专利名称：衣霉素在制备抑制前列腺癌细胞迁移的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种天然的核苷酸抗生素衣霉素在制备抑制前列腺癌细胞迁移的药物中的应用。
背景技术：
前列腺癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤。在美国其发病率居男性恶性肿瘤首位，死亡率居第二位。随着人口老龄化和饮食结构的改变，前列腺癌已经成为威胁我国老年男性健康的重大疾病。
目前，前列腺癌的治疗可分为以下几种1根治性前列腺切除术主要适用于前列腺癌局限在前列腺以内者，但没有已侵犯精囊和淋巴结者经根治手术后获长期生存。前列腺癌根治术的手术死亡率1％～5％。目前较广泛应用的该手术即“保留神经的前列腺根治术”。2放射治疗外照射80％～90％前列腺癌可得到控制，失败常因为有转移。放射治疗会伴有很多并发症。3内分泌治疗前列腺细胞的正常代谢功能依赖于雄激素，在前列腺内变为双氢睾酮，其中仅3％为游离的功能性睾酮，进入前列腺细胞浆内，使之成为双氢睾酮，随后与受体结合成复合物进入细胞核，结合于核染色质的DNA；激活的DNA产生mRNA，变应为前列腺细胞蛋白的密码，对其代谢极为重要，前列腺内细胞对雄激素的信赖各不相同，癌细胞大多数信赖于雄激素，内分泌治疗直接去除雄激素可抑制其生长。4睾丸切除术睾丸切除可使血清睾酮从500ng/dI降至50ng/dl，从而有效地阻止了大多数依赖雄激素前列腺癌的代谢，使癌消退。睾丸切除术后可能出现阵发性发热、出汗、阳萎等。5雌激素可通过垂体性腺轴降低睾酮水平，抑制垂体释放促性腺激素黄体化激素(LH)，亦可增加性类固醇结合球蛋白，降低睾丸内睾酮的合成，增加垂体催乳素分泌，降低前列腺细胞内DNA合成，从而使睾酮达到去睾水平，对心血管系统有并发症，雌激素连续应用二年以上去睾成为不可逆。6抗雄激素药物它们主要作用是阻止雄激素作用于靶细胞，抑制前列腺细胞核的DNA合成。7促性腺释放激素类似物长期大量应用不仅会引起促性腺激素分泌过多，反而抑制垂体释放促性腺激素，该药优点是副作用少，无心血管并发症，停药后睾丸功能有可复性。8化学治疗由于前列腺癌70％～80％左右依赖雄激素，故优先考虑内分泌治疗，化学治疗常用在内分泌，放射等治疗失败以后采用。
抗生素(Antibiotics)是一类在低浓度时能选择性地抑制或杀灭其它微生物的低分子量微生物次生代谢产物。自从1929年英国学者弗莱明首先发现了青霉素以后，抗生素在抗感染、治疗癌症等方面发挥了重大的作用。在应用于临床以后，人们对抗生素进行了人为的加工和改造，使得抗生素的冶疗效果不断提高。抗生素是自然赐予人类的宝物，一直到目前为止，都是人类对抗疾病的最直接的武器，在医药领域有着重要的价值，在临床应用上有不可替代的作用。
在对前列腺癌细胞的研究中我们发现，按照对雄激素的敏感性，前列腺癌分为激素依赖性和激素非依赖性。体内外实验发现，去除睾酮可以引起激素依赖性前列腺癌细胞的凋亡。但是激素非依赖性前列腺癌则失去了正常的细胞凋亡调节，而且恶性度高，经常发生骨转移或肺转移，是临床致死的重要原因。而实验中我们所用的PC3细胞正是激素非依赖性前列腺癌细胞。寻求恢复激素非依赖性前列腺癌细胞凋亡的新型分子机制也是肿瘤细胞学前列腺癌领域的重要课题。
文献报道，CD147分子与前列腺癌PC3细胞的侵袭和转移相关，封闭CD147分子可以减低PC3细胞的侵袭和转移能力。CD147是一个跨膜糖蛋白家族，高表达于上皮来源的肿瘤细胞表面，如肺癌，肝癌，乳腺癌等。CD147通过诱导MMP(基质金属蛋白酶)的分泌促进了肿瘤的浸润，转移。基质金属蛋白酶能降解多种细胞外基质成分，包括层粘蛋白、纤粘蛋白、胶原和基底膜糖蛋白，是癌细胞破坏间质机械屏障，得以向癌周组织浸润、扩散的最为重要的一类蛋白水解酶。
