大黄素作为PI3K/Akt/mTOR信号转导通路活化分子p-Akt和p-mTOR的抑制剂及其应用的制作方法

专利名称：大黄素作为PI3K/Akt/mTOR信号转导通路活化分子p-Akt和p-mTOR的抑制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，涉及大黄素作为PI3K/Akt/mT0R信号转导通路活化分子P-Akt和p-mTOR抑制剂，尤其是对急性白血病耐药细胞PI3K/Akt/mT0R信号转导通路影响的应用。
背景技术：
磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol-3 Kinase,简称 PI3K)是生长因子超家族信号转导过程中的重要分子，和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(简称Akt)及其下游的信号分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(简称mTOR)组成的PI3K/Akt/mT0R是体内重要的信号转导通路之一，通过调节关键信号分子的活化状态，在细胞内发挥促进增殖、抑制细胞凋亡作用，有接近70%的急性髓系白血病(AML)患者存在PI3K/Akt/mT0R信号通路的异常激活，并且该信号通路的持续激活与白血病多药耐药密切相关。Akt是PI3K直接的靶蛋白，在PI3K作用下，Akt催化结构域Thr308和调节结构域Ser473两个位点发生磷酸化而充分活化，活化的Akt (p-Akt)能进一步作用于下游靶蛋白包括(1)磷酸化Bad、Par-4, Caspase-9和P21等促凋亡相关蛋白，使其失活，负调控其促凋亡功能；磷酸化转录因子家族成员Forkhead蛋白，抑制促凋亡基因的转录功能，负调节凋亡促进信号，促进细胞存活；
(2)磷酸化核因子iB (NF- κ B)的抑制性蛋白I κ B激酶(IKK)，使I κ B磷酸化，NF- κ B 从I κ B/NF- κ B复合物中解离，进而核转位，促进其转录活性；并且能够磷酸化NF- κ Β/ρ65 的Ser529和Ser536位点，使结合在核内NF- κ B结合序列上的NF- κ B的转录活性显著增强，Bcl-2家族成员Bcl-xl表达增强，促进细胞存活；(3)磷酸化激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的 Ser2448 位点，从而激活 mTOR，活化的 mTOR(p-mT0R)可磷酸化其下游的两个重要信号分子即mRNA翻译所必需的底物核糖体蛋白 S6激酶(p70S6k)和真核翻译起始因子4E(eIF4E)_结合蛋白1 (4E-BP1)。p70S6k被激活后促进核糖体蛋白的翻译过程。4E-BP1磷酸化后与eIF4E解离，最终增强了与细胞增殖有关的基因的翻译；(4)磷酸化糖原合成酶激酶_3 (glycogen synthasekinase-3 β，GSK-3)。 GSK-3被Akt活化后，解除对真核起始因子(eIF2B)磷酸化位点的作用，使该抑制位点发生去磷酸化，从而启动蛋白质合成途径。GSK-3有两种亚型GSK_3a、GSK_3i3，已有的研究表明，GSK-3i3基因敲除小鼠因肝细胞凋亡导致的肝坏死而死于胚胎期，该现象与NF-κΒ有关，此研究结果表明，GSK-3i3对于维持细胞生存是必不可少的。还有的研究进一步证实， GSK-3 β可直接磷酸化NF- κ B系统的组成成分，增加NF- κ B的活性，从而促进细胞增殖。 因此，PI3K/Akt/mT0R信号通路关键信号分子异常活化后肿瘤细胞抗凋亡作用增强、细胞增殖失控，阻断PI3K/Akt/mT0R信号转导通路多种效应分子的活化为白血病的靶向治疗提供新靶点。
随着研究的不断深入，PI3K/Akt/mT0R信号通路在急性白血病的发生、发展中的重要作用已备受关注，针对该信号转导通路寻找新的抗白血病药物，将为白血病的治疗提供新思路。LY294002和Wortmarmin是两种被广泛应用于研究的PI3K抑制剂，与后者相比，LY294002有更好的化学稳定性，能够有效抑制肿瘤诱发的血管生成和肿瘤生长。经 LY294002和Wortmarmin处理后的急性髓系白血病细胞p_Akt表达下调，细胞凋亡比例明显增加，但由于LY294002的IC50较高，高出Wortmannin上百倍，加上半衰期较短，从而限制了 LY294002的临床应用。目前，对LY294002的化学结构进行改造，合成新型LY294002衍生物正在陆续研发中。新型的雷帕霉素(Rapamycin)作为mTOR的靶向抑制剂在血液系统肿瘤有着广泛的应用前景，它可通过抑制mTOR的激酶活性和其下游的4E-BPl、p70S6K的磷酸化作用，阻断关键蛋白的合成，进而导致细胞周期阻滞和细胞凋亡的发生。目前应用于临床试验的mTOR抑制剂主要有RAD001，CCI-779，AP23573，尤其是后者，美国FDA以快速审批通道应用于软组织和骨骼系统恶性肿瘤的治疗，其在白血病和淋巴瘤血液系统肿瘤的应用目前正处于II期临床试验。Rapamycin及其类似物应用缺陷就是对mTOR发挥抑制作用的同时导致Akt的反馈性激活。积极寻求对PI3K/Akt和mTOR的双重靶向抑制作用制剂已成为当今研究热点。已有研究证实，小分子化合物PI-103是人工合成的脂质激酶家族的一种抑制剂，对急性髓系白血病(简称AML)患者原代白血病细胞PI3K/Akt和mTOR的活化兼具有高度特异性抑制作用，抑制AML细胞增殖的同时诱导AML原代细胞凋亡，而对正常CD34+细胞影响较小。总之，PI3K/Akt/mT0R信号转导通路在白血病的发生、发展、治疗及转归过程凸现出日益重要的作用，针对该信号通路寻求新的靶向药物对于急性白血病的治疗将具有十分重要的作用。

发明内容
本发明的第一目的是提供大黄素作为急性白血病耐药细胞株、急性白血病原代细胞和急性白血病裸鼠移植瘤细胞的PI3K/Akt/mT0R信号转导通路信号活化分子p_Akt和 p-mTOR的抑制剂。
本发明的第二目的是提供大黄素作为PI3K/Akt/mT0R信号通路活化分子p_Akt和 p-mTOR抑制剂的应用。
本发明的第三目的是提供作为PI3K/Akt/mT0R信号通路活化分子p-Akt和p-mTOR 抑制剂的大黄素在制备治疗急性白血病多药耐药细胞的药物中的应用。
本发明的第四目的是提供作为PI3K/Akt/mT0R信号通路活化分子p-Akt和p-mTOR 抑制剂的大黄素在制备治疗急性早幼粒白血病维甲酸耐药细胞和相应敏感细胞的药物中的应用。
本发明的第五目的是提供作为PI3K/Akt/mT0R信号通路活化分子p-Akt和p-mTOR 抑制剂的大黄素在制备治疗急性白血病原代细胞的药物中的应用。
本发明的第六目的是提供作为PI3K/Akt/mT0R信号通路活化分子p-Akt和p-mT0R 抑制剂的大黄素在制备防治高致瘤急性白血病裸鼠移植瘤细胞的药物中的应用。
