专利名称：一种用于治疗乙型肝炎的重组质粒dna疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗乙肝疾病的重组质粒DNA疫苗组合物，属于生物医学领域。
背景技术：
乙型肝炎严重危害人类健康，目前尚无特效治疗手段，乙肝慢性化的主要原因是乙肝病毒(HBV)感染后机体缺乏持久的特异性细胞免疫及体液免疫。HBV外壳蛋白是有大蛋白LS(S1S2S抗原，由前Sl-前S2_S基因编码)、中蛋白 MS (S2S抗原，由前S2-S基因编码)、小蛋白S (S抗原，由S基因编码)三种分子构成，其中， 前S2抗原分子量小，抗原性强，涉及乙肝病毒对宿主细胞的吸附，因而含前S2抗原的疫苗对于接种者的保护作用应更为有效。HBdg是由乙型肝炎病毒基因C区基因编码，从第2个ATG起始翻译，含183-185个氨基酸多肽，分子量约为21KD，其C端富含精氨酸和多种蛋白酶作用位点，有结合RNA的能力，并与其组装成乙肝核心颗粒密切相关。HBdg颗粒由多个核心蛋白亚基构成，呈正二十面体对称的颗粒样结构，单个核心蛋白亚基(包括183-185个氨基酸多肽链)先形成同型二聚体(Homodimer)，二聚体再进一步聚集而形成HBcAg颗粒。重组质粒DNA疫苗是把外源基因克隆到真核表达载体上，然后将重组质粒直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。 与传统的疫苗相比，重组质粒DNA疫苗不仅能有效诱导体液免疫，还能诱导细胞免疫，可兼做预防和治疗性疫苗，DNA质粒疫苗已经在许多疾病的治疗和预防方面显示出广泛的应用前景。Mancini(Mancini M,Hadchouel M,Davis HL,et al. DNA-mediated immunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surface antigen chronic carrier state. ProNatl Acad Sci USA. 1996,93 :12496-12501)等应用编码 preS2/S HBV 包膜蛋白的重组质粒免疫HBV转基因小鼠，经过一次肌肉注射就能清除转基因小鼠循环中的HBsAg， 并且能够长期抑制肝细胞中的病毒复制，证实了 DNA疫苗在治疗慢性乙肝携带者的潜在优势° Mancini-Bourgine M 等(Mancini-Bourgine M, Fontaine H, Scott-Algara D, et al. Induction or expansion of T-cell responsese by a hepatitis B DanAvaccine administered to chronic HBV carriers. Hepatology. 2004,40 :874-882) jS ffi IS 石马 preS2/S HBV包膜蛋白的重组质粒免疫10例慢性乙肝携带者，这10例携带者未接受过任何的抗病毒治疗。结果发现，疫苗能够很好地耐受，有2例携带者的PBMC发生抗原特异性的 T淋巴细胞增殖反应，并且HBV特异性分泌IFN- γ的T细胞数目在免疫后有较大幅度的提高，有5例携带者的血清HBV DNA水平下降，但是这种下降仅仅是暂时性的。此次研究也证实了 HBV DNA疫苗的安全性以及能够在部分慢性乙肝携带者体内诱导出特异的T细胞免疫应答。HBcAg作为优势抗原，在乙肝疫苗的研究中也得到了广泛应用，Veremeiko TA等 (Veremeiko TA,Lebedev LR,Chikaev NA,et al. Humoral immune response ofBalb/c miceimmunized with chimer HBcAg proteins carrying the epitopes of surfacehepatic B virus protein. Vopr virusol，2007，52 :40-45)把HBV外壳蛋白表位插入到 HBcAg，成功构建了 HBcAg-HBsAg融合蛋白，并以此融合蛋白免疫Balb/cxiaoshi，产生了高滴度的针对插入表位HBsiVg和载体蛋白HBdg抗体。张炜等(张炜，懂生福，孙淑惠，等.乙肝病毒核心抗原DNA疫苗诱导小鼠抗原特异性CD8+T细胞动态变化和动态分布.中国免疫学杂志.2004， 20 (6) =379-383)研究了重组HBcAg真核表达质粒pHBcl44对C57BL/6小鼠的免疫作用，结果发现，pHBcl44面以后抗原特异性CD8+T细胞逐渐增多，在初次免疫的第14天出现第一个免疫应答高峰，此后抗原特异性CD8+T细胞数量组建下降进入免疫记忆期并在1年内维持在稳定水平。