血弧菌的天青蛋白(SEQ ID NO 8)或来自橙色绿屈挠菌的橙绿屈挠素(SEQ ID N0:15和16) 的片段。在本发明另一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域至少含有橙色绿屈挠菌橙绿屈挠素B的第57-89位氨基酸(SEQ ID NO :20)。在本发明另一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域至少含有丁香假单胞菌天青蛋白的第51-77位氨基酸(SEQ ID N0:21)。在本发明另一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域至少含有脑膜炎奈瑟氏球菌Laz的第89-115 位氨基酸(SEQ ID N0:22)。在本发明另一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域至少含有副溶血弧菌天青蛋白的第52-78位氨基酸(SEQ ID NO :23)。在本发明另一个实施方案中， 铜氧还蛋白进入结构域至少含有支气管炎博德特菌天青蛋白的第51-77位氨基酸(SEQ ID NO 24)。铜氧还蛋白进入结构域的修饰在本发明的另一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域被化学修饰或遗传改变以产生保留了优先进入细胞和/或将货物化合物转运入细胞的能力的变体。例如，实施例14显示了在第M、61和70位导入脯氨酸残基的铜绿假单胞菌天青蛋白保留了其进入 UISO-Mel-2细胞的能力。在另一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域包含保守的氨基酸序列 DGXXXXXDXXYXKXXD (SEQ ID NO 32)或 DGXXX)(DXX^(KX)(D (SEQ ID NO :33)，其中 D 是天冬氨酸、G是甘氨酸、Y是酪氨酸、K是赖氨酸和X是任意氨基酸。参见实施例17。铜氧还蛋白进入结构域的变体可通过标准技术合成。衍生物是直接形成自天然化合物或经修饰或部分取代形成的氨基酸序列。类似物是与天然化合物结构相似但不相同、 在某些组分或侧链有所不同的氨基酸序列。类似物可以是合成的，也可以来自不同的进化起源。如果衍生物或类似物含有修饰的氨基酸，则变体可以是全长的或不是全长的。铜氧还蛋白进入结构域的变体包括但不局限于包含某些区域的分子，所述区域与铜氧还蛋白进入结构域基本上同源，在相同大小的氨基酸序列上或当与比对的序列进行比较(其中通过同源性算法进行比对)时，具有至少约65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性。
在另一个实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域的变体与铜绿假单胞菌的天青蛋白第50-77位残基，p28(SEQ ID NO 2)具有显著的结构相似性。在另一些实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域的变体与铜绿假单胞菌的天青蛋白残第50-67位残基，pl8 (SEQ ID NO 25)具有显著的结构相似性。测定铜氧还蛋白和其它蛋白之间显著的结构同源性的研究的例子包括iToth等人(Developmental cell 1 :82-92 (2001))。具体的，铜氧还蛋白进入结构域的变体与铜绿假单胞菌的天青蛋白第50-77位残基(SEQ ID NO : 之间显著的结构同源性是通过使用 VAST 算法测定的(Gibrat 等人，Curr Opin Struct Biol 6:377-385(1996)； Madej等人，Proteins 23:356-3690(1995))。在特定的实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域变体与铜绿假单胞菌天青蛋白第50-77位残基(SEQ ID NO 2)结构对比的VAST ρ值小于约10_3，小于约10_5或者小于约10_7。在另一些实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域的变体与铜绿假单胞菌天青蛋白第50-77位残基(SEQ ID NO⑵之间显著的结构同源性可通过使用 DALI 算法(Holm & Sande, J Mol. Biol. 233 :123-138(1993))来测定。在具体的实施方案中，配对结构对比的DALIZ评分为至少约3. 5、至少约7. 0或者至少约10. 0。可使用本领域中已知的方法对铜氧还蛋白进入结构域进行修饰，比如寡聚核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描、PCR诱变和本文所公开的方法和技术。可对克隆的DNA进行定点诱变(Carter, Biochem J. 237 :1-7(1986) ；ZolIer 禾Π Smith，Methods Enzymo 1. 154 329-50(1987))、盒式诱变(cassette mutagenesis)、限制性选择诱变(Wells 等人，Gene 34:315-23(1985))或其它已知的技术以产生铜氧还蛋白进入结构域变体核酸。此外，编码与铜氧还蛋白进入结构域具有结构相似性的进入结构域的核苷酸可通过本领域中熟知的方法来合成。并且，野生型或变体铜氧还蛋白进入结构域的蛋白分子可通过本领域中所熟知的方法来合成。编码铜氧还蛋白进入结构域和与货物化合物连接的铜氧还蛋白进入结构域的复合物的核酸在另一方面，本发明提供了编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含与货物化合物连接的铜氧还蛋白进入结构域，其中所述货物化合物是蛋白质或肽。根据本发明的核酸分子可通过本领域中已知技术的组合来制备。例如，可通过化学合成或克隆分别制备铜氧还蛋白进入结构域和货物化合物的核酸序列。然后用连接酶将核酸序列顺序相连而得到感兴趣的核酸分子。使用铜氧还蛋白进入结构域递送货物化合物的方法已知许多富精氨酸肽通过哺乳动物细胞膜而转位并携带蛋白质货物化合物进入此类细胞。Suzuki. T.，等人· J.Biol· Chem. 277 :2437-43 0002)。例如，HIV Tat 蛋白的富精氨酸的11个氨基酸短片段(第47-57位氨基酸)允许货物蛋白质转运进入哺乳动物细胞。Schwarze, SR.，等人.Trends Cell Biol. 10 :290-95 (2000)。已显示增加 α -螺旋含量并优化精氨酸残基位置的合成的进入结构域增强了其作为蛋白质转导结构域的潜力。