专利名称：菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因及其重组蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗菌肽，具体涉及一种菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因及其重组蛋白、以及构建方法和应用。
背景技术：
抗菌肽是生物体内存在的一种具有抗菌活性的小分子蛋白，氨基酸数目小于100， 常带正电荷，并具广谱抗菌性的一类小肽，是生物体免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性多肽活性物质，具有广谱抗菌作用，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、 真菌均有抑杀作用，还可以抗原虫、病毒，杀伤动物体内的肿瘤细胞，却不破坏动物体内的正常细胞。抗菌肽抗菌时一般没有特殊受体，直接通过物理作用造成细胞膜的穿孔而达到广谱抗菌的效果，因而不会诱导抗药株的产生，它属于小分子多肽，在动物体内容易降解，并且无毒副作用及药物残留问题，是绿色环保型药物。根据抗菌肽序列、结构和三维构象以及抗菌特性的差异，通常将已发现的抗菌肽分为以下四类(1)不含半胱氨酸的线型α螺旋抗菌肽，如蜂毒肽、蛙皮肽、天蚕抗菌肽等；( 含有二硫键的β折叠结构，如防御素、昆虫防御肽等；(3)由一种或多种氨基酸为主构成的多肽，如富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等；(4)前体蛋白剪切而来的多肽，如淡水螯虾O^cifastacus leniusculus)的血蓝蛋白C-端酶解后可产生具有抗菌活性的多肽。在目前许多病原菌对现有抗生素逐步产生抗药性，而新抗生素的发现极其困难的情况下，抗菌肽为开发新型的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。因此，抗菌肽的研究近年来倍受重视，已经深入到分子结构、作用机制、基因的表达与调控等方面。长期以来，抗菌肽的研究主要集中在昆虫和高等动物上，少数的海洋动物抗菌肽的研究则主要集中于鲎、对虾和几种鱼类上，贝类抗菌肽方面的研究起步则相对较晚。在海洋贝类中，贻贝的抗菌肽研究较为透彻，到目前为止，共发现了十余种富含半胱氨酸的抗菌肽，这些多肽在生理条件下均带正电荷，而且具有典型的双亲性结构。根据其一级结构和二硫键形成的不同形式，贻贝抗菌肽又可分为四种类型贻贝防御素(MGD)、贻贝素 (mytilins)、贻贝肽(myticins)和贻贝霉素(mytimycins)。目前国内外关于菲律宾蛤仔抗菌肽及其抗菌活性的研究较少。赵建民等利用大肠杆菌原核表达系统，体外重组表达菲律宾蛤仔大防御素(VpBD)蛋白，具有广谱的抗革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌。
发明内容
本发明目的在于提供一种菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因及其重组蛋白、以及构建方法和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因所述防御素Defensin B基因为序列表 SEQ ID NO. 1中碱基序列所示。一种菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因重组蛋白所述防御素Defensin B基因重组蛋白为序列表SEQ ID NO. 2中氨基酸序列所示。菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因重组蛋白的应用所述防御素Defensin B基因重组表达产物可制备为抗菌药物、免疫增强剂、饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂。所述防御素Defensin B基因重组表达产物可作为制备革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的抑菌药物。革兰氏阳性菌为巴氏葡萄球菌或金黄色葡萄球菌；革兰氏阴性菌为溶藻弧菌、阴沟肠杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌或副溶血弧菌都。所述防御素 Defensin B基因重组表达产物可作为制备对恶臭假单胞菌或金黄色葡萄球菌的抑菌药物。本发明所具有的优点1.本发明从菲律宾蛤仔中克隆到防御素Defensin B的全长cDNA序列，实现其重组表达并测定其抗菌谱和最小抑菌浓度，为菲律宾蛤仔的病害防治、基因辅助选育及进一步开发为医药产品和保鲜防腐剂奠定基础。