专利名称：酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌全细胞混悬液的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抗肿瘤作用的药物的制备方法，特别涉及酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌全细胞混悬液的制备方法。
背景技术：
近年来，我国每年新增肿瘤患者160万-170万人，总数在450万人左右。其发病率和死亡率均呈现上升趋势。国家卫生部发布的《2009年中国卫生统计提要》显示，2008 年部分市县前十位疾病死亡专率中，恶性肿瘤居于首位，已成为危害人类健康的头号杀手。目前现有技术中已存在许多抗肿瘤化疗药物，而且有更多的化合物已被发现具有抗肿瘤作用。但是，大多数抗肿瘤药物由于缺乏理想的选择性，在抑制或杀伤肿瘤细胞的同时，对人体正常组织细胞也具有抑制或损伤作用，因而具有较多的副作用，如蒽环类抗癌抗生素阿霉素的心脏毒性、顺钼加环磷酰胺化疗方案所致骨髓毒性的作用、顺钼治疗卵巢癌或睾丸癌所诱导的神经毒性及其肾毒性等。除化疗药物外，肿瘤的放射疗法及手术治疗目前也很难达到理想的效果。因此，肿瘤治疗新方法及新药物的研发成为国内外医药领域的研发热点。随着细菌生物学和分子生物学的发展，人们认识到许多细菌(如幽门螺杆菌)可以引起肿瘤，同时，一些细菌及其产物也具有肿瘤抑制作用。早在200年前，人们就已经发现某些肿瘤患者在急性细菌感染后，肿瘤生长被抑制(韩景田，张国辉综述，董小青审校.细菌及其产物对肿瘤的影响研究进展.武警医学院学报.2009年2月，第18卷，第2 期，159-161页)。二十世纪八十年代，皮肤病专家发现细菌感染引发的痤疮患者患皮肤癌、 淋巴癌和白血病的几率相对较低，并且这些细菌注入动物体内会导致肿瘤萎缩。对细菌的不同组分进行分离并进行实验发现，细菌所含的脂多糖是其肿瘤抑制作用的活性组分。由于自然科学的发展、基础理论研究与新技术的应用，肿瘤学研究有了长足的进步，细菌及其产物对肿瘤的治疗作用成为该研究领域的热门课题之一。在肿瘤细胞发生发展的过程中，由于基因突变等原因肿瘤细胞会表达一些新的抗原。这些新抗原作为“非己”物质，可以被机体的免疫系统识别和杀伤。然而肿瘤在人体免疫功能作用下仍能发展、转移，表明肿瘤也有自己的保护机制。当机体发生肿瘤时，肿瘤细胞可以凭借多种方式逃避免疫系统的监控而分裂生长，即肿瘤的免疫逃逸(丁红仙.肿瘤免疫逃逸机制的研究进展.海峡药学.2008年，第20卷，第7期，12-14页)。肿瘤细胞通过自分泌-旁分泌途径能分泌免疫抑制性细胞因子，如转化生长因子β (TGF-β)、白细胞介素-IO(IL-IO)、血管内皮生长因子(VEGF)和IL-4等，使肿瘤局部形成深度免疫抑制区， 不仅使身在其中的免疫细胞功能受到严重抑制，甚至功能正常、活化的免疫细胞，一旦进入此环境也将成为免疫功能抑制的“沉默”细胞，是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一(Colombo MP, Piconese S. Regulatory—T—cell inhibition versus depletion :the right choice in cancer immunotherapy. Nat RevCancer. 2007 Nov ；7 (11) :880-7.)。 TGF-β 是介导月中瘤免疫逃逸最有效的免疫抑制分子，能广泛抑制肿瘤患者的免疫系统，可以抑制T细胞增殖，抑制IL-I β、IL-2受体的表达，拮抗抑制Y干扰素、肿瘤坏死因子α (TNF-α )等的免疫效应。IL-10可阻抑抗原递呈细胞(APC)在肿瘤组织的浸润、分化、成熟及对抗原的趋化反应，诱导其表面⑶86、⑶40、⑶讨分子、HLA-I及HLA-II类分子低表达或不表达，直接或通过功能缺陷型APC使细胞毒T淋巴细胞(CTL)处于免疫无能状态。VEGF可影响树突状细胞的分化与成熟，阻碍其抗原递呈功能，进一步影响CTL的扩增、活化及瘤细胞对CTL杀伤的敏感性，还可通过上调B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-幻的表达，抑制瘤细胞凋亡， 在一定程度上限制了机体的有效抗肿瘤免疫。经研究，已经发现多种细菌及其产物具有诱导机体抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长的药理活性，比如李斯特菌是一种广泛存在于自然界的革兰阳性菌，可感APC，激发强烈的细胞免疫，CD4和CD8+T细胞介导的细胞免疫是其特。即使高度减毒的李斯特菌在免疫治疗中仍具有的抗月中瘤效能(Paterson Y, Maciag PC. Listeria-based vaccines for cancer treatment. Curr OpinMol Ther. 2005 Oct ；7 (5) :454-60)。卡介苗(BCG)作为免疫佐剂在防治膀胱肿瘤方面也取得了良好效果，BCG灌注被认为是膀胱肿瘤最有效的辅助治疗手段之一。BCG刺激宿主免疫系统产生抗癌免疫效应与其多种活性组分有关，如核酸、胞壁中的脂质、及脂多糖均能刺激机休免疫系统产生抗癌免疫反应。应用乳酸杆菌LC9018治疗C3H/He系小鼠膀胱癌的实验发现，癌组织可检测到抗肿瘤细胞因子(TNF-α、IL-12)mRNA局部明显的高表达。已知绿脓杆菌的(LPQ能显著延长急性髓性血病患者的缓解期和生存；葡萄球菌肠毒素A对肿瘤细胞具有杀伤作用。金黄色葡萄球菌菌株ATCC25923的DNA也具有抗肿瘤效应(历风元，蒋智敏，周文清，朱涟敏.金黄色葡萄球菌DNA抗肿瘤免疫的实验研究.江西医学院学报.2008年，第48卷，第6期，28-32页)中国专利95193357. 4 (专利权人斯坦福鲁克有限公司；申请日1995. 03. 29，公开号1150388，
公开日1997. 05.21)公开了一种牦牛分支杆菌菌株(NTCT11659菌株)，具有抗肿瘤作用。中国专利02111996. 1 (专利权人靳海；申请日2002. 06. 05，公开号1465353，
公开日2004. 01. 07)公开了一种粘质沙雷氏菌S311菌株(菌种编号=CGMCC NO. 0744)，具有抗肿瘤作用，并已获得中国生物制品一类新药证书。美国专利US3477914(专利权人日本中外制药株式会社即CHUGAI PHARMACEUTICAL COLTD ；
公开日1969年11月11日)公开了一种用青霉素处理的酿脓链球菌Su菌株，具有抗肿瘤作用。目前上市的0K432、沙培林、力尔凡等链球菌制剂既是青霉素处理的酿脓链球菌Su菌株。该专利实施例1给出的数据显示青霉素浓度为5. 4X IO4单位/ml时，与艾氏腹水瘤细胞混合培养，接种于小鼠50天内，小鼠存活率为100%，且均未发现肿瘤。但青霉素的加入限制了该药在青霉素过敏患者中的应用，且所提供的实验结果与国内文献(吴战宇，邱芳萍，卢日峰.改良培养基制备A群链球菌制剂及其抗肿瘤活性研究.中国药业.2007年，第16卷第6期，第5-6页)及临床使用效果差异较大。国内文献报道其中剂量给药后艾氏腹水瘤及肝癌腹水瘤小鼠的生命延长率最高，为63. 38% ；最常生存天数不超过30天。美国专利US3627644(
