专利名称：大鼠附睾特异抗菌肽β-防御素15及其用途的制作方法
技术领域：
本申请涉及附睾特异抗菌肽β -防御素15(defenSin)及其用途。
背景技术：
附睾是连接睾丸和输精管的高度卷曲的管道，是精子成熟、保护、运输和储存的场所，在雄性哺乳动物生殖生育中起着重要作用。附睾从形态上大致分为四个区段起始区 (Initial segment)、头部(Caput)、体部(Corpus)和尾部(Cauda)。从睾丸曲细精管释放的精子在功能上是不成熟的，需要在附睾中经历一系列复杂的结构与功能变化后获得运动力和潜在的受精能力达到成熟[1-4]，这些变化主要来源于精子与附睾管腔液的相互作用。 附睾管腔内膜上皮细胞能分泌多种蛋白，其中一些能掺入或结合到精子膜表面对其进行修饰加工，这些分子的识别有助于更好的了解精子成熟过程。此外，不同区域的附睾上皮还分泌多种免疫分子[5-11]，这样就形成了一个不断变化的免疫微环境，为精子提供防御，保护其免受病原微生物的入侵。抗微生物多肽和蛋白质是真核生物自身防御的重要组成部分。哺乳动物中抗微生物多肽种类主要有defensins和cathelicidins[12]。其中defensins家族根据二硫键的连接方式和每对二硫键间的氨基酸数目的不同可以分为α-defensin、β-defensin和 θ -defensin三个亚家族[13]。β -defensins是进化中的古老分子[14]，在机体抗微生物感染的细胞和组织中大量表达，具有广谱的抗菌作用，能够对抗的微生物包括革命兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌，真菌以及病毒等[15，16]。关于β -defensin的杀菌机制有两种假说 一是defensin单体组装成多聚体在微生物质膜上形成孔道；二是defensin通过静电作用与双层膜极化的基团结合而破坏膜结构[16，17]。根据defensin motif的特征和6个半胱氨酸的配对特征，通过全基因组的同源搜寻，找到了大量的哺乳动物β-defensin基因家族，其中包括39个人β-defensins，43个大鼠β-defensins和52个小鼠β-defensins。这些物种的β-defensin基因都紧密的聚集在4-5个不同的染色体区段[18，19]。此外，一个有趣的发现是这些β-defensin基因在雄性生殖系统中显著表达[18]，表明其可能在防止生殖系统的细菌感染和炎症，以及性传播疾病方面有重要的作用。进一步的研究表明附睾β-defensin家族蛋白不仅在宿主生殖系统免疫防御方面起作用，而且还涉及精子成熟和受精过程。Binlb是大鼠附睾头部特异表达的 β-defensin，在人中有同源基因[7]。它结合在精子头部区域，可以通过激活精子L型Ca2+ 通道来促使未成熟精子获得运动能力[20]。另一个附睾特异的β-defensin基因短尾猿猴DEFB126/ESP13.2可以结合在整个精子表面直至精子获能[21]，在雌性生殖道中保护精子免受抗精子抗体的识别和结合[22]。此外，DEFBU6参与调控精子与卵泡期输卵管上皮的结合，并作为一个去获能因子在精卵结合前离开精子，以保证受精过程的正常发生[23， 24] ο目前，附睾中特异表达的β-defensins作为一个独立的群体正在受到越来越多的关注。在附睾上皮中也分布着一些广泛表达的β-defensins，如果只是起天然免疫作用的话，为什么还要存在附睾专一的β-defensins ？为什么它们在附睾中的表达还存在高度的区域和细胞特异性？本发明人推测附睾组织特异表达的β-defensins可能具有较为专一的抗菌谱，防止生殖系统的感染和性传播疾病。此外除了免疫防御外它们还可能在维持正常的生殖过程中发挥着一定作用，如参与精子的成熟、保护等，目前已证明涉及这一过程的β-defensins还很少。因此，新的与精子成熟过程相关的β-defensin分子的识别是人们的研究方向，可以为男性不育症的个性化诊断、治疗和新型男性避孕药物的开发以及抗生殖道感染药物的研究提供新的靶点和线索。
发明内容
本申请提供一种大鼠Defbl5基因或其同源基因、或所述Defbl5基因或其同源基因编码的氨基酸序列在制备用于调控雄性生育能力用的药物中的用途。在一个具体实施方式
中，所述药物用于调控精子运动成熟。在一个具体实施方式
中，所述同源基因选自人DEFB106B和小鼠Defbl5。本申请提供大鼠Defbl5基因或其同源基因、或所述Defbl5基因或其同源基因编码的氨基酸序列的用途，其特征在于，用于开发雄性避孕药。在一个具体实施方式
中，所述同源基因选自人DEFB106B和小鼠Defbl5。本申请提供一种大鼠Defbl5基因或其同源基因、或所述Defbl5基因或其同源基因编码的氨基酸序列在制备诊断和治疗雄性不育症及抗生殖道感染用的药物中的用途。在一个具体实施方式
中，所述同源基因选自人DEFB106B和小鼠Defbl5。在一个具体实施方式
中，所述感染由大肠杆菌、葡萄球菌和/或真菌引起。本申请提供一种药物组合物，该药物组合物含有大鼠Defbl5基因或其同源基因、 或所述Defbl5基因或其同源基因编码的氨基酸序列，或者含有所述大鼠Defbl5基因或其同源基因、或所述Defbl5基因或其同源基因编码的氨基酸序列的抑制剂。在一个具体实施方式
中，所述抑制剂选自所述基因的SiRNA或所述蛋白的抗体。在一个具体实施方式
中，所述siRNA如SEQ ID N0:11或12所示。本申请还提供一种诊断试剂盒，该试剂盒含有检测哺乳动物，例如人，附睾中 Defbl5基因或其同源基因、或所述Defbl5基因或其同源基因编码的氨基酸序列的表达情况的探针、引物或其它各种试剂。
