一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法

专利名称：一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法，属于药理 活性物质的体内递送及其临床应用领域。具体来说，本发明是一种利用蛋白及多肽展开与 再折叠或自组装的方法将药理活性物质包入蛋白，形成纳米粒的方法。
背景技术：
静脉注射给药能够快速直接地作用于机体。为了降低静脉注射给药的副作用，有 效的方法之一就是将药理活性物质包入微米或纳米级的粒子中。一方面，静脉注射的粒子 可以缓释药理活性物质并延长药理活性物质的半衰期；另一方面，靶向材料可以将粒子中 的药理活性物质靶向地释放。在现有技术涉及的蛋白粒子的制备方法中，如Abraxane 的制备方法(美国专利No. 6，749，868，美国专利No. 5，560，933)，将蛋白溶液与有机溶剂 均勻混合形成乳化液，高压勻浆，形成以紫杉醇为核心的白蛋白纳米粒。除了这种制备方法 比较复杂之外，还需要用高压及相应的高温来去除有机溶剂，从而获得纳米粒。二氯甲烷， 乙腈等有机溶剂具有毒性，需要控制其残留量。此外，这些方法包载药理活性物质的能力是 有限的。同时，由于制备过程中的高压和剪切力，蛋白和多肽还可能失去生物活性。蛋白粒子还被众多文献报道作为药理活性物质和诊断试剂的载体。其中，白蛋 白微球可以用热交联和化学交联的方法来制备。热交联微球是在100 150°C下从乳化 混合物(如白蛋白、需包载的药理活性物质和适当的油相)中制备。然后微球用适当的溶 剂洗涤并保存。Leucuta等报道了热交联微球的制备方法[International Journal of Pharmaceutics Vol. 41:213-217 (1988)];化学交联微球的制备，如文献[Science Vol. 213:233-235 (1981)]所报道，用戊二醛交联蛋白，然后洗涤并保存。而且，现有技术中蛋白纳米粒的制备方法很难保持蛋白的生物活性。而且，难溶 于水的药理活性物质也很难被包入蛋白纳米粒中，因为这种方法本身依靠乳化液的水相交 联。水溶性药理活性物质因其溶于含蛋白的水相而能够被交联进入蛋白阵列，而水溶性差 或脂溶性药理活性物质难以进入这种方法所形成的蛋白阵列中。

发明内容
本发明的技术目的在于提供一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒 的方法，以解决某些药理活性物质由于其疏水的性质而导致无法体内递送，以及形成纳米 粒之后的蛋白质活性丧失的问题。为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案为一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法，包括以下步骤(a)用第 一种溶剂溶解蛋白获得蛋白溶液；(b)在变性剂或者适合的变性条件中将药理活性物质加 入步骤(a)中所述的蛋白溶液中，使蛋白展开与再折叠或自组装，把药理活性物质包入蛋 白，形成蛋白纳米粒。
本发明技术方案中所述的蛋白纳米粒平均粒径为5 2000 nm，优化的为25 500 nm，最优的为50 300 nm。本发明技术方案中所述的蛋白纳米粒可包载占蛋白纳米粒总重量1% 40%的药 理活性物质。本发明技术方案所述的药理活性物质是疏水性药理活性物质，如抗肿瘤药物，心 血管药物，抗炎药物，降糖药物，中枢神经系统药物，免疫抑制药物，以及抗病毒药物。其中，所述的疏水性药理活性物质是紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、5-氟尿嘧啶、 卡莫司汀、阿霉素、苯芥胆留醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、藤黄酸、冬凌草甲素、鬼臼 毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、非诺贝特、硝苯地平、布洛芬、吲哚美辛、吡罗昔康、格列本脲、 地西泮、利哌利酮、齐拉西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地那韦、利托那韦、TelapreviKCAS号 4(^957-28-2)、洛匹那韦、或它们的组合。其中，优选的疏水性药理活性物质是紫杉醇或多西紫杉醇。本发明技术方案所述的药理活性物质是亲水性药理活性物质。其中，所述的亲水性药理活性物质是环磷酰胺、博莱霉素、道诺霉素、表柔比星、甲 氨蝶呤、5-氟尿嘧啶或其类似物、钼或其类似物、长春碱或其类似物、高三尖杉酯碱或其衍 生物、放线菌素-D、丝裂霉素-C、依托泊苷、或它们的组合。本发明技术方案中所述的蛋白是白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、血管内皮抑素、血红 蛋白、肌红蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤维连接蛋白、纤层蛋白、胶原蛋白、 明胶、人造多肽与蛋白，或者它们的组合。其中，优选的蛋白是白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、血管内皮抑素或血红蛋白。本发明技术方案所述的步骤(a)的第一种溶剂是水，生理盐水，糖，冻干保护剂或 蛋白稳定剂。其中，所述的冻干保护剂是磷酸盐，醋酸盐，甘氨酸，三羟甲基氨基甲烷，过氧 化氢，谷胱甘肽，葡萄糖、或它们的组合。所述的蛋白稳定剂是海藻糖，甘露醇，蔗糖，乙酰色 氨酸，辛酸钠或者它们的组合。其中，所述的第一种溶剂优选水，磷酸盐，醋酸盐，乙酰色氨酸，辛酸钠或生理盐 水。本发明技术方案中所述的步骤(a)的操作温度为-20 100°C;优选为50 85°C; 最优为55 75°C。本发明技术方案中所述的步骤(a)的操作pH值为pH3 9 ；优选为pH5 8. 5 ；最 优为pH6 8。本发明技术方案中所述的步骤(b)的变性剂或者适合的变性条件包括水、强酸、 强碱、无机盐、有机溶剂、结构展开剂或表面活性剂。其中，所述的强酸强碱包括盐酸，硫酸， 氢氧化钠等。所述的有机溶剂是甲醇，乙醇，异丙醇，福尔马林，氯仿，丙酮，硫化氢或它们的 组合。所述的结构展开剂是水，2-巯基乙醇，二硫苏糖醇，盐酸胍，尿素，高氯酸，三丁基膦， 甲巯丙脯氨酸，过甲酸，青霉胺，谷胱甘肽，甲硫咪唑，乙酰半胱氨酸或它们的组合。所述的 无机盐是水，氯化钠，磷酸盐，醋酸盐，甘氨酸，三羟甲基氨基甲烷，过氧化氢，谷胱甘肽，葡 萄糖，蔗糖，甘露醇，海藻糖，乙酰色氨酸，辛酸钠或它们的组合。其中，优选的变性剂或者适合的变性条件是水，磷酸盐，醋酸盐，甘氨酸，三羟甲基 氨基甲烷，氯化钠，葡萄糖，乙醇，丙酮，硫化氢，2-巯基乙醇，尿素或它们的组合。
