专利名称：新颖的荷叶总生物碱提取物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及荷叶提取物，特别涉及一种新颖的荷叶总生物碱提取物和一种简便可靠的荷叶总生物碱提取物的制备方法，以及所述提取物的用途特别是在治疗和/或预防肥胖和/或肥胖症、糖尿病、高脂血症、高血压和/或高血压症等糖脂代谢异常疾病中的应用。
背景技术：
荷叶是睡莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn)的干燥叶片，具有清热解暑、减肥降脂、升发清阳、凉血止血等多种功效。现代药理学研究表明，荷叶中的生物碱具有降血脂、抑制胆固醇、抑菌和止痉挛、抗氧化等药理活性，是荷叶的主要有效成份。文献报道对荷叶总生物碱的提取纯化较多采用大孔树脂分离法，采用树脂吸附技术制备的荷叶总生物碱含量较低。文献中(肖文军，胡祥文，胡云铃等.荷叶生物碱柱分离纯化技术研究.食品科学[J]. 2007，28 (6) 120-124)以荷叶干叶为原料，经30%乙醇提取后，研究了聚酰胺、D101、HP-20三种大孔树脂对荷叶生物碱静态吸附与解吸的过程，其最后制备的荷叶生物碱提取物中荷叶总生物碱含量为32. 56%。CN101085041A (中国专利申请号2007101226448，
公开日2OO7年I2月I2日)公开了一种荷叶总生物碱提取物及其制备方法，其中采用大孔树脂进行处理，并且所获得的提取物中总生物碱含量低于58%。因此，提供一种简易的提取荷叶生物碱的方法，获得含有较高纯度生物碱的荷叶提取物，仍是本领域技术人员急于解决的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有提取荷叶生物碱技术中存在的不足，使提取工艺简化可靠和/或获得具有较高纯度生物碱的提取物。本发明人令人惊奇地发现，采用本发明方法制备荷叶总生物碱提取物，药材提取完全，步骤简单，溶剂用量少、毒性低，适于工业化生产；所制备提取物经测定荷叶总生物碱含量可达到70 98% (w/w)，荷叶碱含量可达14 28% (w/w) 0本发明基于上述发现而得以完成。发明概沭本发明第一方面提供一种荷叶总生物碱提取物，其中包含荷叶总生物碱和荷叶碱，所述荷叶总生物碱与荷叶碱的重量比为(3. 5 5) 1。根据本发明第一方面任一项的荷叶总生物碱提取物，其中所述荷叶总生物碱占该提取物重量的70 98% (w/w) 0在一个实施方案中，所述荷叶总生物碱占该提取物重量的 72 96%、72 95%、75 95%、78 95%、78 93%、80 95%、80 92%、或 80 90%。根据本发明第一方面任一项的荷叶总生物碱提取物，其中所述荷叶碱占该提取物重量的14 28% (w/w)。在一个实施方案中，所述荷叶总生物碱占该提取物重量的14 28%、15 28%、15 26%、15 25%、16 25%、17 25%、18 25%、19 25%、或 20 25%。根据本发明第一方面任一项的荷叶总生物碱提取物，其中包含荷叶总生物碱和荷叶碱，所述荷叶总生物碱与荷叶碱的重量比为(3. 5 5) 1，并且所述荷叶总生物碱占该提取物重量的70 98% (w/w)，所述荷叶碱占该提取物重量的14 28% (w/w)。根据本发明第一方面任一项的荷叶总生物碱提取物，其是通过包括以下步骤的方法制备的使荷叶用含有0.05 0.5% (ν/ν)盐酸的乙醇提取，然后进行索氏提取，得到的提取液用盐酸水溶液萃取，水层用乙酸乙酯萃取，使有机层浓缩，干燥，即得。在一个实施方案中，所述含有盐酸的乙醇是含有0. 05 0. 4%、0. 06 0. 4%、0. 07 0. 35%,0. 08 0. 3%,0. 08 0.25%、约 0. 09%、约 0. 1%、约 0. 12%、约 0. 15%、约 0. 2%、或约 0. 25%盐酸的乙醇。在一个实施方案中，所述乙醇是50 80%乙醇(例如55 80%、60 80%、 65 80 %、65 75 %、约65 %、约70 %、或约75 %的乙醇)。在一个实施方案中，所述含有盐酸的乙醇是含有0. 08 0. 25%盐酸的65 75%乙醇。