一种牛β-防御素5成熟肽的制备方法及其重组菌和应用的制作方法

一种牛β-防御素5成熟肽的制备方法及其重组菌和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及动物医药工程【技术领域】，提供了一种真核表达载体，由含有牛β-防御素5成熟肽基因与真核表达载体pPIC9K构建而成的pPIC9K-mBNBD5，牛β-防御素5成熟肽基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；还提供了一种重组菌株；还提供了一种牛β-防御素5成熟肽的制备方法，包括1)牛β-防御素5成熟肽基因的制备；2)上述真核表达载体的构建；3)上述重组菌株的制备；4)毕赤酵母阳性转化子体外诱导表达。本发明所表达的重组牛嗜中性粒细胞β-防御素5成熟肽具有抗菌活性，且有一定的抗结核活性，适合于在畜牧生产及疾病治疗中使用，而且生产成本低、生产效率高。
【专利说明】一种牛β-防御素5成熟肽的制备方法及其重组菌和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于动物医药工程【技术领域】，具体涉及一种牛β -防御素5成熟肽的制备方法，还涉及一种表达牛β -防御素5成熟肽的重组菌，同时还涉及一种牛β -防御素5成熟肽在畜牧生产和药物治疗中抗菌作用的应用。
【背景技术】
[0002]防御素(defensin)属于内源性抗菌妝(endogenousantibioticpeptidees)家族，具备广谱抗微生物和细胞毒活性，对机体免疫至关重要。1991年，人们在牛气管黏膜上皮细胞中首次发现防御素-2这一阳离子多肽抗生素，命名为TAP(TracheaAntiniobial Peptide),而后在牛的粒细胞中又发现了 13种不同于α -防御素，却与TAP序列高度同源的防御素，故命名为β_防御素。由于β_防御素的结构特点为基因序列中含有两个exon，其中 第二个exon编码成熟的β -防御素，即发挥活性的部分，而且成熟β -防御素中含有6个半胱氨酸，可形成3对二硫键，是β -防御素能够发挥生物活性的必要结构。但是动物体内天然防御素的含量较低，直接提取远不能满足需要，化学合成方法可行但成本太高，因此，通过基因重组技术生产防御素多肽，以满足研究和生产的需要成为一种可倉泛。
[0003]另外，有研究已证实牛巨噬细胞有牛嗜中性粒细胞β -防御素(BNBD) 5的表达，且分支杆菌主要感染巨噬细胞，并在巨噬细胞内生存，因此，我们推测BNBD5可能在对抗分支杆菌感染中发挥着重要的作用，并可作为一种分支杆菌的新型治疗药物而广泛使用，因此基于防御素的这一重要特点，我们进行了一种真核表达牛嗜中性粒细胞β -防御素5成熟肽的生产方法的研究。

【发明内容】

[0004]针对现有技术不足，本发明的目的是提供一种牛β -防御素5成熟肽的制备方法及其重组菌和应用。
[0005]为实现上述目的，本发明提供了一种真核表达载体，由含有牛β -防御素5成熟肽基因与真核表达载体PPIC9K构建而成的pPIC9K-mBNBD5，所述牛β -防御素5成熟肽基因的核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示。
[0006]一种编码牛β -防御素5成熟肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]本发明提供了一种重组菌株，由上述真核表达载体pPIC9K_mBNBD5转化毕赤酵母GSl 15构建制成的重组菌株。
[0008]优选的，所述菌株为毕赤酵母阳性转化子菌株巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris (pPIC9K_mBNBD5),该菌株已于2014年3月20日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC N0.8937。
[0009]本发明提供了一种牛β -防御素5成熟肽的制备方法，包括以下步骤:[0010]I)牛β -防御素5成熟肽基因的制备:根据GenBank上公布的BNBD5的⑶S区域核苷酸序列人工合成mBNBD5基因，并设计PCR引物，