本发明技术方案中所述的变性剂或者适合的变性条件的pH值为pH3 9 ；优选为 ρΗ5· 5 8. 5。本发明技术方案中所述的步骤(b)还包括外力操作以辅助蛋白展开。其中，所述的外力包括变化温度、变化压力、施加机械力或辐射。其中，所述的变化压力为对反应施加10 100，000 psi的压力；优选的对反应施 加2000 60，000 psi的压力。本发明的技术方案的方法进一步包括(c)将蛋白纳米粒透析除去多余的小分子 化合物或者进一步浓缩。本发明的技术方案的方法进一步包括(d)将透析后的蛋白纳米粒经过脱水步骤 制备成药物制剂。其中，所述的脱水的步骤是冷冻干燥、喷雾干燥或减压蒸馏。下面是对本发明技术方案的进一步描述除上述总的技术方案以外，本发明进一步提出了一种制备用于体内递送疏水性药理活 性物质的纳米粒制备方法，所述方法包含以下几个步骤(a)在-20 100°C，pH3 9的条 件下，用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液；(b)在变性剂或者适合的变性条件下，将 疏水性药理活性物质加入步骤(a)中所述的蛋白溶液，从而引起蛋白展开与再折叠或自组 装，把药理活性物质包入蛋白。形成的纳米粒平均粒径为5 500 nm，可包载占粒子总重量 约1 40%的疏水性药理活性物质。这里的疏水性药理活性物质可以包括但不局限于紫杉 醇、多西紫杉醇、伊立替康、卡莫司汀、阿霉素、苯芥胆留醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、 藤黄酸、冬凌草甲素、鬼白毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、非诺贝特、硝苯地平、布洛芬、吲哚 美辛、吡罗昔康、格列本脲、地西泮、利哌利酮、齐拉西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地那韦、利 托那韦、Telaprevir、洛匹那韦，以及它们的组合。本技术方案的方法中的蛋白一般可以包括但不局限于白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、 内皮抑素、血红蛋白、肌红蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤维连接蛋白、纤层 蛋白、胶原蛋白、明胶、人造肽与蛋白，以及它们的组合。本实施方案的方法中的第一种溶剂 可以包括水、生理盐水、磷酸盐、醋酸盐、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、过氧化氢、谷胱甘肽、 葡萄糖、海藻糖、甘露醇、蔗糖、乙酰色氨酸、辛酸钠，以及它们的组合。此外，本实施方案的 方法中的变性剂或者适合的变性条件可以包括水，氯化钠，磷酸盐，醋酸盐，甘氨酸，三羟甲 基氨基甲烷，过氧化氢，谷胱甘肽，甲醇，乙醇，异丙醇，福尔马林，氯仿，丙酮，硫化氢，2-巯 基乙醇，二硫苏糖醇，盐酸胍，尿素，高氯酸，三丁基膦，甲巯丙脯氨酸，过甲酸，青霉胺，谷胱 甘肽，甲硫咪唑，乙酰半胱氨酸以及它们的组合。其中，所述的纳米粒子的平均直径优选为25 nm 500 nm ；最优为50 nm 300 nm。所述步骤(a)优选在50°C 85°C进行，最优在55°C 75°C进行。pH优选在5 8. 5 的条件下进行，最优在6 8的条件下进行。所述变性剂或者适合的变性条件是水，氯化钠，磷酸盐，醋酸盐，甘氨酸，三羟甲基 氨基甲烧，乙醇，丙酮，硫化氧，2-巯基乙醇，尿素或它们的组合。其中，所述的变性剂或者适合的变性条件的pH值为3 9，优选为5. 5 8. 5。上述方法进一步包括(c)将纳米粒透析除去多余的小分子化合物或者进一步浓 缩。还进一步包括(d)将透析后的纳米粒经过脱水步骤制备成药物制剂。其中，所述的脱水步骤是冻干，减压蒸馏或喷雾干燥。本发明技术方案再进一步提出了一种制备用于体内递送紫杉醇蛋白纳米粒的方 法，所述方法包含以下几个步骤(a)在55 75°C，pH6 8的条件下，用第一种溶剂溶解 所述蛋白获得蛋白溶液；(b)在变性剂或者适合的变性条件下，将紫杉醇加入步骤(a)中所 述的蛋白溶液，从而引起蛋白展开与再折叠或自组装，把紫杉醇包在所述蛋白中；(c)将纳 米粒透析除去多余的小分子化合物或者进一步浓缩；(d)对所得溶液进行脱水作用，制得 能够保存的药物剂型。这里制得的纳米粒平均粒径为50 300 nm，可包载占粒子总重量约 1 40%的药理活性物质。本实施方案的方法中的变性剂或者适合的变性条件可以从水， 氯化钠，磷酸盐，醋酸盐，甘氨酸，三羟甲基氨基甲烷，过氧化氢，谷胱甘肽，甲醇，乙醇，异丙 醇，福尔马林，氯仿，丙酮，硫化氢，2-巯基乙醇，二硫苏糖醇，盐酸胍，尿素，高氯酸，三丁基 膦，甲巯丙脯氨酸，过甲酸，青霉胺，谷胱甘肽，甲硫咪唑，乙酰半胱氨酸以及它们的组合中 选择。此外，本实施方案的方法中的蛋白可以从白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、内皮抑素、血红 蛋白中选择。本发明技术方案再进一步提出了一种将多西紫杉醇包入蛋白用于体内递送的纳 米粒制备方法，这种方法包含以下几个步骤(a)在55 75°C，pH6 8的条件下用第一种 溶液溶解所述蛋白获得蛋白溶液；(b)在变性剂或者适合的变性条件下，将多西紫杉醇加 入到步骤(a)中所述的蛋白溶液，从而引起展开与再折叠或自组装，把多西紫杉醇包入蛋 白；(c)将纳米粒透析除去多余的小分子化合物或者进一步浓缩；(d)将透析后的纳米粒 经过脱水步骤制备成药物制剂；这里制得的纳米粒平均粒径为约50 300 nm，可包载占粒 子总重量约1 40%的多烯紫杉醇。