胸腺肽、GSF、IL-2、IL_4、IL-12或IFN-γ等为常作为免疫佐剂或增强剂，其中将胸腺肽、63 、11^-2或0^-^作为佐剂与HBV疫苗联合使用已有研究。IL-12具有多种生物活性，是最强的N K细胞激活因子，可促进CD4+ThO细胞分化为Thl细胞，可协调亚适剂量 IL-2诱导LAK(activated killer cells)细胞活性。作为重要的免疫调节分子，IL-12是迄今所知诱导Thl型免疫应答的最主要的细胞因子，原体如细菌、寄生虫、真菌和病毒感染所致疾病及肿瘤的DNA疫苗的研究。中国专利CN1316518A公开了一种重组真核表达质粒pS2S，质粒中含有细胞击落刺激因子，并将重组疫苗质粒与含IL-2和IFN- γ的重做佐剂质粒联合使用，发现发现重组佐剂质粒可以提高重组疫苗质粒的免疫和治疗作用。目前该项目已进入临床研究阶段。将乙肝表面抗原与乙肝核心抗原联合构建重组疫苗质粒时，现阶段通常是利用 HBcAg能装配成直径为27nm的颗粒状结构的特点，直接以HBcAg作为表达载体将乙肝病毒表面抗原融合到HBcAg，构建得到融合蛋白疫苗，或者扩增HBV的S和C基因并拼接成SC融合片段，将融合片段插入真核表达载体中构建融合表达HBsAg/HBcAg的重组DNA质粒。但这种方式构建得到的重组DNA质粒，在获得其中一种抗体滴度时，另一种抗原所产生的抗体滴度很弱，下降明显。虽然DNA疫苗的初步临床试验结果令人满意，但其免疫效果还未达到理想水平， 因此如何增强免疫效果已成为DNA疫苗研究的关键，尤其是在如何保证如何使DNA疫苗可同时获得较强的HBsAg和HBcAg的免疫效果方面。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于治疗乙型肝炎的重组质粒DNA疫苗组合物，本发明所述的重组质粒疫苗组合物含有同时携带乙肝中蛋白S2S编码基因及乙肝核心Core 蛋白编码基因的重组疫苗质粒，和至少一种重组佐剂质粒。本发明所述的重组疫苗质粒，还携带有大肠杆菌复制起始点ColEl、卡那霉素抗性基因序列Kan及两个目的蛋白表达盒；其中处于上游位置的表达盒为优化目的蛋白表达盒，其包括来源于SV40的增强子元件Enhancer、转录调控元件内含子^itronl和外显子 Exonl、来源于HBV的转录后调节元件HPRE。还含有克隆位点区MCS，所述的多克隆位点区包括 SwaI、KpnI、SalI、EcoRv、BglIII 等酶切位点。本发明中，提供的双质粒DNA疫苗组合物，其中所构建的重组疫苗质粒为携带HBV 中蛋白S2S编码基因和核心Core (C)蛋白编码基因的重组疫苗质粒，在所述的重组疫苗质粒中，抗原的表达先后顺序可以是先表达HBV中蛋白S2S后表达HBV核心Core蛋白，即构建的重组质粒为pS2S_C(质粒结构示意图见图1)，具有如kq ID No. 1所示的核苷酸序列；也可以是先表达HBV核心Core蛋白后表达HBV中蛋白S2S，即构建的重组质粒为pC_S2S (质粒结构示意图见图2)，具有如kq ID No. 2所示的核苷酸序列。本发明中，所用的重组佐剂质粒构建所用的细胞因子可以是选自白介素、干扰素、 细胞生长因子中的任意一种。用于本发明重组质粒DNA疫苗组合物的重组佐剂质粒，可以是重组白介素佐剂质粒或重组干扰素佐剂质粒。所述的重组白介素佐剂质粒可以是重组白介素2(pIU)佐剂质粒、重组白介素5佐剂质粒(pIL2)、重组白介素8佐剂质粒(pIL8)重组白介素10佐剂质粒 (PlLlO)、重组白介素12佐剂质粒(pIL12)、重组白介素15佐剂质粒(pILM)或重组白介素 18佐剂质粒(pIL18)中的任意一种；所述的重组干扰素佐剂质粒可以是重组干扰素α佐剂质粒、重组干扰素β佐剂质粒、重组干扰素Y佐剂质粒或重组干扰素λ佐剂质粒的任意一种。本发明还提供了一种构建本发明所述的同时携带乙肝中蛋白S2S编码基因及乙肝核心Core蛋白编码基因的重组疫苗质粒的犯法。构建重组质粒PS2S-C的步骤包括(1)先构建重组质粒载体骨架pOE-EKS 以pDRVISVl. 0为模板，以Primerl与Primer2为引物，其中引物2为5，末端磷酸化的引物，扩增获得大小为748bp的复制子区域(Ori)，同时引入Ec0RI、KpnI及SwaI酶切位点；Primerl :5’ -GGAATTCGGGGTACCATTTAAATTTGAACGTTCGCAAtATGTGAGCAAAAGGCCAG C-3，Primer2 :5’ -CGGCGCGCGCCGAAAACGACGATTGCGAACGTTCAACCCGTAGAAAAGATCAAAG G-3，以pDRVISVl. 