2.与现有技术相比，本发明的防御素Defensin B为菲律宾蛤仔抗菌肽，对海洋来源的多种革兰氏阳性和阴性病原微生物均具有很强的抑制活性，具有开发为广谱抗菌类药物、遗传选育和饲料添加剂等方面的应用价值。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。本发明通过PCR技术，扩增编码防御素Defensin B成熟肽的基因片断并将其克隆到pET21(a)表达载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中实现了原核体外重组表达。本发明的菲律宾蛤仔防御素Defensin B cDNA序列克隆及其体外重组表达，包括下列步骤1)菲律宾蛤仔总RNA的提取及mRNA的纯化；2)菲律宾蛤仔cDNA文库构建；3)菲律宾蛤仔cDNA文库EST序列的大规模测定；4)菲律宾蛤仔EST序列的同源性分析及防御素基因片段的筛5)用基因特异性引物 DBF 5 ‘ AAGTGCTTCGGCAAATCCTCAG 3 ‘和 DBR 5' TTCAACACTAGGCCGTCTCC 3'进行3’和5’RACE克隆得到菲律宾蛤仔防御素Defensin B
cDNA全长序列；
6)菲律宾蛤仔防御素Defensin B的体外重组表达及其活性分析。
实施例1
菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因为SEQ ID No. 1中所示的碱基序列。
序列表SEQ ID No. 1为:
cataactgacgagtcaacaagttccaaaaaatgttcgcaaaagcatgctttgttttgttc
tttgtgtgtataatggttggaagtgcttcggcaaatcctcagaagagattaacttgtgag
tttggaggtgtccaggcatgtgccgctcactgtatcctgttaggttacactggtggatgg
tgcgacggtcataactactgtcattgcaagacgagtgggaaaagggaggcggagacggcc
tagtgttgaaatatcaagcagtcctgtatcatagaaatct3.3.3.3. 3. cagaacaaaa
agcattagaa
(a)序列特征
长度333bp (编码区 31_243bp) 类型碱基序列 链型单链 拓扑结构线性(b)分子类型双链DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源菲律宾蛤仔(Venerupis philippinarum)(f)特异性名称cDNA菲律宾蛤仔中克隆到防御素Defensin B的cDNA序列，该序列全长33!3bp，5，非编码区长30bp，3’非编码区长90bp，有多聚腺苷酸尾巴。该基因包括21!3bp的开放阅读框，编码70个氨基酸，其中编码序列的1-21位氨基酸为信号肽序列，成熟肽为49个氨基酸实施例2菲律宾蛤仔防御素Defensin B的制备一、菲律宾蛤仔总RNA的提取及mRNA的纯化用Trizol试剂从感染鳗弧菌的菲律宾蛤仔的血淋巴中提取总RNA，提取方法依^witrogen公司的Trizol试剂说明书进行取菲律宾蛤仔血细胞50ml，2000g离心lOmin，弃上清，向沉淀细胞中加入20ml的 TRIZOL ,用高速分散器将细胞分散，室温下剧烈震荡IOs ；加入氯仿，剧烈震荡30s ； 40C 10，OOOg高速离心IOmin ；吸取上清液于一个新离心管中，加入预冷的等体积异丙醇 (约15ml)，置于-20°C静置1小时以上；4°C 10，OOOg高速离心IOmin ；小心弃去上清液；用 5ml 70%乙醇清洗沉淀；4°C 10，OOOg高速离心lOmin，小心弃去上清液；真空干燥5min，用约600 μ 1无RNA酶水溶解RNA，待完全溶解后储存于_80°C备用。用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化，具体纯化方法依QIAGENE公司的Ol igotex mRNA纯化试剂盒说明书进行包括在37°C水浴加热Oligotex Suspension，震荡混勻，室温放置；70°C水浴加热OEB 缓冲液；向500 μ 1总RNA溶液(RNA含量约为^ig)中加入650 μ Iof OBB缓冲液，135 μ 1 of Oligotex Suspension，650y 1无RNA酶水，70°C加热体系:3min ；取出反应体系后，室温下放置IOmin, 15，OOOg离心2min,小心吸走上清液，用600 μ 1 0W2重悬Oligotex-mRNA沉淀，剧烈震荡。然后将悬浊液移入放在1.5ml离心管中的离心柱内，15，OOOg离心1 min，将离心柱转移到一个新的1. 