杂交瘤细胞、pcv2单克隆抗体及其应用的制作方法

杂交瘤细胞、pcv2单克隆抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种杂交瘤细胞、PCV2单克隆抗体及其应用。本发明通过创造性地采用PCV2病毒样颗粒作为免疫原，由于PCV2病毒样颗粒是更接近于正常PCV2病毒的蛋白组装而成的空壳结构，能够通过和正常病毒感染一样的途径递呈给免疫细胞，诱导免疫系统产生免疫保护反应，使得本发明的杂交瘤细胞分泌得到的单克隆抗体相比PCV2抗原蛋白单克隆抗体具有更高特异性和灵敏度。
CGMCC NO.9572
20140818
【专利说明】杂交瘤细胞、PCV2单克隆抗体及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫检测领域，具体而言，涉及一种杂交瘤细胞、PCV2单克隆抗体及其 应用。

【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒为单股环状DNA病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属。病毒粒子为无囊 膜的20面体对称结构，直径约为17nm，基因组片段大小为1767bp或1768bp，主要包含三个 开放阅读框（ORFs)，ORFl编码复制相关的蛋白，ORF2编码的Cap蛋白是病毒的主要免疫原 性蛋白，0RF3参与病毒的侵染与发病。目前猪圆环病毒分为2个血清型：PCVl和PCV2dCV2 又可划分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三个基因型，在疾病的流行过程中，PCV2基因型变迀趋 势为PCV2a到PCV2b，毒力也呈增强的趋势。而PCV2c目前只在丹麦有报道发现。猪圆环病 毒II型（PCV2)是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、猪皮炎和肾病综合症（Porcinedermatitisan dnephropathy syndrome， F1DNS)、猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC)等疾病的主 要病原，上述疾病能够导致感染猪渐进性消瘦、淋巴系统的损耗、呼吸和消化系统的紊乱。 临床上，猪圆环病毒常与其他病原共同感染及继发感染，对养猪业造成了巨大的经济损失。
[0003] 目前用于猪圆环病毒II型的检测方法已有多种，其中病原检测方法如聚合酶链式 反应（PCR)、免疫组织化学（IHC)、原位杂交技术（ISH)，酶联免疫吸附实验（ELISA)和免疫 焚光技术（IFA)等。1975年由George Kohler和Cesar Milstein发明的单克隆抗体技术 极大的推动了免疫学和生物医学的发展。单克隆抗体技术初次应用到猪圆环病毒II型研 宄上，是Mc Neilly用PCV2全病毒筛选出了 14株单克隆抗体。其后，单克隆抗体技术广 泛的应用到了猪圆环病毒II型上来。逢莎莎等（2009年）利用PCV2单克隆抗体来进行免 疫组化检测，以研宄人工感染PCV2病猪体内免疫器官的PCV2抗原分布，结果表明PCV2单 克隆抗体的免疫组化可以检测出PCV2抗原在病猪免疫器官分布。徐恒等（2010年）应用 PCV1-PCV2嵌合病毒研制出了单克隆抗体并建立了相关的免疫组化检测体系，探宄了免疫 组化检测和PCR检测两种不同方法的相关性，其中PCR检测结果阳性率为22. 1 %，免疫组化 检测结果阳性率为27. 9%，而其共同阳性率，在PCR检测中占65. 2%，在免疫组化检测中占 51.7%。Ellis 等（1999 年）、Krakowka 等（2000 年）和 Rosell 等（1999 年）分别应用免 疫组化方法对PMWS病猪的淋巴组织进行检测发现，淋巴组织中的单核巨噬细胞和组织细 胞中PCV2抗原表现为强阳性，主要存在于这些细胞的胞浆内，该结果这与唐宁等（2008年） 的PCV2抗体免疫组化研宄的结果相一致，PCV2抗原阳性信号出现在淋巴组织（淋巴结、 脾、扁桃体）、心、肝、肺、肾、胃、十二指肠、大脑及小脑内，而气管、空肠、回肠、盲肠、膀胱、胸 腺、甲状腺、肾上腺、胰腺及生殖器官均未见到阳性信号，该研宄也发现，淋巴组织PCV2阳 性信号主要位于淋巴小结及弥散性淋巴组织内的淋巴细胞、组织细胞和巨噬细胞中，也可 见于扁桃体上皮细胞内。