在一个实施方案中，所述含有盐酸的乙醇是含有0. 09 0. 15%盐酸的68 72%乙醇。在一个实施方案中，所述含有盐酸的乙醇是含有约0.1%盐酸的约70%乙醇。在一个实施方案中，所述提取是冷浸提取。在一个实施方案中，所述乙醇提取液提取后调节ρΗ至8. 5 10. 5，例如调节ρΗ至9 10，然后再将其浓缩。在一个实施方案中，所述索氏提取是用乙酸乙酯进行提取。在一个实施方案中，所述索氏提取液用ρΗ为1 2的盐酸水溶液萃取。在一个实施方案中，所述索氏提取液用盐酸水溶液萃取后，调节PH至11 12，再用乙酸乙酯萃取。根据本发明第一方面任一项的荷叶总生物碱提取物，其是通过包括以下步骤的方法制备的a)使荷叶用含有0. 05 0. 5% (ν/ν)盐酸的50 80%乙醇提取，得到的提取液调节ρΗ至8. 5 10. 5，浓缩，得到第一浓缩液；b)使步骤a)所得第一浓缩液与硅藻土混合，干燥，再用乙酸乙酯在索氏提取器中进行索氏提取，使提取液浓缩，得到第二浓缩液；c)使步骤b)所得第二浓缩液用ρΗ为1 2的盐酸水溶液萃取，水层调节ρΗ至 11 12，再用乙酸乙酯进行萃取，使得到的有机层浓缩，干燥，即得。本发明第二方面提供一种荷叶总生物碱提取物，其中包含荷叶总生物碱和荷叶碱，其中所述荷叶总生物碱占该提取物重量的70 98% (w/w) 0在一个实施方案中，所述荷叶总生物碱占该提取物重量的72 96 %、72 95 %、75 95 %、78 95 %、78 93 %、 80 95%、80 92%、或 80 90%。根据本发明第二方面任一项的荷叶总生物碱提取物，其中所述荷叶碱占该提取物重量的14 28% (w/w)。在一个实施方案中，所述荷叶总生物碱占该提取物重量的14 28%、15 28%、15 26%、15 25%、16 25%、17 25%、18 25%、19 25%、或 20 25%。根据本发明第二方面任一项的荷叶总生物碱提取物，其中包含荷叶总生物碱和荷叶碱，所述荷叶总生物碱占该提取物重量的70 98% (w/w)，所述荷叶碱占该提取物重量的 14 28% (w/w)。根据本发明第二方面任一项的荷叶总生物碱提取物，其中包含荷叶总生物碱和荷叶碱，所述荷叶总生物碱占该提取物重量的70 98% (w/w)，所述荷叶碱占该提取物重量的14 28% (w/w)，并且所述荷叶总生物碱与荷叶碱的重量比为(3. 5 5) 1。根据本发明第二方面任一项的荷叶总生物碱提取物，其是通过包括以下步骤的方法制备的使荷叶用含有0.05 0.5% (ν/ν)盐酸的乙醇提取，然后进行索氏提取，得到的提取液用盐酸水溶液萃取，水层用乙酸乙酯萃取，使有机层浓缩，干燥，即得。在一个实施方案中，所述含有盐酸的乙醇是含有0. 05 0. 4%、0. 06 0. 4%、0. 07 0. 35%,0. 08 0. 3%,0. 08 0. 25%、约 0. 09%、约 0. 1%、约 0. 12%、约 0. 15%、约 0. 2%、或约 0. 25%盐酸的乙醇。在一个实施方案中，所述乙醇是50 80%乙醇(例如55 80%、60 80%、 65 80 %、65 75 %、约65 %、约70 %、或约75 %的乙醇)。在一个实施方案中，所述含有盐酸的乙醇是含有0. 08 0. 25%盐酸的65 75%乙醇。在一个实施方案中，所述含有盐酸的乙醇是含有0. 09 0. 15%盐酸的68 72%乙醇。在一个实施方案中，所述含有盐酸的乙醇是含有约0.1%盐酸的约70%乙醇。在一个实施方案中，所述提取是冷浸提取。在一个实施方案中，所述乙醇提取液提取后调节ρΗ至8. 5 10. 5，例如调节ρΗ至9 10，然后再将其浓缩。在一个实施方案中，所述索氏提取是用乙酸乙酯进行提取。在一个实施方案中，所述索氏提取液用ρΗ为1 2的盐酸水溶液萃取。在一个实施方案中，所述索氏提取液用盐酸水溶液萃取后，调节PH至11 12，再用乙酸乙酯萃取。根据本发明第二方面任一项的荷叶总生物碱提取物，其是通过包括以下步骤的方法制备的a)使荷叶用含有0. 05 0. 5% (ν/ν)盐酸的50 80%乙醇提取，得到的提取液调节ρΗ至8. 5 10. 