专利名称：春砂仁挥发油在制备治疗真菌感染的皮肤癣的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及姜科植物果实的挥发油，具体涉及春砂仁挥发油的药物用途。
背景技术：
春砂仁是姜科植物阳春砂Amomurn villosum Lour、绿壳砂AmomumvillosumLour. Var. xanthioides Τ. L. Wu et Senjen、或海南砂Amomum Iongiligulare T.LWu 的果实，其 主要成分为挥发油，如乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑、十六烷酸、莰烯、α -菔烯、β _菔烯和α _柯 巴烯等。现代药理学研究表明，春砂仁挥发油具有促进胃肠机能，促进消化液分泌，排除消 化管内的积气、利胆、抗溃疡及抗炎、镇痛等多种药理活性。但是，至今尚未见关于春砂仁挥 发油抗真菌的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提春砂仁挥发油新的药物用途。红色毛癣菌、须毛癣菌、石膏样小孢子癣菌是皮肤癣菌代表菌，多成丝状型菌落， 呈绒毛状、棉毛状、粉术状等，光镜下可见有隔、分支、无色的菌丝，为常见浅部治病性皮肤 癣菌，具有嗜皮肤角质蛋白特性，常常侵犯皮肤、毛发、指甲等角化组织引起癣症，常引起手 癣、足癣、头癣等慢性病。本发明人长期致力于抗真菌药物的研究，发现砂仁挥发油提取中 含有多种多烯类及烷酸化合物，对于真菌有显著的抑制作用，且靶位较多，不易产生耐药 性。基于上述研究结果，本发明涉及春砂仁挥发油在制备治疗真菌感染的皮肤癣的药 物中的应用，其中所述的皮肤癣为红色毛癣菌、须毛癣菌或石膏样小孢子癣菌感染的皮肤癣。本发明所述的春砂仁挥发油是医学医学上常用的春砂仁果实的挥发油，它包括果 仁和/或果壳的挥发油。本发明所述的春砂仁挥发油可以采用各种常规的方法提取得到， 其中值得推荐的方法如下所述方法一该方法为Bligh-Dyer法提取提取法，其具体步骤为取粉碎春砂仁，加入 5-10倍的提取溶剂浸泡三天，40°C条件下超声处理45min，抽滤，重复提取三次，合并滤液， 于冰箱中储存过夜，4000r/min离心5min，取下层滤液，然后在旋转蒸发仪中减压除去溶 剂，即得棕黄色春砂仁挥发油；其中所述的提取溶剂为甲醇氯仿水=1 1 0.5的混 合溶剂。方法二 该方法为水蒸汽蒸馏法，其具体步骤为取春砂仁，去壳，果仁与果壳分 开粉碎，过2号标准筛网，置圆底烧瓶中，加入10-15倍量蒸馏水，置提取器中加热煮沸4-8 小时，收集提取的挥发油，静置至油水分离，取油相无水乙醚反复洗涤，减压回收乙醚，然后 加人无水硫酸钠干燥除水，即得淡黄色春砂仁挥发油。本发明所述的应用，其中所述的药物可以是由春砂仁挥发油和医学可接受的辅料组成的口服制剂或外用制剂，其中，口服制剂可以是芳香水剂或合剂；外用制剂可以是醑剂 或软膏剂。由于春砂仁挥发油可干扰真菌麦角留醇生物合成，对于真菌红色毛癣菌、须毛癣 菌或石膏样小孢子癣菌有明显的抑制作用，因此很容易通过上述常规的制剂进入临床。此 外，砂仁挥发油提取中含有多种多烯类及烷酸化合物，且靶位较多，不易产生耐药性优势是 可以预见的。