图1显示大鼠Defbl5基因结构及氨基酸序列比对。A.大鼠Defbl5基因结构示意图。大鼠染色体长臂16ql2.5区是β-defensin基因富集的区域，Defbl5基因就处于期间， 包含两个外显子和一个内含子。基因的位置信息是通过NCBI网站上的Rattusnorvegicus MapViewer获得。B.大鼠Defbl5和其同源基因人DEFB106、小鼠Defbl5以及其它大鼠 β -defensins的氨基酸序列比对结果。图2显示大鼠Defb 15mRNA的表达及调控。A. Defb 15mRNA的组织分布检测。 B. real-time PCR检测Defbl5mRNA在大鼠发育过程中的表达情况。C.阉割及补充雄激素后大鼠附睾Defbl5mRNA的表达变化与血清中睾酮含量(nmol/L)的变化趋势。箭头表示补充雄激素时间。GAPDH和β -actin分别作为RNA和蛋白检测的内参。图3显示Defbl5蛋白在大鼠附睾中的定位。A.制备的Defbl5多克隆抗体的灵敏度和特异性检测。B. western blot检测Defbl5蛋白的组织分布情况，蛋白上样量30 μ g。 GAPDH和β-actin作为内参。C.免疫组化检测Defbl5蛋白在附睾中的定位。Bar = 4mm。 D.不同区域的C图高倍显示。Bar = 50 μ m。Ε. westernblot检测Defbl5蛋白与附睾不同区域精子的结合情况，蛋白上样量20 μ g。β-actin作为内参。F.间接免疫荧光检测Defbl5 蛋白与附睾不同区域精子的结合情况。Bar= 10 μ m。G.间接免疫荧光检测Defbl5与大鼠精子顶体marker IectinPNA在附睾头部区域精子上的共定位情况。Bar = 5 μ m。图4显示Defbl5抗体体外处理对附睾头部精子运动的影响。Α.附睾头部精子与不同稀释度的Defbl5抗体、免疫前血清和另一个无关基因Glbll4抗体共培养lh、2h、;3h后， 精子运动活力的检测。B. western blot检测共培养池后的精子样品中Defbl5蛋白的结合情况。β-actin作为内参。C.间接免疫荧光检测共培养池后的精子样品中Defbl5蛋白的结合情况。Bar = IOym0图5显示体内下调大鼠附睾Defbl5表达。A.细胞水平检测筛选的两个 Defbl5siRNA片断的抑制效果。B.体内下调Defbl5表达后，real-time PCR和western blot检测Defbl5mRNA和蛋白的抑制效果。C，D. Defbl5下调后，western blot和间接免疫荧光检测Defbl5的精子结合情况。E，F. Defbl5下调后附睾头部、尾部精子的运动活力的变化情况。G. western blot检测Defbl5下调后附睾尾部精子蛋白的酪氨酸磷酸化情况。 β -actin作为蛋白样品检测的内参。实验组和对照组大鼠个数为20-22。**，P < 0. 01 ；
氺氺*，P < 0. 001。图6显示Defbl5表达下调对雄鼠生育能力的影响。A.交配的雄鼠中Defbl5下调效果检测。每组实验大鼠数目14-16，**，P < 0.01 ;***，P < 0.001。B.交配实验后，实验组和对照组的胚胎及子代数目。插入的短线表示平均值。图7显示β-defensins活性蛋白的表达及抗菌活力检测。A.重组表达纯化的Defbl5、Binlb、Defbl4和DEFB106蛋白的检测。蛋白上样量3_5yg。B.重组表达的 β-defensins蛋白圆二色性分析。失活的Defbl5蛋白作为阴性对照。C_E.重组表达的 β-defensins抗大肠杆菌(C)抗金黄葡萄球菌(D)抗白色念珠球菌(E)活力比较。F.不同 PH条件下Defbl5蛋白抗金黄葡萄球菌和白色念珠球菌活力。抗菌实验结果均重复三次。图8显示Defbl5表达下调后，大鼠附睾头部其它β-defensins表达变化情况。 A. real-time PCR检测大鼠附睾头部β-defensins表达情况。实验大鼠数目6。B. Defb 15 表达下调后，western blot检测Binlb蛋白的精子结合情况。实验大鼠数目为5，P > 0. 05。
具体实施例方式本申请提供大鼠Defbl5基因或其同源基因、或所述Defbl5基因或其同源基因编码的氨基酸序列在制备用于调控雄性生育能力用的药物、开发雄性避孕药、制备诊断和治疗雄性不育症及抗生殖道感染用的药物中的用途。可从Genebank获得大鼠Defbl5基因的核苷酸序列(ΝΜ_001037520)及其氨基酸序列(ΝΡ_001032609. 1)。本文中同源基因指种间同源基因，不同物种中起源于一个共同的祖先基因的一些同源基因，这些基因通常保持相同的或相似的功能。根据NCBI网站BLAST的结果，大鼠 Defbl5 的同源基因包括人 DEFB106B(NP_0010;35794. 1)和小鼠 Defbl5 (NP_631968. 1)。
或者，可以“同源性”来定义本申请的同源基因。“同源性”指两条多核苷酸或两条多肽部分之间的相似性百分数。两条DNA或两条多肽序列在确定的分子长度内，当序列显示有至少约50%，优选至少约为75%、更佳至少约为80-85%、尤其佳至少约为90%、最佳至少约为95-98%序列相似性时，彼此“基本上同源”。如本文所述，基本同源也指与特定的 DNA或多肽序列完全相同的序列。 本文中，“调控雄性生育能力，，包括调控哺乳动物例如人等雄性的生育能力。调控包括提高或抑制生育能力。例如，对于不育症患者，可上调所述雄性Defbl5基因或其同源基因的表达，或者给予本申请的Defbl5基因或其同源基因、或者所述基因的编码序列，从而促进该雄性精子运动成熟，提高其生育能力。所述上调可包括给予所述基因或编码序列的激动剂。反之，对于避孕目的，可下调所述基因的表达，例如可对所述基因实施操作，降低其编码蛋白的表达，或者可给予所述基因的表达抑制剂或蛋白的抑制剂(例如抗体)等等。因此，本申请也包括一种调控雄性生育能力的方法，该方法包括上调或下调该雄性Defbl5基因或其同源基因的表达。本申请中，雄性不育症可由精子运动能力不足导致。在一个具体实施例中，所述雄性不育症指男性不育症。本申请也包括一种治疗雄性不育症的方法，该方法包括调控该雄性Defbl5基因或其同源基因的表达，或者给予该雄性Defbl5或其同源基因、或者所述Defbl5或其同源基因的编码序列。在一个具体实施方式
