专利名称：苏木提取物制备灌注液制备工艺及其在治疗膀胱癌上的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种苏木提取物的制备方法，具体为一种苏木提取物灌注液制备工艺 及其在治疗膀胱癌上的用途。
背景技术：
苏木(Caesalpinia sappan Linn.)，又名苏枋、芳方木、苏方。苏木心材可入药， 多于秋季采伐，除去白色边材，干燥，即得，干燥心材呈长圆柱形或对剖半圆柱形，长10-100 厘米，直径3-13厘米。表面黄红色至棕红色，具刀削痕，常见纵向裂缝。质坚硬。断面略具 光泽，年轮明显，有的可见暗棕色、质松、带亮星的髓部，气微，味微涩。性味甘、咸、平。归心、 肝、脾经。具有行血祛瘀，消肿止痛的作用。用于经闭痛经、产后瘀阻、胸腹刺痛、外伤肿痛等。现代医学研究发现苏木提取物具有动物体内抗肿瘤活性。关于苏木提取物尤其是 直接从自然界提取得到的巴西苏木素，在治疗肿瘤方面的研究报道也有多篇论文及专利发 表。例如专利号为200610025401. 8公开了一种巴西苏木素类化合物在制备抗肿瘤药物中 的应用，该专利公开了巴西苏木素类化合物的分子结构，以及含有有效成分的植物提取物 在治疗白血病，肾癌、肝癌、肺癌、直肠癌、胃癌、食道癌、及乳腺癌用途。在其说明书公开的 内容中，实施例仅仅给出了从苏木中提取出来的巴西苏木素在体外实验中对各种癌细胞的 抑制效果，而具体对某一体内癌细胞的杀灭效果确没有进行深入研究。膀胱癌是全身比较常见的肿瘤之一，约占所有恶性肿瘤的10%左右，是我国泌 尿系统最常见的恶性肿瘤。本病男性多发，男女发病率的比例约为4 1，发病年龄多在 40岁以上，且随年龄增大而发病率增加。但近年来30岁以下发病者有所增加，20岁左右 的患者也时有所见，总的发病率有上升趋势。初次就诊的患者中70% -80%为表浅性膀胱 癌(Superficial Transitional CellCarcinoma, STCC)。表浅性膀胱癌是指包括原位癌 (Tis) ,Ta及Tl期的所有膀胱肿瘤，不论肿瘤分化程度的高低，都未侵及膀胱肌层。经尿道 切除术或者膀胱部分切除术虽然可以切除原发肿瘤，但由于STCC的多中心性和多发性特 点，复发率高达30%-85%，且绝大多数术后一年内复发。复发的患者中有30%-40%会进 展为浸润性膀胱癌。为了预防肿瘤的术后复发，目前普遍采用的方式是在手术切除原发病灶后，给予 持续的膀胱抗肿瘤药物灌注治疗。膀胱灌注治疗的主要目的如下1、抗癌药物可以在膀胱 内较长时间高浓度直接作用于肿瘤。2、可以杀灭膀胱内术后残余的肿瘤细胞，防止肿瘤细 胞种植，降低复发的可能。3、可以减少全身用药的毒副作用。4、可以保留膀胱，不仅生活方 便，且可保留性功能。5、阻止肿瘤恶性程度的进展。常用的术后膀胱灌注治疗的药物分为两大类化疗药物和免疫调节剂类药物。化 疗药主要包括丝裂霉素(MMC)、表阿霉素和吡柔比星等，是目前国内的一线用药，国外多中 心前瞻性对照研究证明都能够不同程度降低近期(≤2年)复发率，但对远期复发率(≥5年)及生存率的改善不明显。分析影响效果的重要原因之一就是肿瘤细胞的耐药性，包括原发性耐药和获得性 耐药，降低甚至消除了药物效果。现国外应用较多的药物为卡介苗(BCG)，是目前治疗和预 防表浅性膀胱癌最有效的药物之一。其优势在于能够降低近期复发率，同时阻止肿瘤进 展，从而提高了远期疗效。但由于BCG毒副作用大，不能在肿瘤切除后立即使用，从而影响 了预防肿瘤细胞种植的作用。尽管有苏木提取物在治疗肿瘤方面的报道，但是目前还没有发现关于苏木提取物 在治疗膀胱癌方面的研究报道。
发明内容