本发明所述的大黄素(emodin)是从传统中药大黄中提取的一种蒽醌类单体化合物，其化学名称为 1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌(l，3，8-trihydroxy-6-methylanthraquino ne)，分子式为C15HltlO5,分子量为270. 2369，具有抗菌、抗炎、抗氧化、利尿、解痉、降压、肝保护、抗肿瘤活性，已经应用于临床部分病种的治疗，为现有技术，本发明及实施例均采用上述现有的大黄素作为研究对象。已有研究发现，大黄素通过抑制JAK2/STAT3信号途径对多发性骨髓瘤细胞产生细胞毒作用，而大黄素对于急性白血病耐药细胞株、急性白血病原代细胞和急性白血病裸鼠移植瘤细胞PI3K/Akt/mT0R信号通路信号分子活化抑制作用未见文献报道。
本发明所述的PI3K/Akt/mT0R信号通路活化分子p_Akt和p-mTOR抑制剂，其特征是含有药学上的治疗有效剂量的大黄素。所述大黄素是具有药效学特性的大黄素。所述的治疗有效剂量为一般技术人员通过有限次实验可以得出的。本发明所述的大黄素可以依据需要(如下述的本发明应用实施例等)而制成合适的药物学上的剂型。按药学领域的常规生产方法制备，其选用含有重量百分比为0. -99. 5%活性成分的大黄素。也可含有 0. 1% "99. 5%的大黄素的药物组合物，这些为同领域一般技术人员能实现的技术。
本发明的大黄素使用剂量可根据用药途径、患者的年龄、体重、疾病的类型和严重程度等做相应调整，可以一次或多次给药。
本发明所述的大黄素应用于急性白血病的研究方案实施过程分为(1)不同浓度和时间梯度大黄素作用于急性白血病HL-60/ADR耐药细胞后，分别检测大黄素对该耐药细胞PI3K/Akt/mT0R信号转导通路表达的影响。研究设立PI3K/Akt和mTOR特异性抑制剂 LY294002及Rapamycin对照组。(2)大黄素作用于急性早幼粒白血病NB4细胞及其相应维甲酸耐药MR2细胞后两种细胞PI3K/Akt/mT0R表达改变，研究设立时效和量效关系检测组以及PI3K/Akt和mTOR特异性抑制剂对照组。(3)研究大黄素对急性白血病原代细胞Akt 和mTOR活化作用的影响。原代细胞来源于本研究所病房难治、高白细胞数急性白血病患者外周血分离的白血病细胞，经Western Blot证实，多药耐药基因(MDRl)编码产物P_gp表达阳性。⑷构建高致瘤急性白血病HL-60细胞裸鼠异种移植瘤动物模型，体内研究大黄素给药后白血病移植瘤细胞PI3K/Akt/mT0R信号通路表达水平变化。
本发明的有益效果主要表现为(1)大黄素是从中药大黄提取的纯天然蒽醌类单体化合物，具有多种生物学活性，已经被广泛应用于临床，而且价格低廉。由于PI3K/Akt/ mTOR信号通路的异常活化与血液系统肿瘤的发生、发展关系密切。本发明通过体内外研究发现，大黄素作用后的急性白血病多药耐药细胞HL-60/ADR、急性早幼粒白血病维甲酸耐药细胞MR2和相应敏感细胞NB4、急性白血病原代细胞以及高致瘤急性白血病裸鼠移植瘤细胞PI3K/Akt/mT0R信号转导通路关键信号活化分子被特异性抑制。(2)本发明的大黄素可能通过两种途径抑制HL-60/ADR、NB4、MR2和急性白血病原代细胞PI3K/Akt/mT0R信号转导通路，一种是直接抑制了 Akt的活化，进而引起其下游信号的级联反应，另一种可能是直接对PI3K/Akt和mTOR双向抑制作用，进而更有效发挥抑制白血病耐药细胞增殖、诱导细胞凋亡作用。主要表现为细胞周期阻滞，Armexin V FITC/PI法可检测到早期凋亡细胞，细胞形态学观察到典型的凋亡小体形成，DNA片段化分析可见凋亡特征性梯状条带，DNA倍体分析检测到亚二倍体凋亡峰。(3)原代细胞的体外研究结果更进一步证实大黄素对急性白血病耐药细胞作用的有效性，其中Bcl-2表达下调，PI3K/Akt/mT0R信号通路活化受抑制仍然是其主要作用机制，大黄素对正常外周血单个核细胞增殖影响较小，提示大黄素是一种高效低毒抗白血病化合物，对急性髓系白血病特别是复发、难治AML患者具有潜在的应用价值。(4)体内研究证实，大黄素给药后急性白血病裸鼠移植瘤组织蛋白中PI3K/Akt/mT0R信号通路关键活化分子p-Akt、p-mT0R均表达下调，说明大黄素可作为一种新型的PI3K/Akt/ mTOR信号转导活化分子靶向抑制剂，应用于治疗血液系统恶性肿瘤。


图1-1为本发明的大黄素以时间依赖方式抑制HL-60/ADR细胞PI3K/Akt/mT0R信号通路的激活图； 图1-2为本发明的大黄素以浓度依赖方式阻断HL-60/ADR细胞PI3K/Akt/mT0R信号通路活化图； 图1-3为本发明的大黄素特异性抑制HL-60/ADR细胞PI3K/Akt/mT0R信号分子的激活图； 图1-4为本发明的DNA片段化分析检测不同浓度大黄素对HL-60/ADR细胞的诱导凋亡作用图； 图1-5为本发明的Α0/ΕΒ染色法检测大黄素作用不同时间后对HL-60/ADR细胞的凋亡诱导作用图，图中A 对照组图；B :24h处理组图；C :48h处理组图；D :72h处理组图； 图2-1为本发明的大黄素对NB4和MR2细胞PI3K/Akt/mT0R信号通路活化抑制作用图，图中A指NB4细胞；B指MR2细胞； 图2-2为本发明的大黄素对NB4细胞Akt和mTOR活化的特异性抑制作用图； 图2-3为本发明的大黄素对MR2细胞Akt和mTOR活化的特异性抑制作用图； 图2-4为本发明的Armexin V-FITC/PI法检测大黄素对HL-60/ADR细胞早期凋亡诱导作用图，与对照组比较，*P < 0. 01。
图2-5为本发明的大黄素处理48小时后NB4(A)和MR2 (B)细胞凋亡相关形态学改变图，图中A指NB4细胞；B指MR2细胞。标号1指对照组；标号2指30 μ mol/L处理组；标号3指60 μ mol/L处理组； 图2-6为本发明的DNA Ladder检测不同浓度大黄素处理后NB4(A)和MR2 (B)细胞的凋亡诱导作用图，图中A指NB4细胞；B指MR2细胞； 图2-7为本发明的流式细胞仪DNA倍体分析检测大黄素诱导NB4 (A)和MR2 (B)细胞凋亡作用图；图中A指NB4细胞；B指MR2细胞；标号0指对照组；标号1指30 μ mol/L 大黄素处理组图； 图3-1为本发明的大黄素处理48小时3例AML患者原代细胞和2例正常人外周血单个核细胞DNA片段化分析检测结果图； 图3-2为本发明的大黄素处理48h后2例AML患者(A，B)原代细胞和2例正常人 (C，D)外周血单个核细胞流式细胞仪DNA倍体分析图，其中标号0指对照组；标号1指 20 μ mol/L处理组；标号2指40 μ mol/L处理组； 图3-3为本发明的21例AML患者原代细胞和6例正常人外周血单个核细胞P_gp 表达水平图，图中的Pat.