0为模板，以Primerf与Primer4为引物，其中引物3为5，末端磷酸化的引物，扩增获得大小为1056bp的卡那抗性标记基因(Kan)，同时引入EcoRI酶切位点；Primer3 :5’ -tcgtcgttttcggcgcgcgccgTTGAACGTTCGCAAtTCAAGTCAGCGTAATGCT C-3，Primer4 :5，-GGAATTCGGCGCGCGCCGAAAACGACGATGCGAACGTTCAAGAAAGCCACGTTGTGTC T-3，将上述两个片段分别以EcoRI进行单酶切，连接后构建重组克隆pOK-EKS ；(2)构建重组质粒 DNA 疫苗 pRec2. 0_PreS2. S (pS2S)将合成基因ft~eS2S通过Xhol+Xbal双酶切与&ilI+XbaI双酶切的载体pHPRE连接，构建获得重组克隆pHPRE-PreS2S ；以pDRVISVl. 0为模板，以I^rimerS与I^rimere为引物，扩增获得大小为271bp的 BGHpolyA区，同时在上游引入BamHI酶切位点，下游引入Bglll-EcoRV-SalI-KpnI酶切位点；通过BamHI+Kpnl双酶切后克隆入Bglll+Kpnl双酶切的pHPRE_PreS2S载体中，获得重组质粒 pHPRE，-PreS2S ；Primer5 :5，_CGGGATCCgctgtgccttctagttgccag_3，
Primer6 :5’ -GGGGTACCGTCGACAACGTTGATATCAACGTTAGATCTCATAGAGCCCACCGCATC C-3'通过EcoRI+Kpnl将重组质粒pHPRE，_PreS2S的ft~eS2S表达盒克隆入载体 POK-EKS中，构建重组质粒pRec2. 0_PreS2S，其核苷酸序列为kq No. 2所标示的核苷酸序列。在上述方法中，所用的合成基因ft~eS2S委托北京雷默生物科技有限公司合成，其核苷酸序列为CCGCTCGAGCCGCCACCatgcagtggaacttaccacattccatcaggctctgctggaccctagagtgag gggactctatttccccgccggaggaagctcctctggcactgtgaacccagtgcccacaaccgcaagccctatttcct ctatctttagccggaccggagaccccgctcctaatATGGAAAACACTACCTCCGGCTTTCTGGGTCCACTGCTCGTC CTGCAGGCCGGCTTCTTCCTGCTCACCAGAATCCTGACAATCCCCCAGAGCCTGGACTCTTGGTGGACATCCCTGAA CTTCCTCGGAGGCGCACCCACTTGTCCTGGTCAGAATAGCCAGTCCCCAACCAGCAACCACTCCCCTACATCTTGTC CCCCAATTTGCCCTGGCTACAGGTGGATGTGTCTGAGACGCTTTATCATTTTCCTGTTTATCCTGCTCCTGTGCCTG ATTTTCCTGCTCGTGCTGCTGGACTACCAGGGAATGCTCCCCGTGTGTCCACTGCTCCCCGGAACCAGCACCACTTC CACCGGTCCTTGTAAGACATGCACAATCCCCGCTCAGGGCACCAGCATGTTTCCATCCTGTTGCTGTACCAAACCCA GCGACGGCAACTGCACTTGTATTCCCATCCCTTCTTCCTGGGCCTTCGCCAGATTCCTGTGGGAATGGGCAAGCGTC AGGTTCTCCTGGCTGAGCCTGCTCGTGCCCTTTGTGCAGTGGTTTGTCGGCCTGTCTCCCACAGTGTGGCTGAGCGT GATTTGGATGATGTGGTATTGGGGACCATCCCTGTATAATATCCTCTCTCCCTTCCTGCCTCTGCTCCCAATTTTCT TTTGCCTGTGGGTTTACATCTGATTCTAGAGC在上核苷酸序列中，以小写字母表示的一序列核苷酸为一段Kozak序列，核苷酸序列起始端一段序列CTCGAG为引入的B10I酶切位点，核苷酸末端一段序列TCTAGA为引入 W XbaI酶切位点。