5ml离心管中，加入600 μ 1 0W2，15，000g离心lmin，将进入离心管的液体丢弃，将离心柱转移到另一新的1. 5ml离心管中；向离心柱中加入50 μ 1已经加热到 70°C 的 OEB buffer,轻轻混勻，15，OOOg 离心 Imin ；向 spin column 再加入 50 μ 1 OEB 缓冲液，混勻后15，OOOg离心Imin ；回收离心管中的mRNA溶液约100 μ 1。二、菲律宾蛤仔cDNA文库构建用Mratagene公司cDNA合成试剂盒将上述mRNA 逆转录并酶切为酶切片段，具体操作依试剂盒说明书进行包括双链cDNA末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切等，用QIAGEN公司QIAEX II胶纯化试剂盒对大于IOObp的酶切片段进行回收，并与hvitrogen公司Uni-ZAP )(R载体连接，得到 cDNA质粒，并用 Mratagene 公司的 ZAP- cDNA Gigapack III Gold Cloning试剂盒对 cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定和噬菌体文库扩增，具体方法参照说明书进行，扩增后的文库加入终浓度为的DMSO溶液，得到cDNA模板溶液，存于_80°C备用。
逆转录方法包括一链cDNA合成在无RNA酶的200μ 1离心管中依次加入5X逆转录酶缓冲液10 μ 1与2. 5mM的dNTP 8. 5 μ 1，然后再加入30 μ 1多聚腺苷酸(poly (A))引物和RNA (5 μ g)，混勻后室温下放置lOmin，向体系中加入1. 5 μ 1的一链合成酶Mratakript RT(50U/l·! 1)，终体积达到50 μ 1，轻轻混勻反应体系，离心数s，42°C温育1小时。二链合成在冰上依次向含有一链cDNA的离心管中加入IOX反应缓冲液10 μ 1，27 μ 1无核酸酶去离子水。然后再向反应体系中加入2μ 1核糖核酸酶H (RNase H) (1. 5U/μ 1)，11 μ 1 DNA 聚合酶I (9. OU/ μ 1)，轻轻混勻反应体系，离心数s，16°C放置2. 5小时后立即将反应体系置于冰上。补平cDNA末端向二链合成体系中加入需用反应物(IOmM dNTP 6μ 1，T4DNA聚合酶2 μ 1与2 μ 1浓度为10mg/ml的BSA)，快速震荡反应体系离心后，于72°C反应30min ；加入200 μ 1酚-氯仿[1 1 (ν/ν)]，震荡混勻体系，室温下高速离心2min，转移上清至新的离心管中；加入等体积的氯仿，震荡混勻，室温下高速离心aiiin，然后转移上清至新管中； 加入下列试剂使cDNA沉淀，并震荡体系20μ 1 3Μ醋酸钠，400 μ 1无水乙醇，_20°C沉淀过夜；4°C高速离心60min，小心弃去上清，保留沉淀；加入500 μ 1的70%乙醇轻轻洗涤沉淀，室温高速离心anin ；轻轻吸去乙醇，在真空离心机中干燥沉淀；用9μ 1含有EcoR I接头的溶液溶解沉淀并于4°C放置至少30min。EcoR I接头的连接向体系中加入下列成分 1 μ 1 IOX连接缓冲液，1 μ 1 IOmM rATP，1 μ 1 T4DNA连接酶GU/ μ 1)，离心后8°C放置过夜；70°C 30min灭活连接酶。磷酸化EcoR I末端离心反应物k，室温放置5min冷却，加入下列反应物用于磷酸化接头1μ 1 IOX连接缓冲液，2μ 1 IOmM rATP，5 μ 1无菌水，2 μ 1 Τ4多聚核苷酸激酶(5U/ μ 1)，37°C温育30min，70°C 30min灭活激酶，离心2s后室温放置 5min冷却。Bio I内切酶酶切向体系中加入下列成分28μ 1 Xho I酶切缓冲液，3 μ 1 Xho Ι(40υ/μ 1)，37°C温育1.5小时，加入125 μ 1的无水乙醇，_20°C放置过夜，4°C离心60min， 弃去上清，完全干燥沉淀，用50 μ 1双蒸水溶解沉淀。溶解后的cDNA溶液用1. 0%的琼脂糖凝胶中进行电泳分离。cDNA片段回收方法从浓度为1. 0%的琼脂糖凝胶上将大于IOObp的cDNA条带切下，将大约250mg的胶块放入1. 5ml离心管中，加入相当于3倍胶块体积的QXl缓冲液充分混勻，而后向含有胶块的QXl缓冲液中加入60 μ 1 QIAEX II，剧烈震荡30s，充分混勻，以 50°C加热lOmin，溶解胶块；每^iin震荡一次，保持溶液始终为黄色；13，OOOrpm离心30s， 小心吸去上清液；用500 μ 1 QXl缓冲液清洗沉淀，重悬沉淀，13，OOOrpm离心30s并小心吸去上清液；用500 μ 1 PE缓冲液清洗沉淀2次，重悬沉淀，13，OOOrpm离心30s，弃上清液，真空干燥15min至沉淀变白，加入20 μ 1 ρΗ8. 