指病人样本；NL指正常人样本； 图3-4为本发明的大黄素抑制AML患者原代细胞Akt和mTOR的活化并下调Bcl_2 表达图，图中Patient指病人样本； 图4-1为本发明的大黄素对高致瘤HL-60裸鼠移植瘤细胞PI3K/Akt/mT0R信号通路活化抑制作用图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行详细说明 应用实例I 大黄素作用后急性白血病HL-60/ADR耐药细胞PI3K/Akt/mT0R信号通路蛋白表达变化 材料和方法 1细胞株及药物来源 阿霉素诱导的人急性白血病耐药细胞株HL-60/ADR引自中国医学科学院血液学研究所，用含0. 2-0. 4 μ g/ml阿霉素和10%胎牛血清的RPMI1640培养液(HyClone，赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)培养，维持其耐药性，实验前两周换用无阿霉素 RPMI1640培养液。大黄素为南京青泽医药科技开发有限公司产品，HPLC测定其纯度大于 98. 0%，二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司，将大黄素溶解于DMSO中配制成50mmol/L母液，-20°C保存备用。
2实验分组和Western Blot检测 (1)40μ mol/L 大黄素作用于 HL-60/ADR 细胞 0、6、12、24、48 小时；(2)0、20、40 和 80 μ mol/L 大黄素作用 HL-60/ADR 细胞 24 小时；(3) 0、8、80 μ mol/L 大黄素，1 μ mol/L 雷帕霉素(简称 Rapamycin)，40 μ mol/L LY294002 (购自 Sigma 公司)，20 μ mol/L PD98059 (购自Sigma公司)处理HL-60/ADR细胞12小时。收集以上各实验组和对照组HL-60/ADR细胞，PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤后，加细胞裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂、磷酸化酶抑制剂以及苯甲基磺酰氟(简称 Phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)，提取总蛋白。Rapamycin 为Calbiochem公司产品，LY294002化学结构式为=C19H17NO3 · HCL,分子量为343. 8， PD98059化学结构式为=C16H13NO3，分子量为267. 3，二者均购自Sigma公司。Akt (丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶)、p-Akt (Thr308)、p-Akt (Ser473)、NF- κ B (磷酸化核因子-κΒ, ρ65)、 p-NF- κ B [ρ-ρ65 (Ser536) ]、I κ B- α (NF- κ B 抑制性蛋白 α )、ρ_Ι κ B- α (Ser32)、mT0R (哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)、p-mT0R(Ser2448)、4E_BP1 [真核翻译起始因子4E(eIF4E)_结合蛋白 1]、P-4E-BP1 (Thr70)、p70S6k (核糖体蛋白 S6 激酶)、p-p70S6k (Thr389)抗体来源于 Cell SignalingTechnology 公司，β-actin ( β -肌动蛋白)、GSK-3 β (糖原合成酶激酶 _3 β )和 p-GSK-3 β (Ser9)抗体为 Santa Cruz 公司产品。mTOR、p-mT0R 检测用 8% SDS (简称十二烷基硫酸钠)-聚丙烯酰胺凝胶电泳，其余蛋白在10 %或12 % SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。
3 DNA Ladder 分析 按照碧云天Beyotime DNA Ladder抽提试剂盒操作说明进行。主要步骤如下(1) 收集作用72小时不同浓度药物组(20、40、80ymol/L)和对照组HL-60/ADR细胞，每组细胞数为1. O X 106，离心沉淀，弃上清，PBS (磷酸盐缓冲液)洗涤两次，轻柔重悬每管细胞于 200 μ IPBS中。(2)加入4 μ 1 RNase A (RNA酶Α)，涡旋混勻，室温放置2分钟。(3)加20 μ 1 蛋白酶K，涡旋混勻。(4)加200 μ 1裂解液，涡旋混勻，70°C孵育10分钟。(5)加200 μ 1无水乙醇，涡旋混勻。(6)将以上每管混合液加入到DNA纯化柱内，≥SOOOrpm离心1分钟，弃废液。(7)加500 μ 1洗涤液I，≥SOOOrpm离心1分钟，弃废液。(8)加600 μ 1洗涤液II，≥12000rpm离心1分钟，弃废液，再离心1次以去除残留液体。(9) DNA纯化柱置于洁净EP 管中，每管加50 μ 1洗脱液，室温放置1-3分钟，≥ 12000rpm离心1分钟，所得液体即为纯化后得到的总DNA。(10)35V，1%琼脂糖凝胶电泳近3小时。凝胶图像分析仪(上海培清， JS-380A型)上分析结果并拍照。
4荧光显微镜Α0/ΕΒ染色检测凋亡细胞 吖啶橙(Acridine Orange,AO)为Fluka公司产品，溴化乙锭(Ethidium Bromide, EB)购于华美公司，将二者分别溶于pH7. 2的PBS缓冲液中，配制成100 μ g/μ 1母液，4°C 保存，使用前将二者等量混勻。收集40 μ mol/L大黄素作用不同时间段(24、48、72小时) 和对照组HL-60/ADR细胞，PBS洗涤两次后，每管细胞浓度调节为1. OX 106/ml，取细胞悬液 95 μ 1，Α0/ΕΒ染料5 μ 1，混勻后立即放置于激发光波长为490nm的倒置荧光显微镜(日本 Nikon)下观察结果并拍照。
结果 1 Western Blot 检测结果 相同浓度(40 μ mol/L)大黄素作用于HL-60/ADR细胞不同时间段(6-48小时) 以及用不同浓度(20-80 μ mol/L)大黄素处理HL-60/ADR细胞24小时，Western Blot检测结果显示，PI3K/Akt/mT0R信号通路磷酸化的蛋白p_Akt(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)、 口-口65(磷酸化核因子-1^8，ρ65)、ρ-ΙκΒ-α (NF-κΒ 抑制性蛋白 α )、p-GSK-3 β (糖原合成酶激酶_3β )、p-mT0R(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)、P-4E-BP1 [真核翻译起始因子 4E(eIF4E)_结合蛋白1]和p_p70S6k(核糖体蛋白S6激酶)均在大黄素作用下以时间和浓度依赖方式表达逐渐下调，大黄素作用时间越长、浓度越高，以上磷酸化蛋白表达水平降低越显著，而 Akt、NF-K Β(ρ-65)、Ι κ B-α、GSK_33、mT0R、4E_BPl 和 p70S6k 总蛋白表达变化则不及相应的磷酸化蛋白明显(见图1-1、图1-2和图1-3)。