图1为水蒸气蒸馏法果仁提取油抑制红色毛癣菌的效果对照图，图中，A为空白溶 剂对照的抑菌圈，B为砂仁挥发油的抑菌圈，C为空白纸片阴性对照的抑菌圈，D为酮康唑 阳性对照的抑菌圈。图2为水蒸气蒸馏法果仁提取油抑制石膏样小孢子癣菌的效果对照图，图中，A为 空白溶剂对照的抑菌圈，B为砂仁挥发油的抑菌圈，C为空白纸片阴性对照的抑菌圈，D为酮 康唑阳性对照。图3为水蒸气蒸馏法果仁提取油抑制须毛癣菌的效果对照图，图中，A为空白溶剂 对照的抑菌圈，B为砂仁挥发油的抑菌圈，C为空白纸片阴性对照的抑菌圈，D为酮康唑阳性 对照的抑菌圈。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，以便公众进一步理解本发明的 有益效果。例1(效果实验)1实验材料、试剂和仪器试验材料春砂仁(Amomurn villosum Lour)成熟干燥果实(购于广州市药材市 场中药饮片厂生产批号20090601)，按下述方法制备出各种实验用挥发油果仁水蒸油的制备取春砂仁果仁磨得的粉术50. 00g，置500ml圆底烧瓶中，加 10(15倍量)倍量蒸馏水，安装挥发油提取器，电热套加热煮沸6小时，分离出油层，用乙醚 反复洗涤挥发油提取器，使砂仁挥发油充分溶解到乙醚中，将溶有挥发油的乙醚转移至烧 杯中，加无水硫酸钠脱水脱水24h，回收乙醚即得纯净的砂仁挥发油1. 785g。果壳水蒸油的制备取春砂仁药材果壳磨得的粉末50. 00g，置500ml圆底烧瓶中， 加10 (15倍量)倍量蒸馏水，安装挥发油提取器，电热套加热煮沸6小时，分离出油层，用乙 醚反复洗涤挥发油提取器，使砂仁挥发油充分溶解到乙醚中，将溶有挥发油的乙醚转移至 烧杯中，加无水硫酸钠脱水脱水24h，回收乙醚即得纯净的砂仁挥发油0. 485g。B-D法果仁提取油的制备取春砂仁药材果仁磨得的粉末50. 00g,置1000ml锥形 瓶中，加五倍量的甲醇氯仿水=1 1 0.5的混合溶剂，浸泡三天，40°C、40KHZ下超 声处理45min，抽滤，重复提取三次，合并滤液，冰箱中储存过夜，4000r/min离心5min，取下 层，于旋转蒸发仪中减压除去溶剂，得挥发油3. 505g。B-D法果壳提取油的制备取春砂仁药材果壳磨得的粉末50. 00g,置1000ml锥形 瓶中，加五倍量的甲醇氯仿水=1 1 0.5的混合溶剂，浸泡三天，40°C、40KHZ下超声处理45min，，抽滤，重复提取三次，合并滤液，冰箱中储存过夜，4000r/min离心5min，取 下层，于旋转蒸发仪中减压除去溶剂，得挥发油2. 685g。供试菌种标准红毛色癣菌(Trichophyton rubrum CMCC(F)Tla)，标准 须毛癣菌(Trichonphyton mentagrophyton CMCC (F) T5a)，标准石膏样小孢子癣菌 (Microsporumgypseum CMCC (F)M2a)，购于中国医学科学院皮肤研究所。供试药物酮康唑，购于南京白敬宇制药有限公司(批号090213)。实验器材细菌研磨器，广州东征化玻仪器有限公司；电热恒温培养箱DNP-9162 型(宁波东南仪器有限公司)，超净工作台BHC-1300IIA/B3(苏净集团安泰公司)。2.抗菌实验21纸片扩散法测定挥发油抑菌活性用接种环刮取适量各菌种的菌苔，于研磨器中 加Iml生理盐水研勻成菌悬液，用生理盐水调整至0. 5麦氏浊度，取200ul置沙保氏固体 平板培养基中，用接种环采用划线法涂勻，风吹5-lOmin至干。每板贴四个纸片，分别加甲 醇，挥发油、200ug/ml酮康唑甲醇溶液、空白纸片作为溶剂阴性对照、试液、阳性对照、空白 对照。每组平行处理三板，放置10分钟后，置30°C恒温培养箱中培养72h，观察并记录抑菌 圈的大小。2. 2采用常量肉汤稀释法测定春砂仁挥发油对各种菌的MIC。取高压灭菌的试管 十三只，第一管中加2ml营养肉汤，第2-13只中各加lml，取100mg/ml春砂仁挥发油0. 