公开日1971年12月14日)公开了一种酿脓链球菌菌株(ATCC21060)具有抗肿瘤作用。美国专利US434卯41 (专利权人日本中外制药株式会社；
公开日1982年09月14 日)公开了一种酿脓链球菌菌株(ATCC21597)具有抗肿瘤作用。美国专利US4678773(专利权人日本中外制药株式会社；
公开日1987年07月07 日)公开了一种酿脓链球菌菌株(ATCC21059)具有抗肿瘤作用。美国专利US61141 (
公开日2001年04月10日)公开了一种链球菌菌株 (DSM8747)的脂磷壁酸LTA-T，具有抗肿瘤作用。中国目前上市的药品中，已出现酿脓链球菌自酿脓链球菌中提取的以~ -甘露聚糖肽为主的多种成分制成的抗肿瘤制剂，对恶性胸腔积液疗效显著，瘤内及全身用药对实体瘤有一定疗效，也可用与肿瘤放射治疗及化疗联合，作为恶性肿瘤的辅助治疗。细菌细胞用于制备抗肿瘤药物的研究非常广泛，但是由于细菌本身的致病性，一般需要灭活，减小毒性后才能使用。但是毒性的减小往往伴随着抗肿瘤效果的降低，因此， 如何控制毒性与疗效的平衡至为重要。在已公开的抗肿瘤细菌制剂(细胞组分除外)中大多仅处于实验阶段，由于疗效不稳定，差异较大，未能进入临床应用。以细菌组分如~ -甘露聚糖肽、脂磷壁酸、DNA等制成的抗肿瘤药物有确切疗效质量易于控制，但由于细菌抗肿瘤机制尚不完全清楚，因此单种或多种细菌组分混合物(细菌DNA、细菌代谢产物等)治疗肿瘤的疗效并不优于紫杉醇等现有抗肿瘤药物。现有研究资料及技术文献显示多种酿脓链球菌菌株的全细胞制剂具有抗肿瘤的药理活性，关于粘质沙雷氏菌其他菌株的全细胞制剂未见抗肿瘤活性报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种治疗肿瘤的复合细菌全细胞混悬液及其制备方法。本发明是通过以下技术方案实现的一种酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌全细胞混悬液的制备方法，步骤如下酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌分别培养，得全细胞培养液，然后将两种细菌按照细菌个数比例为1 1 或2 1的比例混合，热灭活后用含苯酚或间苯二酚l_3g/l的苯酚生理盐水稀释，即配制成全细胞混悬液。所述酿脓链球菌和粘质沙雷氏菌的培养条件为用每升双蒸水含牛肉膏3. 0g、新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g、氯化钠5. 0g、pH值为7. 2-7. 4的液体培养基在振荡频率为 50rpm、振幅为19mm条件下培养22 M小时；或在每升双蒸水含牛肉膏3. 0g、新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g、氯化钠5. 0g、pH值为7. 2-7. 4的固体培养基上培养22 24小时； 酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌培养温度分别为37°C和25°C。所述酿脓链球菌和粘质沙雷氏菌主种子批菌种启开后传代次数均不超3代，工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数均不超过3代。所述热灭活条件为68°C下热灭活90分钟；或75°C下热灭活60分钟。所述酿脓链球菌的菌株为ATCC19615、ATCC21059、ATCC21597、ATCC21060、 ATCC21068, ATCC700924, ATCC12351 或 CMMCC32210 株中的任一种。所述粘质沙雷氏菌的菌株为ATCC43820、ATTCC43821、ATCC14041、ATCC27117、ATCC13880、ATCC8195 或 ATCC8100 株中的任一种。上述制备方法制备得到的酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌全细胞混悬液，混悬液中， 酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细菌总数为每毫升10万 300万个，优选每毫升10万 30万个。上述制备方法制备得到的酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌全细胞混悬液可以用于治疗肿瘤，其给药途径为瘤内注射、腔内注射或肌肉注射。需要注意的是，在本发明的复合细菌混悬液中酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌比例不变的情况下，本技术领域所属技术人员也可制成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌的细菌总数高于每毫升10万 300万个的复合细菌混悬液，但给患者使用时的最终浓度应为酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌的细菌总数为10万 300万个。本发明的发明人通过大量菌株筛选、组方筛选、工艺研究及临床前药效学实验， 发现革兰氏阴性粘质沙雷氏菌的菌株为ATCC43820、ATTCC43821、ATCC14041、ATCC27117、 ATCC13880、ATCC8195、ATCC8100株虽无显著的抗肿瘤作用，但对革兰氏阳性酿脓链球菌 ATCC19615、ATCC21059、ATCC 21597、ATCC21060、ATCC21068、ATCC700924、ATCC12351、 CMMCC32210菌株的抗肿瘤效果有显著的增效作用。未经青霉素处理的酿脓链球菌和粘质沙雷氏菌，主种子批菌种启开后传代次数1-3代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数1-3代。热灭活并后按照1 1或2 1混合，混悬液中酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌的总浓度为每毫升10万-300个时具有显著的抗肿瘤效果且毒性较小。完全出乎意料的是，本发明的发明人在药效学研究中惊奇的发现，本发明的复合细菌全细胞混悬液在体内外试验中疗效显著优于酿脓链球菌、0K432和紫杉醇，且瘤内注射后对实体瘤具有促使肿瘤瘤块脱落的效果。另外，本发明的复合细菌全细胞混悬液未使用青霉素处理，避免了对青霉素过敏患者的使用限制。由上可见，本发明的将具有抗肿瘤活性的酿脓链球菌菌株与其他无显著抗肿瘤作用的粘质沙雷氏菌全细胞组合的技术方案，取得了意想不到的效果， 其抗肿瘤作用及效果等是所属技术领域技术人员所无法预见或推测的，具备突出的实质性特点和显著的进步。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明实施例1ATCC43820与ATCC21059复合细菌全细胞混悬液的制备菌株酿脓链球菌ATCC21059菌株，粘质沙雷氏菌ATCC43820菌株酿脓链球菌ATCC21059菌株与粘质沙雷氏菌ATCC43820菌株分别培养，按比例混