为了进一步明确大黄素对以上信号分子表达影响是否具有特异性，本研究分别设立了 PI3K/Akt、mTOR和ERK (细胞外调节信号激酶)特异性抑制剂干预组LY294002、雷帕霉素(Rapamycin)和PD98059作为对照。不同浓度(0,8,80 μ mol/L)大黄素、lymol/ LRapamycin,20 μ mol/L PD98059 和 40 μ mol/L LY294002 作用于 HL-60/ADR 细胞 12 小时后，图l-3WesternBlot检测结果显示(1) 80 μ mol/L大黄素组和LY294002组可见p_Akt 蛋白表达明显下调，两组之间P-Akt抑制程度接近，其余四组包括Rapamycin处理组在内 P-Akt表达未见明显改变；(2)与其它三组比较，p-mT0R、p-4E-BPl、p-p70S6k在Rapamycin 处理组、80 μ mol/L大黄素组和LY294002组中均可见表达明显减弱；(3) ERK特异性抑制剂 PD98059作用组对p-Akt、p-mT0R、ρ_4Ε_ΒΡ1和p-p70S6k和相应总蛋白表达影响不明显； (4)大黄素抑制p-Akt、p-mT0R、p-4E-BPl、p-p70S6k表达呈量效关系，80 μ mol/L组抑制效应比8μmol/L更显著；(5)Akt、mT0R、4E-BPl、p70S6k总蛋白在各处理组中表达变化不明显。以上结果提示，大黄素对HL-60/ADR耐药细胞PI3K/Akt/mT0R信号通路活化抑制作用具有特异性。
2 DNA Ladder 检测结果 各浓度组大黄素与细胞共培养72小时后，DNA片段化分析结果显示，各浓度组大黄素处理的细胞均有凋亡特征性DNA改变，即形成典型的DNA降解梯状带，40、80 μ mol/L组诱导DNA梯状带形成的作用更加明显，对照组DNA完整(图1-4)。
3荧光显微镜Α0/ΕΒ染色检测结果 Α0/ΕΒ复合染色结果显示，HL-60/ADR细胞经40 μ mol/L大黄素处理后，随着药物作用时间的延长，细胞大小不均一性更加明显，大黄素作用24小时组细胞核染色质染成绿色，呈固缩状、圆珠状的早期凋亡细胞较多，48、72小时作用组可见较多的晚期凋亡细胞，核染色质致密浓染，被EB染成桔红色并呈固缩状、圆珠状，同时可见核染色质染成桔红色，结构仍较正常的坏死细胞也逐渐增多。对照组细胞大小、形态较均一，胞核和胞浆呈均勻的黄绿色荧光，结构正常(图1-5)。
讨论 PI3K/Akt/mT0R信号转导通路与肿瘤细胞逃避化疗药物的杀伤作用，诱导肿瘤细胞增殖，抑制细胞凋亡过程中具有极其重要的作用。Thr308和/或Ser473两个位点磷酸化是Akt激活的必要条件，40μπιΟ1/1大黄素作用于HL-60/ADR细胞12-48小时，以及 20-80 μ mol/L大黄素处理细胞48小时后，p-Akt (Thr308)、p-Akt (Ser473)被明显抑制，与我们设立的LY294002对照组比较，该抑制作用具有特异性。大黄素对PI3K/Akt/mT0R信号通路上游重要信号分子Akt的活化抑制作用，将进一步影响其下游一系列信号分子的激活。我们对下游的 Ρ-Ι κ B-α (Ser32)、p-p65(Ser536)和 p-GSK-3 β (Ser9)检测结果显示， 以上三种活化分子均随着大黄素作用时间的延长和浓度的提高而表达递减。mTOR是Akt 下游的一个重要作用靶点，也被认为是肿瘤治疗过程中一个重要且具有前景的治疗靶点， mTOR特异抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)及其衍生物CCI-779、RAD001和AP23573目前正在进行临床及临床前研究，我们在研究过程中同时设立雷帕霉素干预组作为对照，大黄素作用后的HL-60/ADR细胞，不仅p-mT0R(Ser2448)表达水平特异性受抑制，而且mTOR直接调控的下游两个效应分子4E-BP1和p70S6k信号通路被阻断，二者的磷酸化水平呈现大黄素作用时间和剂量依赖性表达逐渐减弱。Tamburini应用RAD001对19例急性髓系白血病 (AML)原代细胞的研究结果认为，RAD001可以负反馈激活PI3K/Akt/mT0R信号通路上游信号分子Akt，因此RAD001单药使用可能限制其临床疗效，Tamburini和法国学者Park建议在AML治疗过程需兼顾PI3K/Akt和mTOR两个作用靶点。我们的研究显示，Rapamycin处理组HL-60/ADR细胞高表达p-Akt (Ser473)，而80 μ mol/L大黄素有效阻断mTOR及其下游的信号通路的同时，对P_Akt(Ser473)仍然具有明显抑制作用，而且抑制程度与LY294002 对照组接近。根据以上信号分子Western Blot结果，结合我们在相应处理条件下的HL-60/ ADR细胞DNA Ladder分析和Α0/ΕΒ量效和时效凋亡检测结果，我们分析认为大黄素可能通过两种途径抑制HL-60/ADR细胞PI3K/Akt/mT0R信号转导通路，一种是直接抑制了 Akt的活化，进而引起其下游信号的级联反应，另一种可能是直接对PI3K/Akt和mTOR双向抑制作用，从而更有效发挥抑制白血病耐药细胞增殖、诱导细胞凋亡作用。
应用实例II 大黄素作用后急性早幼粒白血病NB4细胞和相应维甲酸耐药MR2细胞PI3K/Akt/mT0R信号通路蛋白表达改变 材料和方法 1细胞株及药物来源 NB4为全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)敏感的人急性早幼粒白血病(APL)细胞株，MR2细胞株来源于对ATRA耐药的NB4细胞亚克隆，由上海瑞金医院血液研究所惠赠。
2 Western Blot 检测 (1)3(^11101/1、6(^11101/1大黄素作用于肌4和1 2细胞15、30小时后，提取药物处理组以及对照组两种细胞总蛋白。(2)0、8、80ymol/L大黄素，lymol/L雷帕霉素 (Rapamycin) ,40 μ mol/L LY294002,20 μ mol/L PD98059 共六组分别作用于ΝΒ4和 MR2 细胞12小时后，收集细胞，提取各处理组细胞总蛋白。SDS-PAGE检测p_Akt、p-mTOR、ρ_4Ε_ΒΡ1 和p-p70S6k和相应蛋白表达水平变化。β -actin抗体来源于同应用实例I。