Ho， Α.，等人Cancer Res. 61 :474-77 (2001)。相比之下，铜氧还蛋白天青蛋白只有一个精氨酸残基。在一些实施方案中，本发明包括协助货物化合物进入细胞的那些铜氧还蛋白片段的使用，比如pl8(SEQ ID NO. 25)和p28 (SEQ ID NO. 2)。这样的片段可通过鉴定进入细胞所需的那些片段的任何方法来测定。在一个这样的方法中，将铜氧还蛋白片段与标记物质连接并进行检验以测定铜氧还蛋白片段是否进入细胞。可使用这样的方法来鉴定以上所讨论的铜氧还蛋白的适宜片段。在本发明的不同实施方案中，所述货物化合物连接于铜氧还蛋白或其片段，比如来自铜绿假单胞菌的天青蛋白(SEQ ID NO 1)；来自蓝细菌层理席藻的质体蓝素(SEQ ID NO 3)；来自氧化亚铁硫杆菌的铁硫菌蓝蛋白(SEQ ID NO 4)；或来自裂环无色杆菌的假天青蛋白(SEQ ID NO :5)、来自丁香假单胞菌的天青蛋白的片段(SEQ ID N0:21)、来自脑膜炎奈瑟氏球菌的天青蛋白(SEQ ID NO :10)、来自副溶血弧菌的天青蛋白(SEQ IDN0:19)、来自支气管炎博德特菌的天青蛋白(SEQ ID N0:8)、来自橙色绿屈挠菌的橙绿屈挠素A和B(SEQ ID NO :15和16)，以及其它天青蛋白和天青蛋白样蛋白。在另一些实施方案中，所述货物与铜氧还蛋白进入结构域诸如 p28 (SEQ ID NO 2), ρ 18 (SEQ ID NO :25)，或 SEQ IDNO :35-37 中任何一个连接。在本发明的不同实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域可在体外、离体或体内将货物化合物递送到细胞中。例如，可通过将铜氧还蛋白进入结构域和货物化合物的复合物加入到细胞培养诸如巴氏涂片(pap smear)中来实现体外递送。可选地，可通过将复合物加入取自患者的样品如血液、组织或骨髓中并将处理后的样品返回至患者来实现离体递送。还可通过将所述复合物直接施用给患者来实现递送。本发明的方法可用于治疗、预防、诊断或研究目的。通过本发明所递送的货物化合物包括但不限于蛋白质、脂蛋白、多肽、肽、多糖、 核酸，包括反义核酸，染料、微粒和纳米颗粒、毒素、有机分子和无机分子、小分子及药物。在一个实施方案中，可检测的物质，例如，荧光物质，比如绿色荧光蛋白；发光物质；酶，比如β -半乳糖苷酶；或将放射标记的蛋白或生物素化的蛋白递送至细胞而赋予细胞可检测的表型。相似地，可将标记有可检测的物质诸如荧光物质的微粒或纳米颗粒进行递送。适宜的纳米颗粒的一个例子可见于2002年5月7日授权的美国专利第6，383，500 号，其在此通过引用并入。许多这样的可检测物质为本领域技术人员所已知。在一些实施方案中，所述货物化合物是适宜于X-射线计算机断层摄影术(CT)、磁共振成像、超声成像或放射性核素闪烁成像术的可检测物质。在这些实施方案中，向患者施用货物化合物以用于诊断目的。造影剂可作为货物化合物来施用以加强通过X-射线CT、 MRI和超声获得的图像。通过铜氧还蛋白进入结构域来施用靶向肿瘤组织的放射性核素货物化合物可用于放射性核素闪烁成像术。在一些实施方案中，铜氧还蛋白进入结构域可含有具有货物化合物或不具有货物化合物的放射性核素。在另一些实施方案中，所述货物化合物是发出伽马射线或正电子的放射性同位素、磁共振成像造影剂、χ-射线造影剂或超声造影剂。适宜于货物化合物的超声造影剂包括，但不局限于，生物相容性气体微气泡、液体载体以及表面活性剂微球，在靶向部分与微气泡之间可进一步包含任选的连接部分k。在该上下文中，术语液体载体意为水溶液，且术语表面活性剂意为可降低溶液界面张力的任何两亲性物质。ΕΡ0727225Α2中公开了用于形成表面活性剂微球的适宜的表面活性剂列表， 在此通过引用并入。术语表面活性剂微球包括纳米球、脂质体、运载体及其类似物。生物相容性气体可以是空气或碳氟化合物，例如C3-C5全氟烷，其提供回声产生的差异而在超声成像中形成反差。使所述气体包囊于或含于微球中，所述微球任选地通过连接基团而连接着铜氧还蛋白进入结构域。连接可以是共价的、离子的或者通过范德华力。此类造影剂的具体例子包括脂质包囊的全氟碳，其具有多种肿瘤新生血管受体结合肽、多肽或肽模拟物。适宜于作为货物化合物使用的X-射线造影剂包括，但不局限于一种或多种原子序号20或以上的、X射线吸收原子或“重”原子，在铜氧还蛋白进入结构域和X-射线吸收原子之间可进一步包含任选的连接部分Ln。X-射线造影剂中经常使用的重原子是碘。最近， 已公开了包含金属螯合物的X-射线造影剂(例如美国专利第5，417，959号)和包含多个金属离子的多螯合物(例如美国专利第5，679，810号)。更近地，已公开了作为X-射线造影剂的多核簇状复合物(multinuclear cluster complexes)(例如美国专利第5，804，161 号、PCT W091/14460，和 PCT WO 92/17215)。适宜用作货物化合物的MRI造影剂包括，但不局限于，一种或多种顺磁性金属离子，在铜氧还蛋白进入结构域和顺磁性金属离子之间可进一步包含任选的连接部分Ln。顺磁性金属离子以金属复合物或金属氧化物微粒的形式存在。美国专利第5，412，148号和第5，760，191号描述了用于MRI造影剂中顺磁性金属离子的螯合剂的例子。美国专利第 5，801，228号、第5，567，411号和第5，281，704号描述了在MRI造影剂中使用的用于复合一个以上顺磁性金属离子的多螯合剂的例子。美国专利第5，520，904号描述了用作MRI造影剂的由顺磁性金属离子组成的颗粒化组合物的例子。在另一个实施方案中，递送货物化合物以杀死细胞或延迟细胞周期进程，所述细胞比如癌细胞。这样的癌细胞可以是，例如，骨肉瘤细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、淋巴瘤细胞、白血病细胞、软组织肉瘤细胞或乳腺癌细胞、肝癌细胞、膀胱癌细胞或前列腺癌细胞。 例如，所述货物化合物可以是细胞周期调控蛋白，例如P53 ；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物，比如pl6、p21或p27 ；自杀蛋白，诸如胸苷激酶或硝基还原酶；细胞因子或其它免疫调节蛋白，诸如白细胞介素1、白细胞介素2或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；或毒素， 诸如铜绿假单胞菌外毒素A。在另一些实施方案中，递送了上述化合物种类之一的生物活性片段。在又一个实施方案中，所述货物化合物是核酸。在一些实施方案中，所述核酸编码上述种类的化合物之一。在又一个实施方案中，所述货物化合物是用于治疗癌症的药物。