专利名称：山楂叶及其提取物的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及山楂叶及其提取物的新用途。
背景技术：
白内障是由于晶状体混浊，失去双透镜作用，使光线不能透过晶状体到达视网膜， 导致患者失明的一种常见眼科疾病，也是世界首位致盲因素，大多是因为老化和代谢障碍 如糖尿病等引发。白内障的发病机制复杂，目前认为在高血糖情况下多元醇通路被激活，导 致多元醇积聚，引起晶体纤维水肿，蛋白质合成减少、蛋白质分解、裂解及细胞结构的破坏， 最后晶体皮质和核浑浊，白内障形成。醛糖还原酶(AR)是多元醇代谢通路的关键限速酶， 在高血糖生理状态或组织过度利用糖时被激活，促使体内过量葡萄糖转化为山梨醇。山梨 醇在细胞内大量蓄积可改变细胞膜的通透性，造成细胞渗透性水肿，进而出现糖尿病并发 症，尤其在AR含量较高的敏感部位，肾小球基底膜、视网膜及外周神经等。大量动物实验及 临床研究表明醛糖还原酶抑制剂(ARI)能有效改善多元醇代谢通路异常，治疗和预防白内 障。现代白内障囊外摘除或超声乳化术联合后房人工晶状体植入术是当前治疗白内 障的主要手段。术后晶状体后囊浑浊即后发性白内障的发生会使术后提高的视力再度下 降，影响手术效果且费用昂贵。因此，探讨用药物防治白内障，寻找疗效确切、廉价的防治白 内障新药就成为药学工作者研究的重点。山丰查口十力―禾4 才直_山||衾工 Crataegus pinnatifida Bge. var. majorN. E. Br. ^ 山楂C.pirmatifida Bge.的叶子。性酸、甘、平，主入肝经。《中国药典》2005年版载其具 有“活血化瘀，理气通脉”的作用。因此进一步研究山楂叶的药理作用，将其用于白内障的 预防和治疗，是现阶段一个新的研究方向，具有重要的临床意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供山楂叶的新用途。本发明所要解决的另一技术问题在于提供山楂叶提取物的新用途。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是本发明提供了山楂叶在抑制醛糖还原酶活性中的用途。本发明提供了山楂叶在增强晶状体的抗氧化能力，减少晶状体的氧化损伤中的用途。本发明提供了山楂叶在制备醛糖还原酶抑制药物中的用途。本发明提供了山楂叶在制备预防和治疗白内障的药物中的用途。本发明提供了山楂叶提取物在抑制醛糖还原酶活性中的用途。本发明提供了山楂叶提取物在增强晶状体的抗氧化能力，减少晶状体的氧化损伤 中的用途。本发明提供了山楂叶提取物在制备醛糖还原酶抑制药物中的用途。
本发明提供了山楂叶提取物在制备预防和治疗白内障的药物中的用途。优选的，上述用途中所述山楂叶提取物为山楂叶乙醇提取物。优选的，上述用途中所述山楂叶乙醇提取物为山楂叶50% -95%乙醇提取物。本发明还提供了实现上述用途的药物组合物，包含治疗有效量的山楂叶和/或山 楂叶提取物以及任选的药学可接受的赋形剂。上述药学可接受的赋形剂可以是药物制剂领域中任何常规的赋形剂，特定赋形剂 的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态，用于特定给药模式的合 适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学可 接受的赋形剂包括药学领域常规的稀释剂、载体、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂等。上述组合物可以制成滴剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、注射乳剂、注射用无 菌粉针等多种形式，上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。本发明的有益效果是山楂叶及其提取物通过抑制醛糖还原酶，增强机体抗氧化能力，从而有望用于制 备治疗白内障的药物，进而达到对于白内障的治疗目的。
