一种蝇防御素突变体及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，还公开了包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌，以及SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列编码的蝇防御素突变体。本发明通过基因工程的方式制备得到了蝇防御素突变体，其抑菌活性好，耐热活性佳，具备抗胰蛋白酶的活性，具有良好的市场应用前景。
【专利说明】一种蝇防御素突变体及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种蝇防御素突变体及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 抗菌肤（Antibacterial Peptides，ABPs)，又称抗微生物肤（Antimicrobial P印tides，AMPs)，广义上是指广泛存在于生物体内具有抵御外界微生物侵害，清除体内突 变细胞的一类小分子多肽，是生物先天免疫防御系统的一个重要组成部分，在黏膜免疫系 统中起重要作用，称之为"第一道防御体系"或"第一道免疫体系"。抗菌肽广泛存在于细 菌、植物、无脊椎动物及脊椎动物体内，不仅具有广谱抗细菌能力，而且对真菌、病毒及癌细 胞也有一定杀抑作用。此外，还具有稳定、水溶性好、抗菌机理独特、无耐药性、对高等动物 正常细胞无害等特点，从而显示了其在医学和农业上潜在的研究和应用价值。
[0003] 蝇防御素是来自于家蝇的抗菌肽，其杀菌机制是分子中的二硫键与细菌细胞膜的 磷脂有很强的亲和作用，即大量分子与膜结合在一起，形成寡聚糖体，并在细菌细胞膜上围 成一个离子通道，使细胞内大量K+外流和ATP合成受阻，导致细胞呼吸停止、菌体死亡。研 究也发现，防御素附着在细菌表面后，除了本身对细菌的损伤外，还可以使细菌被吞噬细胞 吞噬消化，起到调理素的作用。
[0004] 直接从家蝇中分离提取的蝇防御素难以满足市场需求，采用基因工程的方式制备 重组蝇防御素可以降低成本，但是采用蝇防御素的基因直接在大肠杆菌中表达获得的重组 蝇防御素抗菌活性不高，耐热活性差，不具备抗胰蛋白酶的活性，实际应用价值低。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了一种蝇防御素的突变体。
[0006] 本发明提供了一种如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
[0007] 还提供了一种重组载体，它包含SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。优选地，所述的 重组裁体是重组pGEX_4_l质粒。
[0008] 还提供了一种重组菌，它包含前述的重组载体。优选地，所述的重组菌为重组大肠 杆菌。
[0009] 本发明蝇防御素突变体，它由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列编码。它的氨基酸 序列如SEQ ID NO :4所示。
[0010] 本发明还提供了一种制备前述蝇防御素突变体的方法，包含如下步骤：
[0011] (1)取前述的重组菌，接种于含有50ug/mL氨苄青霉素的液体肉汤培养基中， 37°C、220rpm震荡培养12h，然后用含有50ug/mL的氨苄青霉素的液体肉汤培养基重悬至 OD6tltl为0. 1，于37°C培养至OD6tltl为0.8,加入IPTG至终浓度为ImM，诱导表达3小时，离心， 得菌体；
[0012] (2)取菌体，用GST融合蛋白纯化试剂盒分离纯化，得到结合了 GST融合蛋白的树 脂后，加入等体积的浓度为50U/ml的凝血酶溶液，混匀，室温震荡10小时，离心，得上清，去 除凝血酶，即得。
[0013] 所述液体肉汤培养基每升包含如下成分：蛋白胨l〇g、酵母浸出物5g、NaCl 10g， 其余为水。
[0014] 本发明还提供了前述蝇防御素突变体在制备饲料添加剂或抗菌药物中的用途。
[0015] 本发明还提供了一种抗菌药物，它是以前述蝇防御素突变体为活性成分，加上药 学上可接受的辅料制备而成的制剂。