我们考虑寻找到一种抗生素可使CD147蛋白去糖基化，阻碍或者降低其对基质金属蛋白酶的分泌，从而抑制癌细胞向癌周组织浸润、扩散。
发明内容
本发明的目的是提供一种核苷酸抗生素衣霉素，应用于制备前列腺癌细胞迁移的药物。
我们了解到CD147蛋白对于前列腺癌PC3细胞侵袭和转移具有十分重要的作用。考虑寻找到一种抗生素使CD147蛋白去糖基化，阻碍或者降低其对基质金属蛋白酶的分泌，从而抑制癌细胞向癌周组织浸润、扩散。首先在实验室中培养PC3细胞；然后试用若干种抗生素，例如四环素、青霉素等等，最终发现衣霉素(购于FERMENTEK生物制品公司，为唯一性产品。)可阻断CD147蛋白的糖基化，应用Western blot实验技术检测并证实衣霉素处理后PC3细胞中CD147蛋白去糖基化；再次应用划痕损伤测量了衣霉素处理后PC3细胞的迁移速率，以观察在衣霉素的处理作用后，PC3细胞的迁移速率是否减缓；最后流式细胞术检测衣霉素处理后PC3细胞周期变化。
有益效果在癌症的治疗中，癌细胞的迁移和浸润是影响治疗效果的一个难点，衣霉素可以使CD147蛋白去糖基化从而降低PC3细胞的迁移能力，可以开发为一种新的抑制癌细胞迁移的药物。
图1为经衣霉素处理后，不同组PC3细胞中CD147蛋白去糖基化水平Western blot结果图； 图2为PC3细胞划痕损伤后细胞迁移距离变化图； 图3为未加衣霉素处理的PC3细胞划痕损伤48h后的细胞迁移图； 图4为1ug/ml衣霉素处理后，PC3细胞划痕损伤48h后的细胞迁移图； 图5为0ug/ml衣霉素处理后，PC3细胞划痕损伤48h后的细胞迁移图； 图6为加衣霉素处理的PC3细胞流式图； 图71ug/ml衣霉素处理后，PC3细胞的流式图； 图810ug/ml衣霉素处理后，PC3细胞的流式图。
具体实施例方式 1、PC3细胞的培养 从-80℃冰箱中取出冻存的PC3细胞，迅速转移到37℃水浴锅中使细胞速溶，800r离心5分钟，弃上清。用1ml完全培养基将冻存管中的细胞悬起，800r离心5分钟，弃上清。1ml完全培养基将细胞悬起，用枪吸至10`厘米细胞培养板，加入7ml完全培养基，混匀细胞，放在37℃ 5％CO2恒温培养箱中，培养至细胞长满10`厘米细胞培养板。
注完全培养基为DMEM基本培养基中加入10％胎牛血清，1‰双抗。
2、Western blot检测CD147蛋白去糖基化水平 在12孔细胞培养板中铺4个玻璃片备用。消化PC3细胞后分别向12孔板中铺好玻璃片的4个孔中加入各100ul/孔的PC3细胞，1ml完全培养基。将细胞混匀，用枪头轻轻压实铺在12孔板中的玻璃片，以防止气泡存留。
将12孔板、放入37℃5％CO2恒温培养箱中，待细胞长至80％-90％，将细胞分为三组加入以下药品对照组，1ug衣霉素组，10ug衣霉素组。放入恒温培养箱中继续培养24小时，取出细胞。同上，将细胞分成三组，加药处理，放入恒温培养箱中培养48小时，取出细胞。
吸去培养基，500ul/孔预冷PBS洗细胞，吸出。收集细胞，裂解超声后对蛋白用BCA蛋白定量试剂盒对其进行蛋白定量。之后将该膜样品等蛋白量进行SDS-PAGE，并电转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，与1∶500稀释后的一抗孵育2h，TBST洗膜3次，每次15min，然后与1∶2000稀释后的二抗室温孵育1h，TBST洗膜3次，每次15min，用ECL化学发光试剂盒发光显影，于暗室中进行曝光，显影，定影。
3、划痕损伤测量细胞迁移速率 铺PC3六孔板细胞，加入DMEM完全培养及，恒温培养箱培养至细胞密度达到80％-90％时，吸去完全培养基，PBS洗一遍换用DMEM基本培养基，使细胞同步化，24小时后吸去基本培养基，用200ul枪头沿孔板直径划痕，PBS洗去划痕脱落细胞，加入DMEM完全培养基，将细胞分三组做如下处理对照组，1ug衣霉素组，10ug衣霉素组。分别在0h，15h，24h，48h小时用倒置显微镜照相，并用ImageJ软件分析划痕后细胞迁移变化，主要测量不同时段的划痕距离，每组测5个值取平均数。
