一种仔猪副伤寒活疫苗的生产方法

专利名称：一种仔猪副伤寒活疫苗的生产方法
一种仔猪副伤寒活疫苗的生产方法
背景技术：
i^Wli^M (Paratyphus swine) X^W^^^M'^ (Swine salmonellosis), ± 要是由猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)引起的一种仔猪高热传染病，目前主 要通过接种疫苗进行预防。仔猪副伤寒主要是由猪霍乱沙门氏菌引起幼猪和架子猪的败血症和肠炎，对成年 猪多呈隐性带菌或为猪瘟的继发感染菌，间或引起人类的食物中毒以及侵害其他动物。我国应用的仔猪副伤寒活疫苗CVCC500株(原C500株)(房晓文，李阳陇，黄昌 炳，郑明，冯文达，孙伟等.仔猪副伤寒弱毒菌苗的研究，畜牧兽医学报，1979)，对仔猪有坚 强免疫力，毒力稳定、安全，在猪沙门氏菌病防控中发挥了重要作用。但仍存在以下突出问 题1.疫苗采用普通肉汤作为培养基，该培养基主要成分牛肉浸液的质量受牛肉的种类、 年龄、新鲜及消化程度影响大，造成批次间不稳定。2.疫苗采用1.5%明胶、5%蔗糖为保护 剂，组方简单，冻干存活率低，保护功能较差(尤其在较高温度下)。目前国内14个生产仔 猪副伤寒活疫苗的兽用生物制品企业，冻干存活率一般为50% 60%，需要-15°C以下保 存。存活率低使疫苗中含有大量死亡菌体，死亡菌体崩解产生的内毒素，是产生过敏反应的 因素之一，另外低温保存给边远地区储运和使用带来困难。据报道，每年0. 07% 0. 的 猪接种后出现呕吐、痉挛、全身发疳、死亡等症状。本发明的目的是研究一种合成培养基、耐热保护剂及其相配套的冻干曲线，制备 一种冻干菌存率高，能在2 8°C长期保存的仔猪副伤寒活疫苗。

发明内容
本发明的技术方案是将种子液按培养基总量的 2%接种于液体培养基中， 37°C发酵或通气培养18 21h，培养过程中根据需要加入适量消泡剂，并根据pH升高情况 加入适量灭菌40%葡萄糖以控制pH值。培养结束后立即加入经过灭菌并预热至37°C的冻 干保护剂，充分混勻后按规定头份分装。分装过程中应注意保温振摇均勻，每头份活菌数不 少于 3X109CFU。1生产菌株(1)菌株来源猪霍乱沙门氏菌CVCC79500株(即原C500株)，由中国兽医药品监察所鉴定、保 管和供应。其原始菌种系猪霍乱沙门氏菌CVCC79101株(来自苏联兽药监察所，编号为 133/8。特性该菌种肉肝胃培养物50X IO4CFU活菌致死小鼠，5000X IO4CFU活菌致死海猪， 1.5X IO8CFU活菌静脉注射致死仔猪。血清型6，7:C:1，5。)经0. 05% 1 %醋酸铊的普 通肉汤传500代，每间隔50代逐步提高醋酸铊浓度，人工致弱而来。(2)菌株特性1)毒力用体重18 22g(30 35日龄)小白鼠皮下注射1 X IO8CFU活菌 (0. 2ml)，90%以上存活；豚鼠(350 400g)皮下注射15 X IO8CFU活菌，90%以上存活；家 兔(体重1.5 2. Okg)皮下注射100 X IO8CFU活菌(1ml)，100%存活；仔猪(体重15kg以
3上)静脉注射30X IO8CFU活菌(Iml)，100%存活。2)菌株稳定性在普通琼脂上连传20代，或在仔猪连通过3代，毒力不返强。3)免疫原性以25X IO8CFU活菌免疫家兔(体重1. 5kg)，一个月后攻击2 4MLD(最小致死剂量)强毒菌，保护80%以上；以25 X IO8CFU活菌免疫仔猪(体重12kg)， 静脉注射致死剂量强毒，保护60%以上(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生 物制品规程二〇〇〇版.