本实施方案的方法中的变性剂或者适合的变性条件 可以从水，氯化钠，磷酸盐，醋酸盐，甘氨酸，三羟甲基氨基甲烷，过氧化氢，谷胱甘肽，甲醇， 乙醇，异丙醇，福尔马林，氯仿，丙酮，硫化氢，2-巯基乙醇，二硫苏糖醇，盐酸胍，尿素，高氯 酸，三丁基膦，甲巯丙脯氨酸，过甲酸，青霉胺，谷胱甘肽，甲硫咪唑，乙酰半胱氨酸以及它们 的组合中选择。此外，本实施方案的方法中的蛋白可以从白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、内皮抑 素、血红蛋白中选择。本发明技术方案再进一步提出了一种蛋白包载药理活性物质用于体内递送的纳 米粒，制备这种纳米粒的方法包含以下几个步骤(a)在-20 100°C，pH3 9的条件下， 用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液；(b)在变性剂或者适合的变性条件下，将药理 活性物质加入到步骤(a)所述的蛋白溶液中，使蛋白展开与再折叠或自组装，将药物包裹 在所述蛋白中。本发明技术方案再进一步提出了一种蛋白包载紫杉醇用于体内递送的纳米粒，制 备这种纳米粒的方法包含以下几个步骤(a)在55 75°C，pH6 8的条件下，用第一种溶 剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液；(b)在变性剂或者适合的变性条件下，将紫杉醇加入到步 骤(a)所述的蛋白溶液中，使蛋白展开与再折叠或自组装，将药物包裹在所述蛋白中；(c) 透析形成的纳米粒溶液以去除过剩的物质，得到高浓度的溶液；(d)对所得溶液进行脱水 作用，制得能够保存的药品剂型。本发明技术方案再进一步提出了一种蛋白包载多西紫杉醇用于体内递送的纳米 粒，制备这种纳米粒的方法包含以下几个步骤(a)在55 75°C，pH6 8的条件下，用第 一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液；(b)在变性剂或者适合的变性条件下，将多西紫杉醇加入到步骤(a)所述的蛋白溶液中，使蛋白展开与再折叠或自组装，将药物包裹在所述 蛋白中；(c)透析形成的纳米粒溶液以去除过剩的物质，得到高浓度的溶液；(d)对所得溶 液进行脱水作用，制得能够保存的药品剂型。对本发明所述技术方案的说明本发明所述的“纳米粒”，指的是小的单位，而在转运和性质方面特指为一个整体。本发 明所制备的蛋白纳米粒平均粒径分布于5 nm到2000 nm之间。一个更好的区间是25 nm 到500 nm，再一个更好的区间是50 nm到300 nm。而且，本发明所制备的纳米粒能够结合 高达40%的药理活性物质。本发明中所述的将药理活性物质包入蛋白，指的是药理活性物质可以通过蛋白的 展开和再折叠，进入蛋白中心区域。一般来说，药理活性物质包括在给病人服用时，能够产 生药理反应的任何的物质。本发明中的药理活性物质包括疏水和亲水的化合物。本领域技 术人员清楚疏水性药理活性物质的水溶性不好，亲水性药理活性物质能够优化的溶解在水 中。疏水性的药理活性物质包括如下的化合物，但是不仅仅限于此抗肿瘤药物，心血管药 物，抗炎药物，降糖药物，中枢神经系统药物，免疫抑制药物，以及抗病毒药物。本发明涉及的疏水性药理活性物质可以包括，但是不仅仅局限于此紫杉醇、多西 紫杉醇、伊立替康、卡莫司汀、阿霉素、苯芥胆留醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、藤黄酸、 冬凌草甲素、鬼白毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、非诺贝特、硝苯地平、布洛芬、吲哚美辛、吡 罗昔康、格列本脲、地西泮、利哌利酮、齐拉西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地那韦、利托那韦、 Telaprevir、洛匹那韦，以及它们的组合。更优化的说，具有药理活性的疏水性物质包括抗肿瘤药理活性物质如紫杉醇， 多西紫杉醇，伊立替康，卡氯芥，阿霉素，胆留醇对苯乙酸氮芥，哌泊舒凡，他莫昔芬，环己亚 硝脲，藤黄酸，冬凌草素甲，鬼白毒素以及它们的衍生物，以及它们的组合。在一个更优化的范围中，疏水性药理活性物质包括紫杉醇和多西紫杉醇。上述的 药理活性物质包括晶体形式和无定形形式，其晶体形式包括带有结晶水和不带有结晶水的 形式。本发明所涉及的药理活性物质还包括亲水性物质。亲水性物质可以包括如下化合物，但是不仅仅局限于此环磷酰胺、博莱霉素、道 诺霉素、表柔比星、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶及其类似物、钼及其类似物、长春碱及其类似物、 高三尖杉酯碱及其衍生物、放线菌素-D，丝裂霉素-C，依托泊苷以及它们的组合。本领域技术人员能够理解本发明中使用的药理活性物质的量会根据蛋白的量的 变化而变化，同时根据纳米粒的量的变化而变化。同时，有经验的人能够意识到本发明中使 用的药理活性物质，可以是纯的物质，或者是混合物，这些都没有背离本发明的范围。本发明中，可以选择不同的蛋白去形成本领域技术人员所感兴趣的纳米粒子。本 发明中所涉及的蛋白包括所有的能够展开并结合药理活性物质的蛋白或者多肽。合适的蛋 白的例子包括如下，但是不仅仅局限于此白蛋白，转铁蛋白，胰岛素，血管内皮抑素，血红 蛋白，肌球蛋白，溶菌酶，免疫球蛋白，α -2-巨球蛋白，纤连蛋白，核纤层蛋白，胶原蛋白，明 胶，人造蛋白以及它们的组合。在一个更优化的范围，适合于本发明的蛋白包括如下白蛋白，转铁蛋白，胰岛素， 血管内皮抑素，血红蛋白以及它们的组合物。本领域技术人员会清楚本发明方法中所使用的蛋白的量随着活性物质的量和纳米粒的量的变化而变化[Armalytical Biochemistry Vol. 72:248-254(1976)].本发明方法中的步骤(a)为用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液。这里的蛋白溶 液指的是溶液中包括蛋白和能够溶解蛋白的溶剂，在蛋白展开之后，能够再折叠或者自组 装。这里使用的再折叠指的是一个解折叠或者变性的蛋白能够再折叠恢复到合适的三维结 构的过程。这里使用的自组装指的是再折叠的蛋白结合到一起形成纳米粒的过程。本领域 技术人员清楚蛋白的再折叠过程可以通过很多条件完成。