5，浓缩，得到第一浓缩液；b)使步骤a)所得第一浓缩液与硅藻土混合，干燥，再用乙酸乙酯在索氏提取器中进行索氏提取，使提取液浓缩，得到第二浓缩液；c)使步骤b)所得第二浓缩液用ρΗ为1 2的盐酸水溶液萃取，水层调节ρΗ至 11 12，再用乙酸乙酯进行萃取，使得到的有机层浓缩，干燥，即得。本发明第三方面提供了制备本发明第一方面任一项或第二方面任一项所述荷叶总生物碱提取物的方法，该方法包括以下步骤使荷叶用含有0. 05 0. 5% (ν/ν)盐酸的乙醇提取，然后进行索氏提取，得到的提取液用盐水酸溶液萃取，水层用乙酸乙酯萃取，使有机层浓缩，干燥，即得。在一个实施方案中，所述含有盐酸的乙醇是含有0. 05 0. 4%、 0. 06 0. 4 %、0. 07 0. 35 %、0. 08 0. 3 %、0. 08 0. 25 %、约 0. 09 %、约 0. 1 %、约 0. 12%、约0. 15%、约0. 2%、或约0. 25%盐酸的乙醇。在一个实施方案中，所述乙醇是50 80% 乙醇(例如 55 80%、60 80%、65 80%、65 75%、约 65%、约 70%、或约 75% 的乙醇)。在一个实施方案中，所述含有盐酸的乙醇是含有0. 08 0. 25 %盐酸的65 75 % 乙醇。在一个实施方案中，所述含有盐酸的乙醇是含有0. 09 0. 15%盐酸的68 72%乙醇。在一个实施方案中，所述含有盐酸的乙醇是含有约0. 盐酸的约70%乙醇。在一个实施方案中，所述提取是冷浸提取。在一个实施方案中，所述乙醇提取液提取后调节PH至 8. 5 10. 5，例如调节ρΗ至9 10，然后再将其浓缩。在一个实施方案中，所述索氏提取是用乙酸乙酯进行提取。在一个实施方案中，所述索氏提取液用ρΗ为1 2的盐酸水溶液萃取。在一个实施方案中，所述索氏提取液用盐酸水溶液萃取后，调节PH至11 12，再用乙酸乙酯萃取。
根据本发明第三方面任一项的方法，其包括以下步骤a)使荷叶用含有0. 05 0. 5% (ν/ν)盐酸的50 80%乙醇提取，得到的提取液调节ρΗ至8. 5 10. 5，浓缩，得到第一浓缩液；b)使步骤a)所得第一浓缩液与硅藻土混合，干燥，再用乙酸乙酯在索氏提取器中进行索氏提取，使提取液浓缩，得到第二浓缩液；c)使步骤b)所得第二浓缩液用ρΗ为1 2的盐酸水溶液萃取，水层调节ρΗ至 11 12，再用乙酸乙酯进行萃取，使得到的有机层浓缩，干燥，即得。本发明第四方面提供一种组合物，其包含治疗和/或预防有效量的荷叶总生物碱提取物以及任选的药学可接受的载体。根据本发明第四方面任一项的组合物，其中所述荷叶总生物碱提取物包括荷叶总生物碱和荷叶碱。根据本发明第四方面任一项的组合物，其中所述荷叶总生物碱提取物包括荷叶总生物碱和荷叶碱，所述荷叶总生物碱与荷叶碱的重量比为(3. 5 5) 1。在一个实施方案中，所述荷叶总生物碱与荷叶碱的重量比为(3. 5 4. 5) 1。根据本发明第四方面任一项的组合物，其中所述荷叶总生物碱提取物是本发明第一方面任一项的荷叶总生物碱提取物，和/或所述荷叶总生物碱提取物是本发明第二方面任一项的荷叶总生物碱提取物。根据本发明第四方面任一项的组合物，其为药物组合物。根据本发明第四方面任一项的组合物，其为药物组合物，并且其是呈片剂、颗粒剂、胶囊、丸剂、滴丸的形式。根据本发明第四方面任一项的组合物，其为药物组合物，并且其是与一种或多种药用赋形剂混合制成片剂、颗粒剂、胶囊、丸剂、滴丸中的任一种。本发明第五方面提供荷叶总生物碱提取物在制备用于治疗和/或预防与糖脂代谢异常有关的疾病或病症的产品中的用途。在一个实施方案中，所述产品中包含荷叶总生物碱和荷叶碱，所述荷叶总生物碱与荷叶碱的重量比为(3. 5 5) 1。在一个实施方案中， 所述的与糖脂代谢异常有关的疾病或病症选自肥胖和/或肥胖症、糖尿病、高脂血症、高血压和/或高血压症。本发明第六方面提供荷叶总生物碱提取物在制备用于治疗和/或预防与糖脂代谢异常有关的疾病或病症的产品中的用途，和/或用于降血脂、抑制胆固醇、抑菌、止痉挛、 抗氧化的产品中的用途，其中所述荷叶总生物碱提取物如本发明第一方面任一项所述，或者如本发明第二方面任一项所述。在一个实施方案中，所述产品中包含荷叶总生物碱和荷叶碱，所述荷叶总生物碱与荷叶碱的重量比为(3. 5 5) 1。在一个实施方案中，其中所述的与糖脂代谢异常有关的疾病或病症选自肥胖和/或肥胖症、糖尿病、高脂血症、高血压和/或高血压症。本发明第七方面提供用于治疗和/或预防与糖脂代谢异常有关的疾病或病症的产品，该产品中包含治疗和/或预防有效量的荷叶总生物碱提取物以及任选的药学可接受的载体。在一个实施方案中，所述产品中包含荷叶总生物碱和荷叶碱，所述荷叶总生物碱与荷叶碱的重量比为(3. 5 5) 1。在一个实施方案中，所述的与糖脂代谢异常有关的疾病或病症选自肥胖和/或肥胖症、糖尿病、高脂血症、高血压和/或高血压症。