5的IOmM Tris-Cl溶液室温下溶解5min。cDNA与载体Uni-ZAP XR(Invetrogen)连接在另一干净的200 μ 1离心管中依次加入下列试剂2. 5μ 1重悬cDNA( > 100ng)，0. 5μ 1 10 X连接缓冲液，0. 5 μ 1 IOmM rATP (ρΗ7· 5)，1· 0 μ 1 Uni-ZAP XR 载体(1 μ g)，0. 5 μ 1 T4DNA 连接酶(4U/ μ 1)。12°C放置过夜。噬菌体文库的包装从-80°C冰箱中取出包装蛋白，迅速用手握住融化，立即加入 4μ 1重组cDNA，用微量移液器吸头混勻体系(不要产生气泡)，离心5s，室温(22°C )温育 2小时，加入500 μ 1的SM缓冲液和20 μ 1氯仿，轻轻混勻反应体系。快速离心数s，沉淀蛋白碎片，转移上清至新管中。包装反应的滴度测定在含有氨苄青霉素的LB固体培养基(1L培养基含有氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂粉15g，pH7. 5)上将菌株XLl-Blue MRF’划线37°C过夜培养；用LB液体培养基(1L培养基含有氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，pH7. 5) 培养单克隆菌落，300C，200rpm摇床培养过夜；4°C，IOOOg下离心IOmin沉淀细菌。用25ml IOmM MgSO4重悬细菌；用IOmM MgSO4重悬XLl-Blue MRF，细胞，使浓度达到OD600 = 0 . 5 ；将包装产物按下列比例与宿主菌混合(1) 1 μ 1包装产物和200 μ 1浓度达到OD6tltl = 0. 5大肠杆菌 XLl-Blue MRF’ (OD600 = 0 . 5) ； (2)0. 1 μ 1 包装产物和 200 μ 1 浓度达到 0D_ = 0. 5 大肠杆菌XLl-Blue MRF，(OD600 = 0 . 5)；将混合体系置于37°C温育15min使噬菌体充分附着在宿主细胞表面；加入3ml融化状态下约48°C的NYZ上层培养基(1升培养基含有氯化钠5g，MgSO4 · 7H20 2g，NZ胺IOg,酵母提取物5g，琼脂糖7g，ρΗ7· 5)；迅速铺在干燥预热过的NYZ琼脂培养基(1L培养基含有氯化钠5g，MgSO4 · 7H20 2g，NZ胺10g，酵母提取物5g， 琼脂粉15g，pH7. 5)上，静置IOmin后，倒置于37°C过夜培养；8小时后可见噬菌斑；分别计数两个平板的噬菌斑数目，计算其滴度(每毫升生长的噬菌斑数目，Pfu/ml)。30°C 200rpm条件下，用LB液体培养基过夜培养大肠杆菌XLl-Blue MRF，细胞 50ml ； IOOOg离心宿主细胞IOmin ；用25ml IOmM MgSO4重悬细胞，测定600纳米可见光下菌液吸光度，然后用IOmM MgSO4将菌液稀释至浓度为OD6tltl = 0. 5 ；将含有大约5X 104pfu噬菌体颗粒的悬浊液与600 μ 1浓度为OD6tltl = 0. 5的大肠杆菌XLl-Blue MRF，细胞混合，置于Falcon 2059聚丙烯管中，37°C温育混合液15min，使噬菌体充分附着在宿主菌表面； 将混合液加入约48°C的6. 5ml液态NZY上层培养基中，混勻后倒入新鲜的150mm NZY琼脂糖培养基平板上，静置平板lOmin，倒转平板置于37°C约8小时(噬菌斑直径不超过2mm)； 在每块平板上倒入大约10ml SM缓冲液(1升缓冲液中含有5. 8g NaCl, 2. Og MgS04 ·7Η20， 50. 0ml IM Tris-HCl [ρΗ7. 5], 5. Oml 2% [w/v]白明胶)，4°C放置过夜；将所有平板上的 SM 缓冲液回收入新的聚丙烯管中，每块平板再用ani SM缓冲液清洗一次并回收上清液；向回收液中加入终浓度为5% (ν/ν)的氯仿，室温下放置15min，混勻，500g离心IOmin去除细胞碎片，将上清液转移至新聚丙烯管中，并重复步骤8、9至上清液澄清，加入终浓度为7% (ν/ ν)的DMS0，储存于-80°C。测定扩增文库滴度(方法同前)。三、菲律宾蛤仔cDNA文库EST序列的大规模测定文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物T3 (AATTAACCCTCACTAAAGGG)在MegaBACElOOO测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件(*. abi，*. abd文件)数据经Phred程序处理转化为序列文件(*. seq)和质量文件(*. seq. qual)，依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于 Q13(准确率大于95% )且长度大于IOObp的序列作为EST数据，具体的操作参照《基因表达序列标签(EST)数据分析手册》(胡松年著，浙江大学出版社，2005年)。