图1A为山楂叶HPLC图谱；图1B为山楂叶提取物HPLC图谱。
具体实施例方式为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式
对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。实施例1山楂叶提取物的制备称取干燥山楂叶1kg，加入70%乙醇10L，沸腾回流提取2小时，过滤，残渣中加入 70%乙醇10L，沸腾回流提取2小时，过滤，两次滤液合并，40°C水浴加热减压浓缩至干，得 到山楂叶70%乙醇提取物214g。实施例2山楂叶提取物的制备称取干燥山楂叶1kg，加入50%乙醇10L，沸腾回流提取2小时，过滤，残渣中加入 50%乙醇10L，沸腾回流提取2小时，过滤，两次滤液合并，40°C水浴加热减压浓缩至干，得 到山楂叶50%乙醇提取物235g。实施例3山楂叶提取物的制备称取干燥山楂叶1kg，加入90%乙醇10L，沸腾回流提取2小时，过滤，残渣中加入 90%乙醇10L，沸腾回流提取2小时，过滤，两次滤液合并，40°C水浴加热减压浓缩至干，得 到山楂叶90%乙醇提取物201g。实施例4山楂叶提取物的制备
山楂叶药材1kg用10倍量70 %乙醇提取2次，每次2h，提取液减压浓缩挥去乙 醇，滤过。滤液用D101大孔树脂吸附，树脂床体积与生药量之比为1 l(w/v)；上样后，先 以2倍树脂床体积的水洗涤，弃去水洗液，用4倍树脂床体积的70%乙醇洗脱，洗脱液减压 浓缩，真空干燥，即得山楂叶提取物88g。实施例5山楂叶和山楂叶提取物中金丝桃苷的测定1仪器和试药Agilent 1100液相色谱系统(VWD检测器)；甲醇，乙腈，四氢呋喃为色谱纯；金丝 桃苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号111521-200303)；山楂叶药材采自天津蓟县 青山岭，并经天津中医药大学中医药研究院郭俊华副研究员鉴定为蔷薇科植物山楂的叶。 D101大孔树脂(天津市海光化工有限公司，净品型)。2方法与结果2. 1山楂叶提取物的制备山楂叶药材用10倍量70%乙醇提取2次，每次2h，提取液减压浓缩挥去乙醇，滤 过。滤液用D101大孔树脂吸附，树脂床体积与生药量之比为1 l(w/v)；上样后，先以2倍 树脂床体积的水洗涤，弃去水洗液，用4倍树脂床体积的70%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩， 真空干燥，即得山楂叶提取物。2. 2供试品溶液的制备2. 2. 1山楂叶中金丝桃苷含量测定供试品溶液取山楂叶药材粉末l.Og，精密称定，加70%乙醇100ml回流提取2小时，补足失 重，0. 45um微孔滤膜过滤，即得。2. 2. 2山楂叶提取物中金丝桃苷含量测定供试品溶液取山楂叶提取物20mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇约20ml，超声处理(功率 250W,频率40kHz) 5分钟，用甲醇稀释至刻度，摇勻，0. 45 u m微孔滤膜过滤，即得。2. 3HPLC 条件大连依利特色谱柱(Hypersil 0DS，4. 6謹X 250謹，5 ii m)，流动相为乙腈甲醇 四氢呋喃0. 5%醋酸=1 1 19. 4 78. 6(v/v)，流速 dmL.mirT1;检测波长 363nm。2. 