(3)构建重组质粒pRec2· O-C将合成基因CPreSl通过Xhol+Xbal双酶切与&ilI+XbaI双酶切的载体pHPRE连接，构建获得重组克隆pHPRE-CPreSl ；合成基因CPreSl的核苷酸序列为CCGCTCGAGCCGCCACCATGGATATTGATCCTTACAAAGAGTTTGGCGCCTCTGTGGAACTGCTCAGCT TCCTGCCCTCTGACTTCTTTCCATCCATTAGAGACCTGCTCGATACCGCCAGCGCACTGTATCGCGAGGCCCTGGAA TCCCCTGAGCACTGtAGCCCTCACCATACAGCCCTGAGACAGGCTATCCTCTGTTGGGGAGAACTGATGAACCTGGC AACCTGGGTCGGCTCCAACCTGGAGGACCCAGCCTCTAGGGAACTCGTGGTGAGCTACGTCAATGTGAACATGGGCC TGAAGATTAGACAGCTcCTGTGGTTCCACATCTCCTGCCTCACCTTCGGTCGGGAGACTGTGCTGGA ATATCTGGT GAGCTTTGGCGTTTGGATTAGAACTCCTCCTGCTTACAGGCCTCCAAATGCCCCTATCCTGTCCACCCTCCCTGAGA CCACCGTGGTCAGACGCAGAGGCAGGTCTCCAAGACGGAGGACACCCAGCCCTAGACGCAGGAGATCACAGTCCCCT AGACGGAGAAGGTCTCAGAGCCGCGAATCCCAGTGTGGCGGAGGCGGTAGCATGGGCGGATGGTCTTCCAAACCAAG ACAGGGCATGGGCACCAACCTGAGCGTGCCTAACCCTCTGGGCTTCTTCCCAGATCACCAGCTCGACCCTGCATTTG GCGCCAATTCCAATAACCCAGACTGGGATTTCAACCCTAACAAGGACCATTGGCCTGAGGCCAATCAGGTGGGTGCT GGCGCCTTCGGACCCGGATTTACACCACCCCACGGTGGCCTGCTGGGTTGGAGCCCTCAGGCCCAGGGCATTCTCAC CACTGTTCCCGCAGCTCCACCTCCTGCATCTACCAACAGGCAGTCCGGAAGACAGCCAACTCCCATCAGCCCTCCTC TGCGGGATAGCCACCCTCAGGCTTGATTCTAGAGC
在上核苷酸序列中，加粗部分为一段连接肽，核苷酸序列起始端一段序列CTCGAG 为引入的HioI酶切位点，核苷酸末端一段序列TCTAGA为引入的^CbaI酶切位点。以pDRVISVl. O为模板，以Primer5与Primer6为引物，扩增获得大小为271bp的 BGHpolyA 区，同时在上游引入BamHI酶切位点，下游引入Bglll-EcoRV-SalI-KpnI酶切位点；通过BamHI+Kpnl双酶切后克隆入Bglll+Kpnl双酶切的pHPRE-CPreSl载体中，获得重组质粒 pHPRE，-CPreSl ；通过EcoRI+Kpnl将重组质粒pHPRE，-CPreSl的CPreSl表达盒克隆入载体 pOK-EKS 中，构建重组质粒 pRec2. O-CPreSl ；以pRec2. O-CPreSl为模板，以Primer7与Primer8为引物，扩增获得大小为596bp 的Core基因(C)，并通过I^stl+Xbal双酶切后克隆入I^stl+Xbal双酶切的pRec2. 0-cCPreSl 载体中，获得重组质粒pRec2. O-C。Primer7 :5，-gtcttttctgcagtcaccgtcgTCGAG-3，Primer8 :5’ -GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3，(4)构建重组质粒 pRec2· 0-PreS2S-C(pS2S-C)以pRec2. O-C为模板，以Primer9与Primer8为引物，扩增获得大小为579bp的 Core基因(C)，通过Hindlll+Xbal双酶切与HindIII+Xbal双酶切的载体pcDNA3. 1进行连接，构建获得pcDNA3. I-C ；Primer9 5’ -CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGATATTG-3’Primer8 :5’ -GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3，通过Bglll+PvuII双酶切从质粒pcDNA3. 