[0004] 单克隆抗体是由单个细胞株产生的均一性抗体，具有高度特异性、均一性和可重 复性和弱凝集反应等特性。与多克隆抗体相比单克隆抗体有独特的优势，其特异性优于多 克隆抗体；产生特异性单克隆抗体的杂交瘤可以在体外"永久"地存活并传代，并不断地产 生高特异性、均一性抗体，单克隆抗体适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法。在免疫 组化检测中，单克隆抗体的高特异性可以有效地降低背景色，提高阳性信号强度，使结果易 于判定，这有助于利用此法检测时的阳性结果判定（尤其对初学者），尽量减少假阳性结果 判定的出现，从而使免疫组化检测阳性率的准确性增高。
[0005] 目前在PCV2阳性细胞的免疫组化检测中，一般采用自制的猪或鼠免疫血清的多 克隆抗体，虽然可以判断猪PCV2阳性细胞，但是特异性判断和灵敏度有局限，难免引起研 宄人员对阳性信号细胞的误判，因而，仍需要对现有的PCV2抗体进行改进，以提高抗体的 特异性和灵敏度，从而提高判断的准确性。


【发明内容】

[0006] 本发明的主要目的在于提供一种杂交瘤细胞、PCV2单克隆抗体及其应用，以提高 在感染病猪中对PVC2的检测准确性和灵敏度。
[0007] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种杂交瘤细胞，该杂交瘤细 胞的保藏号为CGMCC NO. 9572。
[0008] 进一步地，杂交瘤细胞由PCV2病毒样颗粒免疫的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细 胞融合而成。
[0009] 根据本发明的一个方面，提供了一种PCV2单克隆抗体，单克隆抗体由上述杂交瘤 细胞分泌产生。
[0010] 进一步地，单克隆抗体在ELISA检测中的抗体滴度大于或等于I :4 X 105。
[0011] 根据本发明的又一个方面，提供了一种PCV2的检测试剂盒，试剂盒包括上述任一 种单克隆抗体。
[0012] 进一步地，试剂盒为免疫组化检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒或ELISA试剂盒。
[0013] 根据本发明的再一个方面，提供了一种PCV2的检测试剂，试剂上述任一种单克隆 抗体。
[0014] 本发明还提供了上述单克隆抗体在体外检测猪圆环病毒中的应用、在制备用于抗 猪圆环病毒感染的药物中的应用以及在制备成用于纯化PCV2的免疫亲和柱中的应用。
[0015] 应用本发明的技术方案，通过创造性地采用PCV2病毒样颗粒作为免疫原，由于 PCV2病毒样颗粒是更接近于正常PCV2病毒的蛋白组装而成的空壳结构，能够通过和正常 病毒感染一样的途径递呈给免疫细胞，诱导免疫系统产生免疫保护反应，使得本发明的杂 交瘤细胞分泌得到的单克隆抗体相比PCV2抗原蛋白单克隆抗体具有更高特异性和灵敏 度。
[0016] 本发明杂交瘤细胞的保藏信息
[0017] 抗猪圆环病毒II型病毒样颗粒单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏 日期：2014年08月18日，保藏编号CGMCC NO. 9572。

【专利附图】

【附图说明】
[0018] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0019] 图1示出了在本发明的一种优选的实施例中本发明的单克隆抗体的特异性免疫 组化检测结果；
[0020] 图2a和图2b示出了在本发明的一种优选的实施例中本发明的单克隆抗体的灵敏 度检测结果；
[0021] 图3示出了在本发明的另一种优选的实施例中本发明的单克隆抗体的特异性免 疫组化检测结果；
[0022] 图4示出了在本发明的另一种优选的实施例中本发明的单克隆抗体的特异性PCR 验证结果；以及
[0023] 图5示出了在本发明再一种优选的实施例中本发明的单克隆抗体与现有的多克 隆抗体免疫组化检测比较结果。

【具体实施方式】