在蛋白溶液中使用的第一种溶液 举例如下，但不仅仅局限于此水，生理盐水，糖，冻干保护剂和蛋白稳定剂，在更精确的范 围，溶剂包括水，氯化钠溶液，磷酸盐溶液，醋酸溶液，甘氨酸溶液，三羟甲基氨基甲烷溶液， 过氧化氢水溶液，谷胱甘肽水溶液，葡萄糖溶液，海藻糖溶液，甘露醇溶液，蔗糖溶液，乙酰 色氨酸溶液，辛酸钠溶液，以及它们的混合物。在一个更加精确的范围，蛋白溶液中的溶剂包括水，磷酸盐，醋酸盐和氯化钠溶 液。本发明中所使用的蛋白溶液中的溶剂的浓度只要适合溶解蛋白和蛋白再折叠，都是可 行的。总体上来说，蛋白溶液中溶剂的含量范围从0.001 M到1.6 M0优化的范围，从0.03 M到1.5 M0再优化的范围，从0.05 M到0.8 M。一个更加优化的范围，从0. 1 M到0. 3 M。 本领域技术人员能够明白用来溶解蛋白的溶剂的量会根据蛋白的量和蛋白溶液浓度的变 化而变化。实验表明，本发明中的步骤(a)中的反应参数对于形成纳米粒来说，是非常重要 的。一般来说，要获得一个理想的结果，本发明中的步骤(a)须在-20°C到100°C范围之间 反应。一个比较精确的范围是从50°C到85°C。一个更加精确的范围是从55°C到75°C。实 验已经证明，要获得一个比较理想的结果，本发明中步骤(a)的pH须在3到9之间，一个比 较精确的范围是从5到8. 5，在一个更加精确的范围是从6到8。本领域技术人员能够清楚 步骤(a)需要一段时间以使得蛋白充分的溶解。一般来说，时间的长短依赖于所使用的蛋 白的种类，蛋白的使用量，使用溶剂的种类，溶剂的含量，溶剂的浓度和其他的一些因素。一 般来说，本领域技术人员能够充分意识到，反应过程和反应过程的每一个步骤都需要充足 的时间，举一个例子，反应过程需要5分钟到8小时不等。本发明的第二个步骤即步骤(b)包括在变性剂或者适合的变性条件下，将药理活 性物质加入到经过步骤(a)所述的蛋白溶液中，使蛋白展开与再折叠或者自组装。这里使 用的变性剂或者适合的变性条件指的是能诱导蛋白或者多肽改变它们的三维或者二维结 构的溶液。一般来说，这里提到的变性剂或者适合的变性条件能够诱导蛋白温和的变性。本 领域技术人员能够充分意识到温和变性指的是在蛋白解折叠/变性之后，能够在某些条件 下(如使用再折叠溶液)再折叠成合适的结构。变性剂或者适合的变性条件可以提供一个环 境来破坏蛋白的二硫键，形成氢键，以使得水能够干扰蛋白内部的疏水作用。本领域技术人 员能够充分意识到许多溶液能够充当变性剂或者适合的变性条件。这里所述的变性剂或 者适合的变性条件括水，强酸，强碱，无机盐，有机溶剂，结构展开剂和表面活性剂。合适的 变性剂或者适变性条件举例如下，但是不仅仅局限于此水，氢氧化钠，盐酸，硫酸，甲醇溶 液，乙醇溶液，异丙醇，福尔马林，氯仿，丙酮，硫化氢，2-巯基乙醇，二硫苏糖醇，胍，尿素， 高氯酸，三正丁基膦，甲巯丙脯酸，过甲酸，青霉胺，谷胱甘肽，甲硫咪唑，乙酰半胱氨酸，氯 化钠溶液，磷酸盐溶液，醋酸盐溶液，甘氨酸溶液，三羟甲基氨基甲烷溶液，过氧化氢，谷胱甘肽，葡萄糖，蔗糖，甘露醇，海藻糖，乙酰色氨酸，辛酸钠以及它们的混合物。在一个更精确 的范围，变性剂或者适合的变性条件包括水，磷酸盐，醋酸盐，甘氨酸，三羟甲基氨基甲烷， 乙醇，丙酮，硫化氢，2-巯基乙醇，尿素。实验证明，当变性剂或者适合的变性条件的PH在 3 9之间，获得的结果是令人满意的。一个更加精确的pH范围是从5. 5到8. 5。另外，除了变性剂，本发明中蛋白解折叠还可以使用外加压力。一般来说，外加压 力包括能够致蛋白解折叠的力量。外加力包括温度，压力变化，机械力，辐射。外加力包括 从10到100，000 psi的压力，一个更合适的范围是从2000到60000 psi。本发明可能另外需要一个步骤(C)将纳米粒子透析除去多余的小分子化合物或 者进一步浓缩。一般来说，这个步骤包括任意的能够将小分子从纳米粒中分离出去的方 法，本领域技术人员能够充分意识到分离的方法包括任意的能够纯化蛋白或者多肽的方 法。这些方法可包括盐沉淀，透析，层析以及它们的组合，这些方法可以适当的选择。一个 更加精细的范围，透析是可行的。本发明可能还需要一个步骤(d)将透析后的纳米粒经过脱水步骤制备成药物制 剂。一般来说，保护的方法包括给纳米粒脱水以方便储存和运输，以致获得合适的剂型。本 发明所涉及的保护的方法包括离心，减压干燥，冻干，喷雾干燥。本领域技术人员能够意识到本发明的范围和精髓是变动的。解折叠的物质是变化 的，同时许多的药理活性物质是可使用的，许多的蛋白和合成的多肽也是可以用来作为载 体的。本发明将会在下面的实施例中得到更加明确和清晰地描述。本发明的有益效果在于首先，经本发明提供的方法形成的纳米粒子可以达到90%的包封率，超过现有技术，形 成了一种高效低耗的方法；其次，本发明所提供的方法能够获得最高达40%的载药量，即纳 米粒中含有40%的药理活性物质。由于有更高的载药量，在治疗时，可以获得更小的用药体 积，更短的用药时间，对病人更方便。较高的载药量降低了递送药理活性物质时蛋白的使用 量，提高了产品的成本效率；最后，现有技术提供的较低载药能力不能满足高剂量给药，因 为高剂量的给药需要很大的给药体积。然而，本实验发明的具有高载药能力的纳米粒不会 受给药体积的限制。通过本发明制备的纳米粒的另一个有益效果是，纳米粒能够特异性的递送药理活 性物质。通过本发明制备的纳米粒子能够靶向一些身体器官和系统。比如，当用白蛋白作 为载体时，通过改变纳米粒子的大小，靶向肝脏，肺，脾脏或者淋巴系统等。当用转铁蛋白或 者胰岛素作为载体的时候，它们的受体在细胞表面高表达，通过载体和肿瘤细胞表面的亲 和性，可以特异性的将药理活性物质输送到肿瘤组织。当载体是血管内皮抑素的时候，它的 受体分布于血管细胞，由于肿瘤组织中存在大量的血管的缘故，纳米粒子能够大量的在肿 瘤组织中蓄积。总之，不同的蛋白载体可以靶向不同的组织或者器官。因此可以说，本发明 提供了一种高效低耗的方法来输送药理活性物质到身体的不同部位。


图1为不同pH对本发明中纳米粒粒径大小的影响(15%投药，药物/蛋白) 图2为本发明中白蛋白-紫杉醇纳米粒的粒径分布3为本发明中白蛋白-紫杉醇纳米粒的透射电子显微镜图像(载药量10. 59%)图4为紫杉醇-白蛋白纳米粒的高分辨率TEM照片其中，(a)白蛋白-紫杉醇纳米粒；(b)放大的空载的白蛋白纳米粒；(c)放大的游离的 紫杉醇；(d)放大的白蛋白-紫杉醇纳米粒图5为白蛋白-紫杉醇纳米粒的X射线粉末衍射图像其中，(a)紫杉醇；(b)空白的白蛋白纳米粒；(c)紫杉醇-白蛋白纳米粒(载药量 12. 9%) ； (d)白蛋白和紫杉醇的物理混合物(12. 9%)图6为白蛋白-紫杉醇纳米粒与药品Abraxane 的再分散其中，(a) 2 mg/mL白蛋白-紫杉醇纳米粒溶液；(b) 2 mg/mL Abraxane 溶液；(c) 20 mg/mL白蛋白-紫杉醇纳米粒溶液；(d) 20 mg/mL Abraxane 溶液；(e) 50 mg/mL白蛋 白-紫杉醇纳米粒溶液；(f)50 mg/mL Abraxane⑧溶液。