中，给予该雄性本申请的用于治疗雄性不育症的药物组合物。本申请也包括一种诊断雄性不育症的方法，该方法包括检测该雄性的Defbl5或其同源基因的表达，和/或检测该雄性的Defbl5或其同源基因编码的蛋白的表达。在一个实施例中，该方法还包括将所得检测结果与对照进行比较，如其表达量与对照相比低，则可确定该对象可能患有不育症。在一个具体实施方式
中，使用本申请的诊断试剂盒进行上述诊断。因此，本申请还包括一种诊断试剂盒，该试剂盒含有检测Defbl5或其同源基因的表达和/或该雄性的Defbl5或其同源基因编码的蛋白的表达用的试剂。所述试剂例如各种探针、引物、和/或进行PCR所需的缓冲液、酶等。所述试剂盒还可含有指导技术人员使用该试剂盒进行诊断的说明书。所述探针、引物或进行PCR所需的缓冲液、酶等可如本申请具体实施例所公开。本申请也包括一种抗雄性哺乳动物生殖道感染的方法，该方法包括提高该雄性 Defbl5或其同源基因的表达和/或该雄性的Defbl5或其同源基因编码的蛋白的表达。在一个实施例中，通过给予本申请的药物组合物来提高所述表达。生殖道感染最常见的病原菌为大肠杆菌、葡萄球菌以及各种真菌(以白色念珠菌为主)。本申请中分别用了这三种病原菌检测了防御素的抗菌活力。本申请也包括一种给雄性哺乳动物避孕的方法，该方法包括降低该雄性Defbl5 或其同源基因的表达和/或该雄性的Defbl5或其同源基因编码的蛋白的表达。在一个实施例中，通过给予本申请的含有所述抑制剂的药物组合物来降低所述表达。
本申请还包括一种药物组合物，该组合物含有有效量的大鼠Defbl5基因或其同源基因、或所述Defbl5基因或其同源基因编码的氨基酸序列，或者含有所述大鼠Defbl5基因或其同源基因、或所述Defbl5基因或其同源基因编码的氨基酸序列的抑制剂。该组合物还可含有药学上可接受的载体或赋形剂。药物组合物中所含有的基因、氨基酸序列、激动剂或抑制剂的量足以抑制或提高精子的运动能力。所述量或有效量可由本领域技术人员采用常规技术手段加以确定。所述抑制剂可选自Defbl5基因或其同源基因的特异性siRNA或Defbl5蛋白或Defbl5基因的同源基因编码的蛋白的特异性抗体等。所述siRNA可包括SEQ ID N0:11和SEQ ID NO 12 所示的siRNA。下文将以具体实施例的方式对本申请进行详细说明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的而非限制性的。除非另有说明，文中所使用的试剂、其用量单位均为本领域常规的试剂及用量单位。一.材料和方法实验动物健康Spague Dawley大鼠(雄性350g ；雌性220g)和新西兰大白兔购自中科院上海实验动物中心。实验前在动物房喂养7-10天，自由进食和水。RNA 抽提及 RT-PCR组织总RNA 的制备是用 Trizol (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA)试剂，根据说明书抽提。Iyg大鼠附睾组织总RNA用ReverTra Ace-α - (Toyobo)按照说明书进行逆转录反应。PCR扩增Defbl5cDNA，扩增条件为94°C 5分钟；94°C 30秒，53°C 30秒，72°C 40秒， 30个循环；72°C 10分钟。扩增引物为F，5，-ATGGACACCGTGCTGACC-3，(SEQ ID NO 1)；R，5，-TCATCCCCGAGTCCTGTTG-3，(SEQ ID NO :2)。扩增产物进行T-A 克隆(Promega pGEM-T Easy Vector Systems)，4°C连接过夜， 转化，小抽，酶切鉴定。阳性克隆送生工公司测序。鉴定用引物及内参引物序列为Defbl5，F :5，-CATTTTTCGATGAGAAGTGCAGCAG-3，(SEQ ID NO 3),R5' -AACTCGTCGCCCTTGTCCCT-3，(SEQ ID NO 4)；GAPDH，F :5，-TACAAGGAGTAAGAAACCGTGGAC-3，(SEQ ID NO 5),R5' -GTTATTATGGGGTCTGGGATGG-3，(SEQ ID NO 6)；扩增条件为94°C 5分钟；94°C 15秒，60°C 15秒，72°C 20秒，30个循环；72°C 10分钟。大鼠阉割实验和雄激素补充实验120天以上的雄性大鼠在戊巴比妥钠(50mg/kg体重)麻醉下进行的。共分为七个实验组，分别为阉割O天(C0,4只)，1天(Cl，4只)3天(C3，4只)，5天(C5，5只)，7天 (C7 7只)，7天后补加雄激素，延长到1天(C7+l，7只)，3天(C7+3，5只)，5天(C7+5，4 只)，7天(C7+7，4只)。注射剂量为每公斤体重3毫克睾酮，阉割第7天开始每两天注射一次，在设定的时间点取血清并处死大鼠分离组织，液氮速冻后放于-70°C冰箱。每个时间点大鼠血清中睾酮的含量在复旦大学附属中山医院检验科测定。