[0024] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0025] 如【背景技术】部分所提到的，在检测PCV2病毒感染的过程中，现有技术中的基于 PCV2蛋白制备的多克隆抗体或单克隆抗体在特异性和灵敏度方面都相对较差，容易导致误 判的缺陷。为了改善上述状况，本发明的发明人对PCV2进行了大量的实验和研宄，本发明 的内容就是在下列研宄结果的基础上做出的：
[0026] 本发明通过创造性地采用自行研制的PCV2病毒样颗粒（PCV2VLPS)作为免疫原进 行后续的研宄工作的。PCV2病毒样颗粒的制备是基于全长Cap基因序列，根据大肠杆菌密 码子的偏好性，优化并合成了 PCV2核衣壳蛋白基因典型序列PCV2b-lB-cap，通过IPTG诱导 大肠杆菌原核表达系统表达该PCV2b-lB-cap序列，并利用其镍柱纯化的可溶性核衣壳蛋 白在特定条件下高效自体组装成了 PCV2病毒样颗粒（具体请参见发明人的另一个专利： 一种PCV2病毒样颗粒及其制备方法和裂解及VLP组装缓冲液，申请号201410145870. 8)。
[0027] PCV2病毒样颗粒是基于PCV2病毒的免疫原结构蛋白组装而成的空壳结构，其形 态与正常PCV2病毒相似，可通过和正常病毒感染一样的途径递呈给免疫细胞，诱导免疫系 统产生免疫保护反应；但相较于一般的抗原蛋白疫苗，它的结构更接近于正常PCV2病毒， 免疫原性更强；而其缺少核酸物质的特点又决定了 PCV2病毒样颗粒无法进行自主复制，不 会造成感染，稳定性和安全性好。因此，基于PCV2病毒样颗粒的单克隆抗体是一种比抗原 蛋白单克隆抗体更加理想的选择。
[0028] 本发明选取了 PCV2病毒样颗粒（PCV2VLPS)作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，选择 免疫效果最好的小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0)进行细胞融合。对于融合了的杂交 瘤细胞产生的抗体使用间接ELISA法进行筛选，选择强阳性株进行亚克隆，经过几次亚克 隆之后获取稳定的分泌抗PCV2VLPS的单克隆抗体且高效价的杂交瘤细胞B69 (保藏号为 CGMCCNO. 9572)。将所获取的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内，之后可从其腹水中收获大量的单 克隆抗体。
[0029] 而且，通过ELISA实验证明本发明的由PCV2病毒样颗粒所制备的单克隆抗体具有 较高的效价，检测灵敏度比较高，且特异性实验也表明，本发明的单克隆抗体相比基于PCV2 蛋白的多抗，不存在与其他病毒的非特异性结合，具有更强的特异性。
[0030] 基于上述研宄结果，在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种杂交瘤细胞，该 杂交瘤细胞保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，命名为B69， 保藏日期：2014年08月18日，保藏号为CGMCC NO. 9572。
[0031] 本发明中，还分别提供了一种由该杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体、含有该单克隆 抗体的试剂盒、以及该单克隆抗体的应用。因此，单克隆抗体在检测猪圆环病毒中的应用也 在本发明的保护范围内。含有该单克隆抗体的免疫组化检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒、 ELISA试剂盒或胶体金快速检测试纸条在是本发明的保护范围内。
[0032] 此外，本发明的单克隆抗体还可以作为一种PVC2的检测试剂或药剂的成分之用， 这样的试剂或药剂包括本发明的单克隆抗体。基于本发明的单克隆抗体而制备用于抗猪圆 环病毒感染的药物中的应用以及在制备成用于纯化PCV2的免疫亲和柱中的应用也在本发 明的保护范围内。