[0011]mBNBD5的上游引物:
[0012]5' ~GCCGAATTCAATCCTCAAAGCTGCCGTT~3/ ；
[0013]mBNBD5的下游引物:
[0014]5' -GCCGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCCACCTCC TGCAGCAT-3'；
[0015]2)上述真核表达载体的构建:双酶切mBNBD5基因和真核表达载体pPIC9K，胶回收mBNBD5基因片段和开环的真核表达载体pPIC9K，16°C连接处理16h，将连接产物转化至大肠杆菌T0P10感受态细胞，即完成重组质粒pPIC9K-mBNBD5的构建；
[0016]3)上述重组菌株的制备:将重组质粒pPIC9K-mBNBD5转化到感受态GSl 15中，筛选阳性转化子，所得阳性克隆即为能够表达mBNBD5的毕赤酵母阳性转化子菌株；
[0017]4)毕赤酵母阳性转化子体外诱导表达。
[0018]优选的，步骤3)中所述 选依次为His+多拷贝转化子的筛选和Mut+转化子的筛选。
[0019]优选的，所述步骤4)包括以下步骤:
[0020]a、挑取PCR鉴定后证实已插入目的片段的His+、Mut+酵母转化子接种至YPD液体培养基中，28°C培养16-18h，离心弃上清；
[0021]b、重悬菌体接种至诱导表达前培养基BMGY中，28°C培养18_24h，至0D600nm达到2-6时离心弃上清；
[0022]C、重悬菌体接种至诱导表达培养基BMMY中，28°C连续培养72h，培养72h后收集表达培养液，离心取上清，进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析，结果显示，与空载体对照相比，含有目的片段的酵母表达上清在7kD处有一特异性条带，说明有目的蛋白表达。
[0023]优选的，诱导表达前培养基BMGY的配方为酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、K2HP043g/L、KH2PO4I1.8g/L、超纯水 800mL/L、10XYNB100mL/L、0.02%生物素的 500XBlmL/L、10% 甘油 100mL/L。
[0024]优选的，诱导表达培养基BMMY的配方为酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、K2HP043g/L、KH2PO4I1.8g/L、超纯水 800mL/L、10XYNB100mL/L、0.02%生物素的 500XBlmL/L、5% 甲醇 100mL/L。
[0025]优选的，所述步骤c中，培养过程中每隔24h补充甲醇使其终浓度为1%。
[0026]本发明提供了一种牛β -防御素5成熟肽在抗微生物感染中的应用。
[0027]本发明的有益效果:对重组牛嗜中性粒细胞β -防御素5成熟肽(mBNBD5)进行体外生产表达研究，仅对牛嗜中性粒细胞β -防御素5具有生物学活性的成熟肽进行表达，同时为了方便纯化，添加了不影响蛋白生物学活性的6-His.tag，从而有利于重组蛋白的纯化，提高重组蛋白产量。毕赤酵母表达系统属于真核表达系统，表达出来的蛋白更接近于天然蛋白，有利于保持重组蛋白的天然结构，对于牛嗜中性粒细胞β_防御素5成熟肽(mBNBD5)有助于3对二硫键的形成，从而保持重组蛋白的活性。活性检测结果发现所表达的重组牛嗜中性粒细胞β-防御素5成熟肽(mBNBD5)具有抗菌活性，且有一定的抗结核活性，适合于在畜牧生产及疾病治疗中使用，而且生产成本低、生产效率高。【专利附图】

【附图说明】
[0028]图1牛β -防御素5成熟肽的PCR结果；
[0029]图2mBNBD5基因的测序比对结果；
[0030]图3重组质粒pPIC9K_mBNBD5构建模式图；
[0031]图4重组菌株基因组PCR鉴定-通用引物鉴定结果，其中，1-2为空质粒对照PPIC9K,3-6 为 pPIC9K-mBNBD5 ；
[0032]图5重组菌株基因组PCR鉴定-mBNBD5特异性引物鉴定结果，其中，1_2为空质粒对照 PPIC9K，3-6 为 pPIC9K-mBNBD5 ；
