专利名称：基于端粒酶显像的肿瘤诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明生物试剂技术领域，具体是以采用放射性标记的端粒抑素来对肿瘤进行“像，从而进行肿瘤的早期诊断。技术背景肿瘤的早期发现，早期治疗，可降低筛查人群癌症死亡率，改善预后，提高生活质量，减少放化疗药物的使用率，降低治疗费用。然而肿瘤的早期诊断一直是一个没有攻克的难题，因而发现合适的肿瘤标志和合理选择与应用肿瘤标志达到筛查和早期诊断目的，是当前的首要任务。常用的筛查方法有子宫颈癌的巴氏涂片，结直肠癌的隐血试验，前列腺癌的肛指检查食道癌的拉网等，但这些检查均不理想。计算机断层扫描、超声诊断、乳房摄影等检测的K小极限为lcm(109细胞)直径的肿瘤。从理论上讲，肿瘤标志较敏感，当肿瘤当细胞数达到108时，就可采用免疫法、多重聚合酶链反应、芯片等技术检测到蛋白、酶、癌基因等生化变化。临床证实，甲胎蛋白阳性比物理检查早出现9个月。而肿瘤标有须定位、可以定量、无创、能动态监测、易普及和推广等优点，可作为首选的初筛方法。端粒是真核细胞染色体末端的特殊DNA-蛋白质结构，其DNA的特殊是含有大量的(TTAGGG)n串联重复并富含G的重复序列，这些序列在进化中高度保守。端粒结构功能主要有2个一是可保护染色体基因组免受被降解或有害重组，其二是端粒重复可为染色体末端提供一种可消耗的非编码序列以暂时缓冲或取消末端复制问题所带来的染色体DNA 进行性缩短。大多数普通体细胞的端粒会随周期性复制而逐渐缩短，最终达到一个使染色体完整性丧失的临界点，细胞增殖停止。说明端粒的缩短与高等真核生物中正常体细胞增生受到限制相关，在细胞衰老中扮演“分裂钟”的作用。与体细胞不同，生殖细胞要为将来产生新的有机体而保存基因组的全部信息。为此它们必须解决端粒缩短所引起的不良后果，方法是在染色体末端补充新的端粒重复序列。端粒酶就是行使这种功能的DNA聚合酶，它是由RNA、蛋白质构成的核酸蛋白，可在体内以酶结构中的RNA成份(与端粒重复序列互补)为模板，在染色体末端催化添加TTAGGG重复序列。在生殖细胞中由于有端粒酶表达，其端粒不随年龄增长而缩短，故生殖细胞为永生细胞。由于端粒缩短和端粒酶无活性，体细胞通常逐渐衰老死亡。仅有极少数细胞偶然通过激活端粒酶而逃避程序性老化，其生存延长可能给另外的基因损伤的积累提供机会， 导致进行性肿瘤性发展[2]。在大多数癌细胞系和肿瘤细胞中端粒酶均有高水平表达[3]。 表明端粒酶的激活表达与细胞的无限增殖有密切关系，通过解除细胞衰老过程中的增生受限，端粒酶的束新活化可能是体细胞向肿瘤转化的关键步骤。一些正常需要更新的组织表达低水平的端粒酶，其作用仅是部分补偿末端复制问题造成的端粒进行性缩短。已发现有端粒酶表达的正常组织有外周血淋巴细胞、造血干细胞、生殖细胞、胚胎体细胞、毛发、皮肤、子宫内膜等分裂旺盛的组织。正常外周血单个核细胞表达端粒酶的水平仅为无限增殖的癌细胞的 2%。Hiyama等发现正常的肠道粘膜有端粒酶活性，他认为这种酶表达起源于肠道基底干细胞，但其水平比癌性粘膜低10倍 100倍。尽管造血祖细胞和激活的淋巴细胞表达很强的端粒酶活性，但端粒仍然逐渐缩短， 提示在这些细胞是以一种与端粒长度无关的方式上调酶活性。由于组织样品通常是不同类型细胞的混合物，其中可能含有表达端粒酶的正常细胞，如果不了解由正常细胞产生的背景表达水平，就有可能将正常细胞的表达误判为肿瘤细胞的表达。研究表明，大多数肿瘤组织细胞均有较高水平的端粒酶表达。而且在一些前侵袭性病变(如发育异常、原位癌)端粒酶表达的频率很高，表明端粒酶激活是癌症多步骤形成过程中的早期事件。常见恶性肿瘤端粒酶表达情形见附表。