Defb 15多克隆抗体制备根据之前文献报道的双拷贝蛋白表达方法制备抗原[26]。两个Defbl5片断被扩增并分别插入到PGEM-T easy (Promega)载体中，相关引物分别为P1, 5‘ CATATGTTTTTCGATGAGAAGTG-3‘ (NdeI) (SEQ ID NO 7)；P2，5，-GGATCCTTTTTCGATGAGAAGTGC-3’ (BamHI)(SEQ ID NO 8)；P3，5，-AGATCTTCCCCGAGTCCTGTTG-3’ (BglII) (SEQ ID NO 9)；P4，5，-AAGCTTTCATCCCCGAGTCCTG-3’ (HindIII)(SEQ ID NO :10)。通过连接Ncol/Bglll酶切得到的小片断和NcoI/BamHI酶切得到的大片断，构建含有双拷贝Defbl5的质粒，将双拷贝片断插入pET48(a) (Novagen)载体的NdeI-HindIII 酶切位点间。用 Novagen pET Expression Systems kit (Invitrogen)进行蛋白表达和纯化。采用之前的免疫方法制备多抗血清[27]，抗体亲和纯化[28]后放于-80°C冰箱中备用。Western免疫印迹分析组织蛋白抽提物按照文献方法制备[29]。15%的SDS-PAGE胶分离蛋白样品，半干转印到 PVDF 膜(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) Defbl5 兔多抗 1 10000 作为一抗4度过夜，HRP偶联的羊抗兔二抗(Calbiochem) 1 10000室温1小时，ECL PLUS显色液 (GE Healthcare)显色5分钟。压片冲洗。免疫组化分析组织切片的制备以及免疫组化染色按照文献[29]报道的方法进行。羊血清封闭液(10%羊血清在PBS中)封闭30分钟以上。一抗1 2004°C结合过夜，生物素偶联的羊抗兔二抗(Sigma，USA) 1 500稀释室温1小时，然后用ABC试剂盒(华美公司)反应(A 与 B 分别 1 200 稀释)，DAB 显色液(0. 05M Tris-HCl pH7. 410ml,DAB 5g,0. 01% H2O2) M 色，然后流水冲洗终止反应。切片再用苏木精染核，梯度脱水，中性树胶封片，在01ympUS52 显微镜下观察，拍照。相连切片用免疫前血清做一抗用于负对照。间接免疫荧光方法参照[29]。10%羊血清室温封闭lh，一抗1 400稀释)，4°C过夜。PBST (PBS 加0. 1 %的Tween-20)洗3次，每次5分钟。分别加FITC标记的羊抗兔IgG的荧光二抗 (Sigma，USA)l 500 稀释。PI 染核 5 分钟(Sigma，USA) 1 5000 稀释。用 80%的甘油封片。用Olympus BX-52显微镜观察，拍照。RNAi靶点的选择和载体的构建目前选择RNAi作用靶点的经验规则主要是GC含量介于30% -52%之间；在第 15-19位有3个以上AU碱基对；9-14位的碱基配对较弱；整体的熔解温度较低(一般低于 20°C，越低则形成链内重复配对的可能也就越低)；正义链的第3位和第19位最好为A、第 10位最好为U、第13位不要出现G、第19位不要是G或C ；靶位点尽量处于靶基因mRNA高级结构上的非配对区域；该段序列不要在其它基因序列中出现(一般不要有15个以上的相同核苷酸)；采用基于载体的RNAi (主要指以RNA聚合酶III的启动子驱动，如U6启动子、Hl启动子等)时还需要注意避免序列中出现连续4个以上的A或T，这会导致转录半途终止。本发明人采用了慢病毒介导的RNAi，载体为pRNAin-Hl/Lenti vector (海基生物， #K0087)。选择的靶点和设计的模版如下
1.位于 Defbl5 全长序列 124 位5，-AATGGGAGATGCACAGAATCT-3，(SEQ ID NO 11)2.位于 Defbl5 全长序列 2 位5，-AAGGGCGACGAGTTGGATGAA-3，(SEQ ID NO 12)3.对照组针对绿色荧光蛋白EGFP有效的RNAi靶点，位于106-127处5，-GGCGATGCCACCTACGGCAAG-3，(SEQ ID NO 13)针对这些位点设计的模板分别为1.正链5' -GATCCTGGGAGATGCACAGAATCTTTCCACCAGATTCTGTGCATCTCCCATTTTTTC -3' (SEQ ID NO: 14)负链5‘ -TCGAGAAAAAATGGGAGATGCACAGAATCTGGTGGAAAGATTCTGTGCATCTCCCAG-3 ‘(SEQ ID NO: 15)2.正链5’ -GATCCGGGCGACGAGTTGGATGAATTCCACCTTCATCCAACTCGTCGCCCTTTTTTC-3，(SEQ ID NO 16)负链5‘ -TCGAGAAAAAAGGGCGACGAGTTGGATGAAGGTGGAATTCATCCAACTCGTCGCCCG-3 ‘(SEQ ID NO: 17)3.正链5' -GATCCGGCGATGCCACCTACGGCAAGTTCAAGAGACTTGCCGTAGGTGGCATCGCCT TTTTTC-3‘ (SEQ ID NO: 18)负链5'-TCGAGAAAAAAGGCGATGCCACCTACGGCAAGTCTCTTGAACTTGCCGTAGGTGGCATCG CCG-3‘ (SEQ ID NO: 19)上述模板正负链分别用水溶解后配成200 μ mol/L储液，分别取10 μ L加入180 μ L 去离子水中，混勻，于95°C水浴保温5分钟，移入70°C水浴保温1小时，然后自然冷却至室温以使正负链退火形成双链。pRNAin-Hl/Lenti载体用BamHI和XhoI进行双酶切后，与上述模板退火双链进行连接，转化Ecoli. DH5 α菌株，提取质粒，酶切鉴定筛选，最后进行测