5ml, 0. 5ml吐温80加入到第一只试管中，混勻，从第一支中吸取Iml弃去，再取Iml至第二只试 管中，混勻；从第二只试管中取Iml至第三只试管中，混勻，从第三只试管中取Iml至第四 只试管中，混勻；依次类推类推，倍比稀释到第11只试管，混勻，吸取Iml弃去；第12管中 加0. 2ml吐温-80、0. 2ml甲醇作为空白对照；第13管中加50ul酮康唑甲醇溶液作为阳性 对照。取各菌适量，置研磨器中研勻，用生理盐水调整到0. 5麦氏浊度，取150ul菌悬液至 15ml营养肉汤培养基中，混勻后向13只试管中各加1ml，混勻；置30°C恒温培养箱中培养 48h，观察并记录实验结果。2. 3试验结果本实验采用红色毛癣菌、须毛癣菌、石膏样小孢子癣菌，采用酮康唑甲醇溶液作为 阳性对照，抑菌圈的大小采用纸片扩散法测定，MIC采用常量肉汤稀释法测定，结果见表1、 2，其中，水蒸气蒸馏法果仁提取油抑制红色毛癣菌、须毛癣菌、石膏样小孢子癣菌的效果见 附图1-3。表1不同提取物对各菌抑菌圈的测定(单位3 ± s mm η = 3) 注“_”表示无抑菌活性，抑菌圈直径为纸片直径表2不同提取物对各菌MIC的测定结果(单位mg/ml) 3对真菌体内麦角留醇生物合成影响的实验3. 1样品制备取各真菌接种于沙保氏固体培养基上28°C培养1周后再接种于营养肉汤培养液 中，28°C，200r/min振荡培养24h，活化两次，使其处于指数生长期后期，用营养培养液调整 真菌浓度至5 X IO8个细胞/mL。取菌液ImL于250mL锥形瓶，加营养肉汤培养液99mL和药 物溶液100 μ L，反应液中药物浓度分别是各药液对真菌的MIC5tlt5 350C，200r/min振荡培养 24h后用血细胞计数板计数。菌液于4000r/min离心5min，PBS洗涤两次至上清液无色，去 上清，称各菌湿重。准确称取湿菌2. 5g，转入专用离心管中，pH 7.4磷酸盐缓冲液混悬，置 于细胞粉碎机上，冰盐浴降温破菌15min。破菌方法为每次破菌5s，间隔5s，重复90次。 破碎后的菌液在高速冷冻离心机上离心，先以1500r/min离心5min，再以10000r/min离心 lOmin，取上清液作为各菌株的离细胞酶液。各取不同离细胞酶液5mL分别加入试管中，再 加入新鲜的皂化剂(10% KOH+甲醇溶液)20mL，在80°C皂化2h，每隔15min振摇一次。皂化 物用石油醚30mL萃取3次，饱和NaCl溶液20mL洗涤两次。合并石油醚萃取液，用无水硫酸 钠脱水干燥，用旋转蒸发仪减压浓缩近干，即得非皂化物(nonsaponifiableLipidsjSLs)。 非皂化物，加乙酸乙酯使溶液体积为lmL/g湿菌。3. 2气相色谱条件使用HP6890气相色谱仪，色谱柱为J&W DB-5MS毛细石英管柱 (30mX250umX0. 25um)。柱温初始温度 150°C，以 15°C /min 升至 250°C (保持 15min)，再 以5°C /min升至290°C。进样口为分流模式，；气化温度为270°C ；载气He为恒流模式，流 速1.0ml/min，平均线速37cm/sec，分流比10 1，自动进样1. Oul;3. 3采用面积归一化法测定各菌中麦角留醇的含量麦角留醇标准曲线的制备精密量取麦角留醇对照品适量，用氯仿溶解定容，配成 浓度为5. 191mg/ml的对照品储备液。取标准品麦角甾醇储备溶液0. 25,0. 5，1，1. 5,2. 0， 2.5,3. Oml于5ml容量瓶中，加入氯仿定容后，分别进样lul，以峰面积为横坐标，对照品 量为纵坐标，进行线性回归，得标准曲线为Y = 148. 3X-105. 81 r = 0. 9992，线性范围为 0.2596 3. 1146mg/ml。3. 4样品中麦角留醇含量测定取制备的样品，注入气相色谱仪中，根据标准曲 线，计算出相应的菌内麦角甾醇的含量。试验结果见表3，试验结果用SPSS 13. 0统计分析结果。表3药物作用前后菌内麦角甾醇含量(ug/g) I±sn = 3