[0033]图6重组蛋白mBNBD5的鉴定结果:Tricine-SDS_PAGE鉴定结果，其中，1:诱导48h ；2:诱导60h ；3:诱导72h ；4:诱导84h ;方框为最优表达时间(72h)；
[0034]图7重组蛋白mBNBD5的鉴定结果:Western Blotting鉴定结果，I为重组蛋白mBNBD5, 2为空质粒对照pPIC9K表达产物；
[0035]图8重组蛋白mBNBD5对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制效果；
[0036]图9重组蛋白mBNBD5对耻垢分支杆菌的抑制效果；
[0037]图10重组蛋白mBNBD5对牛分枝杆菌的抑制效果。
【具体实施方式】
[0038]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明所使用的限制性内切酶EcoR 1、Not I和Sac I均购自Takara大连宝生物；真核表达载体pPIC9K购自Invitrogen公司；FastPfu DNA聚合酶,T4连接酶等购自北京全式金生物技术有限公司；毕赤酵母宿主菌GS115菌株购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；遗传霉素G418购自北京拜尔迪生物技术有限公司，生产厂家为美国INALCO公司。
[0039]实施例1牛嗜中性粒细胞β -防御素5成熟肽基因的制备
[0040]1、设计人工合成牛嗜中性粒细胞β -防御素5成熟肽(mBNBD5)基因的引物
[0041]根据GenBank上公布的BNBD5的CDS区域核苷酸序列(序列号:AJ278799.1)，以及真核表达载体PPIC9K的酶切位点，上游引物设计在基因起始端，加入了 EcoR I酶切位点(下划线处)，在EcoR I酶切位点前加有3个保护性碱基GCC ;下游引物设计在基因末端，并加入了 Not I酶切位点(下划线处)，同时为了方便以后蛋白纯化，在下游引物C-端终止密码子前加了一个6-His *tag(波浪下划线处)，Not I酶切位点前加有3个保护性碱基GCC,委托Genewiz (金唯智)生物科技有限公司合成,分别为:
[0042]mBNBD5的上游引物:
[0043]5' ~GCCGAATTCAATCCTCAAAGCTGCCGTT~3/ ；
[0044]mBNBD5的下游引物:[0045]5' -GCCGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCCACCTCC TGCAGCAT-3'。
[0046]2、mBNBD5 的 PCR 扩增
[0047]从正常牛肺脏组织提取RNA，反转录后获得cDNA，以此DNA为模板，加入TransStart FastPfu DNA聚合酶、牛嗜中性粒细胞β -防御素5成熟肽(mBNBD5)基因上游引物/下游引物、2.5mM dNTPs进行扩增反应，PCR反应体系为:5 X TransStart FastPfubuffer (10 μ L)，2.5mM dNTPs (5 μ L)，浓度为10 μ M的牛嗜中性粒细胞β _防御素5成熟肽(mBNBD5)基因上游引物和下游引物(各I μ L)，模板为牛肺脏组织cDNA(2 μ L)，高压灭菌ddH20 (30 μ L)，TransStart FastPfu DNA 聚合酶(I μ L)，PCR 反应条件依次为:95°C，lmin;95°C，20sec,62°C，20sec, 72°C，30sec, 35cycles ；72°C，5min。反应完成后即获得牛嗜中性粒细胞β -防御素5成熟肽(mBNBD5)的PCR产物，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，可见一条149bp大小的条带，如图1所示，与预期结果一致。
[0048]实施例2重组质粒pPIC9K_mBNBD5的构建