四、菲律宾蛤仔EST序列的同源性分析及防御素基因片段的筛选将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons，分别将所获的Contigs与 Singletons在数据库中进行BLASTn和BLASTx分析，具体的操作参照《基因表达序列标签 (EST)数据分析手册》(胡松年著，浙江大学出版社，2005年)。根据相似性分析结果寻找出与防御素基因同源的EST序列。五、菲律宾蛤仔防御素Defensin B cDNA全长序列的克隆根据与防御素基因同源的EST序列设计基因特异性引物DBF 5 ‘ AAGTGCTTCGGCAAATCCTCAG 3 ‘和DBR 5 ‘ TTCAACACTAGGCCGTCTCC 3 ‘，分别利用载体通用引物 T3 (AATTAACCCTCACTAAAGGG)、 T7 (GTAATACGACTCACTATAGGGC)进行3’和5’末端的扩增，PCR产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒(上海中科开瑞生物芯片公司)进行PCR产物的回收和纯化， 再与PMD-18T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，参照《分子克隆第三版》(黄培堂译， 科学出版社，2002年)的方法转化大肠杆菌T0P10F，挑选阳性克隆提取质粒，用载体引物 Ml3-47 (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)和 RV-M (GAGCGGATAACAATTTCACACAGG)进行 PCR 检测， 确认插入片段大小后进行序列测定，测得的序列经CLUSTER分析拼接后得到全长序列。3，RACE的反应体系和反应条件为10XPCR buffer溶液2. 5μ 1、 25mM 的 MgCl2 溶液 1. 0μ 1、2. 5mM 的 dNTP 溶液 2. 0μ 1、10μΜ 的 DBF 弓| 物溶液 (5 ‘ AAGTGCTTCGGCAAATCCTCAG) 1 μ 1、10 μ M 的通用引物 T3 溶液 1 μ 1、浓度为 5U/ μ 1 的 Taq DNA聚合酶0. 2 μ 1，cDNA模板(文库)溶液1 μ 1，用PCR水定容到25 μ 1 ；反应在ABI Veriti PCR仪中进行，反应条件为首先94°C预变性5min，然后进入下列循环94°C变性 30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，共进行；34个循环，最后72°C延伸IOmin ；5，RACE反应体系和反应条件为10XPCR buffer 溶液 2. 5 μ l、25mM 的 MgCl2 溶液 1. 0μ 1、2. 5mM 的 dNTP 溶液 2. 0 μ 1、10 μ M 的 DBR 引物溶液(5 ‘ TTCAACACTAGGCCGTCTCC 3' )1.0μ IUOyM 的通用引物Τ7溶液1 μ 1、浓度为IU/ μ 1的Taq DNA聚合酶0. 2 μ 1所述cDNA模板溶液1 μ 1， 用PCR水定容到25 μ 1，反应在ABI Veriti PCR仪中进行，反应条件为首先94°C预变性 5min,然后进入下列循环94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，共进行；34个循环，最后72°C延伸IOmin ；PCR筛选阳性克隆的反应条件2. 5μ 1 10XPCR缓冲液，1. 0 μ 1 MgCl 2 (2. 5mM)，2· 0 μ 1 dNTP (2. 5mM)，1 μ 1 弓丨物 Μ13-47 (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC) (10 μ Μ)， 1 μ 1 引物 RV-M(GAGCGGATAACAATTTCACACAGG) (10 μ Μ)，16. 3 μ 1 PCR 水，0· 2 μ 1 (IU) Taq 聚合酶(!Iomega)，1 μ 1菌液模板。反应在ABI Veriti PCR仪中进行，反应条件为首先94°C 预变性5min，然后进入下列循环94°C变性25s，60°C退火30s，72°C延伸60s，共进行30个循环，最后72°C延伸IOmin。