具体实施例方式以下均是基于本发明的代表性实施例，但下述实施例不会在任何方面限制本发明 的保护范围。实施例1.紫杉醇-白蛋白纳米粒的制备100 mgHSA溶于10 mL pH6的含0. 5 mg/mL EDTA和0. 05 M巯基乙醇的磷酸盐缓冲 液，55°C反应持续两小时，结束后用5%的三氯乙酸沉淀并洗涤蛋白，加入1.6 mLlO mg/ mL的紫杉醇(乙醇溶解)溶液到沉淀中，混合2分钟，加入50 mL的0. 08 M的磷酸盐缓冲 液搅拌，溶解混合物。得到的悬液透明，而且载药粒子的平均粒径为80 200 nm, (BIC 90plus Particle Size Analyzer) 0用反相C18柱测定紫杉醇的包封率，流动相为乙腈 水(60:40)，检测波长227 nm。HPLC分析表明本实验的紫杉醇包封率达到90%以上。实验中三氯乙酸还可以用其他变性剂代替，比如水，强酸(盐酸和硫酸)，强碱(氢 氧化钠)，过氧化氢，谷胱甘肽等。结果发现，5%的三氯乙酸可以达到较窄的粒径分布(50 300 nm)。实施例2.紫杉醇-白蛋白纳米粒的制备100 mg HSA溶于50 mL pH7. 4的TRIS缓冲液中，37°C水浴，加入；350 μ L 2-巯基乙 醇，反应持续10分钟，加入2 mL 10 mg/mL的紫杉醇(乙醇溶解)。30分钟后，样品用pH7. 4 的TRIS缓冲液透析M小时，所得样品冻干48小时。所得冻干后的块状样品能够很容易的 用水或生理盐水复溶为原溶液，且纳米粒粒径保持不变。冻干后粒径主要分布在80 200 nm(BIC 90plus Particle Size Analyzer)，HPLC分析表明本实验的紫杉醇包封率达到90% 以上。实施例3.紫杉醇-白蛋白纳米粒的制备100 mg紫杉醇溶解在10 mL pH4. 8的缓冲液中，冰水浴30分钟，滴加7. 5 mL 0°C预冷 的丙酮，继续冰浴1小时。离心，收集沉淀，向沉淀中加入1 mL 10 mg/mL的紫杉醇(丙酮溶 解)，超声混勻，加入50 mL生理盐水，磁力搅拌，形成悬液。用BIC 90plus Particle Size Analyzer进行粒径分析，结果为150 220 nm。冻干的样品能复溶，HPLC分析载药量为 8. 34%ο附加实验表明甘氨酸，甘露醇，乳糖和海藻糖均能作为冻干保护剂，且用乳糖做冻 干保护剂得到的粒径最小。
在制备过程中，我们考察了不同的缓冲液(水，生理盐水，磷酸盐缓冲液，醋酸盐缓 冲液，甘氨酸，三羟甲基氨基甲烷，海藻糖，甘露醇，蔗糖，乙酰色氨酸，辛酸钠和葡萄糖溶液 等)以及不同的PH对粒径和载药量的影响，结果表明pH在8.0较好。但是pH又不能超过 8. 5，因为药理活性物质在pH超过8. 5的时候会分解。实施例4.紫杉醇-转铁蛋白纳米粒的制备100 mg转铁蛋白溶于50 mL pH7. 4的TRIS缓冲液中，75°C搅拌，加入350 μ L 2-巯基 乙醇，反应持续10分钟，缓慢加入1 mL 10 mg/mL的紫杉醇(乙醇溶解)。测得粒径分布在 154. 4 nm (BIC 90plus Particle Size Analyzer)。在制备过程中，我们考察了不同温度对粒径和载药量的影响，结果表明温度在0°C 到100°C之间均能够形成纳米粒，在55 75°C形成的纳米粒更好。实施例5.多烯紫杉醇-转铁蛋白纳米粒的制备100 mg转铁蛋白溶于50 mL pH7. 4的TRIS缓冲液中，65°C搅拌，加入350 μ L 2-巯基 乙醇，反应持续10分钟，加入5 mL 10 mg/mL的多烯紫杉醇(乙醇溶解)。测得平均粒径为 177. 1 nm (BIC 90plus Particle Size Analyzer)。若2-巯基乙醇和其他无机盐配合使用，可以得到更好的粒径结果，比如水，氯化 钠，磷酸盐，醋酸盐，甘氨酸，三羟甲基氨基甲烷，过氧化氢，谷胱甘肽，葡萄糖，蔗糖，甘露 醇，海藻糖，乙酰色氨酸和辛酸钠等。当这些无机盐与2-巯基乙醇混合作为变性剂时，粒 子直径分布更窄，其中，三羟甲基氨基甲烷，乙酰色氨酸和辛酸钠的粒子分布最窄，大约为 80 130 nm。实施例6.藤黄酸-白蛋白纳米粒的制备100 mg HSA溶于10 mL纯水中。55°C搅拌，所得溶液和等体积的5%三氯乙酸溶液混 合并且离心，除去上清。加入含有藤黄酸的乙醇溶液混合，然后加入50 mL pH8.0的TRIS， 搅拌直至蛋白沉淀完全溶解。所得的纳米粒粒径为110 nm (BIC 90plus Particle Size Analyzer)。实施例7.紫杉醇-血红蛋白纳米粒的制备-20°C条件下，向10 mL3%的血红蛋白水溶液中缓慢加入300 mL含有3 mL 2 M的HCl的 丙酮溶液。溶液强力搅拌15分钟，然后离心15分钟。待残余的丙酮蒸发掉以后，收集沉淀， 溶解在冷的去离子水里，在2°C条件下用去离子水透析5个小时，然后用0.0016 M NaHCO3 透析30小时，过滤得到珠蛋白溶液。取7 mL上述的珠蛋白溶液加入28 mL水，得到1 mg/mL的蛋白溶液。在2 8°C 条件下加入0.7 mL含10 mg/mL紫杉醇的乙醇溶液，搅拌直至形成浅蓝色溶液。所得粒子 平均粒径为 308. 1 nm (BIC 90plus Particle Size Analyzer)。实施例8.pH对纳米粒粒径的影响考察本发明考察了不同PH的磷酸盐缓冲液以及它们对纳米粒粒径的影响。所有的蛋白溶 液组中均加入15%的紫杉醇(10 mg/mL)，粒径在恒温条件下测定，结果如图1所示。实施例9.紫杉醇-白蛋白纳米粒的动态光散射(dynamic light scaterring, DLS)分析对按照本发明的方法制备的紫杉醇-白蛋白纳米粒进行粒径分析，所用仪器为BIC 90plus Particle Size Analyzer。结果如图4所示，平均粒径为121 nm，且粒径分布在较窄的范围内。实施例10. 紫杉醇-白蛋白纳米粒的透射电镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)表征按照本发明制备载药量为10. 59%的紫杉醇-白蛋白纳米粒进行透射电镜的分析。所 用仪器为EM 2100型200KV高分辨率透射电镜(日本)。结果如图2所示，显示纳米粒子呈 球形。实施例11. 复溶的紫杉醇-白蛋白纳米粒的稳定性研究冻干得到的紫杉醇-白蛋白块状物用生理盐水，5%的葡萄糖和小牛血清分别溶解成紫 杉醇浓度为5 mg/mL, 5 mg/mL和2 mg/mL的溶液。分别在25°C和37°C放置12小时后，纳 米粒的平均粒径没有变化(DLS，BIC 90plus Particle Size Analyzer)，且没有沉淀产生。 结果如表1所示。表1紫杉醇-白蛋白纳米粒的稳定性研究
