专利名称：标准化脊髓损伤动物模型的造模方法
技术领域：
本发明涉及动物模型的造模方法，具体涉及一种脊髓损伤动物模型的造模方法。
背景技术：
脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是由于各种原因引起的脊髓结构、功能损害 后损伤水平以下的脊髓功能障碍。在美国，每年每百万人口新发生30 40例，有些地区甚 至高达60例。据不完全统计，我国的脊髓损伤人数已突破百万，并以每年12万的速度剧增， 全球脊髓损伤人数已突破三百万。随着现代社会的发展，交通及建筑坠落事故不断增多， SCI人口不断增加，加之SCI患者多数为青壮年，他们在社会和家庭中扮演着重要的角色， 发生意外后将对社会和家庭造成巨大的经济和精神损失。2008年发生的汶川地震是新中 国成立以来破坏性最强、波及范围最广、灾害损失最大的一次地震灾害，震级达到里氏8.0 级，最大烈度达到ll度，人员伤亡惨重。这次突如其来的地震导致了数万伤员脊柱脊髓受 到不同程度的损伤，伤员的功能康复问题显得尤为突出，因此，有关脊髓损伤的研究在国际 国内均是热点课题。 进行脊髓损伤的研究，首先要复制标准理想的脊髓损伤动物模型。理想的脊髓 损伤动物模型应具备以下要求①临床相似性即制作的脊髓损伤动物模型应与临床相近 似，动物模型能够模拟发生人类脊髓损伤的特殊病理过程，尽量接近人类情况。②可调控 性即可以根据实际需要，调整损伤程度，复制不同损伤程度的脊髓损伤动物模型。③可重 复性和可操作性即可以对脊髓损伤模型的关键步骤客观化、定量化，模型操作技术简单， 易于掌握，便于推广。 现阶段临床应用研究使用最多的还是脊髓背侧损伤动物模型。外伤性脊髓损伤动 物模型造模的主要方法有重物坠落(weight drop, WD)法、钳夹压法、气囊压迫法等。WD 法，也称All en打击法，即用重物从不同高度落下，打击动物脊髓背侧，造成不同程度的损 伤。经典的WD法开创了制作脊髓损伤动物模型之先河，可以通过选择重物下落不同高度， 或改变重物质量调节撞击力大小，或限定不同脊髓节段的撞击，从而复制出不同程度、不同 类型的脊髓损伤动物模型。研究表明，WD法复制的脊髓损伤动物模型与人类脊髓损伤均属 于一定力量撞击后造成脊髓水肿、缺血，并继发一系列损伤反应，该模型与人类脊髓损伤的 性质非常相近，是目前为止与人类脊髓损伤相关性较好的一种。WD法最显著的特点就是能 够在相当程度上模拟人类脊髓损伤的受力过程，致伤的部位、范围可以人为控制。该方法保 持了硬脊膜完整，可有效地防止外源性成分侵入脊髓损伤区域，并防止脊髓外露与脑脊液 外漏。 但WD法仍然存在着诸如外力作用不恒定、脊髓损伤不对称、范围不恒定等缺陷。 在重物打击的瞬间，脊柱脊髓的偏移也常常会造成损伤区域与程度的不一致性，并且同样 的势能由于作用于脊髓的面积差异，也会造成损伤情况相差很大。此外，WD法仅模拟了致 伤时的最初打击状态，忽略了持续性的挤压作用，而人类急性脊髓损伤往往因脊柱骨折存 在着持续性的挤压作用。因此，需要对WD法进一步改良。
发明内容
本发明的目的是提供一种标准化脊髓损伤动物模型的造模方法，以该方法造模的 动物模型损伤程度可调控，且重复性好。
本发明的标准化脊髓损伤动物模型的造模方法具体为 1)固定实验动物的四肢、头部和尾部，手术显露实验动物的脊柱部分； 2)在准备损伤的部位放置与脊髓外形相应的垫片； 3)垫片的上方垂直固定一根中空的冲击通道； 4)将一个恰能在冲击通道内自由滑动的标准重量的冲击杆置于冲击通道内，从规 定的高度自由落下，撞击在实验动物脊柱背侧的垫片上； 5)及时移走冲击杆或将冲击杆留置规定长的时间，造成一定程度的脊髓背侧损伤 动物模型。 上述方法中，垫片的大小，冲击杆的重量、落下高度以及冲击杆压迫时间均为定
量，并可以根据实验动物的不同或需要的损伤程度进行调整。 其中，冲击通道出口距离垫片的距离为0. 5 50mm。 为了方便落下高度的定量，可以在冲击通道上设有高度标尺。 本发明的标准化脊髓损伤动物模型造模方法是对传统制备脊髓背侧损伤模型方 法的改进和完善，其优点和创新在于 1 、在固定实验动物四肢的同时，还将实验动物的头部和尾部固定，从而将实验动 物活动对模型稳定性的影响降低到最低程度，保证每次击打位置最大程度的一致性；