口 O1.菌株传代培养基组成每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化钠 5. Og0培养条件pH为7. 5 ；50rpm振荡培养，振幅19mm，粘质沙雷氏菌菌株在25°C下培养；菌株酿脓链球菌菌株在37 °C下培养。传代次数主种子批菌种启开后传代次数为1代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数1代。
2.复合细菌全细胞混悬液的制备培养基每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化钠 5. Og0培养条件pH为7. 2 ；50rpm振荡培养，振幅19mm，粘质沙雷氏菌菌株在25°C下培养M小时；菌株酿脓链球菌菌株在37°C下培养M小时。上述细菌采用直接计数法计数后，按照酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细胞比例为
1 1的比例混合，于68°C下热灭活90分钟，用含苯酚2.0g/L的苯酚生理盐水稀释，配制成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细菌总浓度为每毫升20万个的混合液。所得混合液为淡红色悬液，无摇不散的菌块或异物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至温度降到10°C，然后 2-6C下冻存。实施例2ATTCC43821与ATCC21060复合细菌全细胞混悬液的制备菌株酿脓链球菌ATCC21060菌株，粘质沙雷氏菌ATTCC43821菌株1.菌株传代培养基组成每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化钠 5. Og0培养条件pH为7. 0 ；50rpm振荡培养，振幅19mm，粘质沙雷氏菌在27°C下培养；菌株酿脓链球菌菌株在37 °C下培养。传代次数主种子批菌种启开后传代次数为2代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数1代。2.复合细菌全细胞混悬液的制备培养基每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化钠 5. Og0培养条件pH为7. 4 ；50rpm振荡培养，振幅19mm，粘质沙雷氏菌菌株在30°C下培养22小时；菌株酿脓链球菌菌株在37°C下培养22小时。上述细菌采用直接计数法计数后，按照酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细胞比例为
2 1的比例混合，于68°C下热灭活90分钟，用含苯酚3. 0g/L的苯酚生理盐水稀释，配制成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌总浓度为每毫升200万个的混合液。所得混合液为淡红色悬液，无摇不散的菌块或异物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至温度降到10°C，然后2-6°C 下冻存。实施例3ATCC13880与ATCC7009M复合细菌全细胞混悬液的制备菌株酿脓链球菌ATCC7009M菌株，粘质沙雷氏菌ATCC13880菌株1.菌株传代培养基组成每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化钠 5. Og0培养条件pH为7. 3 ；50rpm振荡培养，振幅19mm，粘质沙雷氏菌在25°C下培养；菌株酿脓链球菌菌株在37 °C下培养。传代次数主种子批菌种启开后传代次数为2代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数2代。2.复合细菌全细胞混悬液的制备
培养基每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化钠 5. Og0培养条件pH为7.4;50rpm振荡(振幅19mm)培养，粘质沙雷氏菌菌株在25°C下培养23小时；菌株酿脓链球菌菌株在37°C下培养23小时。上述细菌采用直接计数法计数后，按照酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细胞比例为 2 1的比例混合，于68°C下热灭活90分钟，用含苯酚3. Og/L的苯酚生理盐水稀释，配制成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌总浓度为每毫升30万个的混合液。所得混合液为淡红色悬液，无摇不散的菌块或异物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至温度降到10°C，然后2-6°C 下冻存。实施例4ATCC27117与ATCC21068复合细菌全细胞混悬液的制备菌株酿脓链球菌ATCC21068菌株，粘质沙雷氏菌ATCC27117菌株1.菌株传代培养基组成每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化钠 5. Og0培养条件pH为7. 2 ；50rpm振荡(振幅19mm)培养，粘质沙雷氏菌在25°C下培养； 菌株酿脓链球菌菌株在37 °C下培养。传代次数主种子批菌种启开后传代次数为2代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数2代。2.复合细菌全细胞混悬液的制备 培养基每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化钠 5. Og0培养条件pH为7.4;50rpm振荡(振幅19mm)培养，粘质沙雷氏菌菌株在25°C下培养22小时；菌株酿脓链球菌菌株在37°C下培养M小时。上述细菌采用直接计数法计数后，按照酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细胞比例为 1 1的比例混合，68°C下热灭活90分钟，用含苯酚2. 