鸡抗菌肽β-防御素重组蛋白CBD的制备方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体来说是一种鸡抗菌肽β-防御素重组蛋白CBD的制备方法；该基因核苷酸引物序列如SEQ?ID?NO：1；蛋白氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2；制备方法包括：(1)鸡β-防御素基因CBD的克隆及测序；(2)表达载体的构建与鉴定；(3)重组蛋白的融合表达；(4)重组蛋白的鉴定；(5)表达产物的可溶性分析；(6)融合蛋白的纯化；(7)鸡重组蛋白的生物学活性检测。本发明操作难度小，可控性强，成本低，为防御素的免疫学研究及工业批量生产奠定了基础。
【专利说明】鸡抗菌肽β -防御素重组蛋白CBD的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体来说是一种鸡抗菌肽β -防御素重组蛋白CBD的制备方法。
【背景技术】
[0002]防御素是一类富含半胱氨酸的阳离子活性肽，广泛分布于动物、植物和昆虫体内。由于其具有广谱的抗微生物活性，因此被命名为“防御素”(defensins)。体外抑菌试验表明，防御素能对革兰氏阳性和阴性细菌、真菌、分枝杆菌、螺旋体、披膜病毒等病原微生物产生较强的杀伤作用，构成宿主抵抗外来病原菌感染的第一道防线。[0003]防御素依据其半胱氨酸空间排布及二硫键大小和形成方式的不同，可分为哺乳动物防御素、昆虫防御素和植物防御素3种类型。哺乳动物防御素又分为α-、β_、Θ-防御素3种类型。β_防御素最早从牛气管粘膜上皮中分离得到，广泛分布于人、鼠、牛、羊、猪的多种器官上皮细胞内。目前，在脊椎动物、无脊椎动物和植物中发现的防御素已超过500多种，Patil等报道了犬染色体基因组编码了 42种β-防御素基因及其拟基因。目前，关于犬β_防御素的基因克隆在国内报道较少，靳慧君等报道了从健康西施犬睾丸组织中扩增出防御素基因，其基因在NCBI上检索名称为DEFB3L(cBD3)，并构建了真核表达载体，证实了其能在HEK293T细胞中得到表达。国外Sang等报道在犬的睾丸组织内克隆到了犬β防御素基因CBD1，并通过化学合成小肽的方法证实了其对革兰氏阳性、阴性菌有抑菌作用，对支原体也有抑制作用。
[0004]随着耐药菌的出现，内源性的抗微生物肽越来越受到重视。防御素(β-defensin)作为抗菌肽的一种，借助其独特的生物学特性，极易被肠道吸收，也因其特殊的抗菌机制，不会诱导产生耐药性微生物。另一方面，动物食品安全越来越受到重视，使用无污染、无残留、无毒副作用的添加剂是解决该问题的关键。防御素是动物体成分之一，参与生命过程，是小分子短肽，具有安全无毒副作用的生物学特征。用基因工程方法生产环保型β -防御素饲料添加剂，或通过日粮添加，对畜牧业生产具有极为重要的现实意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种鸡抗菌肽β -防御素重组蛋白CBD的制备方法。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种鸡抗菌肽防御素重组蛋白CBD基因，所述基因序列如SEQ ID NO:10
[0007]进一步的:所述蛋白氨基酸序列如SEQID NO:2。
[0008]本发明的另一目的是提供一种克隆抗菌肽β防御素重组蛋白CBD基因的引物，所述引物序列如下:
[0009]SEQID NO:35’ -ATGACGCTCATCATGATCGT-3’
[0010]SEQID NO:45’ -TGATGTATAGATTGGTCATG-3’
[0011]本发明的第三个目的是提供一种鸡抗菌肽β -防御素重组蛋白CBD的制备方法，包括如下步骤:
[0012](I)鸡β -防御素基因CBD的克隆及测序；
[0013](2)表达载体的构建与鉴定；
[0014](3)重组蛋白的融合表达；
[0015](4)重组蛋白的鉴定；
[0016](5)表达产物的可溶性分析；
[0017](6)融合蛋白的纯化；
[0018](7)鸡重组蛋白的生物学活性检测。
[0019]进一步的:所述步骤(1)鸡β -防御素基因CBD的克隆及测序包括如下步骤:
[0020]①从鸡睾丸组织中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ；
[0021]②设计引物及PCR反应,利用Primer5.0软件设计引物:
[0022]SEQ ID NO:35’ -ATGACGCTCATCATGATCGT-3’
[0023]SEQ ID NO:45’ -TGATGTATAGATTGGTCATG3’