序鉴定。Lentivirus 的制备Lentivirus在细胞中包被产生。制备方法为10yg pRNAin-Hl/Lenti载体、9μ g pCMV-VSV-G 载体(Addgene,#8454)和 6μ g pCMV-dR Δ 8. 2 载体(Addgene, #8455) 混合，用磷酸钙法转染培养于IOcm培养皿的细胞，其中pCMV-VSV-G为包膜质粒，其转录表达后形成病毒包膜蛋白，pCMV-dRA8. 2为包装质粒，其转录表达后形成病毒衣壳结构蛋白及酶蛋白。转染M小时后，换新鲜的培养基。培养到转染后60小时，收集培养液，于 2，500rpm离心，上清液用0. 45 μ m孔径的滤器MlLLEX-HV(Millipore)过滤去除细胞及其它碎片。收集的病毒液通过超速离心进行浓缩，具体步骤如下先将病毒液于4°C、50，OOOXg 离心90分钟，弃上清；用小体积的TBS缓冲液重悬病毒颗粒再次以50，OOOXg于4°C离心 90分钟，弃上清，用小体积的无菌生理盐水(内含polybrene, Sigma)重悬病毒颗粒，-80°C保存。病毒滴度的测定方法如下将四31~细胞以每孔IO5个细胞的密度接种到六孔细胞培养板(CORNING)中，用DMEM培养基(含10%胎牛血清)将病毒液进行梯度稀释，加入到每孔细胞中。48小时后，用0.25% Trypsin-EDTA将孔中的细胞消化成单细胞。由于病毒基因组中带有绿色荧光蛋白的基因，因此可以通过用流式细胞仪检测带绿色荧光的细胞的百分比来计算病毒的滴度病毒滴度={F - C0/V} · ，其中，F是代表带绿色荧光的细胞的百分比；CO是代表起始接种的细胞的总数；V是代表病毒液的体积；D是代表病毒液的稀释倍数。大鼠附睾内的RNAi选用3月龄的雄性SD大鼠，按照每公斤体重注射40mg的量腹腔注射戊巴比妥钠 2%,w/v)进行麻醉。待大鼠麻醉后，用酒精棉将阴囊部位消毒。用眼科剪于两侧阴囊中上侧剪开表层皮肤，用镊子钝性分离表皮与内部结构，在附睾头部处剪开精索筋膜和睾丸鞘膜，暴露出附睾头部及起始部位，用50 μ L微量注射器将25 μ L病毒液缓慢注射到附睾头部中段区域。缝合睾丸鞘膜、精索筋膜及皮肤。精子运动能力检测将大鼠附睾头部、尾部剪下，分别放入Iml大鼠精子培养液中，轻缓交错剪几下， 孵育5分钟使精子游出。调整至每毫升IX IO6个精子。用CASA(T0XIV0S，Hamilton Thorne Research)检测精子的运动性能。交配实验根据之前文献报道的方法进行Defbl5表达下调的雄鼠生育能力检测[30]。术后 7天的雄鼠与正常雌鼠交配，阴道涂片检测是否交配成功。检测雌鼠子代数目和18天胚胎数目，并观察表型。重组 β -defensins 表达按照文献报道的intein表达纯化系统重组表达β -defensins活性蛋白[31]。将预测的β -defensins成熟区段插入pTWim质粒(NEB)的NcolAhoI酶切位点间。引物序列如下Defb 15 F 5' -GACCATGGACTTTTTCGATGAGAAG-3’ (NcoI)，(SEQ ID NO 20)R5' -ATCCTCGAGTCATCCCCGAGT-3’ (XhoI) ； (SEQ ID NO 21)rBD14 F:5，-GACCATGGACACATTCATCCCAA-3’ (NcoI)(SEQ ID NO 22)R5' -ATCCTCGAGCTACTTCTTCTTTCTG-3，(XhoI) (SEQ ID NO 23)hBD6 F:5，-GCGCCATGGACTTTTTTGATGAGAA-3’ (NcoI)(SEQ ID NO 24)R5' -GGCCTCGAGTTAATCTATAATGCTC-3’ (XhoI) (SEQ ID NO 25)重组蛋白的表达、纯化及检测根据之前的文献进行[32]。蛋白诱导表达条件选择 0. 5mM IPTG, 22°C 6h。最佳剪切 pH 选择 5. O。圆二色谱分析重组蛋白的二级结构，JascoJ-715spectropolarimeter (Tokyo, Japan)。Imm石英杯，记录范围190_250nm，扫描速度100nm/min，温度25°C，连续扫描三次， 取平均值。抗菌活力检测根据之前的文献进行[32]。E.coli K12D31 在含 50ug/ml 链霉素(Sti^ptomycin) 的 LB 肉汤，金黄色葡糖球菌 Staphylococcus aureuCMCC26003)在 Mueller-Hinton 肉汤(牛肉膏300.(^，水解酪蛋白17.58，淀粉1.58，蒸馏水仏)中37°C培养。白色念珠菌 (Candida albicans SC5314)在YPD培养基(酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1L)中30°C培养。对数生长晚期的细菌用冰冷的IOmM磷酸钠缓冲液或IOmM Tris-HClpH7. 4洗涤并重悬。测量细菌悬液的0D600nm，根据公式0D600nmX2. 5X108CFU/ml计算菌液浓度。分别用上述磷酸盐缓冲液稀释菌液至4X 106CFU/ML和4X 105CFU/ML，取50 μ 1菌液与50 μ 1稀释在上述PH值的磷酸盐缓冲液中的多肽孵育，梯度稀释，取100 μ 1涂平板培养 M小时，手工计数菌落数。