0g/L的苯酚生理盐水稀释，配制成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌总浓度为每毫升180万个的混合液。所得混合液为淡红色悬液， 无摇不散的菌块或异物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至温度降到10°C，然后2-6°C下冻存。实施例5ATCC14041与ATCC19615复合细菌全细胞混悬液的制备菌株酿脓链球菌ATCC19615菌株，粘质沙雷氏菌ATCC14041菌株1.菌株传代培养基组成每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化钠 5. Og0培养条件pH为7.4;50rpm振荡(振幅19mm)培养，粘质沙雷氏菌在25°C下培养； 菌株酿脓链球菌菌株在37 °C下培养。传代次数主种子批菌种启开后传代次数为3代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数2代。2.复合细菌全细胞混悬液的制备培养基每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化钠5. Og0培养条件pH为7.3;50rpm振荡(振幅19mm)培养，粘质沙雷氏菌菌株在25°C下培养M小时；菌株酿脓链球菌菌株在37°C下培养23小时。上述细菌采用直接计数法计数后，按照酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细胞比例为 1 1的比例混合，68°C下热灭活90分钟，用含苯酚2. Og/L的苯酚生理盐水稀释，配制成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌总浓度为每毫升20万个的混合液。所得混合液为淡红色悬液，无摇不散的菌块或异物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至温度降到10°C，然后2-6°C下冻存。实施例6ATCC43820与ATCC21060复合细菌全细胞混悬液的制备菌株酿脓链球菌ATCC21060菌株，粘质沙雷氏菌ATCC43820菌株1.菌株传代培养基组成每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化钠 5. Og0培养条件pH为7. 3 ；50rpm振荡(振幅19mm)培养，粘质沙雷氏菌在25°C下培养； 菌株酿脓链球菌菌株在37 °C下培养。传代次数主种子批菌种启开后传代次数为3代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数2代。2.复合细菌全细胞混悬液的制备 培养基每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化钠 5. Og0培养条件pH为7.2;50rpm振荡(振幅19mm)培养，粘质沙雷氏菌菌株在25°C下培养M小时；菌株酿脓链球菌菌株在37°C下培养22小时。上述细菌采用直接计数法计数后，按照酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细胞比例为 1 1的比例混合，75°C下热灭活60分钟，用含苯酚2. 0g/L的苯酚生理盐水稀释，配制成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌总浓度为每毫升10万个的混合液。所得混合液为淡红色悬液，无摇不散的菌块或异物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至温度降到10°c，然后2-6°C下冻存。实施例7ATTCC43821与ATCC21059复合细菌全细胞混悬液的制备菌株酿脓链球菌ATCC21059菌株，粘质沙雷氏菌ATTCC43821菌株1.菌株传代培养基组成每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化钠 5. Og0培养条件pH为7. 2 ；50rpm振荡(振幅19mm)培养，粘质沙雷氏菌在25°C下培养； 菌株酿脓链球菌菌株在37 °C下培养。传代次数主种子批菌种启开后传代次数为2代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数1代。2.复合细菌全细胞混悬液的制备培养基每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化钠 5. Og0
培养条件pH为7.3;50rpm振荡(振幅19mm)培养，粘质沙雷氏菌菌株在25°C下培养M小时；菌株酿脓链球菌菌株在37°C下培养23小时。上述细菌采用直接计数法计数后，按照酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细胞比例为 1 1的比例混合，75°C下热灭活60分钟，用含苯酚2. Og/L的苯酚生理盐水稀释，配制成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌总浓度为每毫升20万个的混合液。所得混合液为淡红色悬液，无摇不散的菌块或异物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至温度降到10°C，然后2-6°C下冻存。实施例8ATCC13880与ATCC21060复合细菌全细胞混悬液的制备菌株酿脓链球菌ATCC21060菌株，粘质沙雷氏菌ATCC13880菌株1.菌株传代培养基组成每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化钠 5. Og0培养条件pH为7.4;50rpm振荡(振幅19mm)培养，粘质沙雷氏菌在25°C下培养； 菌株酿脓链球菌菌株在37 °C下培养。传代次数主种子批菌种启开后传代次数为2代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数1代2.复合细菌全细胞混悬液的制备培养基酿脓链球菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og,新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. 0g，氯化钠5. 0g。粘质沙雷氏菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og, 新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化钠5. Og，琼脂20g。培养条件酿脓链球菌菌株培养条件pH为7. 2 ；50rpm振荡(振幅19mm)培养，在 37°C下培养22小时。