六、菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因的的体外重组表达PCR扩增反应的正向引物为含有Nde I酶切位点的核苷酸序列5，-CATATGAATCCTCAGAAGAGATTAAC-3，，反向引物为含》ιο I酶切位点和6个His纯化标签的核苷酸序列5’ -CTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGT GGTGGGCCGTCTCCGCCTCCC-3，)；将扩增出的编码防御素Defensin B成熟肽的基因片断纯化回收，导入PMD18-T载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌T0P10F感受态细胞中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nde I和B10 I双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒对酶切产生的目的片段纯化回收，得到编码重组蛋白的抗菌肽重组基因，测序该抗菌肽重组基因，将该抗菌肽重组基因导入经同样双酶切的表达载体pET-21 (a)，得到重组质粒；重组质粒构建具体依《分子克隆第三版》操作方法。扩增反应条件为首先94°C预变性 5min,然后进入下列循环94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共进行30个循环，最后 72°C延伸 IOmin ；将上述重组质粒转入表达宿主菌BL21(DE3)plysS，(购于北京全式金生物技术有限公司)中，筛选阳性重组质粒，测序确认，挑取单克隆重组质粒，将单克隆重组质粒接种于200ml LB液体培养基中，220rpm，37°C培养至OD6tltl = 0. 5-0. 7，加入IPTG，使终浓度达到 0. 6mM,继续培养5h, 4°C，5000rpm,离心IOmin,收集菌液；
对上述菌液超声破碎、离心获得包涵体，并对包涵体进行洗涤、溶解、镍柱亲和层析纯化。最后对重组蛋白进行透析复性得到具有抗菌活性的重组蛋白，即本发明的菲律宾蛤仔防御素Defensin B。在收集的菌体沉淀中，加入适量的菌体裂解液(0. 5M NaCl, IOmM Tris-HCl, 0. 5% Triton X-IOOpH 8.5)重悬沉淀，超声波处理，条件为300W，处理 200次，每次5s，间隔15s ；菌体裂解液在4°C下IOOOOrpm离心20min收集包涵体；包涵体沉淀分别用洗液 I (0. 5M NaCl，IOmM Tris-HCl, 0. 5% Triton X_100，2M 尿素 pH 8. 5)和洗液 11(0. 5M NaCl, IOmM Tris-HCl, 0. 5% Triton X-100，2%脱氧胆酸钠 pH 8.5)洗涤一次后用8M尿素溶液(20mM PBS，0. 5M NaCl，8M尿素，20mM咪唑pH 7.4)溶解；经镍柱亲和层析纯化后的重组蛋白采用逐渐降低尿素浓度的方法进行透析复性，透析缓冲液成分如下 IOOmM Tris-HCl, 50mM NaCl, ImM EDTA，2mM还原型谷胱甘肽，0. 02mM氧化型谷胱甘肽，10% 甘油，甘氨酸，尿素(6M，4M，3M，2M，0M)，pH 8.5。·透析缓冲液依次降低尿素的浓度，每次于4°C透析12小时，最后在TBS缓冲液(50mM Tris-HCl，IOOmM NaCl，pH 8. 5)中透析两次。重组蛋白浓度测定采用碧云天生物公司的BCA法测定蛋白浓度试剂盒(P0012)。具体操作依试剂盒说明书进行根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B配制适量BCA工作液，充分混勻；完全溶解蛋白标准品，取10 μ 1用PBS稀释至100 μ 1，使终浓度为0. 5mg/ml ；将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20 μ 1加到96孔板的标准品孔中，用PBS溶液补足到20 μ 1 ；加适当体积样品到96孔板的样品孔中并用PBS补足到到20 μ 1 ；各孔加入 200 μ 1 BCA工作液，37°C放置30min ；测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。菲律宾蛤仔防御素Defensin B编码蛋白具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，分子量为7511. 74Da，等电点为8. 16，其中编码序列的1_21位为信号肽序列，成熟肽分子量为 5286. 96Da，等电点为7. 79，有4个净正电荷。应用例将上述得到菲律宾蛤仔防御素Defensin B加入试管中制成浓度为0. 