[0033] 在本发明一种具体的实施例中，本发明提供的单克隆抗体用于建立免疫组织化学 检测。免疫组织化学检测方法包括：取疑似PCV2感染病料，制备石蜡切片。将石蜡切片进 行脱蜡复水，抗原修复之后去除内源性过氧化物酶，封闭20min，PCV2VLPs单抗4°C过夜孵 育，PBS冲洗3次后，生物素标记羊抗鼠 IgG二抗室温孵育20min，PBS冲洗3次，辣根过氧 化物酶标记卵白素室温孵育15min，PBS冲洗3次，DAB显色剂显色。显微镜观察结果与PCR 检测结果进行比较。
[0034] 下面将详细介绍本发明的杂交瘤细胞的融合制备过程、单克隆抗体的制备方法以 及单克隆抗体的鉴定方法。
[0035] 实验一单克隆抗体的制备
[0036] (l)PCV2VLPs的构建与纯化
[0037] PCV2VLPS的制备采用自行研制的方法进行制备（一种PCV2病毒样颗粒及其制备 方法和裂解及VLP组装缓冲液，申请号201410145870. 8)。PCV2VLPS是基于最具代表性的 全长Cap基因序列，然后根据大肠杆菌密码子的偏好性，优化并合成了一条PCV2核衣壳蛋 白基因典型序列PCV2b-lB-cap，人工合成适合在原核表达系统中高效表达的PCV2核衣壳 蛋白基因，将PCV2b-lB-cap序列与表达质粒pET100_D/T0P0(美国Invitrogen公司）载体 重组构成pET-PCV2b-lB-cap重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌BL21。然后通过IPTG诱 导大肠杆菌原核表达系统表达PCV2核衣壳蛋白的全长基因序列，并利用其镍柱纯化的可 溶性核衣壳蛋白在特定条件下高效自体组装成了病毒样颗粒。
[0038] (2)免疫 BALB/c 小鼠
[0039] 取8?12周龄雌性BALB/c小鼠，用纯化后的PCV2VLPS对小鼠进行颈背部皮下注 射免疫，首次免疫100 μ g/只。首次免疫后第二周和第四周进行第二次免疫和第三次免疫。 第三次免疫两周后，选取免疫反应最好的小鼠脾脏进行融合。
[0040] (3)单克隆抗体的制备与筛选
[0041] 无菌摘取小鼠脾脏，制成细胞悬液并与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0)融合。融合后的 细胞经过适当稀释，分置于96孔培养板中培养，培养10?14天进行ELISA检测，挑选OD 值高的孔中的细胞进行有限稀释法亚克隆。将有限稀释的细胞培养至96孔板中，待克隆生 长到全孔的1/6时，标记单克隆及多克隆，对单克隆进行ELISA检测。ELISA检测后将OD值 最高的单克隆再有限稀释接入96孔板中如上法所述再次亚克隆，此过程重复数次，直至阳 性孔比率为100%，即可获得目的杂交瘤细胞B69。将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细 胞数按1?2x107管进行冻存。
[0042] (4)单克隆抗体腹水的制备
[0043] 以T25瓶为例，每个细胞株加培养基5ml，过夜培养12小时，培养至细胞株密度达 到I X IO6个/ml后收集细胞。准备打腹水的细胞株B69,将细胞株在EP管内混匀，混匀步 骤中用规格为Iml的注射器的针管塑料头将细胞株吸到注射器中，套上针头，将注射器中 的空气排空，轻轻弹匀细胞备用。
[0044] 选取6周龄雌性BALB/c小鼠制备腹水，注射0. 5ml的细胞悬液，注射完成后拔出。 10?14天收集腹水，在5ml离心管内加入50ul 2% Procline300,断颈处死小鼠，左手用弯 头镊子拎起腹部偏下的皮肤，剪开一个小口，吸取腹水，吸出的腹水放于5ml离心管内，上 下颠倒混匀。
[0045] (5)单克隆抗体的纯化
[0046] 将获得的单克隆抗体腹水加入鹿角胶（Sigma公司）和CaCl2除去油脂类杂质和 部分杂蛋白，12000rpm离心30min，再将上清液用0. 22 μ m微孔滤膜过滤，加入等体积0. OlM pH为7. 4的PBS缓冲液，用HiTrap Protein GHP层析柱（GE公司）分离纯化，用5个柱体 积的结合缓冲液（Binding Buffer)除去杂蛋白，用洗脱缓冲液（Elution Buffer)洗脱目 的蛋白并收集蛋白洗脱峰，以〇. IM NaHCOjP 0. 5M NaCl配置的pH为7. 4的透析液透析2d， 每天更换透析液，用截留分子量为30kD的滤膜超滤浓缩，得到纯化的单克隆抗体（腹水）， 紫外分光光度计测其蛋白含量，_30°C保存备用。