本发明为了解决苏木提取物在治疗膀胱癌肿瘤方面的应用而提供了一种苏木提 取物制备灌注液制备工艺及其在治疗膀胱癌方面的用途。本发明是由以下技术方案实现的，一种苏木提取物灌注液制备工艺，步骤包括，取 苏木粉碎，第一次加入3-6倍重量纯化水，煮沸提取45-65分钟过滤得滤液，然后第二次加 入2-4倍重量纯化水，煮沸提取30-50分钟过滤得滤液、然后第三次加入1. 5-2. 5倍重量纯 化水，煮沸提取25-35分；合并三次得到的提取液，减压浓缩到苏木生药量的2倍重；静置 过夜，除去沉淀；再加入石油醚，萃取，保留水相；再加入乙酸乙酯，萃取，去掉水相；减压挥 发尽乙酸乙酯；干燥物称重，加纯化水，使干物质含量为2 %，加热溶解，室温静置过夜，过 滤除去沉淀物；冻干，分装，即可。使用时将冻干粉用蒸馏水稀释即成为灌注液。该灌注液具有毒副作用小、安全性 高，对肿瘤细胞杀伤作用显著等特点。能够用作为制备治疗膀胱癌药物。实验研究结果表明，该提取物对膀胱肿瘤细胞有显著的杀伤作用。与临床常用的 丝裂霉素、表阿霉素、吡柔比星等多种抗癌药比较，具有抗癌活性高，毒性小，安全有效等诸 多优点。经初步的临床观察，该药无明显的不良反应，近期内临床疗效显著。特别是对临床 常见的顽固性、复发性膀胱肿瘤有较好的治疗效果，优于目前常用的抗肿瘤药物。是一种具 有良好开发前景的新的抗肿瘤药物。提取物的抗肿瘤作用1细胞杀伤实验材料细胞来源H22细胞株引自河北医科大学实验动物中心，S180细胞株引自中 国药品生物制品鉴定所，两种细胞由我室自行保存，腹腔接种，使用腹水细胞；人卵巢癌细 胞株SK0V3由中国医学科学院肿瘤研究所免疫室惠赠；膀胱癌细胞株T24购自中科院上海 生命科学研究院；淋巴瘤由本实验室小鼠自发性产生。实验药物注射用丝裂霉素注射用 顺钼(冻干型)羟喜树碱注射液苏木提取物(以下简称Br-I)，自备，以注射用水配制成 所需浓度。结果见下表表1各种药物对T24细胞的杀伤作用 表2各种药物对SK0V3细胞的杀伤作用 表3各种药物对H22细胞的杀伤作用 表4各种药物对S180细胞的杀伤作用 表5各种药物对淋巴瘤细胞的杀伤作用 2细胞凋亡实验材料膀胱癌细胞株T24购自中科院上海生命科学研究院，1640培养基购自美国 Gibco公司胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。Br-I由本实验室从中药材苏 木中提取配制。凋亡试剂盒购自美国BD公司。流式细胞检测仪，美国B-D公司生产，型号 FACSCalibur0方法细胞培养于含10%胎牛血清的PRMI1640培养基中，于5% CO2 37°C培 养箱中传代培养，选取对数生长的细胞，加药液后浓度分别达到0，30μ g/ml，60y g/ml，阳 性对照药为丝裂霉素，含量为60yg/ml。于药物作用6h后消化收集细胞，PBS洗两次，尼 龙筛过滤，加入凋亡试剂Annexin V-FITC, Propidium Iodide，避光15min后上机检测细胞 凋亡情况。结果，对照组细胞早期凋亡率为0. 15%，晚期凋亡率为0. 21%，总凋亡率为0. 36， 属细胞的正常凋亡，死亡细胞率为13. 34% ；30μ g/ml剂量组细胞的早期、晚期凋亡率分别 为0. 36%和0. 99%，总凋亡率为1. 35，比对照组有明显的增加，同时细胞的死亡率也增加 到55%，对靶细胞表现出明显的抑制作用；60 μ g/ml剂量组细胞的晚期凋亡率达到36. 46， 表现出明显的促进凋亡作用，细胞的死亡率也上升为63. 05%，表明药物对靶细胞具有显著 的诱导凋亡及杀伤作用。阳性对照组细胞的总凋亡率为1.27%，表现出一定的促进作用。 (见图 1、2、3、4)3免疫组化材料细胞株SK-0V_3细胞为人卵巢癌来源，由中国医学科学院肿瘤研究所免 疫室惠赠。主要试剂1640培养基购自美国Gibco公司胎牛血清购自杭州四季青生物工程 材料有限公司。Br-I由本实验室从中药材苏木中提取配制。