各菌实验组之间ρ* > 0. 05，实验组与正常对照组之间ρ" < 0. 05.数据表明，酮康唑MIC50组与试药组差别不大，试验效果显示本提取物可以应用 于临床用于治疗或者辅助治疗上述三种真菌性感染的皮肤病。例2(软膏剂)处方按例1所述的水蒸气蒸馏法提取所得果仁水蒸油(即果仁挥发油)10g，甘 油50g，脱水山梨醇硬脂酸酯(司盘_60)10g，凡士林250g。制法取提取物与甘油置水浴上加热至溶解，加入脱水山梨醇硬脂酸酯(司 盘-60)搅勻，最后加入凡士林，搅勻，即得。性状本品为黄褐色软膏。用法与用量取适量涂于患处或用纱布敷于患处，一日3-5次。例3(醑剂)处方按例1所述的水蒸气蒸馏法提取所得果壳水蒸油(即果壳挥发油)10g，乙 醇 490ml。制法取提取物，溶于适量乙醇中，如不透明可用干燥滤器或滤材过滤，再添加乙 醇适量至处方配比量，搅勻，即得。性状本品为无色或淡棕色澄明液体，有砂仁芳香味，并有清凉感。用法与用量外用，局部涂搽，一日3次。例4(芳香水剂)处方按例1所述的B-D法提取所得果仁提取油(即果仁挥发油)1ml，聚山梨酯 80 (吐温-80) 3ml，蒸馏水适量。制法取提取物与吐温-80混勻后，加蒸馏水适量使其成500ml，搅勻，即得。性状本品为无色澄明或几乎澄明的液体，有砂仁芳香。用法与用量口服，一次10_15ml，一日3次。例5 (合剂)处方例1所述的B-D法提取所得果壳提取油(即果壳挥发油)5ml，羟苯乙酯溶 液(5%) 5ml，蒸馏水适量。制法取提取物，与羟苯乙酯溶液(5% )混合，缓慢以细流加入约800ml蒸馏水中，边加边搅拌，在加蒸馏水使其成IOOOml，搅匀，即得。性状本品为无色或淡黄色液体。用法与用量口服，一次5-10ml，一日3次。
权利要求
春砂仁挥发油在制备治疗真菌感染的皮肤癣的药物中的应用，其中所述的皮肤癣为红色毛癣菌、须毛癣菌或石膏样小孢子癣菌感染的皮肤癣。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物由春砂仁挥发油和医学可接 受的辅料组成。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物是芳香水剂或合剂。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物是软膏剂或醑剂。
全文摘要
本发明涉及春砂仁挥发油的药物用途，具体涉及春砂仁挥发油在制备治疗真菌感染的皮肤癣的药物中的应用，其中所述的皮肤癣为红色毛癣菌、须毛癣菌或石膏样小孢子癣菌感染的皮肤癣。本发明所述的春砂仁挥发油是医学上常用的春砂仁果实的挥发油，它包括果仁和/或果壳的挥发油。所述的挥发油配以医学可接受的辅料可制成常见的药物制剂，如芳香水剂，合剂，软膏剂，醑剂等。
文档编号A61K9/06GK101879292SQ201010183710
公开日2010年11月10日 申请日期2010年5月20日 优先权日2010年5月20日
发明者张帆, 张生潭, 李苗霞, 林敬明, 汪铁山, 王兆玉, 郑妮 申请人:南方医科大学