3大黄素对NB4、MR2细胞凋亡的影响 3. 1 Annexin V FITC/PI法检测早期凋亡细胞 NB4和MR2细胞接种于6孔培养板中，两种细胞均分别加入终浓度为30 μ mol/L和 60 μ mol/L的大黄素，另设DMSO对照组，收集对照组和大黄素作用12小时后的NB4和MR2细胞，PBS充分洗涤后，按照Armexin V-FITC/PI试剂盒检测说明书操作，先加Bindingbuffer 重悬浮细胞后，再加入5μ 1 FITC和5μ 1 PI试剂，避光室温孵育后流式细胞仪检测结果。 其中Armexin V-FITC+PI-为早期凋亡细胞。实验重复进行3次。
3.2细胞形态学观察 30ymOl/L、60ymOl/L大黄素作用48小时后，收集对照组和各大黄素处理组细胞，PBS洗涤后涂片，甲醇固定，Wright-GiemSa(10 1)染色，油镜下观察细胞形态学变化。
3. 3 DNA Ladder 检测 收集对照组和30、60ymol/L大黄素作用48小时后的各组细胞，按照碧云天 BeyotimeDNA Ladder抽提试剂盒操作说明进行。主要步骤详见第一部分材料与方法3. 4， 凝胶图像分析仪上分析结果并拍照。
3. 4 DNA倍体分析 对照组和30 μ mol/L大黄素作用于NB4和MR2细胞48小时后，收集细胞，按照 CoulterDNA PREP Reagents Kit检测说明进行操作，先加DNA PREP LPR 100 μ 1，立即混勻后，再加入DNA PREP Stain 1ml，充分混勻后，避光，流式细胞仪(Beckman Coulter FC500) 分析结果。实验重复进行3次。
4统计学处理 采用SPSS14. 0软件包进行统计学处理，结果以均数士标准差表示。实验组和对照组、实验组和实验组之间比较采用方差分析(ANOVA)和t检验。
结果 1 Western Blot 检测结果 30、60 μ mol/L大黄素各作用于两种细胞15小时和30小时后，Western Blot 检测结果显示，PI3K/Akt/mT0R信号通路几种关键信号分子磷酸化蛋白表达下调，主要包括 p-Akt (Ser473)、p-mT0R (Ser2448)及其下游的活化效应分子 p_4E_BPl (Thr70)、 p-p70S6k(Thr389)大黄素抑制以上信号分子的表达呈现明显的量效和时效关系，Akt、 mT0R、4E-BPl和p70S6k总蛋白表达水平改变不及相应活化分子变化明显。与同时设立的 LY294002,Rapamycin 和 PD98059 对照组比较，80 μ mol/L 浓度组大黄素对 p-Akt,ρ-mTOR 及其下游相应的靶分子P-4E-BP1和p-p70S6k表达抑制作用具有明显特异性，且抑制程度与 LY294002、Rapamycin 干预组接近(图 2_1、图 2_2 和图 2_3)。
2细胞凋亡检测结果 2. 1流式细胞仪Armexin V-FITC/PI法早期凋亡细胞检测结果 大黄素作用12小时后流式细胞仪在两种细胞中均可检测到Armexin V FITC+PF早期凋亡细胞，并且细胞凋亡率随着药物浓度的增加而升高，60 μ mol/L组NB4和 MR2细胞平均早期细胞凋亡率分别占16. 90%和14. 57%，与对照组比较，差异均具有显著性(P < 0.01)，见图 2-4。
2. 2细胞形态学观察结果 对照组的NB4、MR2细胞形态如图2-5所示，30 μ mol/L和60 μ mol/L大黄素48小时处理组均可见明显细胞凋亡现象，表现为胞体变小，染色质凝集、固缩、核碎裂、凋亡小体形成。随着药物浓度增加，凋亡细胞数量明显增加。
2. 3 DNA Ladder 检测结果 两种浓度大黄素分别与NB4和MR2两株细胞共培养48小时后，DNA片段化检测结果(图2-6)显示，大黄素各浓度处理组均可见凋亡特征性DNA降解梯状带，对照组DNA仍较完整。
2. 4 DNA倍体分析结果 与未加大黄素对照组比较，大黄素能够促进NB4和MR2细胞凋亡。30 μ mol/L大黄素作用于NB4和MR2细胞48小时后，流式细胞仪进行DNA倍体分析，可见典型的亚二倍体峰(凋亡峰)，NB4细胞凋亡率为(21. 37 士 0. 72) %, MR2细胞为(26. 78 士 5. 19) %，细胞周期分析结果显示，大黄素作用48小时后，与相应对照组比较，两种细胞S期所占比例均明显减少，NB4 Gl期和MR2 G2期细胞所占比例显著增多(P < 0. 05)，(图2-7，表1，表2)。
表1大黄素处理48小时后NB4细胞周期分布
与对照组比较，*Ρ < 0. 05。
表2大黄素处理48小时后MR2细胞周期分布
与对照组比较，flP< 0. 01，*P < 0. 05。
讨论 全反式维甲酸的应用使85%急性早幼粒白血病患者得到完全缓解，是急性早幼粒白血病治疗上的一大突破，但是快速发展的维甲酸耐药是影响该类型患者长期疗效的主要因素，PI3K/Akt/mT0R信号通路与肿瘤细胞多药耐药密切相关，急性早幼粒白血病细胞株NB4和相应的维甲酸耐药细胞株MR2存在PI3K/Akt/mT0R信号通路的持续活化，我们检测了 30,60 μ mol/L大黄素处理15、30h后PI3K/Akt/mT0R信号通路重要的信号分子Akt、mTOR、 4E-BPl、p-70S6k以及相应的磷酸化蛋白，结果显示，p-mTOR及其下游的靶分子ρ_4Ε_ΒΡ1和 p-p70S6k蛋白表达水平随着大黄素作用时间的延长和作用浓度的提高呈明显下调趋势，并且大黄素对mTOR活化抑制作用并未诱发p-Akt的反馈性激活，我们同时检测到的两种细胞p-Akt表达与大黄素作用呈时效和量效关系逐渐减弱。与设立的LY294002、Rapamycin、 PD98059抑制剂干预组比较，进一步证实大黄素对NB4、MR2细胞PI3K/Akt/mT0R信号通路 Akt和mTOR的活化具有双重抑制作用，该作用具有高度特异性。
G0/G1期和G2/M期被认为是肿瘤细胞增殖的“关卡”，G0/G1期和G2/M期失控，导致本来应该停止增殖或发生生理性死亡的细胞进入增殖周期，恶性增生。我们的研究结果显示，经大黄素处理48h后的NB4和MR2细胞周期改变具有一定规律性，两种细胞S期细胞数量明显减少，NB4 Gl期细胞和MR2 G2期细胞所占比例显著增多，与相应对照组比较差异具有显著性意义(P < 0. 05)，因此我们认为，大黄素可能通过阻滞细胞于Gl期和G2期分别调控NB4和MR2细胞周期进程，从而达到抑制细胞增殖作用。30和60 μ mol/L两个浓度组大黄素作用于NB4和MR2细胞12小时，Annexin V FITC/PI法即可检测到早期凋亡细胞， 作用48小时细胞形态学观察到典型的凋亡小体形成，DNA片段化分析可见凋亡特征性梯状条带，DNA倍体分析检测到亚二倍体凋亡峰。
PI3K/Akt/mT0R信号通路异常活化保护肿瘤细胞免于凋亡，促进细胞持续增殖，大黄素处理后的急性早幼粒白血病维甲酸敏感和耐药细胞PI3K/Akt/mT0R信号通路重要信号分子的活化均受明显抑制，该信号通路的抗凋亡作用被削弱，几种方法均检测到大黄素作用后NB4和MR2细胞有明显的凋亡现象，以上研究结果说明大黄素通过作用于PI3K/Akt/ mTOR信号通路，在白血病细胞凋亡的发生和调控过程发挥重要的生物学功能。