存活率计算公式存活％= (β-defensins处理后存活克隆数/ 对照处理后存活克隆数)X 100。二.实验数据1.大鼠Defbl5基因结构及氨基酸序列比对大鼠Defbl5基因位于染色体16ql2. 5区，基因长度为2. 641Λ，含有两个外显子和一个内含子，符合典型的β-defensin家族基因结构特征。大鼠Defbl5基因上游分布有Defbl3、Defbl2，下游还分布有Defbll、Defb9等β-defensin家族基因，这也体现了 β -defensin家基因成簇分布的特征(图1A)。大鼠Defbl5基因的开放阅读框编码一个由 276个氨基酸残基组成的蛋白质，预测其N端的32个氨基酸残基为信号肽。完整蛋白质(含信号肽)的分子量理论上为10. 3KDa，等电点为5. M，去掉信号肽的成熟蛋白质为6. 7KDa, 等电点为5. 21。大鼠Defbl5含有β-defensin家族高度保守的6个半胱氨酸残基。氨基酸序列比对结果表明大鼠Defbl5蛋白与人DEFB106和小鼠Defbl5的相似性较高，分别为 75%和81%，而与其它β-defensin家族基因相似性较低，只有6个半胱氨酸高度保守(图 1B)。2.大鼠Defbl5mRNA的表达及调控抽取大鼠16个组织的RNA(脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、肌肉、睾丸、附睾头、附
睾体、附睾尾、输精管、前列腺、精囊腺)，Real-time PCR检测Defbl5的表达水平，结果显示 Defbl5在附睾头部显著表达，在精囊腺和附睾尾部有微弱表达(图2A)。附睾中的基因在发育过程中往往呈现出时间特异性的表达模式，因此本发明人检验了 Defbl5在大鼠发育过程中的表达情况。本发明人用real-time PCR对不同发育时期的大鼠附睾中Defbl5的表达进行了检测，结果显示，在出生2周以内的大鼠附睾内未检测到Defbl5的表达，出生后第15天的大鼠附睾中开始检测到Defbl5的表达，到第30天 Defbl5mRNA的表达水平达到一个小高峰，从45天到120天Defbl5的表达水平维持在一个恒定的水平，此后Defbl5的表达维持在较高的水平，到M个月(老年)达到最高峰(图 2B)。这与文献报道的β-defensin家族基因多在老年鼠中高表达的结论吻合，可能与其在天然免疫过程中的作用相关。精子成熟是一个雄激素依赖性的过程，为检测是否Defbl5基因的表达也受到雄激素的调控，本发明人抽提阉割的、阉割后每两天给予雄激素补充的不同时间点大鼠附睾的总RNA，real-time PCR检测Defbl5表达变化情况，同时测定每组动物的血清中睾酮浓度。结果显示，阉割后血清睾酮迅速降低，Defbl5基因的mRNA表达水平先下降后上升；阉割第7天后开始补充雄激素，血清中睾酮水平迅速升高，此时附睾中Defbl5基因mRNA表达水平也逐渐上升，这表明Defbl5在体内是受雄激素调控的(图2C)。3.大鼠Defbl5蛋白在附睾中的定位首先本发明人制备了大鼠Defbl5的多克隆抗体，Western Blot检测抗体的灵敏度和特异性。结果表明Defbl5抗血清在1 10000稀释度下能够检测到的抗原下限为 0.5ng(图3A)。由于附睾中β-defensin成员众多且分子量小保守性高，因而容易发生交叉反应。本发明人用表达得到的大鼠和小鼠β-defensin蛋白Defbl，Binlb, Defb42, Defbl5, Defbl4, mDefbl5, mDefb30 通过 western blot 检测了 Defbl5 的抗体特异性。结果表明Defbl5的抗体除识别Defbl5和其在小鼠中的同源基因mDefbl5外，与其它检测的 β-defensin蛋白无交叉反应(图3A)。由于Defbl5和mDefbl5氨基酸序列有80%是相同的，抗原决定簇基本相同，因此可以解释Defbl5的抗体识别mDefbl5。用Defbl5的多克隆抗体对大鼠11个组织的蛋白抽提物进行western blot分析 (心、肝、脾、肺、肾、小肠、睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾、输精管)，只在附睾头部组织中检测到目的条带，大小为7KD左右，与预测成熟肽结果吻合(Defbl5为6. 7KD)，在睾丸等其他蛋白样品中未检测到相同大小的条带，进一步确认了 Defbl5表达的附睾特异性(图:3B)。 用Defbl5的抗体分别对大鼠附睾组织切片进行免疫组化染色，发现Defbl5在附睾起始区基本没有染色信号，其信号主要集中在头部，开始是在细胞中并且信号集中在细胞靠近管腔的一侧，然后管腔中信号逐渐增强，这与其分泌特性也一致。免疫前血清染色未得到信号 (图3C，D)。Defbl5在附睾中的分布，对于mRNA水平和蛋白水平是完全吻合的。从前面免疫组化的结果中可以观察到附睾管腔中的精子团中有Defbl5信号，这提示着Defbl5可能与精子结合，参与精子的附睾成熟过程。提取附睾不同区段的精子，抽取精子总蛋白质，用Western Blot检测是否有Defbl5存在。结果显示，附睾头部的精子中检测到Defbl5的存在，这表明Defbl5从附睾头部的上皮细胞合成并分泌到管腔中后能与精子结合(图3E)。通过间接免疫荧光法进一步证实了 Defbl5结合在附睾头部精子表面 (图3F)，为了对其结合位点进行精确定位，本发明人用大鼠精子顶体Marker lectin PNA 与Defbl5进行免疫荧光共定位检测，结果显示Defbl5蛋白质结合头部精子的顶体区域 (图 3G)。4. Defb 15抗体能够体外抑制附睾头部精子运动既然Defbl5蛋白能够结合附睾头部的精子，本发明人想了解Defbl5在精子成熟过程中是否发挥一定作用。