粘质沙雷氏菌菌株培养条件pH为7. 4 ；25°C下培养M小时。上述细菌采用直接计数法计数后，用含苯酚2. 0g/L的苯酚生理盐水适当稀释，按照酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细胞比例为1 1的比例混合，75°c下热灭活60分钟后，用含间苯二酚2. 0g/L的苯酚生理盐水稀释配制成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌总浓度为每毫升280万个的混合液。所得混合液为淡红色悬液，无摇不散的菌块或异物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至温度降到10°C，然后4°C下冻存。实施例9ATCC27117与ATCC21059复合细菌全细胞混悬液的制备菌株酿脓链球菌ATCC21059菌株，粘质沙雷氏菌ATCC27117菌株1.菌株传代培养基酿脓链球菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og,新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化钠5. Og。粘质沙雷氏菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og, 新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化钠5. Og，琼脂20g。培养条件酿脓链球菌菌株培养条件pH为7. 2 ；50rpm振荡(振幅19mm)培养，在 37 °C下培养。粘质沙雷氏菌菌株培养条件pH为7. 4 ； 25 °C下培养。传代次数主种子批菌种启开后传代次数为1代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数1代。2.复合细菌全细胞混悬液的制备培养基酿脓链球菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og,新胨蛋白胨(Neopeptone) 10. Og，氯化钠5. Og。粘质沙雷氏菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og, 新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化钠5. Og，琼脂20g。培养条件酿脓链球菌菌株培养条件pH为7. 3 ；50rpm振荡(振幅19mm)培养，在 37°C下培养M小时。粘质沙雷氏菌菌株培养条件pH为7. 2 ；25°C下培养23小时。上述细菌采用直接计数法计数后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理盐水适当稀释，按照酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细胞比例为1 1的比例混合，75°c下热灭活60分钟后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理盐水稀释配制成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌总浓度为每毫升80 万个的混合液。所得混合液为淡红色悬液，无摇不散的菌块或异物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至温度降到10°C，然后4°C下冻存。实施例10ATTCC43821与ATCC21597复合细菌全细胞混悬液的制备菌株酿脓链球菌ATCC21597菌株，粘质沙雷氏菌ATTCC43821菌株1.菌株传代培养基酿脓链球菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og,新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化钠5. Og。粘质沙雷氏菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og, 新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化钠5. Og，琼脂20g。培养条件酿脓链球菌菌株培养条件pH为7. 4 ；50rpm振荡(振幅19mm)培养，在 37 °C下培养。粘质沙雷氏菌菌株培养条件pH为7. 3 ； 25 °C下培养。传代次数主种子批菌种启开后传代次数为1代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数1代。2.复合细菌全细胞混悬液的制备培养基酿脓链球菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化钠5. Og。粘质沙雷氏菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og, 新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化钠5. Og，琼脂20g。培养条件酿脓链球菌菌株培养条件pH为7. 2 ；50rpm振荡(振幅19mm)培养，在 37°C下培养23小时。粘质沙雷氏菌菌株培养条件pH为7. 4 ；25°C下培养22小时。上述细菌采用直接计数法计数后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理盐水适当稀释，按照酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细胞比例为1 1的比例混合，75°c下热灭活60分钟后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理盐水稀释配制成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌总浓度为每毫升 160万个的混合液。所得混合液为淡红色悬液，无摇不散的菌块或异物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至温度降到10°C，然后4°C下冻存。实施例11ATCC27117与ATCC21060复合细菌全细胞混悬液的制备菌株酿脓链球菌ATCC21060菌株，粘质沙雷氏菌ATCC27117菌株1.菌株传代培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化钠 5. Og,琼脂 20g.培养条件pH为7. 3 ；酿脓链球菌在37°C下培养；粘质沙雷氏菌菌株在25°C下培养。传代次数主种子批菌种启开后传代次数为1代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数1代。