化学工艺出版社，2000，以下称《规程》)。2.疫苗制造及半成品检验(1)生产用种子制备将猪霍乱沙门氏菌(CVCC79500株)冻干菌种用普通肉汤稀释后，接种普通琼脂平 板，37°C培养18 20h，选取中等大小的典型菌落(菌落为圆形、边缘整齐、突起、半透明、略 湿润的光滑型)5 10个，混合接种于普通琼脂斜面3 5支，37°C培养24h，经纯粹检查合 格后作为一级种子。在2 8°C保存，应不超过2个月。取一级种子按2%接种普通肉汤， 37°C培养24h，纯粹检查合格后，作为种子液。(2)培养基本发明所采用的培养基是普通肉汤培养基(中国兽药典委员会.中华人民共和国 兽药典二〇〇五版三部.北京中国农业出版社，2006年，以下称《中国兽药典》)或/和合
成培养基。本发明所述的合成培养基配方及配制方法如下胰酪蛋白胨 2%，酵母浸出粉3% 4 %，氯化钠0.05%，磷酸二氢钾 0. 0077%，磷酸氢二钠0. 0867%，注射用水；按配方依次称取培养基成分加入到注射用水中，充分溶解后用2mol/L的氢氧化 钠溶液调节PH值为7. 2 7. 4，116°C灭菌30min，临用时，无菌操作加入终浓度的50% 葡萄糖溶液，混勻。(3)保护剂的配制1)保护剂的配方水溶性明胶10g，聚乙烯吡咯烷酮(PVP) Ig,山梨醇50g，蔗糖50g，199培养基5g， L-谷氨酸钠5g，磷酸氢二钾1. 25g，磷酸二氢钾0. 52g，注射用水1000ml。2)配制方法溶液1 在洁净烧杯中，加入注射用水(100°C )适量，按配方依次称取水溶性明 胶、PVP、山梨醇，加入烧杯中，边加入边用玻璃棒搅拌，使其完全溶解，再用注射用水定容至 500ml，经 116°C 灭菌 30min。溶液2 按配方依次称取蔗糖、199培养基、L-谷氨酸钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾 于烧杯中，加入注射用水使其充分溶解后，定容至500ml，0. 22 μ m滤膜的除菌滤器过滤除 菌。3)配苗前，在无菌条件下，将溶液1和溶液2等体积混勻，即成。(3)制苗用菌液制备将猪霍乱沙门氏菌(CVCC79500株)种子液按培养基总量的 2%接种于液体 培养基(普通肉汤培养基或本发明提供的液体合成培养基)中，37°C发酵或通气培养18 21h，培养过程中根据需要加入适量消泡剂，并根据pH升高情况加入适量灭菌40%葡萄糖
4以控制PH值。培养结束后，3500r/min离心20min，去上清，菌泥立即加入经过灭菌处理并 预热至37°C的耐热保护剂悬浮，充分混勻后按规定头份分装。分装过程中应注意保温振摇 均勻。冻干分装后迅速进行冷冻真空干燥，按《中国兽药典》规定的方法、使用本发明提 供的冻干曲线2(见图2)进行。(4)半成品检验纯粹检验取菌液用普通琼脂平板，按《中国兽药典》规定的方法进行，应纯粹。活菌计数取样用普通琼脂平板培养计活菌数，按《中国兽药典》规定的方法进行， 作为计算冻干活菌率的基数及配苗时参考。冻干后检验纯粹检验按《中国兽药典》规定的方法进行，应纯粹。头份、活菌率的计算用普通琼脂平板培养计活菌数，按附录《中国兽药典》规定的 方法进行。以3瓶中最低菌数计算核定该批疫苗每瓶的使用头份，同时按附注方法计算冻 干后的活菌率，以确定使用方法。活菌率在50%以上的疫苗，可用于注射或口服；低于50% 的疫苗，仅限于口服。3成品检验性状白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。纯粹检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验，应纯粹。