[0049]将获得的牛嗜中性粒细胞β -防御素5成熟肽(mBNBD5)的PCR产物用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化及回收，回收产物用内切酶EcoR I和Not I进行双酶切处理，胶回收大小约为160bp的条带；以同样的方法对真核表达载体pPIC9K进行双酶切处理，胶回收约为9kb大小的DNA片段，分别取3 μ L双酶切后胶回收的牛嗜中性粒细胞β -防御素5成熟肽(mBNBD5)基因片段和2 μ L双酶切后胶回收的真核表达载体pPIC9K，加入2 μ L的5XT4DNA连接buffer，I μ L的T4DNA连接酶，补充高压灭菌ddH20至10 μ L，在16°C条件下连接处理16h，将连接产物转化至大肠杆菌TOPlO感受态细胞，涂布200 μ L于LB/Amp+固体培养基上，37°C培养14-16h，即完成重组质粒pPIC9K-mBNBD5的构建。LB/Amp+固体培养板上长出的白色菌落即为含有重组质粒pPIC9K-mBNBD5的阳性菌。真核表达载体pPIC9K为Invitrogen公司的产品。
[0050]挑选LB/Amp+固体培养板上长出的白色菌落加入LB/Amp+液体培养基中扩大培养后，送至北京三博远 志公司进行测序，测序结果与GenBank中公布的BNBD5的⑶S区域核苷酸序列完全一致，如图2所示，说明mBNBD5基因序列成功插入质粒内，重组质粒pPIC9K-mBNBD5已经构建成功，如图3所示。
[0051]实施例3毕赤酵母基因工程菌株的制备
[0052]1、重组质粒的制备和线性化
[0053]挑选转化入重组质粒pPIC9K-mBNBD5的TOPlO阳性菌接种于IOOmL的LB/Amp+液体培养基中，37°C培养12-14h，将菌液于4°C，5000rpm离心30min，收集沉淀的菌体，然后用无内毒素质粒DNA抽提试剂盒提取质粒，同时提取了空质粒PPIC9K的质粒DNA用作空白对照。用内切酶Sac I将提取的重组质粒pPIC9K-mBNBD5和空质粒pPIC9K线性化。为了便于电转化，将线性化的重组质粒pPIC9K-mBNBD5和空质粒pPIC9K经酚/氯仿抽提纯化，加入无水乙醇(_20°C预冷)沉淀DNA，将沉淀物自然干燥后，加入高压灭菌ddH20溶解沉淀。
[0054]2、毕赤酵母电转化感受态细胞的制备
[0055]接种纯化后的毕赤酵母宿主菌GS115单菌落至5mL的YPD (含有酵母提取物，IOg/L;蛋白胨，20g/L;10X葡萄糖，100mL/L)液体培养基中，28°C，250rpm条件下过夜培养。然后取0.1mL的过夜培养物，接种于IOOmL新鲜配制的YPD液体培养基(250mL锥形瓶)中，28°C，250rpm条件下过夜培养，使0D600nm值达到1.3-1.5。取该培养液分装入两个无菌的50mL离心管中于4°C，1500g条件下离心5min，弃上清液，扣干离心管壁；依次加入25mL、15mL冰预冷的灭菌水及IOmL冰预冷的IM无菌山梨醇溶液，振荡重悬菌体，4°C，1500g条件下离心5min，弃上清液，吸干管壁残余液体；再次加入5mL冰预冷的IM无菌山梨醇溶液，重悬菌体，40C，1500g条件下离心5min，弃上清液，吸干管壁残余液体；最后将细胞重悬于ImL冰预冷的IM无菌山梨醇溶液中，振荡混匀后终体积达到约1.5mL，此时得到的即为毕赤酵母GSl 15感受态细胞。将制备的感受态细胞按100 μ L/管分装入1.5mL无菌EP管中，-70°C冰冻保存，保存时间不宜超过两周，时间过长转化效率会变低，最好现用现做。
[0056]3、毕赤酵母的电击转化
[0057]电转化前取两管100 μ L新鲜制备的(或者_70°C冰冻保存的)GSl 15感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻，分别与5-20 μ g线性化的质粒(重组质粒pPIC9K-mBNBD5和空质粒PPIC9K)混合，轻弹混匀，尽数吸出转移至0.2cm的电穿孔转化杯(冰上预冷)中，冰浴5-10min，保持低温状态，使用电穿孔仪(BioRad)进行点击转化，电穿孔转化条件为:电压1500V，电阻300 Ω，电容25 μ F，脉冲时间6_7ms，一次电击；电击后，立即往电击杯中加入ImL冰预冷的IM山梨醇溶液，用微量移液枪吹打均匀后，吸出转移至1.5mL灭菌EP管中，放入28°C温箱中静置培养Ih ;此时取出已经在28°C温箱中烘至表面半干的MD培养基平板(含有琼脂粉，15g/L，10XYNB，100mL/L ；500X 生物素，2mL/L ；10X 葡萄糖，100mL/L)，在超净工作台内将转化液按300 μ L/板涂于培养基表面；将涂布好的MD平板置于28°C温箱中正面放置烘至表面半干，然后倒置培养，2天以后观察转化子的生长情况，生长出的单克隆即为含有牛嗜中性粒细胞β -防御素5成熟肽(mBNBD5)的His+重组转化子。