2.复合细菌全细胞混悬液的制备培养基每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化钠 5. Og，琼脂 20g。培养条件pH为7. 2 ；酿脓链球菌在37°C下培养M小时；粘质沙雷氏菌菌株在 25°C下培养22小时。上述细菌采用直接计数法计数后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理盐水适当稀释，按照酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细胞比例为1 1的比例混合，75°c下热灭活60分钟后，用含苯酚1. 0g/L的苯酚生理盐水稀释配制成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌总浓度为每毫升 160万个的混合液。所得混合液为淡红色悬液，无摇不散的菌块或异物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至温度降到10°C，然后4°C下冻存。实施例12ATCC43820与ATCC21597复合细菌全细胞混悬液的制备菌株酿脓链球菌ATCC21597菌株，粘质沙雷氏菌ATCC43820菌株1.菌株传代培养基每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. 0g，氯化钠 5. 0g，琼脂 20g。培养条件pH为7. 3 ；酿脓链球菌在37°C下培养；粘质沙雷氏菌菌株在25°C下培养。传代次数主种子批菌种启开后传代次数为1代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数3代。2.复合细菌全细胞混悬液的制备培养基每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化钠 5. Og，琼脂 20g。培养条件pH为7. 2 ；酿脓链球菌在37°C下培养1周；粘质沙雷氏菌菌株在25°C 下培养5天。上述细菌采用直接计数法计数后，用含苯酚2. 0g/L的苯酚生理盐水适当稀释，按照酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细胞比例为1 1的比例混合，68°c下热灭活90分钟后，用含苯酚2. 0g/L的苯酚生理盐水稀释配制成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌总浓度为每毫升 200万个的混合液。所得混合液为淡红色悬液，无摇不散的菌块或异物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至温度降到10°C，然后4°C下冻存。实施例13ATCC14041与ATCC7009M复合细菌全细胞混悬液的制备菌株酿脓链球菌ATCC7009M菌株，粘质沙雷氏菌ATCC14041菌株1.菌株传代培养基粘质沙雷氏菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化钠5. Og。酿脓链球菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化钠5. Og，琼脂20g。培养条件酿脓链球菌菌株培养条件pH为7. 3 ；在37°C下培养。粘质沙雷氏菌菌株培养条件PH为7. 4 ；25°C下50rpm振荡(振幅19mm)培养。传代次数主种子批菌种启开后传代次数为2代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数2代。
2.复合细菌全细胞混悬液的制备培养基粘质沙雷氏菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化钠5. Og。酿脓链球菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化钠5. Og，琼脂20g。培养条件酿脓链球菌菌株培养条件pH为7. 4 ；在37°C下培养M小时。粘质沙雷氏菌菌株培养条件pH为7. 4 ；25°C下50rpm振荡(振幅19mm)培养M小时。上述细菌采用直接计数法计数后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理盐水适当稀释，按照酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细胞比例为1 1的比例混合，68°c下热灭活90分钟后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理盐水稀释配制成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌总浓度为每毫升10 万个的混合液。所得混合液为淡红色悬液，无摇不散的菌块或异物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至温度降到10°C，然后4°C下冻存。实施例14ATTCC43821与ATCC19615复合细菌全细胞混悬液的制备菌株酿脓链球菌ATCC19615菌株，粘质沙雷氏菌ATTCC43821菌株1.菌株传代培养基粘质沙雷氏菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化钠5. Og。酿脓链球菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化钠5. Og，琼脂20g。培养条件酿脓链球菌菌株培养条件pH为7. 3 ；在37°C下培养。粘质沙雷氏菌菌株培养条件pH为7. 4 ;25°C下50rpm振荡(振幅19mm)培养。传代次数主种子批菌种启开后传代次数为2代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数2代。2.复合细菌全细胞混悬液的制备培养基粘质沙雷氏菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化钠5. Og。酿脓链球菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化钠5. Og，琼脂20g。培养条件酿脓链球菌菌株培养条件pH为7. 4 ；在37°C下培养23小时。粘质沙雷氏菌菌株培养条件pH为7. 2 ；25°C下50rpm振荡(振幅19mm)培养M小时。