这样的药物包括，例如5-氟尿嘧啶；干扰素α ；氨甲喋呤；他莫昔芬；和长春新碱。上述例子仅用于示例目的，许多其它此类化合物是本领域技术人员已知的。在另一些实施方案中，所述核酸用于基因治疗。适用于治疗癌症的货物化合物包括但不局限于，烷化剂，比如氮芥、烷基磺酸盐、 亚硝脲、氮丙啶和三氮烯(triazene)；抗代谢物，比如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物及嘧啶类似物；抗生素，比蒽环类、博来霉素、丝裂霉素、放线菌素D和普卡霉素(plicamycin)；酶， 比如L-天冬酰胺酶；法呢基蛋白转移酶抑制物；5 α -还原酶抑制物；3型17 β -羟基类固醇脱氢酶抑制物；激素剂，比如糖皮质激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、 黄体酮及促黄体生成素释放激素拮抗剂、醋酸奥曲肽(octreotide acetate)；微管破坏剂，诸如海鞘素或其类似物和衍生物；微管稳定剂，比如紫杉烷类(taxane)，诸如紫杉醇 (Taxol )、多西紫杉醇(Taxotere )，及其类似物，和埃坡霉素诸如埃坡霉素A-F和其类似物；植物衍生制品，诸如长春花生物碱、表鬼白毒素、紫杉烷类；和拓扑异构酶抑制物 ’异戊二烯基转移酶抑制物；和混合制剂，例如羟基脲、普鲁苄胼、米托坦(mitotan)、六甲蜜胺 (hexamethylmelamine)、钼配位复合物，诸如顺钼和卡钼；以及其它用于抗癌的剂和细胞毒性剂，诸如生物反应修饰物、生长因子；免疫调节物和单克隆抗体。这些种类的抗癌剂和细胞毒性剂的代表性例子包括但不限于盐酸氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、异环磷酰胺(ifosfamide)、白消安、亚硝脲氮芥、罗莫司汀 (Iomustine)、司莫司汀(semustine)、链脲霉素、硫替哌、达卡巴嗪(dacartazine)、氨甲喋呤、硫鸟嘌呤、巯嘌呤、氟达拉滨(fludarabine)、pentastatin、克拉屈滨(cladribin)、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、盐酸阿霉素、柔红霉素、伊达比星(idarubicin)、硫酸博来霉素、丝裂霉素C、放线菌素D、番红菌素、番红霉素、喹癌菌素、盘皮海绵内酯、长春新碱、长春花碱、酒石酸脱水长春花碱、鬼白亚乙苷、磷酸鬼白亚乙苷、替尼泊苷、紫杉醇、他莫昔芬、雌氮芥、雌氮芥磷酸钠、氟他胺(flutamide)、布舍瑞林(buserelin)、亮丙瑞林(Ieuprolide)、蝶啶、 diyneses、左旋咪唑、aflacon、干扰素、白细胞介素、阿地白介素、非格司亭(filgrastim)、 沙莫司亭(sargramostim)、利妥昔单抗(rituximab)、卡介苗、维甲酸、盐酸依立替康、倍他米松(betamethosone)、盐酸吉西他滨、六甲蜜胺和托泊替康(topoteca)及其任何类似物或衍生物。这些种类的优选成员包括，但不局限于，紫杉醇、顺钼、卡钼、阿霉素、洋红霉素、柔红霉素、氨基蝶呤、氨甲蝶呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、海鞘素743或紫菜霉素、5-氟尿嘧啶、 6-巯基嘌呤、吉西他滨、阿糖胞苷、鬼白毒素或者鬼白毒素衍生物诸如鬼白亚乙苷、磷酸鬼臼亚乙苷或替尼泊苷、苯丙氨酸氮芥、长春花碱、长春新碱、异长春碱、脱乙酰长春花碱及环氧长春碱。用作货物化合物的抗癌和其它细胞毒性剂的例子包括如下德国专利第 4138042. 8 号；WO 97/19086、WO 98/22461、WO 98/25929、WO 98/38192、WO 99/01124、 WO 99/02224、WO 99/02514、WO 99/03848、WO 99/07692、WO 99/27890、WO 99/28324、 WO 99/43653、WO 99/54330、WO 99/54318、WO 99/54319、WO 99/65913、WO 99/67252、WO 99/67253和WO 00/00485中发现的埃坡霉素衍生物；WO 99/24416中发现的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物(还参见美国专利第6，040，321号)；及WO 97/30992和W098/54966中发现的异戊二烯基蛋白转移酶抑制物；和诸如美国专利第6，011，029中一般和具体描述的那些剂(此美国专利的所述化合物可与任何NHR调节物(包括但不局限于本发明中的那些)诸如AR调节物、ER调节物以及LHRH调节物或者手术去势联用，特别是在治疗癌症中)。当连同本发明的化合物用作货物化合物时，可以Wiysicians，Desk Reference (内科医生案头参考资料，PDR)中指定的或按照本领域一般技术人员所测定的那些量来使用上述其它治疗剂。含有铜氧还蛋白进入结构域的药物组合物含有、包含铜氧还蛋白进入结构域或由铜氧还蛋白进入结构域组成的药物组合物，以及含有与货物化合物连接的铜氧还蛋白进入结构域的复合物的药物组合物可通过任何常规方法来制备，例如，通过常规混合、溶解、颗粒化、包被糖衣、乳化、包囊化、封入 (entrapping)或冻干方法。所述复合物可易于与本领域中熟知的药学上可接受的载体相组合。这种载体使制剂能够以片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬液和类似的形式来配制。适宜的赋形剂还可包括，例如，充填剂和纤维素制剂。其它赋形剂可包括，例如，调味剂、着色剂、防粘剂、增稠剂以及其它可接受的添加剂、佐剂或粘合剂。这种组合物可用于例如细胞类型的检测或成像或用于与细胞死亡有关的病症的治疗或其预防。所述组合物可以足以预防或治疗与细胞死亡抗性有关的病症的量来施用。 如本文所用的，术语“与细胞死亡抗性有关的病症”指疾病、状态或不适，其特征为由适当的、熟练的医师或临床医师判定的、与同种健康细胞相比至少细胞寿命延长的趋势。通常， 宿主生物体是哺乳动物，比如人或动物。含有铜氧还蛋白进入结构域的组合物的施用含有铜氧还蛋白进入结构域的组合物可通过任何适宜的途径来施用，例如，通过口服、口腔、吸入、舌下、直肠、阴道、经尿道、鼻腔、局部、经皮(即透皮)或胃肠外(包括静脉内、肌内、皮下及冠状动脉内施用)来施用。组合物及其药物制剂可以有效达到其预期目的的任何的量来施用。当施用以用于治疗与细胞死亡抗性有关的病症时，所述组合物应以治疗有效量来施用。“治疗有效量”是有效预防受治疗者的现有症状的发展或缓解现有症状的量。治疗有效量的测定在本领域技术人员的能力范围内。