[0058]实施例4含有mBNBD5基因的毕赤酵母阳性转化子的筛选
[0059]1、G418抗性筛选(多拷贝转化子筛选)
[0060]首先配置含有不 同浓度(0.5、l、1.5、2.0、3.0、4.0mg/mL)G418(遗传霉素)的YPD-G418固体培养基平板，然后进行多拷贝转化子筛选，具体步骤如下:
[0061]a:吸取l_2mL灭菌水至含有His+转化子的平板上(即MD平板上)；
[0062]b:用灭菌刮子重悬His+转化子,注意不要划破琼脂板；
[0063]c:将细胞悬液集中转移至灭菌的50mL离心管中，涡旋(5_10s)混匀细胞；
[0064]d:分光光度计测定细胞浓度(10D = 5X107细胞/mL)；
[0065]e:在每块含有不同浓度G418的YPD平板上涂布约IO5个细胞，同时为了确定所得到的多拷贝转化子是否占平板转化子的1-10%，需要涂布不含G418的YPD平板作为对照；
[0066]f:28°C温箱培养平板，每天检查转化子生长情况。其中G418抗性克隆生长较慢，一般5天左右出现，而不含G418的YPD平板上2天就会有克隆出现。在G418抗性YPD平板上生长的单克隆即为His+多拷贝转化子，且G418浓度越高，拷贝数也越多。(注意:如果此步骤中重悬下来的His+转化子还有剩余，可加15%灭菌甘油，存于-70°C，可在以后继续做G418抗性筛选。)
[0067]2、Mut+转化子的筛选
[0068]为了确定His+多拷贝转化子的甲醇诱导型，需进行Mut筛选，具体操作如下:将上一步所得的His+多拷贝转化子(G418抗性YH)板上的单克隆)编号后用灭菌牙签挑取，放入20 μ L灭菌水中混匀，然后以点种方式分别接种于丽平板(含有琼脂粉，15g/L，10XYNB,100mL/L ；500X 生物素，2mL/L ;5% 甲醇，100mL/L)及 MD 平板(含有琼脂粉，15g/L，10XYNB，100mL/L ;500X 生物素，2mL/L ;10X 葡萄糖，100mL/L)上，此时确保先在 MM 平板上点，每个克隆需要换一次牙签，每块平板上点20-30个单克隆，28°C温箱中培养平板2天。两天后，计数平板，并比较单菌落在MM平板及MD平板上的生长情况，其中在MD平板上和MM平板上生长速度一致，大小也一致的单克隆即为Mut+转化子。
[0069]3、毕赤酵母阳性转化子(His+Mut+多拷贝转化子)的PCR鉴定
[0070]抽提含有牛嗜中性粒细胞β -防御素5成熟肽(mBNBD5)的毕赤酵母阳性转化子的基因组，并以其为模板，加入TransStart FastPfu DNA聚合酶、真核表达载体pPIC9K的通用引物5' AOXl和3' A0X1、以及5' AOXl和牛嗜中性粒细胞β -防御素5成熟肽(mBNBD5)基因的下游引物、2.5mM dNTPs进行扩增反应，PCR反应体系为:5XTransStartFastPfu buffer (10 μ L)，2.5mM dNTPs (5 μ L)，浓度为 10 μ M 的真核表达载体 pPIC9K 的通用引物5' AOXl和3' A0X1、牛嗜中性粒细胞β -防御素5成熟肽(mBNBD5)基因下游引物(各I μ L)，模板为毕赤酵母阳性转化子的基因组DNA (2 μ L)，高压灭菌ddH20 (30 μ L)，TransStart FastPfu DNA 聚合酶(I μ L)，PCR 反应条件依次为:95°C，Imin ；95°C,20sec,62°C，20sec, 72°C，30sec, 35cycles ；72°C, 5min。加入真核表达载体 pPIC9K 的通用引物扩增出的PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，可见两条条带(500bp，2Kbp)，且含有重组质粒pPIC9K-mBNBD5的酵母基因组扩增条带大于含有空质粒pPIC9K的酵母基因组扩增条带(图4)，说明插入重组质粒的完整性良好，且重组质粒pPIC9K-mBNBD5已完全导入酵母基因组。