上述细菌采用直接计数法计数后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理盐水适当稀释，按照酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细胞比例为1 1的比例混合，68°c下热灭活90分钟后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理盐水稀释配制成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌总浓度为每毫升10 万个的混合液。所得混合液为淡红色悬液，无摇不散的菌块或异物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至温度降到10°C，然后4°C下冻存。实施例15ATTCC8195与ATCC12351复合细菌全细胞混悬液的制备菌株酿脓链球菌ATCC12351菌株，粘质沙雷氏菌ATTCC8195菌株1.菌株传代培养基粘质沙雷氏菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化钠5. Og。酿脓链球菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化钠5. Og，琼脂20g。培养条件酿脓链球菌菌株培养条件pH为7. 2 ；在37°C下培养。粘质沙雷氏菌菌株培养条件pH为7. 4 ;25°C下50rpm振荡(振幅19mm)培养。传代次数主种子批菌种启开后传代次数为2代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数2代。2.复合细菌全细胞混悬液的制备培养基粘质沙雷氏菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. 0g，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化钠5. Og。酿脓链球菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化钠5. Og，琼脂20g。培养条件酿脓链球菌菌株培养条件pH为7. 4 ；在37°C下培养23小时。粘质沙雷氏菌菌株培养条件pH为7. 2 ;25°C下50rpm振荡(振幅19mm)培养22小时。上述细菌采用直接计数法计数后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理盐水适当稀释，按照酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细胞比例为2 1的比例混合，68°C下热灭活90分钟后，用含间苯二酚1. Og/L的苯酚生理盐水稀释配制成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌总浓度为每毫升20万个的混合液。所得混合液为淡红色悬液，无摇不散的菌块或异物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至温度降到10°C，然后4°C下冻存。实施例16ATTCC8100与CMCC32210复合细菌全细胞混悬液的制备菌株酿脓链球菌CMCC32210菌株，粘质沙雷氏菌ATTCC8100菌株1.菌株传代培养基粘质沙雷氏菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化钠5. Og。酿脓链球菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化钠5. Og，琼脂20g。培养条件酿脓链球菌菌株培养条件pH为7. 2 ；在37°C下培养。粘质沙雷氏菌菌株培养条件pH为7. 4 ;25°C下50rpm振荡(振幅19mm)培养。传代次数主种子批菌种启开后传代次数为2代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数2代。2.复合细菌全细胞混悬液的制备培养基粘质沙雷氏菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨 (Neopeptone) 10. Og，氯化钠5. Og。酿脓链球菌菌株培养基每升双蒸水含牛肉膏3. Og，新胨蛋白胨(Neop印tone) 10. Og，氯化钠5. Og，琼脂20g。培养条件酿脓链球菌菌株培养条件pH为7. 4 ；在37°C下培养23小时。粘质沙雷氏菌菌株培养条件pH为7. 2 ;25°C下50rpm振荡(振幅19mm)培养22小时。上述细菌采用直接计数法计数后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理盐水适当稀释，按照酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细胞比例为2 1的比例混合，68°C下热灭活90分钟后，用含苯酚1. Og/L的苯酚生理盐水稀释配制成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌总浓度为每毫升20 万个的混合液。所得混合液为淡红色悬液，无摇不散的菌块或异物，混合液配制后立即置冰乙醇浴直至温度降到10°C，然后4°C下冻存。实施例17复合细菌全细胞混悬液的毒性实验将酿脓链球菌菌株与粘质沙雷氏菌菌株按照实施例1-16所述的组合及制备方案制备培养后，按照细菌总浓度配制成6 X 109/ml、3 X 109/ml、1. 5 X 109/ml、7. 5 X 108/ml、 6. OXlOVmlU. OXlOVml六个浓度，每个浓度的悬液以0. 5ml腹腔注射体重20 25g小鼠5只，观察3天，注射含菌7. 5 XlOVml的小鼠全部生存，注射含菌1. 5X 109/ml的小鼠死亡率为40%-60%，注射含菌3X109/ml-6X107ml的小鼠死亡率为60%-100%。由此可见，实施例1-15所述混悬液的浓度均在安全剂量范围内。实施例18酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌的配比对抗肿瘤作用的影响酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌按照实施例4、5、8所述组合及配制方法方法制备成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌比例为1 0(不含粘质沙雷氏菌)、1 1、2 1、3 1、5 1、 1 3、1 6的混悬液，细菌总浓度为1.0X107ml。荷腹水瘤KM小鼠传至第二代，抽取瘤细胞，肉瘤S180腹水瘤稀释为IX IO7个/ml。每只小鼠消毒右前肢腋下皮肤，接种0. 2ml 瘤细胞，建立皮下实体瘤模型。肿瘤生长至^Omm3左右时腹腔注射给药每天给药1次，每次给药0. Iml (阴性对照组给予生理盐水)，共给药5次。至生理盐水组全部死亡，计算肿瘤生长抑制率及死亡率，肿瘤生长抑制率(％)=(生理盐组平均瘤重-给药组平均瘤重)/ (生理盐组平均瘤重)X 100 %，如表1所示。表1复合细菌全细胞混悬液中酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌的配比对抗肿瘤作用的影响