方法细胞接种于六孔板内的盖 玻片上，待其生长良好时，加入药液，浓度分别为0，10 μ g/ml，20 μ g/ml，40 μ g/ml，80 μ g/ ml,阳性对照药为顺钼，浓度为60 μ g/ml。药物作用24h后，PBS缓慢清洗，4%多聚甲醛固 定，蒸馏水冲洗后分别加入caspase3，caspase9，survivin相应稀释一抗，4°C过夜。次日取 出室温放置lOmin，PBS洗5min、3次；滴加二抗，37°C 30min ；PBS洗5min、3次；DAB显色， 哈瑞氏苏木素复染细胞核，盐酸乙醇分化，镜下控制，自来水返蓝IOmin ；脱水、透明70%、 80%、90%、100%酒精(1)、(2)各5min，二甲苯(1)、(2)各lOmin，中性树胶封片，高倍镜 下观察。4. 2结果如图5所示意，图5A1-A6分析说明1.对照组细胞凋亡蛋白表达阴性，仅有极个别的细胞质有浅表着色；2. 25 μ g/ml组与对照组无明显差异；
3. 50 μ g/ml组有约45%细胞弱阳性表达，细胞浆着色；4. 100 μ g/ml组有90%以上的细胞阳性表达，细胞质深染；5. 200 μ g/ml组约90%的细胞强阳性表达，细胞质及细胞核均深染；6.顺钼组，与对照组比较无明显差异，表明对细胞的凋亡无明显影响。图5B1-B6 的说明1.药物浓度在50 μ g/ml以下时，与对照组比较无明显差异，表明在此浓度下不能 引起细胞凋亡蛋白Cas印ase3的变化；2.药物浓度达到100 μ g/ml以上时，细胞质染色明显增加，提示在此浓度下药物 可以诱导细胞产生大量的凋亡蛋白，从而引起细胞发生凋亡；3.顺钼组细胞与对照组比较无明显差异，表明药物对细胞凋亡未产生明显的影响图 5C1-C6 说明1.对照组细胞核及细胞质均有明显的着色，说明凋亡抑制蛋白Survivin在正常 的细胞中表达较强，对细胞的凋亡产生抑制作用。2.给药各剂量组细胞内凋亡抑制蛋白Survivin的表达均受到抑制，表明药物对 细胞的凋亡有促进作用。但各剂量组间没有明显的差异。本发明所述灌注液对初发的表浅性膀胱肿瘤的治疗作用拟系统观察表浅性膀胱肿瘤患者60例，观察期限为24个月。方法术后连续灌注 8次；从第3周开始，每周灌注1次，连续灌注8次；接下来每月灌注1次，连续灌注10次。 详细记录观察期内患者的用药情况、不良反应及临床疗效，分别于术后3月、6月、9月、12 月、18月、24月时行膀胱镜检查，并作详细记录，与现行临床常用化学及生物治疗药物进行 疗效比较。6. 2对复发性膀胱肿瘤的治疗作用拟对使用常规化疗药物及生物治疗药物不能控制的术后复发患者，采用PGF灌注 治疗。重点观察PGF对复发性膀胱肿瘤的治疗作用。治疗方法同上，观察数量为60例。PGF预防浅表性膀胱癌临床观察统计表
图1对照组凋亡率为0. 36%图220 μ g/ml剂量组，凋亡率为1. 35 %图380 μ g/ml剂量组，凋亡率为36. 76%
图4阳性对照组，凋亡率为1. 27%图 5A(1_6)为 Br-I 对 Caspase9 的影响图 5B (1-6)为 Br-I 为对 Caspase3 的影响图 5C(1_6)为 Br-I 对 Survivin 的影响图6为薄层层析图1列-苏木色精标准品、2列-PGF样品、3列-乙酸乙酯萃取物、4列-正丁醇萃取 物、5列-乙酸乙酯萃取物经柱层析后的馏分4、6列-乙酸乙酯萃取物经柱层析后的馏分 5、7列-乙酸乙酯萃取物经柱层析后的馏分6图7PGF水提物的液相色谱8a乙酸乙酯萃取物液相色谱8b正丁醇萃取物液相色谱9柱色谱法分离乙酸乙酯萃取物图IOb乙酸乙酯萃取物经柱层析后的馏分5的液相色谱IOc乙酸乙酯萃取物经柱层析后的馏分6的液相色谱IOd乙酸乙酯萃取物经柱层析后的馏分7的液相色谱11柱色谱法分离正丁醇萃取物图12a正丁醇萃取物经柱层析后的馏分3的液相色谱12b正丁醇萃取物经柱层析后的馏分4的液相色谱12c正丁醇萃取物经柱层析后的馏分6的液相色谱13馏分4的核磁共振氢谱图14馏分4的核磁共振碳谱图15馏分4的碳氢相关谱图15馏分4的碳氢相关谱图16馏分4的紫外-可见吸收光谱图17馏分4的红外光谱图18巴西木素的红外标准谱图19乙酸乙酯萃取物经柱层析后馏分4的结构式