应用实例III 大黄素对P-gp阳性急性白血病原代细胞PI3K/Akt/mT0R信号通路活化抑制作用 材料和方法 1研究对象 21例急性髓系白血病(AML)原代细胞来自2008年2月至2009年1月我院收治的 AML初诊或慢性粒细胞白血病(简称CML)急性髓系变患者外周血，AML诊断标准参照FAB 分型、流式细胞仪免疫分型及染色体核型分析。21例患者中男性9例，女性12例，年龄在 14-80岁之间，中位年龄为35岁，外周血白细胞数在18. 77X 109/L-238. 73X 109/L之间，中位白细胞数为 131. 60X 109/L，M0 3 例，Ml 2 例，M2a 5 例，M3 1 例，M5a 2 例，M5b 2 例，CML 急性髓系变4例，AML未定型2例。正常人共6例，取自健康献血者外周血。
2 MTT 实验 收集患者和正常人新鲜抗凝外周血样本，分离单个核细胞，含15%胎牛血清的 IMDM培养液重悬浮细胞，接种于96孔板中，接种细胞数为2. 0 X IO5/孔，每孔药物和细胞悬液总体积为100 μ 1。实验分为5组对照组以及10、20、40、8(^!1101/1大黄素组，每组重复 3个平行孔，药物作用48小时后进行MTT比色，与未加大黄素对照组吸光度值比较，计算不同样本各组细胞存活率、抑制率及IC50值，绘制细胞生长曲线。
3细胞凋亡检测 3. 1 DNA Ladder 检测 将部分患者原代细胞接种于6孔培养板中，细胞浓度为2. OX 106/ml，实验分为对照组、20和40 μ mol/L大黄素处理组，37°C ,5% C02温箱培养48小时后，收集细胞，PBS洗涤后，按照第一部分3. 4DNA Ladder检测说明进行实验操作。
3.2 DNA倍体分析 部分病例和正常人新鲜分离的单个核细胞接种于6孔培养板中，细胞接种数量和分组方案同方法3.1，药物作用时间为48小时，收集细胞后按照Coulter DNA PREP Reagents Kit检测说明进行操作，加DNA LRP 100 μ 1混勻后，立即再加DNA stain 1ml，充分混勻，避光，流式细胞仪(Coulter XL AD08041)上分析结果。
4 Western Blot 检测 将原代细胞接种于6孔培养板中，细胞浓度为2. OX 106/ml，分组方案同方法3. 1， 37°C,5% C02温箱培养24小时后，收集细胞，PBS洗涤细胞后，加蛋白提取裂解液和酶抑制剂，提取总蛋白，准确定量变性后进行SDS-PAGE电泳，测定的目的蛋白主要包括Akt、 P-Akt (Ser473)、Bcl_2、mTOR、p-mT0R(Ser2448)。P_gp 兔源单抗购自武汉博士德生物有限公司，其余的抗体来源同“应用实例I ”。
结果 1 MTT检测结果 大黄素对21例不同急性白血病患者原代细胞均有抑制作用，其IC50值介于13. 84-50. 86 μ mol/L之间，中位IC50值为29. 44 μ mol/L。大黄素抑制急性白血病原代细胞增殖作用呈剂量依赖性，随着大黄素浓度的增加，白血病细胞存活率逐渐降低，抑制效果逐渐增强，80 μ mol/L大黄素作用于急性髓系白血病原代细胞48小时后，最高抑制率可达到95. 40%，而对正常人外周血单个核细胞抑制作用则不明显，80 μ mol/L大黄素作用于6 例正常人单个核细胞48小时，细胞存活率均在70%以上(表1)。
表1大黄素对21例不同类型AML患者原代细胞和6例正常人外周血单个核细胞存活的影响
表3-1 Pat.指病人样本；NL 正常人外周血样 2细胞凋亡检测结果 2· 1 DNA Ladder 检测 随机选取 3 例 AML 患者原代细胞(Patient 16,Patient 17 和 Patient 81，经 20、 40 μ mol/L大黄素处理48小时，DNA Ladder检测结果显示，大黄素能够以剂量依赖方式诱导AML原代细胞DNA片段化形成，而未加大黄素对照组AML细胞以及相同剂量大黄素处理组2例正常人(NL4、NL5)外周血单个核细胞DNA均较完整，见图3_1。
2. 2 DNA倍体分析 随机选取2例AML患者(Patient7 M5b、Patient2 Ml)原代白血病细胞，经20、40 μ mol/L大黄素处理48小时，流式细胞仪进行DNA倍体分析，7号M5b患者原代细胞在两种浓度大黄素处理组均可见到明显的亚二倍体峰(凋亡峰)，凋亡细胞比例分别为26. 8% 和37. 5%，未加大黄素对照组则仅占8. 16% (图3-3，A0-A2)。2号Ml型白血病患者原代细胞经40 μ mol/L大黄素作用48小时后，细胞凋亡率为27.8%，相应对照组和20 μ mol/L 处理组凋亡率较低，分别为6. 52%,6. 16% (图3-3，B0-B2)。2例正常人外周血单个核细胞(Normal PBMC 1、Normal PBMC 3)经20、40 μ mol/L大黄素处理48小时，凋亡细胞比例和未经大黄素处理的对照组接近，均在10%左右(图3-2，C0-C2, D0-D2)。
3. Western Blot 检测结果 图3-4显示，19例患者外周血单个核细胞均强弱不等表达有MDRl基因表达产物 P-gp，2例患者(Patient 9,Patient 18，Patient简写为Pat)和6例正常人外周血单个核细胞P-gP为阴性。21例患者AML原代细胞经20、40 μ mol/L大黄素作用24小时后，检测到 18例患者Akt活化受抑制，即磷酸化的Akt表达水平下调，该18例患者中有8例同时检测至IJ Akt下游重要的信号蛋白mTOR的磷酸化受抑制，与未用大黄素处理的对照组比较，P-Akt 和p-mT0R随着大黄素处理组浓度的增加，表达水平逐渐下调，该表达变化较总Akt和mTOR 更加明显。21例患者中有3例患者(Patient 3、18、20)对照组和大黄素处理组未检测到 P-Akt表达。Bcl-2家族成员重要的抗凋亡蛋白Bcl-2在21例各型AML患者中均有表达， 并且经20、40 μ mol/L大黄素处理后，其表达水平均不同程度受抑制，该抑制作用呈大黄素浓度依赖性(图3-5)。
讨论 大黄素对乳腺癌、肝癌、前列腺癌、神经母细胞瘤等细胞株水平的研究已被大量报道，我们的前期研究证实大黄素具有抑制多种白血病细胞增殖、诱导细胞凋亡作用，大黄素对急性白血病原代细胞作用效果如何？对正常细胞是否存在毒性？ PI3K/Akt/mT0R信号转导通路是否在其中依然发挥重要作用？我们查阅国内外文献未见大黄素作用于急性白血病原代细胞相关报道，针对这些疑问我们做了进一步的研究。
