一种老芒麦品种或品系鉴定的特异性引物、试剂盒和其在鉴定老芒麦品种或品系中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种用于老芒麦品种或品系鉴定的特异性引物，其核苷酸序列为：上游引物Pf：AGATGAAGCTGGTAACCGAGACAG；下游引物Pr：ATTTCCTCTAATGGAAGCTCTGGC。本发明还提供相应的试剂盒及其在鉴定老芒麦品种或品系中的应用。采用本发明提供的引物及相应的PCR扩增程序和电泳产物检测方法，可对7个国内老芒麦品种（系）进行快速、准确鉴定。也可通过特异扩增条带将上述7个国内老芒麦品种（系）与野生材料和近缘物种进行区分。
【专利说明】一种老芒麦品种或品系鉴定的特异性引物、试剂盒和其在 鉴定老芒麦品种或品系中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术辅助育种，特别是涉及一种老芒麦品种或品系鉴定的特异性 引物、试剂盒和其在鉴定老芒麦品种或品系中的应用。
【背景技术】
[0002] 老芒麦L.)是禾本科（Poaceae)小麦族（Triticeae)披碱草 属的多年生疏丛型中旱生植物，为披碱草属的模式种。老芒麦在北半球温带地区 分布较广，是欧亚大陆的广布种，尤其是我国草甸草原和高寒草甸群落的重要组成部分，能 形成优势种和建群种。由于其具有抗寒性强、粗蛋白含量高、适口性好、易栽培等优点，老芒 麦已成为国家"天保工程"和"退牧还草工程"中广泛使用的优良牧草之一。
[0003] 传统上对于老芒麦种质的分类和鉴定常依耐株高、穗长、分蘖数等形态学指标，其 种植成本高、鉴定周期长；另外形态指标受环境因素影响大，具有不稳定性，在测定过程中 也存在较大的人为误差，从而影响鉴定结果的可靠性。生产上推广的老芒麦品种或栽培种 多为野生材料驯化而来，形态上与野生材料相似，很难通过传统的形态指标加以准确快速 的鉴定，不利于老芒麦品种的知识产权保护、推广和合理利用。
[0004] 随着分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记和基因标记技术的建立和成 熟，为发展简便、快速、准确的种质鉴定技术提供了有效手段。SSR (Simple sequence repeat，简单重复序列）标记因具有数量丰富、多态性高、共显性、扩增稳定、引物序列易于 交流等优点，已在水稻（ftTza safira)、玉米（Zea 細％ L.)、棉花AerAacea? L)、甜瓜L)、西瓜)等作物的种质鉴定中应用。而在 草业上SSR分子标记应用不多，仅见于披碱草柱花草从es spp.)、紫花苜猜（Jfct/icago satira)、结缕草（Zopsia 等少数草种。目前，国内 尚无老芒麦品种的分子指纹图谱构建及快速检测的研究报道。
【发明内容】
[0005] 本发明通过一对SSR特异引物(表1)构建了 7个老芒麦品种（系）分子指纹图谱； 利用此特异引物和检测方法可鉴定7个品种(系)，也可将品种和其他不同来源的野生老芒 麦材料和近缘物种加以区分，由此提供了老芒麦品种(系）分子指纹图谱、快速检测试剂盒 及鉴定方法。
[0006] 本发明提供了用于老芒麦品种或品系鉴定的1对特异性SSR引物，具体参见表1。
[0007] 表1 :特异性老芒麦SSR引物
【权利要求】
1. 一种用于老芒麦品种或品系鉴定的特异性引物，其特征在于：所述特异性引物的核 苷酸序列为： 上游引物 Pf :AGATGAAGCTGGTAACCGAGACAG ; 下游引物 Pr :AITTCCTCTAATGGAAGCTCTGGC。
2. -种用于老芒麦品种或品系鉴定的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求 1所述的特异性引物。
3. 权利要求1所述的特异性引物、权利要求2所述的试剂盒在老芒麦品种或品系快速 鉴定中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：具体步骤如下：（1)提取老芒麦种质DNA 并应用权利要求1所述的特异性引物或权利要求2所述的试剂盒进行PCR扩增； (2)对扩增产物进行凝胶电泳并染色，对扩增条带进行分析：具有特异性特征条带 225bp、170bp和llObp的是同德品种，具有特异性特征条带160bp的是青牧品种，具有特异 性特征条带200bp的是新疆老芒麦栽培种，具有特异性特征条带250bp、219bp和149bp的 是内蒙老芒麦栽培种，具有特异性特征条带190bp的是第二种内蒙老芒麦栽培种，具有特 异性特征条带140bp的是川草2号品种，具有特异性特征条带120bp的是红原品系。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件为：94 °C变 性30 sec，65- 61 °C退火30 sec，72°C延伸1 min,共5个循环，每个循环退火温度降低 1°C ;94 °C 变性 30 sec，60 °C 退火 30 sec，72 °C 延伸 1 min，共 30 个循环；72 °C 延 伸 10 min，4 °C保持。
6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述染色时所用的银染液的制备方法为： 将0.8-1 g AgN03加入1L蒸馏水中，配成浓度为0.08 %-1 %的银染液；优选地，浓度为0.09 %〇
7. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述染色时所用的显影液的制备方法为： 将NaOH 15g、甲醒4ml、四硼酸钠0. 19g加入至蒸馈水中，定容至1L。
8. 根据权利要求4、6或7所述的应用，其特征在于：所述染色的具体步骤为： (1) 银染：电泳结束后将清洗后的胶放入预先置好的200ml硝酸银染色液中容器中，染 色10分钟； (2) 显影：银染结束后蒸馏水水洗1-2次，再加入预冷的200 ml显影液中显影，至条带 清晰可见，显影5分钟左右； (3) 将染色完毕的胶置玻板上，凝胶用数码相机照相保存。
9. 老芒麦品种或品系的指纹图谱，其特征在于：是将提取的老芒麦种质DNA进行PCR 扩增，对扩增产物凝胶电泳并染色后得到的扩增条带；其中，具有特异性特征条带225bp、 170bp和llObp的是同德品种，具有特异性特征条带160bp的是青牧品种，具有特异性特征 条带200bp的是新疆老芒麦栽培种，具有特异性特征条带250bp、219bp和149bp的是内蒙 老芒麦栽培种，具有特异性特征条带190bp的是第二种内蒙老芒麦栽培种，具有特异性特 征条带140bp的是川草2号品种，具有特异性特征条带120bp的是红原品系。
10. 权利要求9所述的老芒麦品种或品系的指纹图谱在从不同来源的老芒麦种质和近 缘物种中鉴别同德品种、青牧品种、新疆老芒麦栽培种、内蒙老芒麦第一栽培种、内蒙老芒 麦第二栽培种、川草2号品种和红原品系中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104450902SQ201410712070
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】谢文刚, 张俊超, 王彦荣, 赵旭红 申请人:兰州大学