癌组织端粒酶表达有以下特点O癌组织表达阳性率很高，除少数肿瘤外，阳性率均在80%以上。而癌旁组织和正常相应组织阳性率低于10%，为低水平表达。总体上，端粒酶表达与临床特征无明显关系， 但与临床病理学特征有一定联系。一些研究表明端粒酶活性反映了细胞的恶变程度。例如 SCLC的恶性程度高于NSCLC，故端粒酶的检出率和活性均高于NSCLC[7]。胃癌中端粒酶阳性肿瘤恶性程度较高。前列腺癌组织中端粒酶活性相对水平与病理分化有关，高水平端粒酶活性在分化差的前列腺癌中更常见。在一些前侵袭性病变中端粒酶表达水平增加，如结肠肿瘤、口腔原位癌和发育异常病灶约半数表现端粒酶活性，尽管前侵袭病变并非都进展为癌，但其中端粒酶表达阳性者似乎可列为密切监控的对象。本发明是采用能靶向肿瘤细胞中高表达的端粒酶(tolemerase)的端粒抑素来进行肿瘤早期检测的目的。将端粒抑素采用锝标记后，能高灵敏度诊断体内端粒酶高表达区域，从而显示肿瘤的早期发生部位。
发明内容
本发明公开了以核素标记的端粒抑素作为肿瘤诊断方法。该方法具体如下端粒抑素采用锝标记后，进行纯化；纯化后锝标记端粒抑素静脉注射，能显像肿瘤的出现部位。本发明通过以下途径实现1、室温下取含氯化亚锡(SnC12) lmg,滴加2mL 99mTc-F洗脱液(比活度为5mci/ mL)和2mL浓度为ImM的端粒抑素，充分振摇lmin，静置15min。采用硅胶G薄层板，展开剂为正丁醇-冰醋酸_水G 1 1)，展开后测端粒抑素的标记率为99. 78%。2、标记后的端粒抑素采用色谱进行纯化。锝标记后的端粒抑素分子量较大，出峰时间晚于i标记的端粒抑素约lmin。3、稀释锝标记后的端粒抑素至InM。下面结合实施例对本发明进行进一步说明实施例1皮下肿瘤对锝标记后的端粒抑素的吸收取裸鼠10只，皮下接种IOf5Hela细胞，自然生长一周后，取2uL InM的锝标记后的端粒抑素注射至裸鼠尾静脉中。注射后监测菏瘤区域肿瘤细胞对锝标记后的端粒抑素的吸收。结果显示，注射一小时后，瘤区能探测到锝的趋向，在4小时达到最大。M小时后没有衰减，而在肝脏、脾脏、肺部等组织中，没有探测到锝的存在。表明锝标记后的端粒抑素能很好的进行肿瘤显像。实施例2肺原位肿瘤对锝标记后的端粒抑素的吸收取小鼠10只，尾静脉接种IO6小鼠Lewis肺癌细胞，自然生长一周后，取2uL InM 的锝标记后的端粒抑素注射至裸鼠尾静脉中。注射后监测肺部区域肿瘤细胞对锝标记后的端粒抑素的吸收。结果显示，注射0.6小时后，肺部能探测到锝的趋向，在4小时达到最大。 72小时后没有衰减，而在肝脏、脾脏、肾脏等组织中，没有探测到锝的存在。表明锝标记后的端粒抑素能很好的进行肿瘤显像。
权利要求
1.一种基于放射性同位素锝标记的肿瘤诊断试剂盒，其特征在于以锝标记的端粒抑素进行显像。
2.端粒抑素的标记方法为室温下取含氯化亚锡(SnCU)lmg，滴加2mL 99mTc-F洗脱液(比活度为5mci/mL)和2mL浓度为ImM的端粒抑素，充分振摇lmin，静置15min。
全文摘要
本发明公开了基于端粒酶成像来检测肿瘤细胞的方法。该方法具体如下室温下取含氯化亚锡(SnCl2)1mg，滴加2ml 99mTc-F洗脱液(比活度为5mci/mL)和2ml浓度为1mM的端粒抑素，充分振摇1min，静置15min。标记后的端粒抑素采用色谱进行纯化。稀释锝标记后的端粒抑素，注射至动物体内可对肿瘤区域进行显像。
文档编号A61K51/08GK102188725SQ20101012147
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月11日 优先权日2010年3月11日
发明者吴锦昌, 周俊东, 张舒羽 申请人:苏州百润生物科技有限公司