[0016] 本发明通过基因工程的方式制备得到了纯品蝇防御素突变体，其抑菌活性好，耐 热活性佳，具备抗胰蛋白酶的活性，具有良好的市场应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图I SDS - PAGE分析。1泳道为纯化LUC-ori融合蛋白；2泳道为纯化的LUC-n融 合蛋白；9泳道为LUC-n菌悬液总蛋白；8泳道为细胞溶解后上清蛋白；7泳道为溶菌酶，DNA 酶，RNA酶酶解后上清；6泳道为酶解后沉淀总蛋白；4, 5泳道为上柱前清液,3为第一次洗 柱清液。
[0018] 图2 SDS - PAGE分析。泳道1为LUC-ori融合蛋白酶切结果；泳道2, 3为LUC-n 融合蛋白酶切结果，2为5单位凝血酶，3为2. 5单位凝血酶；4泳道为LUC-n融合蛋白未酶 切结果，箭头所示为蝇防御素蛋白。
[0019] 图3 SDS-PAGE分析。1泳道：突变LUC-n蛋白超滤离心后的离心液；2泳道：LUC-n 蛋白经透析袋浓缩后的清液；3泳道：未突变LUC-ori蛋白超滤离心后的离心液；4泳道： LUC-ori蛋白透析袋浓缩后的清液。
[0020] 图4抑菌实验结果。1号样品：LUC-n融合蛋白酶切液；2号样品：LUC-〇ri融合蛋 白酶切液；3号样品：GST蛋白对照；4号样品：凝血酶对照。
[0021] 图5热处理后的抑菌结果。蓝色点为LUC-n热处理结果，红点为LUC-ori热处理 结果。
【具体实施方式】
[0022] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内 容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0023] 实施例1本发明重组蛋白的制备
[0024] 1、重组表达
[0025] (1)蝇防御素多肽基因的克隆
[0026] 基因序列分析
[0027] 将野生蝇防御素命名为LUC-ori，从NCBI数据库中调取已知蝇防御素序列，对其 进行Blastp分析，得出氨基酸序列。
[0028] 对蝇抗菌肽基因进行改造，将甘氨酸突变称丝氨酸，命名为LUC-n。
[0029] 核苷酸比对：
[0030] LUC-ori(SEQ ID NO ：1):
[0031] gctacttgcg atttattgag tggtactggt gttaaacatt cagcttgtgc tgcccactgc
[0032] ttgttgagag gaaatcgtgg cggttattgt aatggtagag ctatttgcgt gtgtcgtaat
[0033] LUC-n(SEQ ID NO ：2):
[0034] gctacttgcg atttattgag tggtactggt gttaaacatt cagcttgtgc tgcccactgc
[0035] ttgttgagag gaaatcgtgg cagttattgt aatggtagag ctatttgcgt gtgtcgtaat
[0036] 合成前述 LUC-ori 和 LUC-n。
[0037] 氨基酸序列比对：
[0038] LUC-ori (SEQ ID NO ：3)：
[0039] ATCDLLSGTG VKHSACAAHC LLRGNRGGYCNGRAICVCRN
[0040] LUC-n(SEQ ID NO ：4)：
[0041] ATCDLLSGTG VKHSACAAHC LLRGNRGSYC NGRAICVCRN
[0042] (2)重组菌的构建和筛选
[0043] 重组表达载体的构建：全基因 LUC-n和LUC-ori分别通过EcoRI/Notl位点克隆到 大肠杆菌表达载体pGEX-4-l上，得到重组载体pGEX-LUC-n。