本发明第八方面提供用于治疗和/或预防与糖脂代谢异常有关的疾病或病症的产品，和/或用于降血脂、抑制胆固醇、抑菌、止痉挛、抗氧化的产品，该产品中包含治疗和 /或预防有效量的荷叶总生物碱提取物以及任选的药学可接受的载体，所述荷叶总生物碱提取物如本发明第一方面任一项所述，或者如本发明第二方面任一项所述。在一个实施方案中，所述产品中包含荷叶总生物碱和荷叶碱，所述荷叶总生物碱与荷叶碱的重量比为 (3. 5 5) 1。在一个实施方案中，所述的与糖脂代谢异常有关的疾病或病症选自肥胖和 /或肥胖症、糖尿病、高脂血症、高血压和/或高血压症。本发明第九方面提供在有需要的受试者中治疗和/或预防与糖脂代谢异常有关的疾病或病症方法，和/或在有需要的受试者中降血脂、抑制胆固醇、抑菌、止痉挛、抗氧化的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的荷叶总生物碱提取物。在一个实施方案中，所述荷叶总生物碱提取物如本发明第一方面任一项所述，或者如本发明第二方面任一项所述。在一个实施方案中，所述荷叶总生物碱提取物中包含荷叶总生物碱和荷叶碱，所述荷叶总生物碱与荷叶碱的重量比为(3. 5 5) 1。在一个实施方案中，所述的与糖脂代谢异常有关的疾病或病症选自肥胖和/或肥胖症、糖尿病、高脂血症、高血压和/或高血压症。本发明任一方面或该任一方面的任一项所具有的特征同样适用于其它任一方面或该其它任一方面的任一项，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。在本发明中，例如，提及“本发明第一方面任一项”时，该“任一项” 是指本发明第一方面的任一子方面，在其它方面以类似方式提及时，亦具有相同含义。发明详述下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。如本文所述的，术语“荷叶”可以符合2005年版《中华人民共和国药典》相应项下的规定。如本文所述的，术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。如本文所述的，术语“组合物”，其还可以是指药物组合物，可用于在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症。如本文所述的，术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。如本文所述的，术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。如本文所述的，百分比符号“ ％ ”，其具有如2005年版《中华人民共和国药典》凡例中的定义。特别地，对于本发明所述的乙醇，是指具有指定浓度的乙醇水溶液；对于本发明所述的盐酸的％浓度，其是指体积百分比浓度。在一些情况下，如未特别指明，对于总物料是固体时一般是指重量/重量的百分比，对于总物料是液体时一般是指重量/体积的百分比。如本文所述的，术语“荷叶总生物碱提取物”是指一种由植物荷叶特别是符合2005 年版《中华人民共和国药典》“荷叶”项下的规定的荷叶经提取得到的一种提取物，其中含有若干种类的生物碱(称之为总生物碱)。如本文所述的，术语“荷叶总生物碱”是荷叶经提取后获得的包含若干生物碱的活性组分群，其中包含单体化合物荷叶碱以及其它生物碱，例如现有技术已经记载的生物碱如N-去甲基荷叶碱和/或0-去甲基荷叶碱等。本发明令人惊奇地发现，通过对药材用酸醇冷浸提取、索氏提取和溶剂萃取简单的三个步骤可以容易地制备荷叶总生物碱提取物，并且所制备提取物中荷叶总生物碱含量可以达到70 98%。