4方法学考察金丝桃苷的标准曲线的制备精密称定金丝桃苷对照品适量，用甲醇配成系列浓 度的对照品溶液，按2. 3色谱条件测定，金丝桃苷的回归方程为Y(A) = 17997X(c)+35. 17，相 关系数r = 0. 9995，线性范围为8-320 u g. mL—1。金丝桃苷最低检测限(L0D)和最低定量限(L0Q)分别为1 y g. mL—1和3 y g. ml/1。 日间精密度和日内精密度均小于4%。加样回收率为96-104% (RSD%<2%)。2. 5含量测定结果经测定，山楂叶及山楂叶提取物中金丝桃苷含量分别为0. 16%和2. 35%。色谱图见图1A和图1B。实施例6对蛋白质糖基化终末产物形成抑制1.相关溶液配制
10mM 3 -巯基乙醇含有135mM磷酸缓冲液(pH7. 0)配制方法精确称取磷酸二 氢钾18. 36g、磷酸氢二钠19. 17g，分别加入1L蒸馏水中，两溶液混合调节pH值至7.0，按 74. 18mg/100ml加入3 -巯基乙醇，振荡溶解。180mM磷酸缓冲液(pH7. 0)配制方法精确称取磷酸二氢钾24. 48g、磷酸氢二钠 25. 56g，分别加入1L蒸馏水中，两溶液混合调节pH值至7. 0。1. 0M硫酸锂溶液配制方法精确称取硫酸锂1. lg溶于10ml蒸馏水中振荡溶解。10mM DL_甘油醛溶液配制方法精确称取0. 9gDL_甘油醛溶于1L蒸馏水中振荡溶解。10mM咪唑含6M氢氧化钠溶液配制方法精确称取240g氢氧化钠溶解于1L蒸馏 水中，再称取6. 8g咪唑振荡溶解。0. 3mM NADPH溶液配制方法精确称取2. 5mg NADPH加入10ml 180mM磷酸缓冲 液(pH7. 0)振荡溶解，取出lml溶液，加入27ml 180mM磷酸缓冲液(pH7. 0)，配成0. 01M的 NADPH溶液，冰浴保存。2.样品溶液配制用DMS0溶解实施例1所述山楂叶70%乙醇提取物，配成64mg/ml的溶液，_20°C保存。实验前将样品DMS0溶液用180mM磷酸缓冲液(pH7. 0)稀释成400 u g/ml、200 u g/ ml、100ii g/ml、50ii g/ml、25ii g/ml、12. 5ii g/ml、6. 25 ii g/ml、0 ii g/ml，各样品溶液在终浓 度时所含DMS0体积相等且小于2. 5%。3.醛糖还原酶制备(1)醛糖还原酶提取方法Wistar大鼠脱白处死，立即摘取眼球，采用后路手术摘取晶状体(冰上进行)放 入20mll0mM 0 -巯基乙醇含有135mM磷酸缓冲液(pH7. 0)中，勻浆，100000X g、4°C离心 30min，取上清，-20°C保存。(2)醛糖还原酶筛选方法实验在玻璃试管中进行，设三组，每组4个复孔，分别为对照组A、样品组B、空 白组C，各样品测试组，180mM磷酸缓冲液(pH7. 0) 225 yl、1. 0M硫酸锂溶液50 yl、10mM DL-甘油醛溶液50iU、提取的酶溶液100 ill和样品溶液25iU混合，30°C预热3min，加入 0. 3mMNADPH溶液50 u 1，30°C反应30min，加入0. 5M的盐酸150 u 1终止反应；标准曲线组， 180mM磷酸缓冲液(pH7. 0) 2450 u 1、1. 0M硫酸锂溶液700 ii lUOmM DL_甘油醛溶液700 ii 1、 二甲基亚砜350 ill、提取的酶溶液1400 ill和0. 5M的盐酸2100 ill混合后取出600 yl， 分别加入NADP溶液使其终浓度为0 ii M、1 ii M、2 ii M、4 ii M、8 ii M、16 u M，各测试管分别加入 lOmM咪唑含6M氢氧化钠溶液，60°C反应20min，室温放冷后于激发波长360nm，发射波长 460nm检测荧光吸收度。4抑制活性计算方法按照以下公式计算有效组分各浓度的抑制率，据各浓度的抑制率计算出IC50。抑制率(%) = (A-B)/(A-C) X100其中A为对照组吸收度，B为样品组吸收度，C为空白组吸收度。实验结果