1-C上切出C表达盒，克隆入 Bglll+EcoRV 双酶切的 pRec2. 0_PreS2S 中，构建获得重组质粒 pRec2. 0_PreS2S_C。构建本发明所述重组质粒PC-S2S的步骤包括以上述构建重组质粒pS2S-C步骤O)中构建得到的pRec2. 0-PreS2S为模板，以 Primerll与Primerl2为引物，扩增获得大小为873bp的PreS2S基因，通过Hindlll+Xbal 双酶切与Hindlll+Xbal双酶切的载体pcDNA3. 1进行连接，构建获得pcDNA3. l_PreS2S ；Primerll :5’ -CCCAAGCTTGCCGCCACCATGCAGTGGAACTC-3，Primer12 :5， -GCTCTAGAATCAGATGTAAACCCAC-3，通过Bglll+PvuII双酶切从质粒pcDNA3. l_PreS2S上切出I^reSZS表达盒，克隆入 Bglll+EcoRV 双酶切的 pRec2. O-C 中，构建获得重组质粒 pRec2. 0_C_PreS2S (pC_S2S)。本发明中，构建重组佐剂质粒的方法，可以依照现有技术公开的技术方案，其真核表达载体可以是市售的pcDNA3. l、pVAXl等。如构建重组人干扰素-Y质粒可以依照文献(丁强，沈历中，吴文溪.人Y-干扰素基因在大肠癌细胞中的表达研究.中华普通外科杂志，2002，17 (7) =410-412)所公开的方法构建并制备得到pcDNA3_IFN-γ。如构建的白介素 10 的方法可以参考文献(Zhang Zhen-Lin, Shen Shui-Xian, et. Intramuscular injection of interleukin-10plasmid DNAprevented autoimmune diabetes in mice. Acta Pharmacologica Sinica[J], 2003, 24 (8) :751-756)所公开的方法构建获得。除依据已公开的方法构建重组佐剂质粒，其获得方法还可以通过市售获得。本发明的还一目的在于提供一种本发明所述的重组质粒DNA疫苗及本发明所述的含本发明所述重组质粒DNA疫苗的组合物在制备具有预防和治疗乙型肝炎疾病药物中的用途。
图1为构建的重组疫苗质粒pS2S-C的结构示意图。图2为构建的重组疫苗质粒PC-S2S的结构示意图。图3为重组疫苗质粒PS2S-C及pC-S2S的酶切电泳图谱，其中泳道1为重组疫苗质粒pS2S-C经^CbaI单切后的图谱，可切出两条带，分别为 2300bp 和 4570bp ；泳道2为重组疫苗质粒PS2S-C经EcoRI单切后，切出大小约为6870bp的普带；泳道3为未进行酶切的重组疫苗质粒PS2S-C ；泳道4为重组疫苗质粒PS2S-C经Ndel+Sall双酶切后，切出大小约为1300bp、 2100bp、3400bp的三条普带；泳道5为重组疫苗质粒pS2S-C经PvuII+Xbal双酶切后，切出大小约为lOOObp、 2200bp、3600bp的三条普带；泳道 6 为 marker DL2000 ；泳道7 为 marker DL15000 ；泳道8为重组疫苗质粒pC-S2S经)(baI单切后的图谱，切出的两条带分别为 2550bp 和 4320bp ；泳道9为重组质粒pC-S2S经^CbaI单切后的图谱，切出大小约为6870的普带；泳道10为未进行酶切的重组疫苗质粒PS2S-C ；泳道11为重组疫苗质粒pC-S2S经Ndel+Sall双酶切后，切出大小约为1500bp、 2300bp、3100bp的三条普带；泳道12为重组疫苗质粒PC-S2S经PvuII+Xbal双酶切后，切出大小约为250bp、 500bp、2500bp、3600bp 的四条普带。
具体实施例本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。下列实施例中，重组佐剂质粒pcDNA3. I-IL 2、pcDNA3. I-IFN- λ委托北京雷默生物技术有限公司构建获得。所用材料及试剂携带转录后调节元件(HPRE)的DNA疫苗质粒phH、质粒 pDRVISVl.O由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心病毒免疫室惠赠(该质粒的构建过程及详细资料已在中国专利CN1560259A中完全公开)；真核表达质粒pcDNA3. 