当然，适宜的剂量将根据以下而不同，例如所应用的含有铜氧还蛋白进入结构域的化合物、宿主、施用方式以及被治疗或诊断的病症的性质和严重性。然而，在本发明的方法的一个实施方案中，在每日剂量为约0. 001到约20mg/kg体重的含有铜氧还蛋白进入结构域的化合物时获得了令人满意的人体疗效。在一个实施方案中，用于治疗人体的指定的每日剂量的范围为从约0. 7mg到约1400mg的含有铜氧还蛋白进入结构域的化合物，其可例如以每日剂量、每周剂量、每月剂量和/或持续给药来方便地施用。每日剂量可以是每天1 到12次的不连续剂量。可选地，剂量可以每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周及类似递增至每31天来施用。可使用任意适当的给药形式包括片剂、贴剂、静脉内施用及其类似的形式进行连续的、间歇的或单剂的给药。更具体地，组合物以治疗有效量来施用。在具体的实施方案中，治疗有效量为从约0. 01-20mg/kg体重。在具体的实施方案中，剂量水平为约 10mg/kg/ 日、约 15mg/kg/ 日、约 20mg/kg/ 日、约 25mg/kg/ 日、约 30mg/kg/ 日、约 35mg/kg/ 日、约 40mg/kg/ 日、约 45mg/kg/ 日或约 50mg/kg/ 日。在某些实施方案中，将含有铜氧还蛋白进入结构域的化合物导入患者的方法为与其它治疗癌症的已知药物共同施用。这种方法为本领域所熟知。在具体的实施方案中，含有铜氧还蛋白进入结构域的化合物为混合剂的一部分，或与含有或具有其它治疗癌症的药物共同给药。这种药物包括，例如，本文所列的那些，且具体为5-氟尿嘧啶、干扰素α、氨甲蝶呤、他莫昔芬和长春新碱。以上例子仅用于示例，许多其它此类化合物为本领域技术人员所知。编码铜氧还蛋白进入结构域或组合进入结构域与货物化合物的融合蛋白的核酸分子可插入到载体中并用作基因治疗载体。基因治疗载体可通过诸如静脉内注射、局部施用(Nabel等人，美国专利第5，3 , 470号1994. USA)，或立体定向注射(stereotactic injection) (Chen 等人，Proc Natl Acad Sci USA，第 91 卷，第 3054-57 页(1994))递送至受治疗者。基因治疗载体的药物制品可包括可接受的稀释剂或可包含基因递送运载体嵌入其中的缓释基质。可选地，当完整的基因递送载体例如逆转录病毒载体可由重组细胞完整产生时，药物制品可包括一种或多种产生基因递送系统的细胞。在一方面，组合物以DNA被递送，因此复合物是在原位产生的。在一个实施方案中，DNA 是“裸露的”，如例如 Ulmer 等人，Science259 1745-49 (1993)所描述和 cohen, Science 259 :1691-92(1993)中所综述的。通过将DNA包被在载体上(例如可被有效转运入细胞的生物可降解的珠子)可提高裸露DNA的摄取。在此类方法中，DNA可存在于本领域技术人员已知的多种递送系统中的任何中，所述系统包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系统。将DNA整合入这些表达系统的技术为本领域技术人员所熟知。见例如WO 90/11092、 WO 93/24640, WO 93/17706 和美国专利第 5，736，524 号。用于从生物体到生物体穿梭遗传物质的载体可分为两大类克隆载体是复制型质粒或噬菌体，并具有在适当宿主细胞中繁殖非必需的且外源DNA可插入其中的区域；外源 DNA如同其为载体的成分一样被复制和繁殖。表达载体(比如质粒、酵母或动物病毒基因组)被用来将外源遗传物质导入宿主细胞或组织中，从而转录和翻译外源DNA，例如组合物的DNA。在表达载体中，导入的DNA与诸如启动子的元件可操作地连接，所述元件向宿主细胞发出信号以转录所插入的DNA。某些启动子是尤其有用的，例如应答特定因子而调控基因转录的诱导型启动子。将组合物多核苷酸与诱导型启动子可操纵地连接可调控野生型-天青蛋白进入结构域组合物多肽或片段的表达。典型的诱导型启动子的例子包括对α-干扰素、热休克、重金属离子和类固醇例如糖皮质激素(Kaufman，Methods Enzymo 1. 185 487-511(1990))及四环素响应的那些启动子。其它所需的诱导型启动子包括对构建体所导入的细胞而言不是内源性的但是当外源提供诱导剂时在那些细胞中是响应的那些启动子。 通常，有用的表达载体常为质粒。然而，考虑了其它形式的表达载体例如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。载体的选择取决于所用的生物体或细胞，以及载体的所需命运。通常，载体包含信号序列、复制起点、标记基因、增强子元件、启动子以及转录终止序列。包含铜氧还蛋白进入结构域-货物化合物复合物的试剂盒在另一方面，本发明提供了试剂盒，其在包装或容器内含有以下的一种或多种 (1)包含铜氧还蛋白进入结构域本身(比如pl8或p28)或包含与货物化合物连接的铜氧还蛋白进入结构域的试剂；( 含有药学上可接受的佐剂或赋形剂的试剂；C3)施用工具，比如注射器；(4)施用说明书。还考虑了其中同一容器内含有成分(1)-(4)中的两个或多个的实施方案。包含铜氧还蛋白、铜氧还蛋白进入结构域、铜氧还蛋白进入结构域-货物化合物复合物，或其变体、衍生物或结构等价物的药物组合物包含铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的药物组合物可通过任何常规方法生产，例如通过常规混合、溶解、颗粒化、包被糖衣、乳化、包囊化、封入或冻干方法。基本上纯的或药物级的铜氧还蛋白或其变体、衍生物和结构等价物可易于与本领域公知的药学可接受载体组合。这种载体使制剂能够以片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、 悬液等形式配制。适宜的载体或赋形剂还可包括，例如，充填剂和纤维素制剂。其它赋形剂可包括，例如调味剂、着色剂、防粘剂、增稠剂以及其它可接受的添加剂、佐剂或粘合剂。在一些实施方案中，所述药物制剂基本上不含防腐剂。在另一些实施方案中，所述药物制剂可至少含有一种防腐剂。药物剂型的一般方法见于Ansel等人，！Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (药物齐[J型禾口药物递送系统)(Lippencott Williams & Wilkins，Baltimore MD(1999)) 可将本发明使用的包含铜氧还蛋白、或其变体、衍生物或结构等价物的药物组合物以多种途径来施用，包括通过注射(例如，皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹腔内注射和类似的注射)，通过吸入、通过局部施用、通过栓剂、通过采用透皮贴剂或通过口腔来施用。 