加入真核表达载体PPIC9K通用引物的上游引物和牛嗜中性粒细胞β-防御素5成熟肽(mBNBD5)基因的下游引物扩增出的PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，结果发现插入真核表达载体PPIC9K的酵母基因组并未扩增出条带，而插入重组质粒pPIC9K-mBNBD5的酵母基因组却可见一条特异性条带，且大小与预期一致(图5)，说明筛选出的酵母菌株即为毕赤酵母阳性转化子(His +Mut+多拷贝转化子)菌株。
[0071]实施例5含有mBNBD5基因的毕赤酵母阳性转化子的体外诱导表达
[0072]1、阳性酵母转化子的体外诱导表达
[0073]挑取PCR鉴定后证实已插入目的片段的His+Mut+酵母转化子接种至5mL的YPD液体培养基中，28°C培养16-18h，离心弃上清，重悬菌体接种至25mL BMGY诱导表达前培养基中，BMGY 中包含酵母提取物(10g/L)、蛋白胨(20g/L)、K2HPO4(3g/L)、KH2PO4(I1.8g/L)、超纯水(800mL/L)、10XYNB(100mL/L)、500ΧΒ(0.02%生物素)(lmL/L)、10%甘油(IOOmL/L)，28°C培养18-24h，至0D600nm达到2_6时离心弃上清，重悬菌体接种至200mL的BMGY诱导表达培养基中，BMMY中包含酵母提取物(10g/L)、蛋白胨(20g/L)、K2HPO4(3g/L)、KH2PO4 (I 1.8g/L)、超纯水(800mL/L) UO X YNB (100mL/L)、500 X B (0.02% 生物素)(lmL/L)、5%甲醇(100mL/L)，28°C连续培养72h，培养过程中，每隔24h需补充甲醇使其终浓度为1%，培养72h后收集表达培养液，离心取上清，进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析。同时进行空载体PPIC9K阳性酵母转化子的诱导表达，离心收集表达上清做为空白对照。结果显示，与空载体对照相比，含有目的片段的酵母表达上清在7kD处有一特异性条带，说明有目的蛋白表达，如图6所不。
[0074]2、重组蛋白的纯化及鉴定
[0075]重组蛋白通过镍柱(GE)进行纯化，经过双蒸水透析除盐后，真空冷冻干燥浓缩，PBS溶解后进行Western Blotting鉴定,结果发现只有一条单一条带,如图7所示,说明重组蛋白得到表达，即牛嗜中性粒细胞β -防御素5成熟肽蛋白。
[0076]实施例6初步抑菌活性试验
[0077]研究重组牛嗜中性粒细胞β -防御素5成熟肽(mBNBD5)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性，同时以GS115上清液，空质粒诱导表达上清液作为对照，结果发现
0.5 μ g/mL、I μ g/mL和2 μ g/mL的重组牛嗜中性粒细胞β -防御素5成熟肽(mBNBD5)体外诱导表达发酵液对大肠杆菌和葡萄球菌均有较强的抑菌作用，且有剂量依赖性，如图8所示。而对照组则并未观察到抑菌圈，说明抑菌活性主要归功于重组蛋白mBNBD5。
[0078]抗分枝杆菌试验(CFU)研究重组牛嗜中性粒细胞β -防御素5成熟肽(mBNBD5)对耻垢分支杆菌和牛分枝杆菌的抗菌活性，同时以不加蛋白孔作为对照，分别用不同浓度的重组牛嗜中性粒细胞防御素5成熟肽(mBNBD5)与耻垢分支杆菌和牛分枝杆菌共培养，培养3h、6h、9h、12h后涂板检测耻垢分支杆菌的存活情况；培养3h、24h、48h、72h后涂板检测牛分支杆菌的存活情况。结果发现纯化后的重组蛋白mBNBD5对耻垢分支杆菌(图9)和牛分枝杆菌(图10)均有杀菌作用，且有剂量依赖性和时间依赖性。
[0079]虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发 明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种真核表达载体，其特征在于，由含有牛β -防御素5成熟肽基因与真核表达载体PPIC9K构建而成的pPIC9K-mBNBD5，所述牛β -防御素5成熟肽基因的核苷酸序列如SEQID NO:1 所示。