[0047] 实验二ELISA效价的测定
[0048] (1)抗原蛋白的包被
[0049] 用4 μ g/ml的PCV2VLPS包被酶标板，4°C过夜。同时阳性对照His标签蛋白和阴 性对照5% BSA(牛血清白蛋白）也分别包被酶标板并4°C过夜。
[0050] (2)封闭
[0051] 从4°C冰箱中取出包被好的酶标板将其中的包被液弃去，然后将5% BSA(牛血清 白蛋白）以每孔200 μ 1的量依次加入，盖上盖子放入37°C温箱孵育lh。从37°C温箱取出 包被和封闭好的酶标板，将封闭液倒入水池，用力甩干净，然后用蒸馏水冲洗干净，最后将 上述酶标板用毛巾拍干。
[0052] (3) -抗的孵育
[0053] 将抗 PCV2VLPS 的单克隆抗体用 5 % BSA 进行 1 :3125,1 :6250,1 :12500,1 : 2. 5X104，1 :5X104，1 :1X105，1 :2X105，1 :4X105等不同倍数的稀释，依次加入每孔中， 100 μ 1/孔，阳性对照用1:8000倍稀释的HIS抗体，阴性对照用5 % BSA。将酶标板置于 37°C温箱孵育lh，之后取出酶标板，将板内的一抗弃去，蒸馏水冲洗干净，拍干。
[0054] (4)二抗的孵育
[0055] 将稀释好的辣根过氧化物酶标记的抗鼠二抗（Sigma，Inc.)以100 μ 1/孔的量依 次加入酶标板孔中，盖上盖子放入37°C温箱孵育45min。从温箱取出孵育好二抗的酶标板， 甩去二抗后，用蒸馏水冲洗干净，拍干。
[0056] (5)显色及终止
[0057] 将现配的TMB(四甲基联苯胺）底物显色液以100 μ 1/孔的量依次加入酶标板 孔中，盖上盖子放入37°C温箱15min。打开酶标仪，预热lmin。从温箱取出酶标板，将2Μ H 2SO4以每孔50 μ 1的量依次加入酶标板孔中以终止反应，混匀后用酶标仪测定每孔吸光度 (0D450的值），以实验组的0D450nm/对照组的0D450nm>2. 1的孔判定为阳性，具体结果见 表1。
[0058] 表1不同倍数稀释的抗PCV2-VLPS抗体的ELISA检测OD值
[0059]

【权利要求】
1. 一种杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞的保藏号为CGMCC NO. 9572。
2. 根据权利要求1所述的杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞由PCV2病毒样颗 粒免疫的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成。
3. -种PCV2单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细 胞分泌产生。
4. 根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体在ELISA检测中的 抗体滴度大于或等于1 :4X105。
5. -种PCV2的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3或4所述的单克 隆抗体。
6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为免疫组化检测试剂盒、免 疫荧光检测试剂盒或ELISA试剂盒。
7. -种PCV2的检测试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求3或4所述的单克隆抗 体。
8. 权利要求3或4所述的单克隆抗体在体外检测猪圆环病毒中的应用。
9. 权利要求3或4所述的单克隆抗体在制备用于抗猪圆环病毒感染的药物中的应用。
10. 权利要求3或4所述的单克隆抗体在制备成用于纯化PCV2的免疫亲和柱中的应 用。
【文档编号】C12M1/00GK104498439SQ201410712094
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】王乃东, 杨毅, 邓治邦, 王爱兵, 朱哲, 蔡杰, 雷昕诺, 张颜, 湛洋 申请人:湖南农业大学