药物递送系统的一般信息可在Ansel等人，同前中找到。在一些实施方案中，可对包含铜氧还蛋白、或其变体、衍生物或结构等价物的药物组合物进行配制并直接用作皮下注射和静脉注射等的注射剂。可注射的制剂尤其可有利地用来治疗适宜于化学预防治疗的患者。包含铜氧还蛋白、或其变体、衍生物或结构等价物的药物组合物还可与预防剂诸如聚丙二醇或相似的包膜剂混合后来进行口服。当通过注射施用时，可将铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物配制成水溶液，具体为在诸如Hanks溶液、林格溶液或生理盐水缓冲液的生理相容缓冲液中。溶液可包含配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，铜氧还蛋白、或其变体、衍生物或结构等价物可以是粉末形式，在使用前用适宜的运载体诸如无菌无热原水来构建。在一些实施方案中，药物组合物不添加佐剂或为增强肽所刺激的免疫反应而添加的任何其他物质。 在一些实施方案中，药物组合物包含抑制对肽的免疫反应的物质。当通过静脉流体来施用时，用来施用铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的静脉流体可由类晶体或胶体组成。本文所用的类晶体是矿物盐或其它水溶性分子的水溶液。本文所用的胶体包含较大的不可溶的分子，比如明胶。静脉流体可以是无菌的。如表2所描述的，可用于静脉内施用的类晶体流体包括但不局限于，生理盐水 (0. 9%浓度的氯化钠溶液)、林格乳酸盐或林格溶液和5%的葡萄糖水溶液，有时称作D5W。表2.常用类晶体溶液的组合物
溶液其它名称[Na+][Cl1][葡萄糖]D5W5%葡萄糖002522/3 & 1/33.3%葡萄糖/0.3% 盐水5151168半张生理盐水0.45% NaCl77770生理盐水0.9% NaCl1541540林格乳酸盐*林格溶液1301090*林格乳酸盐也具有^mmol/L乳酸盐、4mmol/L K+和3mmol/L Ca2+。当通过吸入来施用时，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物可利用适宜的推进剂诸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氧化碳或其它适宜的气体以气雾剂喷雾形式从加压包或喷雾器中递送。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供阀释放计量的量来确定剂量单位。用于吸入器或吹入器的诸如明胶的药囊和药筒可配制成含有所述蛋白和适宜的粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。当通过局部施用时，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物可配制成如本领域中熟知的溶液、凝胶、软膏、乳膏、凝胶剂、悬浮液等。在一些实施方案中，通过透皮贴剂来施用。当通过栓剂施用时(例如直肠或阴道)，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物组合物也可以配制成含有常规栓剂基质的组合物。当通过口服施用时，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物可易于通过将铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物与本领域中熟知的药学上可接受的载体混合而配制。可利用固体载体诸如甘露醇、乳糖、硬脂酸镁及其类似物；所述载体能使铜氧还蛋白及其变体、衍生物或结构等价物配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等，用于待治疗的受治疗者的口服摄入。对于口服固体剂型例如粉末、胶囊和片剂，适合的赋形剂包括填充物例如糖、纤维素制剂、颗粒化剂和粘合剂。本领域熟知的其它常规载体，也包括多价载体，例如细菌荚膜多糖、葡聚糖或基因工程载体。此外，包括铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的持续释放制剂允许在延长的时期内释放铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物，而不使用持续释放制剂，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物会在引起或增强治疗效果之前从受治疗者系统中被清除、和/或例如被蛋白酶和简单的水解降解。本发明的肽在血流中的半衰期可通过本领域技术人员熟知的几种方法延长或优化。本发明的肽变体可包括，但不局限于，可能提高其在血流中的稳定性、特定活性、存在时间、和/或降低铜氧还蛋白的免疫原性，并保留所述肽在哺乳动物细胞、组织和动物中抑制癌前病变发展的能力。所述变体包括，但不局限于那些减少肽的水解、减少肽的脱酰胺作用、减少氧化、降低免疫原性、提高肽的结构稳定性或增加肽的尺寸的变体。所述肽还包括环化的肽(参见 Monk 等人，BioDrugs 19(4) =261-78, (2005) ；DeFreest 等人， J. Pept. Res. 63 (5) :409-19 (2004))，D，L-肽(非对映体，Futaki 等人，J. Biol. Chem. Feb 23 ；276 (8) :5836-40(2001) ；Papo 等人，Cancer Res. 64(16) :5779-86(2004) ；Miller 等人，Biochem. Pharmacol. 36(1) =169-76, (1987))；含有非天然氨基酸的肽(参见 Lee 等人·，J. Pept. Res. 63 (2) :69-84 (2004))，N-末端修饰和 C-末端修饰(参见 Labrie 等人·， Clin. Invest. Med. 13(5) :275-8, (1990))，烃类环钩(参见 khafmeister 等人，J. Am. Chem. Soc. 122 :5891-5892(2000) ；Walenski 等人，Science 305 :1466-1470(2004))和聚乙二醇化。在各种实施方案中，药物组合物包括载体和赋形剂(包括但不局限于缓冲液、碳水化合物、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸诸如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、悬浮剂、 增稠剂和/或防腐剂)、水、油、盐溶液、水性右旋葡萄糖和甘油溶液、模拟生理条件需要的其它药学上可接受的辅助剂，例如缓冲剂、张力调节剂、润湿剂及其类似物。