[0044] LUC-n和LUC-ori基因在Invitrogen公司进行合成，同时在基因两端添加 EcoRI/ NotI位点，并将基因通过TA克隆至pMD18-T载体（购自TaKaRa公司）中，使用Qiagen公司 的质粒提取试剂盒，分别提取含有LUC-n和LUC-ori基因的pMD18-T载体质粒以及pGEX4-l 载体质粒，使用EcoRI/Notl双酶切，使用胶回收试剂盒（购自TaKaRa公司）分别回收基 因片段以及PGEX载体，使用DNA连接试剂盒（购自TaKaRa公司）进行16°C下连接30分 钟，采用大肠杆菌热激法转化方法，将连接液转化至DH5 α并涂布于含有50ug/mL的氨苄 青霉素肉汤培养基平板上。次日使用基因引物5' GAATTCGCTACTTGCGATTTATTGA，以及3' 引物GCGGCCGCTTAATTACGACACACGC对阳性克隆进行PCR筛选，PCR条件95°C预变性5min， 95°C 30sec，55°C lmin，72°C lmin，30 个循环，72°C lOmin，得到的阳性克隆送至 Invitrogen 公司测序，挑出分别含有pGEX-LUC-ori重组质粒和pGEX-LUC-n重组质粒的阳性克隆。
[0045] (3)重组表达
[0046] 挑取阳性单克隆于含有50ug/mL的氨苄青霉素的液体肉汤培养基中，37°C、 220rpm震荡培养12h，次日用新鲜培养基稀释培养液至OD 6c?为0. 1，继续于37°C培养至 0D_ :0. 8,然后加入终浓度为ImM的IPTG，诱导3小时。诱导结束后，取样进行SDS-PAGE电 泳验证。
[0047] 液体肉汤培养基配方：蛋白胨10g、酵母浸出物5g、NaCl IOg,加水至1L， ρΗ7· 0, 115? 灭菌 20min。
[0048] (4)分离纯化：
[0049] a、取菌体，米用 Thermo 公司《Pierce GST spin purification kit》（即 GST 融合 蛋白纯化试剂盒），按照试剂盒的操作说明分离纯化，得到结合了 GST融合蛋白的树脂；
[0050] b、将结合了 GST融合蛋白的树脂与凝血酶混合反应，即按每毫升树脂加入Iml凝 血酶溶液，凝血酶溶液是含有浓度为50U/ml凝血酶的PBS溶液，颠倒数次，室温下震荡10 小时，4°C以500g离心5min，将上清转移到新管中。
[0051] c、使用通用电气医疗集团Vivaspin样品浓缩离心管离心洗涤，选择分子量截流 范围为IOkD的离心管，将酶解上清液中4kD大小的防御素与36kD大小的凝血酶分离，去除 离心液，即得纯品蛋白，然后在IkD的透析膜中浓缩，保存。
[0052] 2、测定
[0053] (I)SDS-PAGE
[0054] 取前述分离纯化过程中的样品和分离纯化得到的样品，用SDS-PAGE电泳分析蛋 白条带。
[0055] (2)抑菌试验：取酶切液160 μ L加入牛津杯中16-18小时后取出观察，具体参见 蝇防御素活性测定方法。
[0056] 1.原理
[0057] 本法基于防御素杀菌抑菌能力，利用在特定条件下一定浓度的防御素在含有微生 物的培养基内扩散并形成固定大小的抑菌区域的原理进行测定，同时通过微生物检定法二 剂量法计算防御素相当于标准抗菌物质的效价单位。
[0058] 2.参考文献及标准
[0059] 《中华人民共和国兽药典》2010版--抗生素微生物鉴定法
[0060] QB 2394-2007食品添加剂乳酸链球菌素
[0061] 3.试剂
[0062] 3. 1底层琼脂I. 5g琼脂,加水至IOOmL, 115°C，灭菌20min。
[0063] 3.2上层琼脂：蛋白胨l.Og，酵母浸粉0.5g，NaCl l.Og，加水至lOOmL，琼脂糖 I. 5g，ρΗ7· 0,115?，灭菌 20min。
[0064] 3· 3 LB固体培养基：蛋白胨I. 0g，酵母浸粉0· 5g，NaCl I. 0g，加水至lOOmL，琼脂 I. 5g，ρΗ7· 0,115?，灭菌 20min。
[0065] 3. 4 LB液体培养基：蛋白胨l.Og，酵母浸粉0. 5g，NaCl l.Og，加水至lOOmL， 115°C，ρΗ7· 0,灭菌 20min。
[0066] 3· 5 磷酸缓冲液：Κ2ΗΡ042· 0g，ΚΗ2Ρ048· 0g，加蒸馏水定容至 lOOOmL，过滤，115°C， 30min，备用。
[0067] 4.分析步骤
[0068] 4. 1指示菌的活化
[0069] 按照试剂3. 4的配方，配置30mL的培养液，取出一支指示菌，吸取ImL无菌水加 入其中并充分混匀，最后转接ImL指示菌菌悬液于培养液中，放入摇床，200rpm，37°C，培养 18h。取出培养好的指示菌菌悬液，600nm下用无菌蒸馏水调零，测定其OD值，如果OD值介 于1. 5 - 2. 0,菌悬液的加入量为40微升每IOmL上层培养基，如果OD值在2. 0 - 2. 5之间， 菌悬液加入量为35微升每IOmL上层培养基。