权利要求
1.一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法，包括以下步骤(a)用第一种溶剂溶解蛋白获得蛋白溶液；(b)在变性剂或者适合的变性条件下，将药理活性物质加入步骤(a)中所述的蛋白 溶液中，使蛋白展开与再折叠或自组装，把药理活性物质包入蛋白，形成蛋白纳米粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的蛋白纳米粒的平均粒径为25nm 500 nm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的蛋白纳米粒的平均粒径为50nm 300 nm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的药理活性物质在纳米粒中所占的重量比是1% 40%ο
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的药理活性物质是疏水性药理活性物质。
6.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的疏水性药理活性物质是紫杉醇、多 西紫杉醇、伊立替康、5-氟尿嘧啶、卡莫司汀、阿霉素、苯芥胆留醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛 莫司汀、藤黄酸、冬凌草甲素、鬼白毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、非诺贝特、硝苯地平、布洛 芬、吲哚美辛、吡罗昔康、格列本脲、地西泮、利哌利酮、齐拉西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地 那韦、利托那韦、Telaprevir、洛匹那韦、或它们的组合。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的药理活性物质是亲水性药理活性物质。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的亲水性药理活性物质是环磷酰胺、 博莱霉素、道诺霉素、表柔比星、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶或其类似物、钼或其类似物、长春碱 或其类似物、高三尖杉酯碱或其衍生物、放线菌素-D、丝裂霉素-C、依托泊苷、或它们的组合。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的蛋白是白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、 血管内皮抑素、血红蛋白、肌红蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤维连接蛋白、 纤层蛋白、胶原蛋白、明胶、人造多肽与蛋白、或它们的组合。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(a)的第一种溶剂是水、生理盐 水、糖、冻干保护剂或蛋白稳定剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述的冻干保护剂是磷酸盐、醋酸盐、甘 氨酸、三羟甲基氨基甲烷、葡萄糖或它们的组合。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述的蛋白稳定剂是海藻糖、甘露醇、蔗 糖、乙酰色氨酸、辛酸钠或它们的组合。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(a)的操作温度为-20 100°C。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(a)的操作温度为55 75 °C。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(a)的操作pH值为pH3 9。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(b)中的变性剂或者适合的变 性条件是水、强酸、强碱、无机盐、有机溶剂、结构展开剂或表面活性剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于所述的无机盐是水、氯化钠、磷酸盐、醋 酸盐、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、过氧化氢、谷胱甘肽、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、乙酰 色氨酸、辛酸钠、或它们的组合。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于所述的有机溶剂是甲醇、乙醇、丙醇、异 丙醇、福尔马林、氯仿、丙酮、硫化氢、或它们的组合。
19..根据权利要求16所述的方法，其特征在于所述的结构展开剂是水、2-巯基乙醇、 二硫苏糖醇、盐酸胍、尿素、高氯酸、三丁基膦、甲巯丙脯氨酸、过甲酸、青霉胺、谷胱甘肽、甲 硫咪唑、乙酰半胱氨酸、三氯乙酸、或它们的组合。
20.根据权利要求1所述的方法，其所述的变性剂或者适合的变性条件是水、磷酸盐、 醋酸盐、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、葡萄糖、乙醇、丙酮、硫化氢、2-巯基乙醇、尿 素、或它们的组合。