具体实施例方式实施例1、一种膀胱灌注液制备工艺，步骤包括，取苏木粉碎，第一次加入5倍重量 纯化水，煮沸提取60分钟过滤得滤液，然后第二次加入3倍重量纯化水，煮沸提取40分钟 过滤得滤液、然后第三次加入2倍重量纯化水，煮沸提取30分合并三次得到的提取液，减 压浓缩到生药量的2倍重；静置过夜，除去沉淀；再加入一倍体积量的石油醚，萃取，保留水 相；再加入三倍体积量的乙酸乙酯，萃取，去掉水相；减压挥发尽乙酸乙酯；干燥物称重，加 纯化水，使干物质含量为2 %，加热溶解。室温静置过夜，过滤除去沉淀物；冻干，分装，即 可。以下是对提取液中有效成分的鉴定结果以下内容中PGF代表所述的提取液。从图6可以看出PGF样品中苏木色精标含量甚微；PGF样品中至少含有四个组
8分；而乙酸乙酯和正丁醇萃取物的组分比PGF样品组分相对较少，说明用萃取法起到了一 定的分离提纯作用；正丁醇萃取物中不含有组分2，说明乙酸乙酯对组分2起到了富集作用。高效液相色谱法分离PGF，高效液相色谱分析结果对PGF样品、乙酸乙酯萃取物 和正丁醇萃取物进行液相色谱分析，结果如图7、图8所示。从图7可以看出，PGF水提物中 至少有9个组分，其中含量较大的有四个，其出峰时间分别在9. 8min、12. lmin、15. 8min和 19.Omin0从图8可以看出，乙酸乙酯萃取物主要为9min和12min组分，正丁醇萃取物中 9min组分基本消失，主要为12min、15min和19min组分，也可以说明用乙酸乙酯萃取后可 以将9min组分富集，这与薄层分离的结果完全一致。3.柱色谱法分离PGF中的化学成分，柱色谱法分离乙酸乙酯部分对乙酸乙酯部 分进行柱色谱分离，结果如图9所示。并用高效液相色谱法检测各馏分的纯度，结果如图10 所示，从图10可以看出，馏分4的纯度较高，可以达到90%以上；馏分6和馏分7的主成 分一致，其中馏分7的纯度较高，可达到90%以上；馏分5纯度较差，主要为14min和17min
组分，还需要进一步分离纯化。柱色谱法分离正丁醇部分，结果如图11所示。并用高效液相色谱法检测各馏分的 纯度，结果如图12所示。从图12可以看出，正丁醇对萃取物经柱层析后各馏分的纯度较差，需要进一步对 分离条件进行选择。4化合物的结构鉴定，用各种方法对乙酸乙酯经柱层析后的馏分4进行结构鉴定， 结果如图13-17所示。馏分4蒸去溶剂后得红色结晶性粉末。1H NMR(300MHz，溶剂D20)显示两个亚甲基质子 δ 2. 78(lH，d，J = 16. 2Hz，H_7)， 2. 98 (1H, d，J= 16.2Hz，H_7，)；两个连氧亚甲基质子 δ 3. 61 (1Η, d, J = 11. 7Hz, H_6)， 3.91(lH，d，J= 11.7Hz，H-6，)；一个次甲基质子 δ 3. 7 (1H，S，H_llb)；以及五个芳香质子 δ 6. 32(1H，S，H_4)；属于 AB 偶合的 δ 6. 54(lH，d，J = 8. 4Hz，H_2)，7. 27(lH，d，J = 8. 4Hz, H-l)；位于苯环对位的 δ6. 69(1H，S，H_8)，6. 73(1H，S，H-11)。13C NMR (300MHz，溶剂D20)显示 16 个 13C 信号，δ ppm :41· 63 (C_7)，49. 93 (C-12)， 70. 23 (C-6)，77· 94 (C_6a)，104. 22 (C_4) ,110. 60 (C_2) ,112. 92(C_11) ,113. 96 (C_8)， 115. 59 (C-Ia)，132. 39(C_7a)，132. 