在药材提取时，选用酸醇冷浸的方法，比回流提取法更安全方便，节约能源，提取物中杂质含量低，便于后续步骤中荷叶总生物碱含量的提高。另外，含盐酸的乙醇提取液，在进行多次浸取时，最后一次的冷浸液可以用来当下一批次荷叶冷浸提取的第一次冷浸溶剂，减少了溶剂用量。在索氏提取步骤中，将硅藻土拌入前面步骤获得的浓缩液中，可以更好的分散上述浓缩液，使其在索氏提取回流时与有机溶剂(例如乙酸乙酯)的接触更为充分，提取更加完全。此外，在不同步骤中使用的溶剂(特别是有机溶剂)为单一、 低毒的溶剂，便于回收再利用。在一个实施方案中，本发明提取物可以通过包括以下步骤的方法制备；或者在一个实施方案中，本发明提取物的制备方法包括以下步骤(1)药材冷浸提取以含盐酸0.05% 0.5%的50% 80%的乙醇为提取溶剂， 提取溶剂用量为16 18倍，冷浸提取3次，合并冷浸提取液，调节提取液pH为9 10，减压浓缩回收溶剂，得第一浓缩液；(2)索氏提取分离第一浓缩液，加入硅藻土拌勻，干燥后，用乙酸乙酯进行索氏提取，提取后减压浓缩回收溶剂，得第二浓缩液；(3)溶剂萃取分离第二浓缩液，用1 2倍体积的pH = 1 2的盐酸水溶液萃取2 4次，分出合并酸水层；调节酸水层pH到11 12后，用1 2倍体积的乙酸乙酯萃取2 4次，收集乙酸乙酯层，减压浓缩回收溶剂，干燥后，得荷叶总生物碱提取物。在一个实施方案中，制备提取物时，荷叶药材冷浸提取的最佳溶剂为含盐酸0. 1% 的体积百分比浓度为70%的乙醇。采用本发明方法制备荷叶总生物碱提取物，药材提取完全，步骤简单，溶剂用量少、毒性低，适于工业化生产；所制备提取物经酸性染料比色法测定荷叶总生物碱含量可达到70%以上(例如80%以上)，经HPLC测定荷叶碱含量可达14%以上(例如15%、18%或 20%以上)。本发明的药物组合物可以制成临床上可以接受的剂型，包括片剂、颗粒剂、胶囊、 丸剂、滴丸等等。其制剂成型技术可采用本领域技术人员熟知的常规的制备方法，本发明在此不作限定。可采用口服制剂中允许使用的常用辅料，包括崩解剂、填充剂、润滑剂、粘合剂、矫味剂、助流剂、表面活性剂等。本发明通过生物学实验例来进一步描述本发明的荷叶总生物碱提取物在治疗和/ 或预防与糖脂代谢异常有关的疾病或病症方面的有益效果。
肝脏及外周组织是胰岛素作用的靶组织，是胰岛素抵抗产生的主要部位，是探讨胰岛素抵抗形成的机制和葡萄糖代谢障碍的病理生理学环节的重点，荷叶总生物碱能有效抑制脂肪前体细胞分化，降低脂肪细胞中甘油三酯的蓄积，提示其具有减肥和改善胰岛素抵抗作用。荷叶总生物碱提取物可以抑制细胞膜上η乙酰胆碱受体激动剂乙酰胆碱(ACh)、 电压依赖型钠离子通道开放剂藜芦定碱(Ver)、电压依赖型钙离子通道开放环境的高钾介导的儿茶酚胺(CA)的分泌，且具有剂量依赖性，同时又能显著抑制乙酰胆碱诱导的细胞钙内流。说明荷叶总生物碱提取物通过减少细胞内钙离子浓度发挥抑制儿茶酚胺分泌，此项研究结果提示荷叶除应用于中暑之外，可用于肥胖和/或肥胖症、糖尿病、高脂血症、高血压和/或高血压症等糖脂代谢异常疾病。
图1显示荷叶碱对照品HPLC色谱图(1-荷叶碱峰)。图2显示本发明荷叶总生物碱提取物的HPLC色谱图(1-荷叶碱峰)。图3显示荷叶总生物碱提取物对ACh、Ver、高钾诱导的儿茶酚胺分泌的影响。图4显示不同浓度荷叶总生物碱提取物对ACh (A) ,Ver (B)、高钾(C)诱导的CA分泌的影响。
具体实施例方式通过下面的实例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。制备例1——荷叶总生物碱提取物的制备(1)药材冷浸提取取IOOg荷叶药材，用含盐酸0.05%的70%的乙醇冷浸提取3 次，溶剂用量分别为1800mL、1800mL、1600mL，每次36小时，合并提取液，调节提取液pH至 8. 5，减压浓缩至约IOOmL,得第一浓缩液；(2)索氏提取分离将第一浓缩液，加入50g硅藻土拌勻，干燥后放入索氏提取器中，用200mL乙酸乙酯提取2次，每次3小时，合并提取液，减压浓缩至约IOOmL,得第二浓缩液；(3)溶剂萃取分离第二浓缩液，用PH = 1的盐酸水溶液IOOmL萃取3次，合并酸水层，调节PH至11，将酸水层用300mL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，浓缩干燥，得荷叶总生物碱提取物。制备例2——荷叶总生物碱提取物的制备(1)药材冷浸提取IOOg荷叶药材，用含盐酸0.1%的50%的乙醇冷浸提取3次， 溶剂用量分别为1600mL、1600mL、1600mL，每次36小时，合并提取液，调节提取液pH至10， 减压浓缩至约IOOmL,得第一浓缩液；