应当意识到， 虽然可以采用本领域一般技术人员已知的任何适宜的载体来施用本发明的组合物，但载体的类型可根据施用方式而不同。还可使用熟知的技术将化合物包在脂质体中。生物可降解的微球也可以作为载体用于本发明的药物组合物。例如在美国专利第4，897，268号；第 5,075, 109 号；第 5, 928, 647 号；第 5,811, 128 号；第 5，820，883 号；第 5,853, 763 号；第 5，814，344号和第5，942，252号中已公开了适宜的生物可降解的微球。可通过常规的熟知的灭菌技术或可通过无菌过滤对药物组合物进行灭菌。所得的水溶液可以包装原样使用，或冻干，在施用前将冻干制剂与无菌溶液混合。铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的施用铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物，比如P18或p28，可被配制成药物组合物来施用，并可通过任何适宜的途径来施用，例如，通过口服、口腔、吸入、舌下、直肠、阴道、经尿道、鼻、局部、经皮肤即经皮或胃肠外(包括静脉内、肌内、皮下和冠状动脉内)或玻璃体施用。其药物制剂可以任何有效实现其想要的目的的量来施用。更具体地，组合物以治疗有效量来施用。在特定的实施方案中，治疗有效量一般从约0. 01-20mg/天/kg体重。
包含铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的化合物单独或与其它活性剂和 /或货物化合物联合可用于预防癌症。当然，适合的剂量将取决于，例如，所使用的铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的化合物、宿主、施用模式和潜在癌症的性质和严重度。 然而，通常在人类中获得满意效果的每日剂量为约0.01-20mg/kg体重。在人类中方便施用的铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的化合物的每日指定剂量在从约0. 7mg到约 1400mg的范围中，例如每日剂量、周剂量、月剂量和/或连续剂量。每日剂量可以是不连续的剂量，从每天1次到每天12次。可选地，剂量可以为每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周，并且以类似天数增加直至31天或更长进行施用。可选地，给药可以是连续的， 使用贴剂、静脉内施用及类似的施用。主治医师根据病人的情况来决定准确的配方、施用途径和剂量。可个别地调整用药剂量和间隔，以提供足以维持治疗作用的活性铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物(有或没有货物化合物)的血浆水平。通常，所需的铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物与按照预期的施用途径和标准药物实践所选择的药用载体混合施用。在一方面，铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物作为DNA来递送，从而在原位产生多肽。在一个实施方案中，DNA是“裸露的”，例如，在Ulmer等人，(Science 259 1745-1749(1993))中所述和 Cohen 综述(Science 259:1691-1692(1993))。可通过将 DNA 涂布到载体(例如，生物可降解珠)来提高裸DNA的摄入，且然后DNA被有效地运输到细胞中。用这种方法，DNA可存在于本领域普通人员已知的任意多种递送系统内，包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系统。将DNA整合到这样的表达系统中所用的技术对于本领域普通技术人员是熟知的。参见例如，W090/11092, W093/24640, WO 93/17706和美国专利第 5，736，524 号。用于在生物体间穿梭传送遗传物质的载体可分为两大类克隆载体是复制型质粒或噬菌体，具有在适当的宿主细胞中增殖必需的区域，其中可以插入外源DNA;所述外源 DNA被复制和增殖，如同其为载体的组分一样。表达载体(例如，质粒、酵母或动物病毒基因组)用来将外源遗传物质导入到宿主细胞或组织中以转录并翻译外源DNA，如铜氧还蛋白的DNA。在表达载体中，导入的DNA与诸如启动子的元件可操作地连接，所述元件传递信号至宿主细胞以高度转录插入的DNA。一些启动子是特别有用的，例如响应于特定因子来调控基因转录的可诱导型启动子。将铜氧还蛋白和其变体和衍生物同可诱导型启动子可操作地连接能够调控响应于特定因子的铜氧还蛋白和其变体和衍生物的表达。典型的诱导型启动子的例子包括对α-干扰素、热激、重金属离子和类固醇诸如糖皮质激素(Kaufman， Methods Enzymo 1. 185 :487-511 (1990))和四环素响应的那些启动子。其它理想的诱导型启动子包括对于导入构建体的细胞不是内源性的那些启动子，然而，当外源提供诱导剂时，在那些细胞中是应答性的。一般，有用的表达载体常为质粒。然而，其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒)被考虑了。此外， 本发明的肽，包括在一个实施方案中的P18，可用作载体以选择性递送治疗化合物进入癌细胞或肿瘤。载体选择取决于所用的生物体或细胞和载体的预期的命运。通常，载体包括信号序列、复制起点、标记基因、多接头位点、增强子元件、启动子和转录终止序列。包含铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的药盒