山楂叶70%乙醇提取物醛糖还原酶半数抑制浓度(IC50)为89. 7 ii g/ml，表明山 楂叶70%乙醇提取物具有抑制醛糖还原酶活性，可以用于制备预防和治疗白内障的药物， 进而治疗白内障。实施例7山楂叶70%乙醇提取物对硒诱导的白内障大鼠的治疗作用1.实验动物出生12天的Wistar大鼠60只(自己繁殖)，由母鼠喂养，饲养在天津中医药大学 实验动物中心，环境设施符合《中华人民共和国卫生部实验动物环境设施标准》二级标准， 合格证号为医动字第01-19981109号。2.药品配制方法制备滴眼液精确称取实施例1所述一定量的山楂叶70%乙醇提取物，溶于双蒸 水中振荡溶解配成lmg/ml、2mg/ml的溶液，抽滤后得滴眼液。动物分组出生12天的Wistar乳鼠，雌雄不拘，平行分成正常组、模型组、山楂叶70%乙醇提 取物高剂量组(4mg/kg)、山楂叶70%乙醇提取物低剂量组(2mg/kg)、阳性对照组(吡诺克 辛钠滴眼液，商品名白内停，武汉远大制药集团股份有限公司，批号080925)，每组12只， 母乳喂养。白内障模型制作及给药于乳鼠出生第12天用镊子轻轻打开乳鼠的眼睑成杯状，正常组和模型组滴入蒸 馏水，给药组滴入上述不同浓度的山楂叶70%乙醇提取物滴眼液，阳性对照组滴入吡诺克 辛钠滴眼液2ml/kg体重，保持眼睛睁开约lmin，防止药液溢出眼外，每8h给药1次，连续7 日。于乳鼠出生第14天皮下注射亚硒酸钠19mol/kg体重，96h后肉眼观察白内障程度，水 合氯醛麻醉，腹主动脉取血、采集晶状体，-80°C保存。4样本采集腹主动脉取血后，迅速摘取眼球，采用后路手术法剥离晶状体，用粗滤纸吸干，称 重，-80°C保存。检测方法1血清指标检测血液3500r min—WC离心lOmin，分离出血清。用超氧化合物歧化酶试剂盒、丙 二醛试剂盒、过氧化氢酶试剂盒(均为南京建成生物有限公司生产)，于多功能读板机上检 测超氧化合物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)水平。2晶状体生化检测晶状体称重后置勻浆管中，加入冰1. 0ml 180mM磷酸缓冲液(pH7. 0)，勻浆， 3500r mirTWC离心lOmin，取上清液，用超氧化合物歧化酶试剂盒、丙二醛试剂盒、谷胱 甘肽试剂盒、过氧化氢酶试剂盒(均为南京建成生物有限公司生产)，于多功能读板机上检 测SOD、MDA、GSH、CAT ；荧光分光光度法检测醛糖还原酶活性。4实验结果4. 1血清指标检测结果乳鼠血清SOD、CAT的活性及MDA含量见表1，可知模型组乳鼠血清SOD活性比正常组比显著性降低，吡诺克辛钠滴眼液、山楂叶70%乙醇提取物高剂量组和山楂叶70%乙 醇提取物低剂量组均能显著性提高亚硒酸钠诱导的白内障乳鼠血清SOD的活性；吡诺克辛 钠滴眼液、山楂叶70%乙醇提取物高剂量组乳鼠血清SOD的活性明显高于正常组，山楂叶 70%乙醇提取物高剂量的作用优于吡诺克辛钠滴眼液组。模型组乳鼠血清CAT活性与正常 组比显著性下降，吡诺克辛钠滴眼液、山楂叶70%乙醇提取物高剂量组均能显著性提高乳 鼠血清CAT的活性，山楂叶70%乙醇提取物低剂量组有提高乳鼠血清CAT活性的趋势。各 剂量组乳鼠血清MDA含量没有显著性差异。表1乳鼠血清SOD、CAT的活性和MDA含量 与模型对照组比较有显著性差异*p < 0. 05，< 0.014. 