(2)索氏提取分离将第一浓缩液，加入50g硅藻土拌勻，干燥后放入索氏提取器中，用200mL乙酸乙酯提取2次，每次3小时，合并提取液，减压浓缩至约IOOmL,得第二浓缩液；(3)溶剂萃取分离第二浓缩液，用PH = 2的盐酸水溶液IOOmL萃取2次，合并酸水层，调节PH至12，将酸水层用200mL乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，浓缩干燥，得荷叶总生物碱提取物。制备例3——荷叶总牛物碱提取物的制备(1)药材冷浸提取100g荷叶药材，分别加1700mL含0. 5%盐酸的80%的乙醇，冷浸提取3次，每次36小时，合并提取液，调节提取液pH至10. 5，减压浓缩至约IOOmL,得第一浓缩液；(2)索氏提取分离将第一浓缩液，加入50g硅藻土拌勻，干燥后放入索氏提取器中，用200mL乙酸乙酯提取2次，每次3小时，合并提取液，减压浓缩至约IOOmL,得第二浓缩液；(3)溶剂萃取分离第二浓缩液，用PH = 1的盐酸水溶液IOOmL萃取4次，合并酸水层，调节PH至11，将酸水层用400mL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，浓缩干燥，得荷叶总生物碱提取物。在不同制备例中使用不同的提取条件，并且产物的性能参数列于表1。分析试验例1——荷叶总生物碱提取物中荷叶总生物碱的含量测定采用酸性染料比色法进行测定。对照品溶液的制备取荷叶碱对照品适量，精密称定，用三氯甲烷配制成浓度为 0. 04mg · ml/1的荷叶碱对照品溶液。溴甲酚绿缓冲液的制备精密称取溴甲酚绿125mg，用0. 2mol化―1的NaOH 12. 5mL 溶解，加入适量邻苯二甲酸氢钾，加少量水溶解，调节PH值到4. 0。标准曲线的绘制分别精密吸取0、0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5mL对照品溶液于5mL量瓶中，加三氯甲烷至刻度，振摇，移至分液漏斗中，精密加入溴甲酚绿缓冲液和0. 2mol ·厂1 的NaOH各0. 5mL，摇勻，静置，取澄清的三氯甲烷层在415nm波长下测定紫外吸光度，以荷叶碱浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，得回归方程Y = 71. 5109Χ-0. 01476，r = 0. 9986，线性范围 0. 004 0. 02mg. m Γ1。荷叶总生物碱提取物中总生物碱的测定精密称取8mg荷叶总生物碱提取物置于 IOml容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，摇勻，精密吸取Iml于IOml容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，摇勻，得供试品溶液。取ImL供试品溶液置于加入5mL三氯甲烷的分液漏斗中，再加入溴甲酚绿缓冲液3mL和0. 2mol · L-1的NaOH溶液ImL,振摇Imin,静置30min,取澄清的三氯甲烷溶液层于415nm处测定吸光度，代入回归方程计算，得到荷叶总生物碱提取物中总生物碱的含量。上文制备例中获得的荷叶总生物碱提取物的测定结果见表1。分析试验例2——荷叶总生物碱提取物中荷叶碱的含量测定采用HPLC法测定。对照品溶液的制备取荷叶碱对照品适量，精密称定，用甲醇配制成浓度为 0. 0154mg · mL—1的荷叶碱对照品溶液。