[0070] 4. 2标准品液的制备
[0071] 4. 2. 1硫酸粘杆菌素标准液
[0072] 准确称取硫酸粘杆菌素标准品（中国兽医药品监察所，含量22156U/mg) 0· 0360g， 用试剂3. 5磷酸缓冲液定容至10mL，2000rpm，离心IOmin后再稀释10倍后作为高剂量浓 度，并将其稀释1倍，使之配成高低剂量两个浓度梯度溶液。
[0073] 4.2.2防御素供试品
[0074] 准确称取防御素3. 8000g，并溶于6. 2mL的磷酸缓冲液当中，混匀，2000rpm，离心 10min，留上清液作为高剂量浓度，并将其稀释1倍，使之配成高低剂量两个浓度梯度溶液。
[0075] 4. 3平板的制备
[0076] 用无菌20mL移液管移取15mL的平板试剂3. 1底层琼脂于平板上，将平板放置于 水平的操作台上至冷却，备用。
[0077] 加热融化试剂3. 2上层琼脂，呆冷却置50°C时（刚好不烫手的温度），按步骤4. 1 指定量加入大肠杆菌悬液，摇匀后置于50°C恒温水浴锅中，用无菌IOmL移液管每次精确移 取IOmL试剂3. 2上层琼脂注入含底层琼脂的平板上，迅速轻放于于水平操作台上至冷却， 保证琼脂胶凝后效价测定培养基平面的平整度。
[0078] 4. 4 上样
[0079] 用直尺将平板划分为均匀的四份，在每个制备好的平板中以等距离安置牛津杯4 个。样品和标准品的高低剂量分别以对角形式加入，加入量为160微升。上样完成后，放入 培养箱，用事先烘干（烘箱120°C，2h)的陶瓦盖代替平板上盖盖好平板，37°C，培养6h。实 验重复5组。
[0080] 4. 5测量及结果计算
[0081] 将平板取出，倒出牛津杯，将平板放置在一个黑色背景的平台上，用游标卡尺测量 各抑菌圈的大小，取其平均值，按公式1计算效价，或使用二剂量法生物效价测定软件计 算。
[0082]
【权利要求】
1. 一种如SEQ ID NO :2所不的核苷酸序列。
2. -种重组载体，其特征在于：包含SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
3. 根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体是重组pGEX-4-l质 粒。
4. 一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求2或者3所述的重组载体。
5. 根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述的重组菌为重组大肠杆菌。
6. -种蝇防御素突变体，其特征在于：它由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列编码。
7. 根据权利要求6所述的蝇防御素突变体，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
8. -种制备权利要求6或7所述蝇防御素突变体的方法，其特征在于：包含如下步骤： (1) 取权利要求4或5所述的重组菌，接种于含有50ug/mL氨苄青霉素的液体肉汤培养 基中，37°C、220rpm震荡培养12h，用含有50ug/mL的氨苄青霉素的液体肉汤培养基重悬至 0D6Q(I为0. 1，于37°C培养至0D6(I(I为0. 8,然后加入IPTG至终浓度为ImM，诱导表达3小时， 离心，得菌体； (2) 取菌体，用GST融合蛋白纯化试剂盒分离纯化，得到结合了 GST融合蛋白的树脂后， 加入等体积的浓度为50U/ml的凝血酶溶液，混匀，室温震荡10小时，离心，得上清，去除凝 血酶，即得。
9. 权利要求6或7所述蝇防御素突变体在制备饲料添加剂或抗菌药物中的用途。
10. -种抗菌药物，其特征在于：它是以权利要求6或7所述蝇防御素突变体为活性成 分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
【文档编号】C12P21/02GK104404049SQ201410712363
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】李钢, 邹辉琴, 高静雷, 温静 申请人:四川华德生物工程有限公司