菌株组合菌株配比死亡率肿瘤生长抑制率ATCC21068ATCC271171017%65%ATCC21068ATCC27117110%92%*ATCC21068ATCC27117210%94%*ATCC21068ATCC271173133%68%ATCC21068ATCC271175133%62%ATCC21068ATCC271171317%54%ATCC21068ATCC271171617%44%ATCC19615ATCC140411:00%56%ATCC19615ATCC14041110%98%*ATCC19615ATCC14041210%95%*ATCC19615ATCC140413117%64%ATCC19615ATCC140415133%51%ATCC19615ATCC140411333%55%ATCC19615ATCC140411633%40%ATCC21060ATCCl33801033%71%ATCC21060ATCC13380110%93%*ATCC21060ATCCl3380210%86%*ATCC21060ATCC133803117%61%ATCC21060ATCC133805117%64%ATCC21060ATCCl3380130%56%ATCC21060ATCC13380160%49%*与相同菌株1 0(不含粘质沙雷氏菌)相比ρ <0.01。上述每组动物均为6只，数据表明酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌配比为1 1和 1 2时的抗肿瘤效果均优于酿脓链球菌单独使用的效果，以3 1、5 1、1 3、1 6等
15比例混合，虽然死亡率有所降低，但肿瘤生长抑制率较低未见显著升高。实施例19酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌的配比对抗肿瘤作用的影响酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌按照实施例7、12、15所述组合(比例可变)及配制方法方法制备成酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌比例为1 0(不含粘质沙雷氏菌)、1 1、2 1、 3 1、6 1、1 2、1 4的混悬液，细菌总浓度为1.0X106/ml。荷腹水瘤KM小鼠传至第二代，抽取瘤细胞，肝癌H22腹水瘤稀释为2. 5X IO7个/ml。每只小鼠消毒右前肢腋下皮肤，接种0. 2ml瘤细胞，建立皮下实体瘤模型。肿瘤生长至^Omm3左右时腹腔注射给药每天给药1次，每次给药0. Iml (阴性对照组给予生理盐水)，共给药5次。至生理盐水组全部死亡，计算肿瘤生长抑制率及死亡率，肿瘤生长抑制率(％)=(生理盐组平均瘤重-给药组平均瘤重)/(生理盐组平均瘤重)X 100%。同时以0K-432(日本中外制药公司，小鼠静脉注射剂0. 2mg/kg,隔天给药1次，共给药5次)及紫杉醇(15. Omg/kg,每天给药1次，共给药5次)为对照，比较组合菌株抗肿瘤作用，结果如表2所示。表2复合细菌全细胞混悬液中酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌的配比对抗肿瘤作用的影响
权利要求
1.一种酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌全细胞混悬液的制备方法，其特征在于，步骤如下 酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌分别培养，得全细胞培养液，然后将两种细菌按照细菌个数比例为1 1或2 1的比例混合，热灭活后用含苯酚或间苯二酚l_3g/l的苯酚生理盐水稀释，即配制成全细胞混悬液。
2.根据权利要求1所述的酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌全细胞混悬液的制备方法，其特征在于所述酿脓链球菌和粘质沙雷氏菌的培养条件为用每升双蒸水含牛肉膏3. 0g、新胨蛋白胨10. 0g、氯化钠5. 0g、pH值为7. 2-7. 4的液体培养基在振荡频率为50rpm、振幅为 19mm条件下培养22 M小时；或在每升双蒸水含牛肉膏3. 0g、新胨蛋白胨10. 0g、氯化钠5. 0g、pH值为7. 2-7. 4的固体培养基上培养22 M小时；酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌培养温度分别为37 °C和25 °C。
3.根据权利要求1所述的酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌全细胞混悬液的制备方法，其特征在于所述酿脓链球菌和粘质沙雷氏菌主种子批菌种启开后传代次数均不超3代，工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数均不超过3代。
4.根据权利要求1所述的酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌全细胞混悬液的制备方法，其特征在于所述热灭活条件为68°C下热灭活90分钟；或75°C下热灭活60分钟。
5.权利要求1 4所述的制备方法制备得到的酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌全细胞混悬液。
全文摘要
本发明公开了一种酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌全细胞混悬液的制备方法，步骤如下酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌分别培养，得全细胞培养液，然后将两种细菌按照细菌个数比例为1∶1或2∶1的比例混合，热灭活后用含苯酚或间苯二酚1-3g/l的苯酚生理盐水稀释，即配制成全细胞混悬液。本发明制备得到的酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌全细胞混悬液，混悬液中，酿脓链球菌与粘质沙雷氏菌细菌总数为每毫升10万～300万个，可以用于治疗肿瘤，其给药途径为瘤内注射、腔内注射或肌肉注射。
文档编号A61K35/74GK102232972SQ201010164039
公开日2011年11月9日 申请日期2010年5月6日 优先权日2010年5月6日
发明者厉保秋 申请人:山东大学