[0024]用cDNA为模板进行梯度PCR操作扩增鸡抗菌肽β -防御素重组蛋白CBD基因序列，PCR反应体系为25 μ L体系，反应条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸2min，共35个循环，而后·72°C延伸7min ；
[0025]③、PCR产物的回收和纯化；
[0026]④、克隆；
[0027]⑤、测序鉴定。
[0028]本发明的有益技术效果是:本发明运用分子生物学技术，在国内外第一次鸡抗菌肽β防御素重组蛋白CBD;本发明操作难度小，可控性强，成本低，为防御素的免疫学研究及工业批量生产奠定了基础。
【具体实施方式】
[0029]下面结合实施实例对本发明作进一步说明:
[0030]实施实例一
[0031](I)、鸡β -防御素基因CBD的克隆及测序
[0032]本发明根据Genbank已发表的犬β -防御素基因核苷酸序列，利用Primer5.0 软件设计引物:SEQ ID NO:35’ATGACGCTCATCATGATCGT-3’ ；SEQ ID NO:45’ -TGATGTATAGATTGGTCATG-3’，从公鸡睾丸组织中扩增出CBD基因，片段大小为297bp。(液氮中取出睾丸组织，置于研磨器中研磨，然后分别装于50mL瓶内，80°C保存。按Trizol试剂说明书提取各组织样本的总RNA。采用cDNA反转录试剂鼠源反转录酶M-MLV，按说明反转录成cDNA，然后以cDNA为模板按以下程序进行PCR扩增:反应条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸2min，共35个循环，而后72°C延伸7min。结束后，PCR产物用Ig / L琼脂糖凝胶电泳检查结果，并用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。并克隆至pMD19-T载体上，构建CBD模板质粒pMD19_T_CBD，经序列测定其基因序列如SEQ IDNO:1。
[0033]ATGACGCTCATCATGATCGTTGCAATCCTGCTGTTCCAGAAGTCCAAAGTAACTGAACAACTTAAGAGATGCTGGGGTGAATATATACGAGGATATTGCAGGAAAATATGCAGAATAAGTGAAATACGTGAAGTACTCTGTGAAAATGGGAGATATTGTTGCCTCAACATCGTGGAATTGGAAGCACGTAGAAAAATTACAAAG CCACCTCCTCCAGAGCCAAGGACATATGCAATGACTTTCCCTCAAGATGATGATATAATTGTAGAAAATTATTTGATGTATAGATTGGTCATG
[0034]鸡β -防御素基因CBD的核苷酸序列通过同源比发现和其他哺乳动物的β -防御素基因CBD具有很高的一致性性，翻译的重组蛋白氨基酸序列一致性超过99%，蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0035](2)、表达载体的构建与鉴定
[0036]在上下游引物5’分别添加EcoRI和XhoI酶切位点(SEQ ID NO:55’ CGGAATTCATGACGCTCATCATGATCGT3’，SEQ ID NO:65’ CGCTCGAGGTATAGATTGGTCATG3’)，以 pMD19_T_CBD为模板，扩增CBD基因，回收扩增PCR产物割胶纯化，将纯化产物和空载体pGEX-6p-l分别用EcoRI和XhoI双酶切，回收纯化酶切产物，经T4连接酶连接转化克隆感受态细胞DH5a，涂布平板挑取单菌落与液体LB (Amp+)中摇菌，抽提质粒，将重组质粒进行双酶切鉴定，将酶切鉴定为阳性菌液送往上海生工进行基因测序，测序准确后，并将其命名为pGEX-6p-l-CBD。
[0037](3)、重组蛋白的融合表达
[0038]将测序正确的重组质粒PGEX-6P-1-CBD转化到E.coli BL21 (DE3)(商购)中。挑单菌落接种于LB液体培养基中(50 μ g / ml氨苄霉素)，37°C过夜培养。次日按I %接种于50ml LB液体培养基中(含50 μ g / ml氨苄霉素)，37°C振荡培养至0D600为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.6mM, 37°C，200rpm振荡培养，分别于诱导后2、4、6、8小时各取菌液5mL，离心保留菌体，最后用SDS-PAGE电泳检测诱导表达情况。
[0039](4)、重组蛋白的鉴定