2晶状体生化检测结果乳鼠晶状体S0D、CAT、AR活性及GSH含量见表2，模型组晶状体CAT活性与正常组 晶状体CAT活性显著性降低，阳性对照组和山楂叶70%乙醇提取物高低剂量治疗组均能显 著性升高晶状体CAT活性但仍然没有使其恢复到正常水平。模型组晶状体SOD活性与正常 组比显著性降低，吡诺克辛钠滴眼液治疗组、山楂叶70%乙醇提取物高低剂量组均能显著 性提高晶状体S0D活性，除山楂叶低剂量治疗组外其余各组均能使其恢复到正常水平。模 型组晶状体GSH含量与正常组晶状体GSH含量比显著性下降，阳性对照组和山楂叶70%乙 醇提取物高低剂量治疗组均能显著性升高晶状体GSH含量且使其基本达到正常水平。表2乳鼠晶状体S0D活性、CAT活性、GSH含量 与模型对照组比较有显著性差异*p < 0. 05，< 0.01结论1、山楂叶70%乙醇提取物能显著性降低硒诱导的白内障乳鼠血清S0D、CAT活性， 增强机体整体抗氧化能力，可以降低白内障发生率，提示该药物可以用于白内障治疗和预 防。2、山楂叶70%乙醇提取物能显著性增强硒诱导的白内障乳鼠晶状体SOD、CAT活 性和GSH含量，增强晶状体的抗氧化能力，减少晶状体的氧化损伤，防治白内障。实施例8片剂实施例1所述山楂叶70%乙醇提取物 40mg乳糖187mg玉米淀粉50mg硬脂酸镁3mg制备方法按上述比例将山楂叶70%乙醇提取物、乳糖和玉米淀粉混和，过200目 筛，用水均勻润湿，把润湿后的混合物干燥再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片即得。实施例9胶囊剂实施例1所述山楂叶70%乙醇提取物 20mg半乳糖188mg硬脂酸镁 2mg制备方法按上述比例将山楂叶70%乙醇提取物与半乳糖、硬脂酸镁均勻混合， 过200目筛，把得到的混合物装入1号胶囊，即得。
实施例10口服液实施例1所述山楂叶70%乙醇提取物2g将配方量山楂叶70%乙醇提取物加入400毫升蒸馏水中溶解，滤过，加入适量单 糖浆、苯甲酸钠，再加蒸馏水至1000毫升，冷藏，滤过，封装于10毫升安瓿中，100°C灭菌30 分钟，即得。实施例11颗粒剂实施例1所述山楂叶70%乙醇提取物 IOOOmg将配方量山楂叶70%乙醇提取物加入600g蔗糖中，混合均勻，过200目筛，80%乙 醇软材，制粒，干燥，6g/袋。上述参照具体实施方式
对该山楂叶的新用途进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变 化和修改，应属本发明的保护范围之内。
权利要求
山楂叶在制备醛糖还原酶抑制药物中的用途。
2.山楂叶在制备预防和治疗白内障的药物中的用途。
3.山楂叶提取物在制备醛糖还原酶抑制药物中的用途。
4.山楂叶提取物在制备预防和治疗白内障的药物中的用途。
5.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于所述山楂叶提取物为山楂叶乙醇提取物。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述山楂叶乙醇提取物为山楂叶 50% -95%乙醇提取物。
7.实现上述用途的药物组合物，包含治疗有效量的山楂叶和/或山楂叶提取物以及任 选的药学可接受的赋形剂。
全文摘要
本发明提供了山楂叶及其提取物在制备醛糖还原酶抑制药物中的用途，以及在制备预防和治疗白内障的药物中的用途，所述山楂叶及其提取物通过抑制醛糖还原酶，增强机体抗氧化能力，从而有望用于制备预防和治疗白内障的药物，进而达到对于白内障的治疗目的。
文档编号A61P27/12GK101837061SQ20101020662
公开日2010年9月22日 申请日期2010年6月23日 优先权日2010年6月23日
发明者刘二伟, 张德芹, 李玉红, 王涛, 胡利民, 赵春风, 高秀梅 申请人:天津中医药大学