2、在实验动物脊髓上增加使用了垫片，并统一垫片的质量和面积，保证每次击打 脊髓所受外力均匀分布于同样大小的致伤脊髓节段，范围恒定； 3、在实验动物脊髓上使用的垫片可以根据制备损伤模型的具体情况，选择不同质 地的垫片，使其存在不同程度的缓冲，以模拟现实中不同厚度软组织的缓冲；
4、在实验方法中使用了中空的垂直冲击通道，冲击杆在下落过程中只能沿着规定 的方向下落，不会出现击打位置的偏离； 5、将击打用的重锤改为具有一定长度的冲击杆，由于有冲击通道固定，下落后可 以保持下落位置，不会向侧方倒落，造成其他部位的不必要损伤； 6、使用垂直冲击通道和冲击杆，可以使冲击杆在脊髓垫片上保持恒定不动，规定 具体时间就可以完成标准化压迫过程，模拟骨折后对脊髓的压迫； 7、统一了冲击杆的质量和下落高度，使冲击速度和势能得到了统一；统一了垫片 的质地和面积，以及冲击杆的局部压迫时间，使外力作用统一恒定，从而使模型标准化。
因此，与以往常用的脊髓损伤模型制备方法比较，本发明最突出的特点是实现了 实验方法的标准化，有很好的重复性，并能模拟外伤缓冲和压迫等情况，更接近于人类脊髓 损伤情况。
具体实施例方式
1、实验动物造模 雄性SD大鼠，体重263. 00± 17. 32g，随机分成假手术组和实验组，大鼠用10%水
4合氯醛腹腔麻醉，俯卧固定，在固定动物四肢的同时，还将动物的头部和尾部均固定。行T12 椎板切除术，切口以T12为中心，长约3cm，切开皮肤和肌肉，显露Tll 13棘突和椎板，咬 除T12棘突和椎板。假手术组在上述操作完成后，缝合肌肉和皮肤。实验组以脊髓为中心 显露大小为3X4mm的打击区，将中空的垂直冲击通道移至显露的脊髓暴露部位，利用冲击 杆先行定位，并在该部位放置垫片，通过定位使冲击杆能够在落下后准确击中暴露好脊髓 上方的垫片上。按不同高度、不同重量打击暴露的脊髓部位，并使冲击杆落下后留置不同时 间。完成实验后缝合手术切口。 根据高度、重量、压迫时间、垫片质地将实验组大鼠再分成若干组，观察其运动功
能和脊髓组织学变化。 2、结果 2. 1动物基本情况观察 在实验打击后可见大鼠的双后肢抽动、甩尾，随后完全松弛。大鼠造模麻醉苏醒 后，出现双后肢不能自主活动，并明显尿潴留，肌张力降低，显示造模成功。术后3d内，大鼠 活动较少，饮食少，体重有所减轻，此后饮食逐渐恢复正常，体质量增加，活动增多。经过人 工按摩膀胱，5 7天后所有大鼠能够基本恢复自主排尿。有部分大鼠术后3天内出现血 尿，经及时按压排空膀胱后，多数尿色转为正常，但有少数大鼠血尿死亡。所有大鼠切口干 燥，未见感染。由于更换垫料及时，SD大鼠的后肢未见褥疮现象。实验过程中，对照组有l 只、实验组有2只大鼠因麻醉意外死亡。
2. 2运动功能测定 1)后肢运动评分标准(采用改良的Tarlov评分) 0分完全瘫痪，针剌时下肢无反应；l分完全瘫痪，针剌时下肢有反应，但肢体不 能活动；2分肢体可活动，但不能站立或站立不稳(< 5秒)；3分可站立，但无法行走；4 分可行走数步，但不稳定；5分能缓慢行走，但不灵活，存在一定缺陷；6分正常行走。
2)评估四肢肌力标准(采用斜板实验) 斜板由两块矩形的合金板通过铰链相连而成，一块作底板，另一块为移动板，表面
铺约6mm厚的橡胶垫。将大鼠头朝前，身体纵轴与斜板纵轴垂直放置，板从水平位置(0度)
起逐渐增大移动板与水平底板间的角度，当大鼠刚好能在板上停留5s时，记录角度。每只
大鼠测3次，取平均值。 3)运动功能测定结果 ①同等质量冲击杆，随着冲击杆落下高度的增加，大鼠后肢运动评分逐渐下降，斜 面临界角逐渐下降，显示大鼠四肢肌力降低。 ②冲击杆落下高度相同时，随着冲击杆质量的增加，大鼠后肢运动功能和斜面临 界角逐渐下降。 ③增加冲击杆落下高度和冲击杆质量，模型大鼠的脊髓损伤程度加重，其后肢运 动功能和斜面临界角下降。 ④同等质量冲击杆，冲击杆落下高度也相同时，随着冲击杆落下压迫时间的延长， 大鼠后肢运动评分呈下降趋势，斜面临界角也变小。 ⑤脊髓损伤后，大鼠的脊髓具有一定的自修复功能，损伤程度轻的在伤后2周左 右，部分大鼠的运动功能和斜面临界角可基本上恢复到损伤前水平，提示脊髓的自修复功能与脊髓的损伤程度有一定的关系。