[0040]SDS-PAG E电泳后，将凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜上，利用目的蛋白上的GST标签，用抗GST鼠单克隆抗体为一抗，HRP标记的山羊抗鼠多克隆抗体为酶标二抗，进行Western Blot 分析。
[0041](5)、表达产物的可溶性分析
[0042]取500ml诱导7小时的菌液离心收集菌体，按10:1比例重悬于PBS中，超声破碎(300-400W，超声3s，间隔5s，工作15分钟)，然后12000rpm离心10分钟，分别保留上清和沉淀，用SDS-PAGE电泳检测分析目的蛋白是否为可溶性蛋白。在菌体超声破碎上清检测到少量蛋白，目的蛋白大多以包涵体的形式存在。
[0043](6)、融合蛋白的纯化
[0044]1000mL上述诱导表达的菌液，离心收集菌体后，用STE洗涤菌体，加入20mL菌体裂解液重悬菌体，4°C作用30min，使溶菌酶充分裂解细菌细胞壁，可以观察到菌液变得十分粘稠，呈丝状。超声破碎直至菌液不再粘稠，12000rpm离心30min,用Novagen公司ProteinRefolding Kit蛋白纯化试剂盒处理包涵体后进行透析，获得具有生物学活性的蛋白。然后利用带GST凝胶的柱子(上海生工)进行纯化回收目的蛋白。
[0045](7)、鸡重组蛋白的生物学活性检测
[0046]CBD融合蛋白的活性检测用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定。分别取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别接种于5mL无氨苄抗性LB液体培养基，37°C摇床培养过夜。酵母菌(GSl 15)接种于5mL无抗YH)液体培养基中，30°C摇床培养过夜。分别取0.5mL上述培养液接种于新鲜的5mL无氨苄抗性LB和YPD培养基中，分别与37°C、30°C摇床培养至对数生长中期。取200 μ L此细菌培养液，涂于无氨苄抗性LB和Yro琼脂平板，放置片刻。待菌液稍干后，用直径为6mm的灭菌打孔器打孔若干个，分别在孔中加入100 μ L PBS作对照，100 μ L此重组蛋白。将平板正面向上37°C培养2h后，倒置继续培养18h (酵母菌培养40h)，观察抑囷效果。
[0047]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0048]
【权利要求】
1.鸡抗菌肽β-防御素重组蛋白CBD基因，其特征在于:所述基因序列如SEQ ID NO:1
2.根据权利要求2所述鸡抗菌肽β-防御素重组蛋白CBD蛋白，其特征在于:所述蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:2ο
3.一种克隆抗菌肽β_防御素重组蛋白CBD基因的引物，其特征在于:所述引物序列如下:
SEQ ID NO:35’ -ATGACGCTCATCATGATCGT-3’
SEQ ID N0:45’ TGATGTATAGATTGGTCATG-3’。
4.一种鸡抗菌肽β -防御素重组蛋白CBD的制备方法，其特征是，包括如下步骤: (1)鸡β-防御素基因CBD的克隆及测序； (2)表达载体的构建与鉴定； (3)重组蛋白的融合表达； (4)重组蛋白的鉴定； (5)表达产物的可溶性分析； (6)融合蛋白的纯化； (7)鸡重组蛋白的生物学活·性检测。
5.根据权利要求2所述制备鸡抗菌肽β防御素重组蛋白CBD的方法，其特征在于:所述步骤(1)鸡β -防御素基因CBD的克隆及测序包括如下步骤: ①从鸡睾丸组织中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA； ②设计引物及PCR反应，利用Primer5.0软件设计引物:
SEQID NO:35’ -ATGACGCTCATCATGATCGT-3 ’
SEQ ID NO:45’ -TGATGTATAGATTGGTCATG3’ 用cDNA为模板进行梯度PCR操作扩增鸡抗菌肽β -防御素重组蛋白CBD基因序列，PCR反应体系为25 μ L体系，反应条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火45s，72 °C延伸2min，共35个循环，而后72°C延伸7min ； ③、PCR产物的回收和纯化； ④、克隆； ⑤、测序鉴定。
【文档编号】C12N15/12GK103710349SQ201310654728
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】段升华 申请人:中山奈德生物科技有限公司