2.—种重组菌株，其特征在于，由权利要求1所述的真核表达载体pPIC9K-mBNBD5转化毕赤酵母GSl 15构建制成的重组菌株。
3.根据权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris，保藏编号为 CGMCC N0.8937。
4.一种牛β-防御素5成熟肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)牛β-防御素5成熟肽基因的制备:根据GenBank上公布的BNBD5的⑶S区域核苷酸序列人工合成mBNBD5基因，并设计PCR引物， mBNBD5的上游引物:
5' -GCCGAATTCAATCCTCAAAGCTGCCGTT-3'； mBNBD5的下游引物:
5' -GCCGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCCACCTCC TGCAGCAT-3'； 2)权利要求1所述的真核表达载体的构建:双酶切mBNBD5基因和真核表达载体PPIC9K，胶回收mBNBD5基因片段和开环的真核表达载体pPIC9K，16°C连接处理16h，将连接产物转化至大肠杆菌TOPlO感受态细胞，即完成重组质粒pPIC9K-mBNBD5的构建； 3)权利要求3所述重组菌株的制备:将重组质粒pPIC9K-mBNBD5转化到感受态GSl15中，筛选阳性转化子，所得阳性克隆即为能够表达mBNBD5的毕赤酵母阳性转化子菌株； 4)毕赤酵母阳性转化子体外诱导表达。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述筛选依次为His+多拷贝转化子的筛选和Mut+转化子的筛选。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)包括以下步骤: a、挑取PCR鉴定后证实已插入目的片段的His+、Mut+酵母转化子接种至YPD液体培养基中，28°C培养16-18h，离心弃上清； b、重悬菌体接种至诱导表达前培养基BMGY中，28°C培养18_24h，至0D600nm达到2_6时离心弃上清； C、重悬菌体接种至诱导表达培养基BMMY中，28°C连续培养72h，培养72h后收集表达培养液，离心取上清，进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析，结果显示，与空载体对照相比，含有目的片段的酵母表达上清在7kD处有一特异性条带，说明有目的蛋白表达。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，诱导表达前培养基BMGY的配方为酵母提取物 10g/L、蛋白胨 20g/L、K2HP043g/L、KH2P04ll.8g/L、超纯水 800mL/L、10 X YNBlOOmL/L、0.02%生物素的 500XBlmL/L、10%甘油 100mL/L。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，诱导表达培养基BMMY的配方为酵母提取物 10g/L、蛋白胨 20g/L、K2HP043g/L、KH2P04lL 8g/L、超纯水 800mL/L、10 X YNB100mL/L、0.02%生物素的 500XBlmL/L、5% 甲醇 100mL/L。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c中，培养过程中每隔24h补充甲醇使其终浓度为I %。
10.一种由权利要求4-9所述制备方法制得的牛β -防御素5成熟肽在抗微生物感染中 的应用。
【文档编号】C12N15/81GK103981209SQ201410168747
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】周向梅, 赵德明, 康静静, 吕悦, 尹晓敏, 杨利峰 申请人:中国农业大学