在一方面，本发明提供了包含以下的一种或多种处于包装或容器中的方案或药盒(1)包含至少一种铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物的药理活性组合物；(2) 另外的化学预防药物，(3)向患者施用所述生物活性组合物的器材，例如注射器、喷雾器等。当提供药盒时，所述组合物的不同组分可以视情况包装在独立的容器中，在使用前立刻混合。这样的独立包装的组分可以允许长期贮存而不失去活性组分的功能。药盒中所含的试剂可在任意种类的容器中提供，从而保持了不同组分的使用期且其不被容器的材料所吸收或改变。例如，密闭的玻璃安瓿可以含有冻干的铜氧还蛋白和其变体、衍生物和结构等价物，或在中性、不反应气体诸如氮气下包装的缓冲液。安瓿可以由任何适宜的材料组成，例如玻璃、有机聚合物诸如聚碳酸酯、聚苯乙烯等，陶瓷、金属或通常用于保存相似试剂的任何其它材料。其它适宜的容器的例子包括简易瓶，其由与安瓿相似的物质制成，以及包壳(envelope)，其可以包括箔内衬的内部，诸如铝或合金。其它容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶、注射器或类似物。容器可具有无菌存取口，例如有塞子的瓶子，该塞子可以用皮下注射针刺穿。其它容器可具有两室，两室被易于除去的膜隔开，去除膜后允许组分混合。可除去的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等。药盒还可提供说明材料。说明书可以印在纸上或其它载体上，和/或以电子可读介质提供，例如软盘、⑶_R0M、DVD-R0M、压缩盘、录像带、录音带、闪存装置等。详细的说明书可以不与药盒物理联系在一起；而是可以指引使用者到药盒的制造商或经销商指定的互联网站，或作为电子邮件来提供。铜氧还蛋白、铜氧还蛋白进入结构域和其变体、衍生物和结构等价物的修饰可对铜氧还蛋白或其变体、衍生物或结构等价物进行化学修饰或遗传改变以产生如上所述的变体和衍生物。所述变体和衍生物可以通过标准技术来合成。可对铜氧还蛋白进入结构域进行类似修饰。除天然存在的铜氧还蛋白的等位基因变体，还可通过突变将变化导入到铜氧还蛋白编码序列中，突变引起所编码的铜氧还蛋白的氨基酸序列的变化，但这不会显著改变铜氧还蛋白抑制癌前病变发展的能力。“非必需”氨基酸残基是可在野生型的铜氧还蛋白序列中发生改变而不改变药理学活性的残基，而“必需”氨基酸残基是这种药理学活性所需要的。例如铜氧还蛋白中保守的氨基酸残基预期是尤其不适合改变的，且因此是“必需”的。可进行不改变所述多肽的药理学活性的保守置换的氨基酸是本领域中熟知的。可用的保守置换如表3中“优选置换”所示。只要所述置换实质上没有改变化合物的药理学活性，一种类型的氨基酸被相同类型的另一种氨基酸替代的保守置换在本发明的范围之内。表3.优选置换
权利要求
1.一种方法，所述方法包括通过使癌细胞与细胞毒性的铜氧还蛋白相接触而杀死所述癌细胞，其中所述细胞毒性的铜氧还蛋白通过一种或多种胞吞途径优先进入所述癌细胞， 并且其中所述细胞毒性的铜氧还蛋白是天青蛋白的截短体，其中所述天青蛋白的截短体包含来自SEQ ID NO 2的C-末端的氨基酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述天青蛋白的截短体来自铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)0
3.如权利要求1所述的方法，其中所述天青蛋白的截短体包含SEQIDNO :2。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述天青蛋白的截短体由SEQIDNO :2组成。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞毒性的铜氧还蛋白通过胞膜窖介导的胞吞作用优先进入所述癌细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述细胞毒性的铜氧还蛋白进入所述癌细胞是通过高尔基体来介导的。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞毒性的铜氧还蛋白包含无论所述癌细胞的状态如何能够与所述癌细胞的细胞膜接触的氨基酸。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述细胞毒性的铜氧还蛋白与所述癌细胞的细胞膜上的氨基酸接触。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述细胞毒性的铜氧还蛋白与所述癌细胞的细胞膜上的细胞表面肽接触。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述细胞毒性的铜氧还蛋白与所述癌细胞的细胞膜上的受体接触。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述细胞毒性的铜氧还蛋白包含位于SEQID NO 1中的第69、70、75、76和85位的氨基酸中的每一个。
12.如权利要求7所述的方法，其中所述细胞毒性的铜氧还蛋白包含选自由SEQID NO :35、SEQ ID NO 36和SEQ ID NO 37组成的组的氨基酸序列。
13.如权利要求7所述的方法，其中所述细胞毒性的铜氧还蛋白由选自由SEQID NO 35、SEQ ID N0:36和SEQ ID NO :37组成的组的氨基酸序列组成。
14.一种分离的肽，所述分离的肽能够与癌细胞的细胞膜接触，通过胞膜窖介导的胞吞作用进入所述癌细胞，并杀死所述癌细胞，其中所述分离的肽包含来自SEQ ID N0:2的 C-末端的氨基酸。
15.如权利要求14所述的分离的肽，其中所述分离的肽与所述癌细胞的细胞膜上的氨基酸接触。
16.如权利要求14所述的分离的肽，其中所述分离的肽与所述癌细胞的细胞膜上的细胞表面肽接触。
17.如权利要求14所述的分离的肽，其中所述分离的肽与所述癌细胞的细胞膜上的受体接触。
18.如权利要求14所述的分离的肽，其中所述分离的肽进入所述癌细胞是由高尔基体来介导的。
19.如权利要求14所述的分离的肽，其中所述分离的肽来自铜绿假单胞菌。
20.如权利要求14所述的分离的肽，其中所述分离的肽包含SEQIDNO :2。
21.如权利要求14所述的分离的肽，其中所述分离的肽由SEQID NO :2组成。
22.如权利要求14所述的分离的肽，其中所述分离的肽包含选自由SEQID NO 35、SEQ ID NO 36和SEQ ID NO :37SEQ ID NO 36组成的组的氨基酸序列。
23.如权利要求14所述的分离的肽，其中所述分离的肽由选自由SEQIDNO 35、SEQ ID N0:36和SEQ ID NO :37SEQ ID NO :36组成的组的氨基酸序列组成。
24.一种分离的肽，所述分离的肽能够与癌细胞的细胞膜接触，通过胞膜窖介导的胞吞作用进入所述癌细胞，并杀死所述癌细胞，其中所述分离的肽包含见于SEQ ID N0:1的第 69、70、75、76和85位的氨基酸中的一个或多个。
25.如权利要求24所述的分离的肽，其中所述分离的肽包含位于SEQIDN0:1中的第 69、70、75、76和85位的氨基酸中的每一个。
26.如权利要求24所述的分离的肽，其中所述分离的肽与所述癌细胞的细胞膜上的氨基酸接触。
27.如权利要求24所述的分离的肽，其中所述分离的肽与所述癌细胞的细胞膜上的细胞表面肽接触。