供试品溶液的制备取荷叶总生物碱提取物适量，精密称定，用甲醇配制成浓度为 0. 176mg · mL-1。HPLC色谱条件色谱柱Phenomsil C18 (4. 6匪X 250匪，5 μ m)；流动相乙腈-水-三乙胺-冰醋酸(27 70. 6 1.6 0. 78)；检测波长:270nm ；流速1. OmL .mirT1 ； 柱温25°C。标准曲线的绘制取荷叶碱对照品适量，精密称定，用甲醇配成系列浓度的对照品溶液。以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标作图，得荷叶碱回归方程为Y = 3. 22X+12. 02，r = 0. 9998，线性范围为 9. 56X 1(Γ3 0. 478 μ g。样品测定精密吸取对照品溶液5 μ 1，供试品溶液5 μ 1，依次注入高效液相色谱仪，测定荷叶碱峰面积，按外标一点法计算，得荷叶碱含量。上文制备例中获得的荷叶总生物碱提取物的测定结果见表1。荷叶碱对照品和制备例1的提取物的HPLC图谱分别见图1和图2。同时计算该提取物中，总生物碱与荷叶碱
的重量比率。表1、荷叶总生物碱提取物样品或其组合物中，荷叶碱和总生物碱的含量测定结果
样品总生物碱 (% )*荷叶碱 (% )**总生物碱/荷叶碱w制备例170. 014. 05 1制备例298. 028. 03. 5 1制备例385. 019. 34. 4 1注表示总生物碱占提取物的重量百分数(％ )广表示荷叶碱占提取物的重量百分数(％)表示提取物中的总生物碱与荷叶碱的重量比率。制剂例1、制备包含荷叶总牛物碱提取物的药物组合物取制备例1的荷叶总生物碱提取物100g，淀粉50g，微晶纤维素60g，羧甲基淀粉钠 120g，交联聚维酮50g。混合均勻后，以含羟丙基甲基纤维素的90%乙醇溶液制软材，16 目筛制粒，60°C干燥并整粒。再加入微粉硅胶20g，硬酯酸镁2g，与干燥颗粒混合均勻，压制成1000片本发明的药物组合物的片剂，包薄膜衣。牛物学试验例1、荷叶总牛物碱提取物对脂肪前体细胞分化及脂肪蓄积的影响肥胖和/或肥胖症是引起糖尿病胰岛素抵抗、高胰岛素血症的重要因素，也是代谢综合征及心血管疾病的独立危险因素。具有抑制脂类物质吸收作用的中药可以辅助和替代糖尿病前期的饮食疗法。有些中药通过抑制脂肪酶活性、减少单酰甘油和游离脂肪酸的分解，从而减少脂类物质的吸收；有些中药是通过抑制脂肪细胞的形成减少肥胖和/或肥胖症程度。脂肪细胞由起源于中胚层的多能干细胞在多种因素的作用下逐步分化、发育而成，其过程大致经历了成体干细胞、间充质前体细胞、前脂肪细胞、成熟脂肪细胞几个阶段， 成熟脂肪细胞以前各阶段细胞统称为脂肪前体细胞。脂肪细胞数量的多少直接影响肥胖和 /或肥胖症的程度。发明人研究了荷叶总生物碱提取物对脂肪前体细胞分化的影响，方法结果如下3T3-L1脂肪前体细胞的培养及诱导分化3T3-L1细胞按3. 33 X IO4细胞/ml接种细胞于48孔板中，在37°C培养箱(5% C02、95%空气)中培养，细胞培养基为DMEM高糖完全培养液，每2d换一次液，待细胞完全融合后开始诱导；培养液换成含有0.5mmol/L IBMX, 1 μ mol/L地塞米松，10 μ g/ml胰岛素的高糖DMEM完全培养液进行诱导分化；培养48h后， 换含5 μ g/ml胰岛素的高糖DMEM完全培养液培养，48h后换高糖DMEM完全培养液维持培养，每2d换一次液。培养至第12天，细胞90%分化为成熟脂肪细胞。将制备例2的荷叶总生物碱提取物溶解于DMSO溶液中，制备成64mg/ml溶液，再用培养液稀释后加入细胞培养体系，终浓度为100、30、10、3、l、0.3yg/ml，DMSO含量低于 0. 5%，该浓度DMSO含量对细胞生长无影响。结果见表2。表2、荷叶总生物碱提取物对脂肪前体细胞抑制率
权利要求
1.一种荷叶总生物碱提取物，其中包含荷叶总生物碱和荷叶碱，所述荷叶总生物碱与荷叶碱的重量比为(3. 5 5) 1。
2.根据权利要求1的荷叶总生物碱提取物，其特征在于以下(1)至(3)任一项或多项(1)所述荷叶总生物碱占该提取物重量的70 98%(w/w)；(2)所述荷叶碱占该提取物重量的14 28%(w/w)；(3)所述荷叶总生物碱与荷叶碱的重量比为(3.5 5) 1，并且所述荷叶总生物碱占该提取物重量的70 98% (w/w)，所述荷叶碱占该提取物重量的14 28% (w/w)。