1 购自hvitrogen公司；真核表达载体pHPRE由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心病毒免疫室构建；携带内部核糖体进入位点(IREQ的双顺反子表达质粒PlRESneo购自Clontech公司J93T、C0S_7细胞购自于ATCC ；小鼠脾细胞以1640完全培养基培养(10%胎牛血清，Invitrogen公司)；各种限制性内切酶、pfu聚合酶、DNA连接试剂Sol I均购自 NEB公司；质粒抽提纯化试剂盒购自TIANGEN公司；乙肝表面抗原及表面抗体定量ELISA检测试剂盒(化学发光法)购自北京源德生物科技有限公司。小鼠IFN-Y的ELISP0T检测试剂盒购自BD公司。抗原刺激肽由北京赛百盛生物技术有限公司合成。基因合成及基因测序工作委托北京英峻生物科技有限公司进行。实施例1 重组质粒 pRec2. 0-preS2S_C (pS2S_C)的构建(1)先构建重组质粒载体骨架pOE-EKS 以pDRVISVl. O为模板，以Primerl与Primer2为引物，其中引物2为5，末端磷酸化的引物，扩增获得大小为748bp的复制子区域(Ori)，同时引入Ec0RI、KpnI及SwaI酶切位点；Primerl :5’ -GGAATTCGGGGTACCATTTAAATTTGAACGTTCGCAAtATGTGAGCAAAAGGCCAG C-3，Primer2 :5’ -CGGCGCGCGCCGAAAACGACGATTGCGAACGTTCAACCCGTAGAAAAGATCAAAG G-3，以pDRVISVl. O为模板，以Primerf与Primer4为引物，其中引物3为5，末端磷酸化的引物，扩增获得大小为1056bp的卡那抗性标记基因(Kan)，同时引入EcoRI酶切位点；Primer3 :5’ -tcgtcgttttcggcgcgcgccgTTGAACGTTCGCAAtTCAAGTCAGCGTAATGCT C-3'Primer4 :5，-GGAATTCGGCGCGCGCCGAAAACGACGATGCGAACGTTCAAGAAAGCCACGTTGTGTC T-3'将上述两个片段分别以EcoRI进行单酶切，连接后构建重组克隆pOK-EKS ；(2)构建重组质粒 DNA 疫苗 pRec2. 0_PreS2. S将合成基因ft~eS2S通过Xhol+Xbal双酶切与&ilI+XbaI双酶切的载体pHPRE连接，构建获得重组克隆pHPRE-PreS2S ；以pDRVISVl. O为模板，以I^rimerS与I^rimere为引物，扩增获得大小为271bp的 BGHpolyA区，同时在上游引入BamHI酶切位点，下游引入Bglll-EcoRV-SalI-KpnI酶切位点；通过BamHI+Kpnl双酶切后克隆入Bglll+Kpnl双酶切的pHPRE_PreS2S载体中，获得重组质粒 pHPRE，-PreS2S ；Primer5 :5，_CGGGATCCgctgtgccttctagttgccag_3，Primer6 :5’ -GGGGTACCGTCGACAACGTTGATATCAACGTTAGATCTCATAGAGCCCACCGCATC C-3，通过EcoRI+Kpnl将重组质粒pHPRE，_PreS2S的ft~eS2S表达盒克隆入载体 pOK-EKS 中，构建重组质粒 pRec2. 0_PreS2S ；(3)构建重组质粒pRec2. O-C将合成基因CPreSl通过Xhol+Xbal双酶切与&ilI+XbaI双酶切的载体pHPRE连接，构建获得重组克隆pHPRE-CPreSl ；以pDRVISVl. O为模板，以I^rimerS与I^rimere为引物，扩增获得大小为271bp的 BGHpolyA区，同时在上游引入BamHI酶切位点，下游引入Bglll-EcoRV-SalI-KpnI酶切位点；通过BamHI+Kpnl双酶切后克隆入Bglll+Kpnl双酶切的pHPRE-CPreSl载体中，获得重组质粒 pHPRE，-CPreSl ；通过EcoRI+Kpnl将重组质粒pHPRE，-CPreSl的CPreSl表达盒克隆入载体 pOK-EKS 中，构建重组质粒 pRec2. O-CPreSl ；以pRec2. O-CPreSl为模板，以Primer7与Primer8为引物，扩增获得大小为5%bp 的Core基因(C)，并通过I^stl+Xbal双酶切后克隆入I^stl+Xbal双酶切的pRec2. 0-cCPreSl 载体中，获得重组质粒pRec2. O-C。Primer7 5' -gtcttttctgcagtcaccgtcgTCGAG-3‘Primer8 :5’ -GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3，(4)构建重组质粒 pRec2. 