MDRl基因编码产物为P-糖蛋白(P-gp)，P_gp介导的MDR途径为经典的MDR途径。 国外学者对158例初诊髓系白血病患者进行P-gp表达检测，阳性率高达73%。P-gp过度表达往往预示急性白血病治疗预后不良，该类患者CR率、4-5年总生存期和无病生存期均较MDRl/P-gp阴性者低。根据课题研究开展需要，我们经初筛选择的21例急性白血病患者中，19例患者原代细胞不同程度表达P_gp，2例为阴性，结果显示，不同类型原代白血病细胞对大黄素同样敏感，经10-80 μ mol/L大黄素作用以后，所有患者白血病细胞均不同程度受到抑制，大黄素浓度越高，细胞抑制作用越明显。大黄素对21例AML患者原代细胞的IC50 值介于13. 84-50. 86 μ mol/L之间，中位IC50值为29. 44 μ mol/L。我们分析Ρ-gp表达强阳性3例患者(Patient6U0U9)检测结果，除了 10号患者IC50值为34. OWmol/L，略高于所有检测患者的中位IC50外，6号和19号IC50分别为26. 62 μ mol/L和24. 04 μ mol/L, 均低于29. 44 μ mol/L,而2例P-gp表达阴性患者(Patient 9、18) IC50值分别为32. 72和 29. 44 4!1101/1，该值接近于总体平均扣50，提示大黄素对于？1 表达阳性和阴性白血病细胞兼具有抗增殖作用，以上大黄素对AML原代细胞体外药敏试验结果进一步验证了我们前期在白血病细胞株基础上的研究结论。
诱导肿瘤细胞凋亡是化疗药物抗肿瘤重要的作用机制之一，我们随机选取的5个病例原代细胞经两种浓度大黄素作用48小时后，进行经典凋亡相关指标检测，证实大黄素在体外具有诱导原代白血病细胞凋亡作用。理想的抗肿瘤药物还应该具有靶向性，在有效诱导肿瘤细胞凋亡同时对正常细胞毒性作用微小。大黄素对正常人原代细胞的作用研究文献报道极少，Yi等发现联合应用10 μ mol/L低剂量大黄素和2 μ mol/L As2O3抑制Hela细胞和U937细胞增殖同时，对正常人原代皮肤成纤维细胞无抑制作用。2001年美国国家毒理学规划处(National Toxicology Program, NTP)对大黄素进行了大小鼠体内为期最长达 2年的毒理学和致突变研究，结果显示该药具有较高安全性。Muto等应用0-100 μ mol/L大黄素作用于正常人外周血单个核细胞48小时后，应用XTT法分析，结果认为大黄素在该浓度范围内对正常细胞存活没有影响。我们通过6例正常人外周血单个核细胞体外MTT检测结果发现，0-80 μ mol/L浓度范围内，正常外周血单个核细胞存活率均在70 %以上，最高浓度组大黄素(80 μ mol/L)对正常细胞抑制率介于20. 88% -28. 97%之间。随机测定的4例献血者正常单个核细胞经大黄素作用后未见凋亡现象，或仅见少量凋亡细胞，提示大黄素对正常细胞的细胞毒作用较小，与Muto等报道的结果相符，也与我们在第三部分对NIH3T3 和L02的分析结果相吻合。
美国M. D.Anderson癌症中心两位学者Zeng和Konopleva提出阻断Bcl-2和mTOR/ Akt信号通路可以协同诱导AML细胞凋亡。我们前面的研究也已经证实，下调抗凋亡蛋白 Bcl-2表达水平和抑制Akt信号转导通路在大黄素诱导AML细胞株细胞凋亡过程中发挥关键作用。Karakas等检测152例AML患者中，有127例表达特异性bcl-2mRNA，而有学者报道 Bax/Bcl-2的比值与AML的预后呈正相关。我们用Western Blot方法检测21例患者外周血原代AML细胞，所有患者均无一例外高表达Bcl-2蛋白，并且在两种高低不同浓度大黄素处理后24小时，其表达水平均不同程度下调。Bcl-2表达量减少，抗凋亡作用被削弱，促凋亡效应增强，因此随机抽取的5例AML样本在大黄素作用24小时后可见到较明显的细胞凋亡现象。Steven等对258例初诊AML患者检测结果显示，p_Akt和抗凋亡蛋白XIAP、Bcl_2 表达水平显著相关，均呈现高表达，提出联合应用雷帕霉素和PI3K抑制剂有助于诱导AML 细胞株和原代AML细胞凋亡。由于原代细胞研究涉及患者个体之间、标本处理方式的差异， Akt信号通路的激活与否是否因人而异？ Xu等的研究消除了我们的疑虑，他们的实验结果证实，AML细胞的存活与Akt信号通路的激活关系密切，在检测的22例原代AML样本中，20 例存在Akt的活化，并且，活化的Akt在新鲜的、冻融过的、体外培养24小时以及低幼稚细胞比例的样本中均可检测出，检出率不受样本人为处理因素、幼稚细胞比例影响。我们检测的21例患者p-Akt检出率为90. 00% (18/21)，18例患者AML细胞经大黄素处理后，p_Akt 表达均明显下调，其中同时有8例检测到Akt信号通路下游的信号蛋白p-mT0R表达逐渐减弱，与未用大黄素处理的对照组比较，P-AKT和p-mT0R在大黄素处理组中下调水平较总Akt和mTOR更加明显，并且呈大黄素浓度依赖性。综上可见，Bc 1-2表达下调、Akt/mTOR信号通路活化受到抑制可能参与了大黄素作用于AML原代细胞过程中。
21例AML患者细胞有3例未检测到p_Akt表达，18例Akt有活化者其下游有10 例p-mTOR未被检测到，但MTT检测结果显示，大黄素仍然能够不同程度抑制该类细胞增殖、 诱导细胞凋亡。Muto等的研究认为，大黄素可通过选择性抑制JAK2/STAT3信号通路，快速下调Bcl-2家族成员Mcl-I表达，进而抑制多发性骨髓瘤细胞株细胞增殖，促进细胞凋亡。 Cheema等证实，大黄素通过抑制PI3K和MAPK信号通路使Her2/neu过表达乳腺癌细胞株 MDA-MB-453细胞增殖受抑制。Huang等通过比较大黄素作用于人乳腺癌细胞株BCap-37凋亡相关基因文库的改变，结合凋亡检测结果认为P53和IGF-2基因介导的凋亡相关途径共同参与了大黄素诱导BCap-37凋亡过程。以上研究说明大黄素作用靶点具有广泛性，因此我们认为，大黄素还可能通过其他作用机制抑制AML原代细胞增殖、诱导细胞凋亡。
总之，以上原代细胞的体外研究结果更进一步证实大黄素对急性髓系白血病耐药细胞作用的有效性，其中Bcl-2表达下调，PI3K/Akt/mT0R信号通路活化受抑制仍然是其主要作用机制，大黄素对正常外周血单个核细胞增殖影响较小，提示大黄素是一种高效低毒抗白血病化合物，对急性髓系白血病特别是复发、难治AML患者具有潜在的应用价值。
应用实例IV 大黄素给药后急性髓系白血病荷瘤鼠瘤组织PI3K/Akt/mT0R表达水平改变 材料和方法 1细胞培养和药物来源 高致瘤急性髓系白血病细胞(HL-60)引自本所细胞库，培养体系为含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，置37°C、5% CO2的饱和湿度培养箱培养。阿糖胞苷(Ara-C)为浙江海正药业股份有限公司产品，环磷酰胺为江苏恒瑞医药股份有限公司产品。