21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法进一步包括(c)将纳米粒透 析除去多余的小分子化合物或者进一步浓缩。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于所述的方法进一步包括(d)将透析后的 纳米粒经过脱水步骤制备成药物制剂。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于所述的脱水步骤是冻干、减压蒸馏或喷 雾干燥。
24.一种制备用于体内递送疏水性物质的蛋白纳米粒的方法，包括以下步骤(a)在-20 100°C，pH3 9的条件下，用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液； (b)在变性剂或者合适的变性条件下，将药理活性物质加入到步骤(a)所述的蛋白溶液 中，使蛋白展开与再折叠或自组装，将药物包裹在所述蛋白中；所述的纳米粒子直径25 nm 500 nm,所述蛋白纳米粒含有1% 40%重量比的疏水 性药理活性物质；所述的疏水性药理活性物质是紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、卡莫司汀、阿霉素、苯芥 胆甾醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、藤黄酸、冬凌草甲素、鬼白毒素、阿托伐他汀、斯伐 他汀、非诺贝特、硝苯地平、布洛芬、喷哚美辛、吡罗昔康、格列本脲、地西泮、利哌利酮、齐拉 西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地那韦、利托那韦、Telaprevir、洛匹那韦或它们的组合；所述的蛋白是白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、血管内皮抑素、血红蛋白、肌球蛋白、溶菌酶、 免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤连蛋白、核纤层蛋白、胶原蛋白、明胶、人造蛋白、或它们的 组合；所述的第一种溶剂是水、氯化钠、磷酸盐、醋酸盐、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、过氧化 氢、谷胱甘肽、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、蔗糖、乙酰色氨酸、辛酸钠、或它们的组合；所述的变性剂或者适合的变性条件是水、氯化钠、磷酸盐、醋酸盐、甘氨酸、三羟甲基 氨基甲烷、过氧化氢、谷胱甘肽、甲醇、乙醇、异丙醇、福尔马林、氯仿、丙酮、硫化氢、2-巯基 乙醇、二硫苏糖醇、盐酸胍、尿素、高氯酸、三丁基膦、甲巯丙脯氨酸、过甲酸、青霉胺、谷胱甘 肽、甲硫咪唑、乙酰半胱氨酸、三氯乙酸、或它们的组合。
25.根据权利要求M所述的方法，其特征在于所述的方法进一步包括(c)将纳米粒透析除去多余的小分子化合物或者进一步浓缩。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于所述方法进一步包括(d)将透析后的纳米粒经过脱水步骤制备成药物制剂。
27.根据权利要求沈所述的方法，其特征在于所述的脱水步骤是冻干、减压蒸馏或喷雾干燥。
28.一种制备用于体内递送紫杉醇蛋白纳米粒的方法，包括以下步骤(a)在55 75°C，pH6 8的条件下，用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液；(b)在变性剂或者适合的变性条件下，将紫杉醇加入到步骤(a)所述的蛋白溶液中， 使蛋白展开与再折叠或自组装，将紫杉醇包裹在所述蛋白中；(c)将纳米粒透析除去多余的小分子化合物或者进一步浓缩；(d)将透析后的纳米粒经过脱水步骤制备成药物制剂；所述的纳米粒子直径为50 nm 300 nm,所述蛋白纳米粒含有1% 40%重量比的紫 杉醇；所述的变性剂或者适合的变性条件是水、氯化钠、磷酸盐、醋酸盐、甘氨酸、三羟甲基氨 基甲烷、过氧化氢、谷胱甘肽、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、福尔马林、氯仿、丙酮、硫化氢、2-巯 基乙醇、二硫苏糖醇、盐酸胍、尿素、高氯酸、三丁基膦、甲巯丙脯氨酸、过甲酸、青霉胺、谷胱 甘肽、甲硫咪唑、乙酰半胱氨酸、或它们的组合；所述的蛋白是白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、血管内皮抑素、血红蛋白、肌球蛋白、溶菌酶、 免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤连蛋白、核纤层蛋白、胶原蛋白、明胶、人造蛋白、或它们的 组合。
29.一种制备用于体内递送多西紫杉醇蛋白纳米粒的方法，所述方法包括下面步骤(a)在55 75°C，pH6 8的条件下，用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液；(b)在变性剂或者适合的变性条件下，将多西紫杉醇加入到步骤(a)所述的蛋白溶液 中，使蛋白展开与再折叠或自组装，将多西紫杉醇包裹在所述蛋白中；(c)将纳米粒透析除去多余的小分子化合物或者进一步浓缩；(d)将透析后的纳米粒经过脱水步骤制备成药物制剂；所述的纳米粒子直径为50 nm 300 nm，所述蛋白纳米粒含有1% 40%重量比的多西 紫杉醇；所述的变性剂或者适合的变性条件是水、氯化钠、磷酸盐、醋酸盐、甘氨酸、三羟甲基氨 基甲烷、过氧化氢、谷胱甘肽、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、福尔马林、氯仿、丙酮、硫化氢、2-巯 基乙醇、二硫苏糖醇、盐酸胍、尿素、高氯酸、三丁基膦、甲巯丙脯氨酸、过甲酸、青霉胺、谷胱 甘肽、甲硫咪唑、乙酰半胱氨酸、或它们的组合；所述的蛋白是白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、血管内皮抑素、血红蛋白、肌球蛋白、溶菌酶、 免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤连蛋白、核纤层蛋白、胶原蛋白、明胶、人造蛋白、或它们的 组合。