74 (C-I)，137. 38 (C-Ila)，143. 82(c_10)，144. 08 (C-9)， 154. 46(C-3)，156. 24(C-4a)。由以上信息与文献[3] 一致，且红外吸收光谱与标准谱图(图 18) —致，鉴定化合物3为巴西木素，结构如图19所示。实施例2，一种膀胱灌注液制备工艺，步骤包括，取苏木粉碎，第一次加入3倍量纯 化水，煮沸提取65分钟过滤得滤液，然后第二次加入2倍量纯化水，煮沸提取50分钟过滤 得滤液、然后第三次加入1. 5倍量纯化水，煮沸提取35分；合并三次得到的提取液，减压浓 缩到苏木生药量的2重倍；静置过夜，除去沉淀；再加入两倍量的石油醚，萃取，保留水相； 再加入四倍乙酸乙酯，萃取，去掉水相；减压挥发尽乙酸乙酯；干燥物称重，加纯化水，使干 物质含量为2%，加热溶解，室温静置过夜，过滤除去沉淀物；冻干，分装，即可。结构及成分
9鉴定结果同实施例1。 实施例3、一种膀胱灌注液制备工艺，步骤包括，取苏木粉碎，第一次加入6倍量纯 化水，煮沸提取45分钟过滤得滤液，然后第二次加入4倍量纯化水，煮沸提取30分钟过滤 得滤液、然后第三次加入2. 5倍量纯化水，煮沸提取25分；合并三次得到的提取液，减压浓 缩到苏木生药量的2重倍；静置过夜，除去沉淀；再加入1. 5倍量石油醚，萃取，保留水相； 再加入2倍量的乙酸乙酯，萃取，去掉水相；减压挥发尽乙酸乙酯；干燥物称重，加纯化水， 使干物质含量为2%，加热溶解，室温静置过夜，过滤除去沉淀物；冻干，分装，即可。结构及 成分鉴定结果同实施例1。
权利要求
一种苏木提取物灌注液，作为制备治疗膀胱癌药物的应用。
2.一种苏木提取物灌注液制备工艺，其特征在于步骤包括，取苏木粉碎，第一次加入 3-6倍重量纯化水，煮沸提取45-65分钟过滤得滤液，然后第二次加入2-4倍重量纯化水， 煮沸提取30-50分钟过滤得滤液、然后第三次加入1. 5-2. 5倍重量纯化水，煮沸提取25-35 分；合并三次得到的提取液，减压浓缩到苏木生药量的2倍重；静置过夜，除去沉淀；再加入 石油醚，萃取，保留水相；再加入乙酸乙酯，萃取，去掉水相；减压挥发尽乙酸乙酯；干燥物 称重，加纯化水，使干物质含量为2%，加热溶解，室温静置过夜，过滤除去沉淀物；冻干，分 装，即可。
3.如权利要求1所述的苏木提取物灌注液制备工艺，其特征在于步骤包括，取苏木粉 碎，第一次加入5倍重量纯化水，煮沸提取60分钟过滤得滤液，然后第二次加入3倍重量纯 化水，煮沸提取40分钟过滤得滤液、然后第三次加入2倍重量纯化水，煮沸提取30分合并 三次得到的提取液，减压浓缩到生药量的2倍重；静置过夜，除去沉淀；再加入一倍体积量 的石油醚，萃取，保留水相；再加入三倍体积量的乙酸乙酯，萃取，去掉水相；减压挥发尽乙 酸乙酯；干燥物称重，加纯化水，使干物质含量为2%，加热溶解。室温静置过夜，过滤除去 沉淀物；冻干，分装，即可。
全文摘要
本发明涉及一种苏木提取物的制备方法，具体为一种苏木提取物灌注液制备工艺及其在治疗膀胱癌上的用途。解决苏木提取物在治疗膀胱癌肿瘤方面的应用。步骤包括，取苏木粉碎，三次水提，合并三次得到的提取液，减压浓缩；静置过夜，除去沉淀；再加入石油醚，萃取，保留水相；再加入乙酸乙酯，萃取，去掉水相；减压挥发尽乙酸乙酯；干燥物称重，加纯化水，使干物质含量为2％，加热溶解，室温静置过夜，过滤除去沉淀物；冻干，分装，即可。实验研究结果表明，该提取物对膀胱肿瘤细胞有显著的杀伤作用。与临床常用的丝裂霉素、表阿霉素、吡柔比星等多种抗癌药比较，具有抗癌活性高，毒性小，安全有效等诸多优点。
文档编号A61K36/48GK101904892SQ201010183648
公开日2010年12月8日 申请日期2010年5月22日 优先权日2010年5月22日
发明者任连生, 张蕻, 王国平, 王晋芬 申请人:山西省肿瘤医院