28.如权利要求24所述的分离的肽，其中所述分离的肽与所述癌细胞的细胞膜上的受体接触。
29.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求14所述的分离的肽。
30.如权利要求29所述的药物组合物，还包含药学上可接受的载体。
31.如权利要求30所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体适宜于静脉内施用。
32.一种方法，所述方法包括通过向哺乳动物患者施用治疗有效量的权利要求29所述的药物组合物来治疗所述患者。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述患者是人。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述患者处于比一般群体高的发生癌症的风险。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、肺癌、结肠直肠癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌和宫颈癌。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述患者具有至少一种高风险特征。
37.如权利要求33所述的方法，其中所述患者具有癌前病变。
38.如权利要求33所述的方法，其中所述患者已被治愈癌症或癌前病变。
39.如权利要求32所述的方法，其中所述药物组合物通过选自由静脉注射、肌内注射、 皮下注射、吸入法、局部施用、透皮贴剂、栓剂、玻璃体注射和口腔组成的组的方式来施用。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述施用的方式是通过静脉注射。
41.一种药盒，所述药盒包括在小管中的权利要求29所述的组合物。
42.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求24所述的分离的肽。
43.如权利要求42所述的药物组合物，还包含药学上可接受的载体。
44.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体适宜于静脉内施用。
45.一种方法，所述方法包括通过向哺乳动物患者施用治疗有效量的权利要求42所述的组合物来治疗所述患者。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述患者是人。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述患者处于比一般群体高的发生癌症的风险。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、肺癌、结肠直肠癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌和宫颈癌。
49.如权利要求46所述的方法，其中所述患者具有至少一种高风险特征。
50.如权利要求46所述的方法，其中所述患者具有癌前病变。
51.如权利要求46所述的方法，其中所述患者已被治愈癌症或癌前病变。
52.如权利要求45所述的方法，其中所述药物组合物通过选自由静脉注射、肌内注射、 皮下注射、吸入法、局部施用、透皮贴剂、栓剂、玻璃体注射和口腔组成的组的方式来施用。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述施用的方式是通过静脉注射。
54.一种药盒，所述药盒包括在小管中的权利要求42所述的组合物。
55.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求14所述的分离的肽和货物化合物。
56.如权利要求55所述的药物组合物，其中所述分离的肽与所述货物化合物连接。
57.如权利要求56所述的药物组合物，其中所述货物化合物是他莫昔芬。
58.如权利要求55所述的药物组合物，其中所述货物化合物选自由蛋白、脂蛋白、多肽、肽、多糖、核酸、染料、微粒、纳米颗粒、毒素和药组成的组。
59.如权利要求55所述的药物组合物，其中所述货物化合物是可检测的物质。
60.如权利要求59所述的药物组合物，其中所述货物化合物是通过X-射线CT可检测的X-射线造影剂。
61.如权利要求59所述的药物组合物，其中所述货物化合物是通过MRI可检测的磁共振成像造影剂。
62.如权利要求59所述的药物组合物，其中所述货物化合物是超声造影剂并且是通过超声可检测的。
63.如权利要求55所述的药物组合物，还包含药学上适宜的载体。
64.一种方法，所述方法包括通过将细胞与权利要求55所述的药物组合物相接触而将货物化合物递送到所述细胞中。
65.一种方法，所述方法包括通过向患者施用权利要求59所述的药物组合物来诊断癌症。
66.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求24所述的分离的肽和货物化合物。
67.如权利要求66所述的药物组合物，其中所述分离的肽与所述货物化合物连接。
68.如权利要求67所述的药物组合物，其中所述货物化合物是他莫昔芬。
69.如权利要求66所述的药物组合物，其中所述货物化合物选自由蛋白、脂蛋白、多肽、肽、多糖、核酸、染料、微粒、纳米颗粒、毒素和药组成的组。
70.如权利要求66所述的药物组合物，其中所述货物化合物是可检测的物质。
71.如权利要求70所述的药物组合物，其中所述货物化合物是通过X-射线CT可检测的X-射线造影剂。
72.如权利要求70所述的药物组合物，其中所述货物化合物是通过MRI可检测的磁共振成像造影剂。
73.如权利要求70所述的药物组合物，其中所述货物化合物是超声造影剂并且是通过超声可检测的。
74.如权利要求66所述的药物组合物，还包含药学上适宜的载体。
75.一种方法，所述方法包括通过将细胞与权利要求66所述的药物组合物相接触而将货物化合物递送到所述细胞中。
76.一种方法，所述方法包括通过向患者施用权利要求70所述的药物组合物来诊断癌症。
全文摘要
本发明公开了通过细胞毒性化合物的优先进入来杀死和/或抑制癌细胞的生长的方法和材料。细胞毒性化合物的优先进入是通过使用来源于包括天青蛋白的p18截短体和p28截短体的铜氧还蛋白的蛋白质转导结构域来实现的。
文档编号A61K38/00GK102325542SQ200980157000
公开日2012年1月18日 申请日期2009年12月17日 优先权日2008年12月18日
发明者克雷格·贝蒂, 塔帕斯·达斯古普塔, 山田彻, 布莱德·泰勒, 拉杰沙瓦瑞·梅塔 申请人:Cdg医疗公司