0_PreS2S_C以pRec2. O-C为模板，以Primer9与Primer8为引物，扩增获得大小为579bp的 Core基因(C)，通过Hindlll+Xbal双酶切与HindIII+Xbal双酶切的载体pcDNA3. 1进行连接，构建获得pcDNA3. I-C ；Primer9 5’ -CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGATATTG-3’Primer8 :5’ -GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3，通过Bglll+PvuII双酶切从质粒pcDNA3. 1-C上切出C表达盒，克隆入 Bglll+EcoRV 双酶切的 pRec2. 0-preS2S 中，构建获得重组质粒 pRec2. 0_PreS2S_C。实施例2 重组质粒 pRec2. 0_C-preS2S (pC_S2S)的构建以实施例1中构建得到的pRec2. 0_PreS2S为模板，以Primerll与Primerl2为引物，扩增获得大小为87!3bp的ft~eS2S基因，通过Hindlll+Xbal双酶切与Hindlll+Xbal双酶切的载体pcDNA3. 1进行连接，构建获得pcDNA3. l_PreS2S ；Primerll :5，-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGCAGTGGAACTC-3，Primer12 :5， -GCTCTAGAATCAGATGTAAACCCAC-3，通过Bglll+PvuII双酶切从质粒pcDNA3. l_PreS2S上切出I^reSZS表达盒，克隆入 Bglll+EcoRV 双酶切的 pRec2. O-C 中，构建获得重组质粒 pRec2. 0_C_PreS2S (pC_S2S)。实施例3含乙肝核心Core蛋白基因与不含Core蛋白基因对健康Balb/c小鼠的体液和细胞免疫比较6-8周龄Balb/c雌性小鼠购自中国医学科学院动物繁殖中心，清洁级饲养。M只小鼠分为4个组，3个免疫组分别给予pRec2.0空载体组、重组质粒DNA疫苗pRec2. 0-S2S组、重组质粒DNA疫苗pRec2. 0-S2S-C (pS2S_C)、重组质粒DNA疫苗 pRec2. 0-C-S2S (pC_S2S)进行免疫，剂量均为50 μ g/只，免疫程序为第0、2、4周各免疫一次，第6周杀鼠取血清并分离淋巴细胞。体液免疫检测取小鼠血清严格按北京源德生物科技公司试剂盒使用说明书方法操作。1、细胞免疫检测小鼠淋巴细胞制备颈椎脱臼法处死小鼠，置盛有75%乙醇的烧杯中，使小鼠体毛完全润湿约3分钟以上，然后切开小鼠腹腔，取出脾脏，将分离的脾脏放于下置无菌烧杯的200目筛网上(有培养液滴)，轻轻捻碎脾组织，研磨挤出脾细胞，取 5ml无血清1640培养液缓缓冲下细胞至烧杯中，将5ml脾细胞悬浮液缓慢加入装有2. 5ml 淋巴细胞分离液的15ml离心管中，2000-2500r/min离心20min，手机分离淋巴细胞后，用 IC离心洗涤细胞两次，每次1500r/min离心6min，用适量含5% FCS-1640完全培养液重悬分离的脾淋巴细胞，台盼兰染色计数每只小鼠分离淋巴细胞活细胞总数，调整细胞密度至 3X105/ml, 370C 5% C02培养箱中培养以供ELISP0T检测。2、ELISP0T检测严格按BD公司试剂盒使用说明书方法操作。作为小鼠特异性细胞免疫的阳性评价标准，HBV DNA疫苗免疫组的细胞免疫应答阳性率应不低于60%，血清HBcAg及血清-HBs彡IOmIU被认为是机体保护性有效浓度，结果见表2。表2含乙肝核心Core蛋白基因与不含Core蛋白基因对健康Balb/c小鼠的体液和细胞免疫比较
^HBsAg—HBcAg
体液免疫细胞免疫体液免疫细胞免疫