3.根据权利要求1至2任一项的荷叶总生物碱提取物，其是通过包括以下步骤的方法制备的使荷叶用含有0.05 0.5% (ν/ν)盐酸的乙醇提取，然后进行索氏提取，得到的提取液用盐酸水溶液萃取，水层用有机溶剂萃取，使有机层浓缩，干燥，即得。
4.一种荷叶总生物碱提取物，其中包含荷叶总生物碱和荷叶碱，其中所述荷叶总生物碱占该提取物重量的70 98% (w/w)。
5.根据权利要求4的荷叶总生物碱提取物，其特征在于以下(1)至(3)任一项或多项(1)所述荷叶碱占该提取物重量的14 28%(w/w)；(2)所述荷叶总生物碱占该提取物重量的70 98%(w/w)，所述荷叶碱占该提取物重量的 14 28% (w/w)；(3)所述荷叶总生物碱占该提取物重量的70 98%(w/w)，所述荷叶碱占该提取物重量的14 28% (w/w)，并且所述荷叶总生物碱与荷叶碱的重量比为(3. 5 5) 1。
6.根据权利要求4至5任一项的荷叶总生物碱提取物，其是通过包括以下步骤的方法制备的使荷叶用含有0.05 0.5% (ν/ν)盐酸的乙醇提取，然后进行索氏提取，得到的提取液用盐酸水溶液萃取，水层用有机溶剂萃取，使有机层浓缩，干燥，即得。
7.制备权利要求1至6任一项的荷叶总生物碱提取物的方法，该方法包括以下步骤 使荷叶用含有0. 05 0.5% (ν/ν)盐酸的乙醇提取，然后进行索氏提取，得到的提取液用盐酸水溶液萃取，水层用有机溶剂萃取，使有机层浓缩，干燥，即得。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤a)使荷叶用含有0.05 0. 5% (ν/ν)盐酸的50 80%乙醇提取，得到的提取液调节 ρΗ至8. 5 10. 5，浓缩，得到第一浓缩液；b)使步骤a)所得第一浓缩液与硅藻土混合，干燥，再用乙酸乙酯在索氏提取器中进行索氏提取，使提取液浓缩，得到第二浓缩液；c)使步骤b)所得第二浓缩液用ρΗ为1 2的盐酸水溶液萃取，水层调节ρΗ至11 12，再用乙酸乙酯进行萃取，使得到的有机层浓缩，干燥，即得。
8.一种组合物，该组合物包含治疗和/或预防有效量的荷叶总生物碱提取物以及任选的药学可接受的载体，其中所述荷叶总生物碱提取物包括荷叶总生物碱和荷叶碱，所述荷叶总生物碱与荷叶碱的重量比为(3. 5 5) 1 ；或者，该组合物包含治疗和/或预防有效量的荷叶总生物碱提取物以及任选的药学可接受的载体，其中所述荷叶总生物碱提取物如权利要求1至6任一项所述。
9.荷叶总生物碱提取物在制备用于治疗和/或预防与糖脂代谢异常有关的疾病或病症的产品中的用途。在一个实施方案中，所述产品中包含荷叶总生物碱和荷叶碱，所述荷叶总生物碱与荷叶碱的重量比为(3. 5 5) 1。
10.荷叶总生物碱提取物在制备用于治疗和/或预防与糖脂代谢异常有关的疾病或病症的产品中的用途，和/或用于降血脂、抑制胆固醇、抑菌、止痉挛、抗氧化的产品中的用途，其中所述荷叶总生物碱提取物如权利要求1至6任一项所述。在一个实施方案中， 所述产品中包含荷叶总生物碱和荷叶碱，所述荷叶总生物碱与荷叶碱的重量比为(3. 5 5) 1。
全文摘要
本发明涉及新颖的荷叶总生物碱提取物及其制备方法和用途。具体地，本发明公开了一种荷叶总生物碱提取物，其中荷叶总生物碱含量可达到70～98％(w/w)，荷叶碱含量可达14～28％(w/w)，所述荷叶总生物碱与荷叶碱的重量比为(3.5～5)∶1。本发明还公开了制备本发明荷叶总生物碱提取物的方法、包含荷叶总生物碱的组合物、以及荷叶总生物碱提取物在制备用于治疗和/或预防与糖脂代谢异常有关的疾病或病症的产品中的用途。本发明提取物的目的物质含量高、制备方法简单、制备方法适合工业化。
文档编号A61P21/02GK102258578SQ20101018149
公开日2011年11月30日 申请日期2010年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者刘二伟, 刘虹, 毛浩萍, 王涛, 王萌, 王虹, 臧忠良, 高秀梅 申请人:天津中医药大学