2. 3组织学观察
1)标本制备 每组各取大鼠3只，于SCI 12小时后，以10%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉后仰卧固 定，剪开胸腔，暴露心脏，自左心室通过静脉导管快速灌注生理盐水冲洗血管，待右心耳留 出液体基本无色，随即用冷的4X多聚甲醛固定液灌注，先快后慢，30min后取出脊髓组织， 取损伤节段和相邻节段长约8mm的脊髓，4t:下移入4%多聚甲醛固定6h，依次移入20%和 30%的蔗糖溶液中直至沉底，然后常规脱水，石蜡包埋，水平面连续切片，厚5 ii m， HE染色， 光镜下观察。 2)脊髓切片光镜观察结果 ①假手术组脊髓灰、白质结构清晰、正常，灰质可见较多大而多角的神经元，细胞 核圆而大、染色浅、核仁清晰，白质神经纤维排列紧密； ②同等质量冲击杆，随着冲击杆落下高度的增加，模型大鼠脊髓结构破坏程度加 重；冲击杆落下高度相同时，随着冲击杆质量的增加，模型大鼠脊髓结构破坏程度加重；
③增加冲击杆落下高度和冲击杆质量，模型大鼠脊髓结构破坏程度加重；
④同等质量冲击杆，冲击杆落下高度也相同时，随着冲击杆落下压迫时间的延长， 模型大鼠的脊髓结构破坏程度加重； ⑤在较高高度和较大冲击杆质量情况下，厚软质地的垫片制造的脊髓损伤大鼠模
型较硬质垫片制造的脊髓损伤大鼠模型脊髓结构破坏程度略轻，在冲击高度和冲击杆质量
较小的情况下，两者差异不明显； ⑥脊髓损伤组织学表现(由轻到重) 中央管依稀可见，灰质内有出血灶，但坏死面积较小，灰质内有残存的神经元，白 质神经纤维水肿——脊髓灰、白质正常结构和中央管消失，灰、白质斑片状出血，神经元肿 胀、坏死，神经纤维水肿，部分结构模糊不清——脊髓结构破坏消失，灰、白质大片出血坏 死，神经元几乎全部消失，胶质细胞坏死，白质坏死崩解，细胞稀少，呈"一片荒凉"景象。
运动功能和组织学观察均证实可根据实际需要调节击打高度、冲击杆重量、冲击 杆落下压迫时间来控制脊髓损伤的程度，使之达到客观量化的目的。 通过实验我们也发现，使用垫片后，制备的脊髓损伤动物模型从运动功能评价和
组织学观察方面，其模型重复程度都优于未使用垫片制备的脊髓损伤动物模型。 因此，本发明标准化脊髓损伤动物模型的造模方法作为脊髓分级损伤的模型，整
个操作技术简便，重复性较好，对于分析脊髓分级损伤的组织形态学变化、病理机制以及探
讨相应的治疗措施，观察治疗结果或比较不同的实验结果都有十分重要的意义。
权利要求
标准化脊髓损伤动物模型的造模方法，包括以下步骤1)固定实验动物的四肢、头部和尾部，手术显露实验动物的脊柱部分；2)在准备损伤的部位放置与脊髓外形相应的垫片；3)垫片的上方垂直固定一根中空的冲击通道；4)将一个恰能在冲击通道内自由滑动的标准重量的冲击杆置于冲击通道内，从规定的高度自由落下，撞击在实验动物脊柱背侧的垫片上；5)及时移走冲击杆或将冲击杆留置规定长的时间，造成一定程度的脊髓背侧损伤动物模型。
2. 根据权利要求1所述的标准化脊髓损伤动物模型的造模方法，其特征是冲击通道出 口距离垫片的距离为0. 5 50mm。
3. 根据权利要求1所述的标准化脊髓损伤动物模型的造模方法，其特征是在冲击通道 上设有高度标尺。
全文摘要
标准化脊髓损伤动物模型的造模方法，是固定实验动物的四肢、头部和尾部，手术显露实验动物的脊柱部分，在准备损伤的部位放置与脊髓外形相应的垫片，垫片的上方垂直固定一根中空的冲击通道。将一个恰能在冲击通道内自由滑动的标准重量的冲击杆置于冲击通道内，从规定的高度自由落下，撞击在实验动物脊柱背侧的垫片上，及时移走冲击杆或将冲击杆留置规定长的时间，造成一定程度的脊髓背侧损伤动物模型。与以往常用的脊髓损伤模型制备方法比较，本发明最突出的特点是实现了实验方法的标准化，造模的动物模型损伤程度可调控，有很好的重复性，并能模拟外伤缓冲和压迫等情况，更接近于人类脊髓损伤情况。
文档编号A61B19/00GK101756752SQ20101003335
公开日2010年6月30日 申请日期2010年1月8日 优先权日2010年1月8日
发明者刘强, 双卫兵 申请人:山西医科大学