本发明人体外培养大鼠附睾头部精子，加入Defbl5抗体共孵育，免疫前血清和另一个附睾头部表达的基因Glbll4的抗体作对照。由于精子运动力的获得是精子成熟的重要指标，而附睾头部对其运动成熟发挥重要作用，因此本发明人检测了共培养不同时间的精子的运动力。CASA检测结果表明Defbl5抗体使精子的运动力显著下降，并且这种抑制效果是剂量依赖性的，而与对照组共培养的精子运动力并没有明显变化 (图4A)。为了检测与Defbl5抗体共培养后的精子表面是否还有Defbl5蛋白的结合，本发明人抽提了实验组和对照组的精子样品蛋白，western blot结果显示共培养池后精子上没有Defbl5蛋白(图4B)。间接免疫荧光结果也进一步证实了这一结论(图4C)。综合以上结果，当精子上结合的Defbl5蛋白减少时，精子的运动能力下降，因此本发明人推测 Defbl5可以起到维持精子运动的作用。5. Defbl5蛋白在精子成熟过程中起到维持精子运动的作用为了进一步证实体外结果，本发明人尝试用RNAi方法体内下调大鼠Defbl5的表达。由于Defbl5分泌到管腔后即结合到精子上，短期的抑制该基因表达可能只影响少量的精子，这些精子的表型变化难于被检测到，基于病毒载体的RNAi则能维持较长的作用时间，因此本发明人选择慢病毒介导的RNAi来下调大鼠Defbl5的表达。利用软件预测，本发明人设计了 2个RNAi作用靶点，在PCl细胞系中对这些位点进行了筛选，结果显示，针对124-144,226-246 (15sil和15sU)两处位点的载体在细胞内特异性下调Defbl5mRNA的效果最好，抑制效率达到80% -90%,Defbl5蛋白质的表达水平也明显下调(图5A)。包装好的病毒局部注射进附睾头部，其中左侧附睾为实验组注射Defbl5特异的SiRNAS(15Sil和 15si2)，右侧附睾为对照组注射EGFP特异的siRNA (Csil和Csi2)。注射病毒为2 X IO6TU/ ml,30y L·检测体内Defbl5mRNA和蛋白的抑制效果达到50%-60% (图5B)，附睾头部精子结合的Defbl5蛋白也明显减少(图5C，D)。本发明人检测了 Defbl5下调后附睾头部尾部精子的运动情况，结果表面精子的运动力和前向运动百分数显著降低(图5E，F)，证明了 Defbl5蛋白确实起到维持精子运动特别是前向运动力的作用。此外，除了运动能力，潜在的受精能力也是精子成熟的一个基本方面，而精子表面蛋白的酪氨酸磷酸化水平是精子获能的重要指标。本发明人检测了 Defbl5下调后附睾尾部精子蛋白的酪氨酸磷酸化情况， Western blot结果表明实验组与对照组并没有明显差别(图5G)，推测Defbl5蛋白可能并不影响精子获能。6. Defbl5表达下调的雄鼠生育能力显著降低既然Defbl5下调后，附睾头部尾部精子的运动能力明显降低，那么这种变化对精子的影响究竟有多大？本发明人检测了雄鼠的生育能力。注射siRNA的雄鼠七天后与正常雌鼠进行交配，本发明人分别检测了 18天的胚胎及子代的情况。结果表明与对照组(两侧附睾均注射EGFP siRNA)相比，实验组(两侧附睾均注射Defbl5siRNAs)的胚胎及子代数目均显著减少(图6B)，这表明Defbl5表达下调引起的精子运动力降低对雄鼠的生育能力有显著影响。7. β-defensins活性蛋白的表达及抗菌活力检测IMPACT -TWIN系统是一新型的蛋白融合表达及纯化系统，表达的目的蛋白与一种蛋白自剪接元件(称为“内含肽”，intein)及几丁质结合蛋白形成融合蛋白，通过利用内含肽的可诱导自我裂解活性，在几丁质层析柱上将目标蛋白释放出来，达到采用一个层析柱进行蛋白分离纯化的方法[32]。本发明人利用此系统重组表达了大鼠附睾不同区域表达的β -defensins，Defbl5、Binlb和Defbl4(图7A)，此外还表达了 Defbl5的人同源基因 DEFB106的蛋白(图7A)，并检测了这些β -defensins重组蛋白抑制革兰氏阴性菌(大肠杆菌)、阳性菌(金黄葡萄球菌)和酵母菌(白色念珠球菌)的能力(图7C-E)。结果表明，这些β-defensins抑制大肠杆菌的能力相似，LD9tl (抑制90%细菌生长的剂量)为10-20 μ M， 而抑制金黄葡萄球菌的能力则互不相同，其中Defbl4抗菌活力最强，LD9tl为5μΜ，Defbl5 和Binlb最大剂量(50 μ M)只能抑制50%金黄葡萄球菌的生长。在对白色念珠球菌抗性检测中，Defbl4和rBinlb能力较强，LD9tl为20 μ Μ，而Defbl5和其同源基因DEFB 106的重组蛋白抗菌活力较弱，LD90为40-50 μ M0三.讨论世界卫生组织调查发现已婚夫妇中不育者占15%，其中男方原因导致的病例占三分之一以上。很多遗传和环境因素都能导致雄性不育[33，34]，如染色体异常、化学药物、辐射、污染等，然而临床资料显示生殖系统感染是引起雄性不育的主要原因[35]。附睾是雄性生殖系统中的一个重要的附属性器官，是精子成熟和储存的场所。在世界范围内5-10%的性活跃人群患有附睾炎，其中20-40%可导致雄性不育症[36]。附睾中的天然免疫系统作为机体的第一道屏障，能够快速识别和抵抗多种病原微生物(细菌、真菌、病毒等)，保护精子避免收到微生物的攻击。本发明人目前的结果表明一些重组表达的附睾β-defensins具有剂量依赖性的抑制大肠杆菌、金黄葡萄球菌和白色念珠球菌活性，其中Defbl4对抗三种微生物的活力最强；Defbl5及其人同源基因DEFB106则显示了相似的抗大肠杆菌和白色念珠球菌活性，而在抑制金黄葡萄球菌上Defbl5的活力较强。