2动物来源及接种 4-6周龄BALB/C裸鼠，平均体重16g左右，雌雄各半，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号为SCXK (沪)2007-0005。饲养环境福建医科大学实验动物中心，许可证号为SYXK(闽)2008-0001，SPF级无菌层流柜，所用垫木、饮水、饲料以及其它动物实验接触的物品均经高压灭菌处理或紫外线消毒。进入SPF级无菌层流柜后的所有裸鼠于第三天开始，每只腹腔注射100mg/kg (10mg/ml环磷酰胺0. 2ml)，连续两天，隔天后，收集处于对数生长期高致瘤HL-60细胞，接种于裸鼠右前肢背侧皮下，每只细胞接种数量为1. 5X107, 约2周接种部位可以触及移植瘤生长。
3动物分组及给药方案 随机挑选荷瘤鼠30只，分成5组，每组6只，雌雄各半，将荷瘤鼠分为阴性(溶媒)对照组，2mg/kg小剂量Ara-C组，20mg/kg大黄素组，40mg/kg大黄素组，以及2mg/kg Ara-C和20mg/kg大黄素联合用药组，每日腹腔注射给药1次，连续14天。
4 Western Blot 检测 剪取各组瘤组织标本，研磨器研磨，PBS洗涤细胞后，加蛋白裂解液，提取总蛋白， 检测PI3K/Akt/mT0R信号通路相关蛋白在各药物处理组瘤块中的表达变化，操作步骤及抗体来源同第一部分。
结果 图4-1 Western Blot检测结果显示，20mg/kg大黄素组、40mg/kg大黄素组、20mg/ kg大黄素和Ara-C联合用药组均不同程度依次下调p_Akt、p-p65、p-mTOR蛋白表达水平， Ara-C单药组对以上四种活化蛋白影响甚微，Akt、p65、mT0R总蛋白表达水平在各给药组中变化则不明显。
讨论 我们通过对大黄素给药后急性白血病移植瘤组织蛋白检测发现，PI3K/Akt/mT0R信号转导通路重要的信号分子Akt、mT0R、NF-KB(p-65)总蛋白表达水平在各组中未见明显改变，其相应的磷酸化蛋白在20mg/kg大黄素组、40mg/kg大黄素组和大黄素与Ara-C联合用药组中表达逐渐减弱。我们的研究已经证实，大黄素以及大黄素与小剂量Ara-C联合应用，能够有效抑制高致瘤HL-60裸鼠移植瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，明显提高荷瘤鼠存活率，延长荷瘤鼠生存时间(结果未附)。Wang等通过体内研究表明，大黄素可通过抑制p38 MAPK的激活和下调纤连蛋白的表达水平，从而改善糖尿病小鼠模型肾功能不全症状。Lu等将芦荟大黄素作用于肝癌细胞株，结果发现，芦荟大黄素能够明显抑制ERK的活化，诱导JNK的激活，p38MAPK活性不受影响。还有的研究表明，NF- κ B和转录因子活化蛋白-1 (AP-I)与肿瘤的发生密切相关，许多血液和实体瘤中存在NF-κ B的异常活化，NF-κ B 的异常活化将使肿瘤细胞自身免于凋亡，NF-kB已经成为肿瘤化疗新的靶向分子。Yi等在体外发现大黄素和As2O3联合应用于Hela细胞，NF-κ B和AP-I表达同时下调。Kim等也发现大黄素可以显著抑制NF- κ B和AP-I的活性间接抑制神经胶质瘤细胞分泌ΜΜΡ-2和 MMP-9。Brown等将大黄素、DHA联合应用于成人T细胞白血病(ATL)细胞株C8166，发现Akt 和AP-I成员Jim D、JAB1均显著下调，C8166细胞增殖受到明显抑制，正常人外周血单个核细胞在各药物组中未见明显变化。Ara-C为嘧啶类抗代谢药，能够抑制DNA聚合酶的活性， 干扰DNA合成，广泛应用于AML的治疗，本课题设计的小剂量Ara-C组对高致瘤HL-60细胞裸鼠移植瘤的研究结果显示，Ara-C单药对移植瘤细胞p-Akt的影响甚微，和Sampath等的研究结论一致。综合以上学者的观点结合我们的研究结果，我们认为，PI3K/Akt/mT0R信号通路重要信号分子的活化受阻是大黄素抗HL-60细胞裸鼠移植瘤生长的主要作用机制之一，体内研究结果与我们的体外研究结论相一致，也进一步阐明了大黄素对白血病细胞 PI3K/Akt/mT0R作用具有靶向性。
结论 大黄素对急性白血病耐药细胞株、P-gp+急性白血病原代细胞和高致瘤急性白血病裸鼠移植瘤细胞PI3K/Akt/mT0R信号通路的活化具有特异性抑制作用，大黄素是一种新型PI3K/Akt/mT0R信号转导通路活化分子靶向抑制剂，为急性白血病和急性白血病多药耐药的靶向治疗提供新思路。
权利要求
1.一种PI3K/Akt/mT0R信号转导通路活化分子ρ-Akt和p-mTOR的抑制剂，其特征在于 含有药学上的治疗有效剂量的大黄素。
2.根据权利要求1所述的抑制剂，其特征在于所述大黄素是对急性白血病多药耐药细 胞，急性早幼粒细胞白血病维甲酸耐药细胞和高致瘤急性白血病裸鼠移植瘤细胞具有抑制 增殖作用的药效学特性的大黄素。
3.权利要求1或2所述的大黄素作为PI3K/Akt/mT0R信号通路活化分子ρ-Akt和 p-mTOR的抑制剂的应用。
4.权利要求3所述的作为PI3K/Akt/mT0R信号通路活化分子p_Akt和p-mTOR抑制剂 的大黄素在制备治疗急性白血病多药耐药细胞的药物中的应用。
5.权利要求3所述的作为PI3K/Akt/mT0R信号通路活化分子p_Akt和p-mTOR抑制剂 的大黄素在制备治疗急性早幼粒白血病维甲酸耐药细胞和相应敏感细胞的药物中的应用。
6.权利要求3所述的作为PI3K/Akt/mT0R信号通路活化分子p_Akt和p-mTOR抑制剂 的大黄素在制备治疗急性白血病原代细胞的药物中的应用。
7.权利要求3所述的作为PI3K/Akt/mT0R信号通路活化分子p_Akt和p-mTOR抑制剂 的大黄素在制备体内治疗高致瘤急性白血病裸鼠移植瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开大黄素作为PI3K/Akt/mTOR信号转导通路活化分子p-Akt和p-mTOR的抑制剂及其应用，大黄素是从中药大黄提取的纯天然蒽醌类单体化合物，具有抗微生物、抗炎、抗氧化、免疫调节、肝保护等多种生物学活性。本发明发现，急性白血病多药耐药细胞HL-60/ADR、急性早幼粒白血病维甲酸耐药细胞MR2和相应敏感细胞NB4以及急性白血病原代细胞经大黄素作用后，PI3K/Akt/mTOR信号转导通路关键信号活化分子尤其是被p-Akt和p-mTOR被特异性抑制，体内研究证实，大黄素给药后急性白血病裸鼠移植瘤组织蛋白中PI3K/Akt/mTOR信号通路关键活化分子p-Akt、p-p65和p-mTOR均表达下调，说明大黄素可作为一种新型的PI3K/Akt/mTO信号转导活化分子特别是p-Akt和p-mTOR靶向抑制剂，应用于治疗血液系统恶性肿瘤。
文档编号A61K31/122GK101843605SQ20101018185
公开日2010年9月29日 申请日期2010年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者胡建达, 陈英玉, 郑志宏, 魏天南 申请人:福建医科大学附属协和医院