pRec2. 0一——— ——pcDNA3. 1-S2S46.25 ±20.31188.67±91.81■— ——pRec2. 0-S2S97.49 ±40.21379.15± 129.25一一pS2S-C106.34 土 35.29348.21 ±59.0546.41 ±19.14 —pC-S2S—113.40±43.37275.49±84.07 146.30±58.15从上表结果可以看出，空载体质粒的HBsAg、HBcAg细胞免疫和体液免疫均呈阴性，而对于对照质粒pcDNA3. 1-S2S，其HBsAg的体液免疫值为(46. 25士20. 31)mIU/ml，细胞免疫值(188. 67 士91. 81) SFU/百万细胞，而对于经优化的重组质粒pRec2. 0-S2S，其体液免疫值为(97.49士40.21)111贝/1111，细胞免疫值(379. 15 士 129. 25) SFU/百万细胞，明显要强于对照质粒(差异具有显著性，P <0.01)。对于优化表达HBV包膜中蛋白S2S同时表达 HBV核心Core蛋白的重组质粒pS2S_C，其HBsAg的体液免疫值略高于不含Core蛋白的重组质粒pRec2. 0-S2S,细胞免疫值要低于不含Core蛋白的重组质粒pRec2. 0-S2S，其值分别为(106. 34士35. 29)mIU/ml、(348. 21 士59. 05) SFU/百万细胞，相互间差异无显著性，但重组质粒还可获得HBcAg的体液免疫水平，其值为06.41 士 19. 14)U/ml，但HBcAg的细胞免疫值未检测出，呈阴性。对于优化表达HBV核心Core蛋白同时表达HBV包膜中蛋白的重组质粒PC-S2S，其HBsAg的细胞免疫值要低于pRec2. 0-S2S，为(113. 40士43. 37) SFU/ 百万细胞，体液免疫值未检测出，呈阴性，但HBcAg的体液免疫和细胞免疫值较高，分别为 (275. 49士84. 07)U/ml、(146. 30士58. 15) SFU/百万细胞。构建的同时含HBV包膜中蛋白和 HBV核心Core蛋白的重组质粒，与不含Core蛋白的重组质粒相比，在获得HBsAg免疫水平的同时，还可获得HBcAg的水平，起到更全面的免疫作用。实施例4质粒疫苗组合物对健康Balb/c小鼠的体液和细胞免疫作用6-8周龄Balb/c雌性小鼠购自中国医学科学院动物繁殖中心，清洁级饲养。 35只小鼠分为7个组，6个免疫组分别给予质粒疫苗PS2S-C (50 μ g)、pC_S2S (50 μ g)、 pS2S-C+pcDNA3. l_hIL2(10 μg+10μ g)、pS2S-C+pcDNA3. I-IFN- γ (10 μ g+10μ g)、 pC-S2S+pcDNA3. l_hIL2 (10 μ g+10 μ g)、pC_S2S+pcDNA3. I-IFN- y (10 μ g+10 μ g)，禾口一个空白对照组(给予pRec2. 0空载体50 μ g，试验接种相应核酸疫苗)，每只小鼠按各组剂量注射质粒DNA，体积为100μ1，每只小鼠两后肢胫前肌各注射50μ1。免疫程序为0、2、4周各免疫一次，第6周杀鼠取血清并分离淋巴细胞。HBsAg、HBcAg的体液和细胞免疫水平检测方法表3质粒疫苗组合物对正常BaLb/c小鼠HBsAg、HBcAg的免疫水平；± s
权利要求
1.一种用于治疗乙型肝炎的重组质粒DNA疫苗组合物，其特征在于所述的重组质粒 DNA疫苗组合物含有同时携带乙肝包膜中蛋白S2S编码基因及乙肝核心Core蛋白编码基因的重组疫苗质粒，和至少一种重组佐剂质粒。
2.根据权利要求1所述的DNA疫苗组合物，其特征在于所述的重组疫苗质粒，其编码乙肝包膜中蛋白S2S的编码记忆和乙肝核心Core蛋白编码基因之间通过至少一个蛋白表达盒彼此分开。
3.根据权利要求1所述的DNA疫苗组合物，其特征是所述的重组佐剂质粒为重组细胞因子佐剂质粒。
4.根据权利要求3所述的DNA疫苗组合物，其特征是所述的细胞因子为白介素、干扰素、细胞生长因子或细胞集落因子中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的DNA疫苗组合物，其特征是所述的细胞因子为白介素或干扰素。
6.根据权利要求5所述的DNA疫苗组合物，其特征在于所述的白介素为重组白介素2 佐剂质粒，所述的干扰素为重组人干扰素Y佐剂质粒。
7.权利要求1-6中任意一权利要求所述重组质粒DNA疫苗在制备具有预防和治疗乙型病毒性肝炎药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种重组质粒重组质粒DNA疫苗组合物，所述的组合物含有同时携带乙肝中蛋白S2S编码基因及乙肝核心Core蛋白编码基因的重组疫苗质粒，和至少一种重组佐剂质粒，其中佐剂质粒为重组白介素2或重组人干扰素γ佐剂质粒。
文档编号A61K39/39GK102233137SQ20101016477
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月30日 优先权日2010年4月30日
发明者刘勇, 周德胜, 张春丽, 李鼎峰 申请人:北京凯因生物技术有限公司, 北京凯因科技股份有限公司