以上的抗菌检测是在相同的体外条件下进行的(磷酸盐缓冲液，PH 7. 4)，然而附睾管腔中pH范围从头部到尾部是6. 6-6. 8 [37，38]，那么附睾表达的β-defensins的抗菌活力强弱与这一酸性环境是否相关？本发明人进一步检测了不同PH条件下，重组的Defbl5蛋白抑制金黄葡萄球菌和白色念珠球菌的活力，结果表明Defbl5在pH6. 5-7. 0条件下活性更强(图7F)，这与其在附睾头部表达特性相吻合。 本发明人尝试表达更多的大鼠附睾β-defensins蛋白，在模拟体内环境的条件下进行抗菌活力检测来确证它们在天然免疫过程中的直接作用。精子在通过附睾管的过程中获得运动力和潜在的受精能力。尽管附睾在精子成熟中的重要作用很早已被证实，但是目前仅发现很少的附睾蛋白与这一过程直接相关。本发明人识别了一个新的调控精子运动成熟的分子Defbl5，当体内Defbl5的表达下调后， 精子的前向运动力明显降低。本发明人之前的研究发现另一个大鼠附睾头部特异表达的 β -defensin成员Binlb能够起始精子运动。由于β -defensins之间可能存在相互作用， 为了排除其它家族成员的影响本发明人检测了附睾头部其它11个β -defensins的表达变化情况。结果表明Defbl5下调后这些β-defensins在mRNA水平上没有明显的变化，同时 Binlb蛋白的精子结合模式也没有受到影响(图8)，因此本发明人证明Defbl5确实起到维持精子运动的作用。考虑到Binlb和Defbl5这两个与精子运动相关的分子分别定位在附睾相邻的区域(Binlb在附睾头部中间区域表达；Defbl5在附睾头部远端区域表达)，本发明人推测它们可能接替作用与精子上，Binlb起始精子的运动而Defbl5维持其运动力。此外附睾体部、尾部上皮还可能分泌一些其它的分子继续这一接力作用直至精子完全获得运动能力达到成熟。本发明人的实验数据表明Defbl5蛋白只特异地结合附睾头部的精子，然而 Defbl5表达下调后附睾尾部精子的前向运动力也显著下降。精子的成熟既需要一系列的细胞变化也要保证每一变化的正确发生。Defbl5对附睾头部精子的调控可能是其成熟过程中一个关键步骤，缺少Defbl5蛋白结合的精子发生运动缺陷，并且这一缺陷无法在其后通过附睾体部、尾部管腔的过程中得到修复。运动力保证精子能够进入雌性生殖道并穿过透明带与卵结合，因而可以作为生育能力的一个重要指标。Defbl5下调引起的精子运动力缺陷最终导致雄鼠生育能力明显下降。总之，本发明人的实验结果证实了 Defbl5在调控精子运动成熟及雄性生育力中的重要作用，不仅为解决精子成熟异常所引起的不育症提供了分子基础，有助于改进临床不育的个性化诊断和治疗，也为进一步研究开发男性避孕药物提供作用靶点。此外，附睾表达的β-defensins (例如DefbM)具有显著的抗感染能力，可以在一定程度上缓解由于抗生素滥用导致的抗药性问题，为开发抗生殖道感染的药物提供了新的设计思路。参考文献1. 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权利要求
1.大鼠Defbl5基因或其同源基因、或所述Defbl5基因或其同源基因编码的氨基酸序列在制备用于调控雄性生育能力用的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物用于调控精子运动成熟。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述同源基因选自人DEFB106B和小鼠 Defbl5。
4.大鼠Defbl5基因或其同源基因、或所述Defbl5基因或其同源基因编码的氨基酸序列的用途，其特征在于，用于开发雄性避孕药。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述同源基因选自人DEFB106B和小鼠 Defbl5。
6.大鼠Defbl5基因或其同源基因、或所述Defbl5基因或其同源基因编码的氨基酸序列在制备诊断和治疗雄性不育症及抗生殖道感染用的药物中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述同源基因选自人DEFB106B和小鼠 Defbl5。
8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述感染由大肠杆菌、葡萄球菌和/或真菌引起。
9.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有大鼠Defbl5基因或其同源基因、 或所述Defbl5基因或其同源基因编码的氨基酸序列，或者含有所述大鼠Defbl5基因或其同源基因、或所述Defbl5基因或其同源基因编码的氨基酸序列的抑制剂。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述抑制剂选自所述基因的siRNA 或所述蛋白的抗体。
全文摘要
本申请涉及大鼠附睾特异抗菌肽β-防御素15及其用途。具体而言，本申请涉及大鼠Defb15基因或其同源基因、或所述Defb15基因或其同源基因编码的氨基酸序列在制备用于调控雄性生育能力用的药物中、开发男性避孕药、制备诊断和治疗雄性不育症及抗生殖道感染用的药物中的用途。本申请也涉及含有所述基因或氨基酸序列的药物组合物。
文档编号A61K31/713GK102198264SQ20101012986
公开日2011年9月28日 申请日期2010年3月23日 优先权日2010年3月23日
发明者刁华, 张永莲, 赵越 申请人:中国科学院上海生命科学研究院