4、流式细胞仪检测细胞周期变化 收集上述步骤加药48小时后的细胞培养液，2000转离心5分钟，PBS洗6孔板，100ul/孔胰酶消化细胞，37℃消化2分钟，培养液终止消化。将消化下的细胞转至1.5mlEP管中，2000转离心5分钟。弃上情，PBS洗细胞一次，离心收集细胞。加0.1ml/孔预冷70％乙醇固定，40分钟。PBS洗掉乙醇，离心弃上清。加入PI染液0.1ml/孔，4℃避光染色2小时，流式细胞仪分析细胞状况。
5、结果的分析 (1)、Western blot检测CD147去蛋白糖基化水平 Western blot检测结果如图1所示。六组蛋白分别对应六组细胞，从左到右依次为培养24h对照组；培养24h加入1ug/ml衣霉素处理组；培养24h加入10ug/ml衣霉素处理组；培养48h对照组；培养48h加入1ug/ml衣霉素处理组；培养48h加入10ug/ml衣霉素处理组。对应加入衣霉素的四组出现了特异性反应条带，同预期的结果相一致，对照组未出现此反应条带，表明衣霉素确实阻断了PC3细胞中CD147蛋白的糖基化过程。
(2)、划痕损伤测量细胞迁移速率 划痕测量数据见表1、图2，对照组的PC3细胞在划痕48小时后趋于将划痕部位长满；1ug衣霉素作用下细胞迁移速率较对照组慢；10ug衣霉素作用下细胞迁移较1ug衣霉素组更慢。这些变化也可以通过图3、4、5表现出来。以上结果说明衣霉素可以使CD147蛋白去糖基化，从而降低PC3细胞的迁移能力，且PC3细胞的迁移能力对衣霉素呈剂量依赖，未见衣霉素有促进PC3细胞凋亡的作用。
表1 PC3细胞在不同处理条件下随时间变化划痕距离的变化
(3)、流式细胞检测结果 图6、7、8为细胞流式结果图，从图中峰值变化及数据我们可以发现在不加药的情况下，处于S期的PC3细胞为38.764％，G2期0.510％，加入10ug衣霉素后，处于S期的PC3细胞为17.557％，G2期10.196％，加入1ug衣霉素后，处于S期的PC3细胞为17.873％，G2期0.547％，说明衣霉素可以促使PC3细胞提前进入G2期。
综上，可以看出衣霉素在对PC3细胞的作用中只体现出了抑制细胞迁移的作用，并没有促进PC3细胞凋亡的作用，且10ug的衣霉素比1ug时对细胞的迁移能力影响更大。流式检测细胞周期结果表明，衣霉素是通过影响细胞周期中S期和G2的变化来影响细胞的迁移能力的，是由于衣霉素使CD147蛋白去糖基化向胞浆转移，通过某些信号因子传递到细胞核，使细胞核对细胞周期产生了影响。
权利要求
1.衣霉素在制备抑制前列腺癌细胞迁移的药物中的应用，其特征是此种抗生素可阻断CD147蛋白的糖基化，从而抑制了PC3细胞的浸润和扩散。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及衣霉素在制备抑制前列腺癌细胞迁移的药物中的应用。CD147蛋白对于前列腺癌PC3细胞侵袭和转移具有十分重要的作用。寻找到一种抗生素使CD147蛋白去糖基化，阻碍或者降低其对基质金属蛋白酶的分泌，抑制癌细胞向癌周组织浸润、扩散。首先培养PC3细胞；然后试用若干种抗生素，应用Western blot实验技术检测，证实此种抗生素处理后PC3细胞中CD147蛋白去糖基化；再应用划痕损伤测量了此种抗生素处理后PC3细胞的迁移速率；最后流式细胞术检测抗生素处理后PC3细胞周期变化。此种抗生素可抑制了PC3细胞的浸润和扩散。从而开发为一种新药。
文档编号A61K31/7072GK101810634SQ201010164879
公开日2010年8月25日 申请日期2010年5月7日 优先权日2010年5月7日
发明者李晓萌, 潘莹, 高阳, 金浩, 王妍青 申请人:东北师范大学