46mg/mL 抗菌肽液共9管，分别接种巴氏葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、溶藻弧菌、阴沟肠杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌以及副溶血弧菌各5 μ 1，使每管最终菌液浓度约为 5 X 105CFU/ml，培养M小时后，利用酶标仪测定600nm的光吸收值，确定MIC值，得到如表1 所示的结果，从表1中可以看出，菲律宾蛤仔防御素Defensin B对上述革兰氏阳性菌(巴氏葡萄球菌和金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(溶藻弧菌、阴沟肠杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌、副溶血弧菌)都有效，说明本发明的菲律宾蛤仔防御素Defensin B是一种广谱抗菌肽，且疗效较好。其中巴氏葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌 37°C培养；溶藻弧菌、恶臭假单胞菌以及副溶血弧菌培养。具体步骤调节各菌至OD6tltl为1后，稀释1000倍备用。在96孔板中每孔中加入 100 μ 1 LB液体培养基，再在每一行第一个孔中加入100 μ 1抗菌肽，混勻后从第一个孔中吸出100 μ 1加到第二个空中，混勻后吸出100 μ 1加到第三个孔中，依此类推，第10个孔中吸出的100 μ 1不再加到第11孔中。每行1-11孔中都接种稀释好的相应菌种5 μ 1，第12 孔为只含培养基的对照。培养Mh以上，测定吸光值，并计算相应MIC。最终发现菲律宾蛤仔防御素 Defensin B对以上各种菌都有很强的抑制作用，其中对恶臭假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强，最小抑菌浓度分别为0. 014mg/mL和0. 029mg/mLo表1 菲律宾蛤仔防御素Defensin B抗菌素疗效表
权利要求
1.一种菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因，其特征在于所述防御素Defensin B基因为序列表SEQ ID NO. 1中碱基序列所示。
2.一种菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因重组蛋白，其特征在于所述防御素 Defensin B基因重组蛋白为序列表SEQ ID NO. 2中氨基酸序列所示。
3.—种权利要求1所述的菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因重组蛋白的应用，其特征在于所述防御素Defensin B基因重组表达产物可制备为抗菌药物、免疫增强剂、饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂。
4.权利要求3所述的菲律宾蛤仔防御素DefensinB基因重组蛋白的应用，其特征在于所述防御素Defensin B基因重组表达产物可作为制备革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的抑菌药物。
5.权利要求4所述的菲律宾蛤仔防御素DefensinB基因重组蛋白的应用，其特征在于革兰氏阳性菌为巴氏葡萄球菌或金黄色葡萄球菌；革兰氏阴性菌为溶藻弧菌、阴沟肠杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌或副溶血弧菌都。
6.权利要求5所述的菲律宾蛤仔防御素DefensinB基因重组蛋白的应用，其特征在于所述防御素Defensin B基因重组表达产物可作为制备对恶臭假单胞菌或金黄色葡萄球菌的抑菌药物。
全文摘要
本发明涉及抗菌肽，具体涉及一种菲律宾蛤仔防御素Defensin B基因及其重组蛋白、以及构建方法和应用。所述防御素Defensin B基因为序列表SEQ ID NO.1中碱基序列所示。基因重组蛋白为序列表SEQ ID NO.2中氨基酸序列所示。本发明的防御素Defensin B为菲律宾蛤仔抗菌肽，对海洋来源的多种革兰氏阳性和阴性病原微生物均具有很强的抑制活性，具有开发为广谱抗菌类药物、遗传选育和饲料添加剂等方面的应用价值。
文档编号A61P31/04GK102363784SQ201110321040
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者吴惠丰, 张林宝, 王清, 赵建民 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所