30.一种包含有药理活性物质的蛋白纳米粒，用于体内药物递送；其特征在于所述的 纳米粒的制备步骤通过以下方法(a)在-20 100°C，pH3 9的条件下，用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液；(b)在变性剂或者适合的变性条件下，将药理活性物质加入到步骤(a)所述的蛋白 溶液中，使蛋白展开与再折叠或自组装，将药物包裹在所述蛋白中；所述的纳米粒子直径为5 nm 2000 nm,所述蛋白纳米粒含有1% 40%重量比的疏水性药理活性物质；所述的药理活性物质是紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、卡莫司汀、阿霉素、苯芥胆甾 醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、藤黄酸、冬凌草甲素、鬼白毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、 非诺贝特、硝苯地平、布洛芬、喷哚美辛、吡罗昔康、格列本脲、地西泮、利哌利酮、齐拉西酮、 他克莫司、雷帕霉素、茚地那韦、利托那韦、Telaprevir、洛匹那韦、或它们的组合；所述的蛋白是白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、血管内皮抑素、血红蛋白、肌球蛋白、溶菌酶、 免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤连蛋白、核纤层蛋白、胶原蛋白、明胶、人造蛋白、或它们的 组合；所述的第一种溶剂是水、氯化钠、磷酸盐、醋酸盐、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、过氧化 氢、谷胱甘肽、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、蔗糖、乙酰色氨酸、辛酸钠、或它们的组合；所述的变性剂或者适合的变性条件是水、氯化钠、磷酸盐、醋酸盐、甘氨酸、三羟甲基氨 基甲烷、过氧化氢、谷胱甘肽、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、福尔马林、氯仿、丙酮、硫化氢、2-巯 基乙醇、二硫苏糖醇、盐酸胍、尿素、高氯酸、三丁基膦、甲巯丙脯氨酸、过甲酸、青霉胺、谷胱 甘肽、甲硫咪唑、乙酰半胱氨酸、或它们的组合。
31.一种包含有紫杉醇的蛋白纳米粒，用于体内药物递送；其特征在于所述的纳米粒 的制备步骤通过以下方法(a)在55 75°C，pH6 8的条件下，用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液；(b)在变性剂或者适合的变性条件下，将紫杉醇加入到步骤(a)所述的蛋白溶液中， 使蛋白展开与再折叠或自组装，将紫杉醇包裹在所述蛋白中；(c)将纳米粒透析除去多余的小分子化合物或者进一步浓缩；(d)将透析后的纳米粒经过脱水步骤制备成药物制剂；所述的纳米粒子直径为50 nm 300 nm,所述蛋白纳米粒含有1% 40%重量比的紫 杉醇；所述的变性剂或者适合的变性条件是水、氯化钠、磷酸盐、醋酸盐、甘氨酸、三羟甲基氨 基甲烷、过氧化氢、谷胱甘肽、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、福尔马林、氯仿、丙酮、硫化氢、2-巯 基乙醇、二硫苏糖醇、盐酸胍、尿素、高氯酸、三丁基膦、甲巯丙脯氨酸、过甲酸、青霉胺、谷胱 甘肽、甲硫咪唑、乙酰半胱氨酸、或它们的组合；所述的蛋白是白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、血管内皮抑素、血红蛋白、肌球蛋白、溶菌酶、 免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤连蛋白、核纤层蛋白、胶原蛋白、明胶、人造蛋白、或它们的 组合。
32.一种包含有多西紫杉醇的蛋白纳米粒，用于体内药物递送；其特征在于所述的纳 米粒的制备步骤通过以下方法(a) 在55 75°C，pH6 8的条件下，用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液；(b)在变性剂或者适合的变性条件下，将多西紫杉醇加入到步骤(a)所述的蛋白溶液 中，使蛋白展开与再折叠或自组装，将多西紫杉醇包裹在所述蛋白中；(c)将纳米粒透析除去多余的小分子化合物或者进一步浓缩；(d)将透析后的纳米粒经过脱水步骤制备成药物制剂；其中所述的纳米粒子直径为50 nm 300 nm,所述蛋白纳米粒含有1% 40%重量比 的多西紫杉醇；所述的变性剂或者适合的变性条件是水、氯化钠、磷酸盐、醋酸盐、甘氨酸、三羟甲基氨 基甲烷、过氧化氢、谷胱甘肽、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、福尔马林、氯仿、丙酮、硫化氢、2-巯 基乙醇、二硫苏糖醇、盐酸胍、尿素、高氯酸、三丁基膦、甲巯丙脯氨酸、过甲酸、青霉胺、谷胱 甘肽、甲硫咪唑、乙酰半胱氨酸、或它们的组合；所述的蛋白是白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、血管内皮抑素、血红蛋白、肌球蛋白、溶菌酶、 免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤连蛋白、核纤层蛋白、胶原蛋白、明胶、人造蛋白、或它们的 组合。
全文摘要
本发明一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法，属于药理活性物质的体内递送及其临床应用领域。本发明利用蛋白及多肽展开与再折叠或自组装的方法，将药理活性物质包入蛋白纳米粒，用于体内递送。
文档编号A61K31/337GK102048695SQ20101024788
公开日2011年5月11日 申请日期2010年8月9日 优先权日2009年8月11日
发明者丁大伟, 吴锦慧, 汤晓雷, 胡一桥, 袁阿虎 申请人:南京大学