活菌计数按瓶签注明头份，用普通琼脂平板做活菌计数(按《中国兽药典》规定的 方法进行)，每头份含活菌数应不少于3X 109CFU。安全检验按瓶签注明头份，将疫苗用普通肉汤或蛋白胨水稀释，皮下注射体重 1.5 2. Okg兔2只，各1.0ml(含2头份)，观察21日，应存活。剩余水分测定按《中国兽药典》规定的方法进行测定，应不超过4. 0%。真空度测定按《中国兽药典》规定的方法进行测定。贮藏与有效期2 8°C保存，有效期至少为18个月。本发明的优点本发明涉及一种仔猪副伤寒活疫苗的生产方法。在本发明提供的生产方法中采用 了合成培养基和耐热冻干保护剂及其相适应的冻干曲线一整套技术，提高猪霍乱沙门氏菌 CVCC79500株培养菌数，保证批次间稳定性，减少冻干过程的损失率，降低菌体死亡和代谢 副产物产生的过敏反应，将成品疫苗的保存温度提高到2 8°C，有效期达到18 24个月， 并可实现较高温度短期保存(37°C保存7日，活菌减少率低于20% )。


图1 冻干曲线1示意图。-35°C进箱；_40°C维持约4h ；产品由_40°C升至-10°C， 维持IOh ；板层温度提高到28°C，维持8h。全程约28h。图2 冻干曲线示意图。2 :0 5°C进箱；以每minl°C降至_40°C或以下，维持约4h ； 板层控制-10°c，维持14 16h ；每间隔2h升温10°C，在28°C维持6h出箱。全程约28h。本发明所使用的冻融菌存率、冻干菌存率及活菌减少率计算方法冻融菌存率(％) = 化冻后每头份(或每ml)活菌数/预冻前每头份(或每ml)活菌数*100%
冻干菌存率(％) =冻干后每头份(或每ml)活菌数/冻干前每头份(或每ml)活菌数*100%
活菌减少率(%) =耐老化试验前每头份(或每ml)活菌数一耐老化试验后每头份(或每ml)活菌数/耐老化试验前每头份(或每ml)活菌数*l00%实施例1将猪霍乱沙门氏菌(CVCC79500株)种子液按培养基总量的 2%接种于本发 明所提供的合成培养基(液体培养基)中，37°C发酵或通气培养18 21h，培养过程中根 据需要加入适量消泡剂，并根据PH升高情况加入适量灭菌的40%葡萄糖以控制pH值。培 养结束后，3500r/min离心20min，去上清，菌泥立即加入经过灭菌并预热至37°C的本发明 提供的耐热冻干保护剂，充分混勻后按规定头份分装。分装过程中应注意保温振摇均勻，并 迅速进行冷冻真空干燥，按《中国兽药典》规定的方法、使用本发明提供的冻干曲线2(见图 2)进行，每头份含活菌数应不少于3X109CFU。实施例2将猪霍乱沙门氏菌(CVCC79500株)种子液按培养基总量的 2%接种于普通 肉汤培养基(《中国兽药典》记载的配方)中，37°C发酵或通气培养18 21h，培养过程中 根据需要加入适量消泡剂，并根据PH升高情况加入适量灭菌40%葡萄糖以控制pH值。培 养结束后，3500r/min离心20min，去上清，菌泥立即加入经过灭菌并预热至37°C的耐热保 护剂，充分混勻后按规定头份分装。分装过程中应注意保温振摇均勻，并迅速进行冷冻真空 干燥，按《中国兽药典》规定的方法、使用本发明提供的冻干曲线2(见图2)进行，每头份含 活菌数应不少于3X 109CFU。实施例3成品检验性状白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。纯粹检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验，应纯粹。活菌计数按瓶签注明头份，用普通琼脂平板做活菌计数(按《中国兽药典》规定的 方法进行)，每头份含活菌数应不少于3X 109CFU。安全检验按瓶签注明头份，将疫苗用普通肉汤或蛋白胨水稀释，皮下注射体重 1.5 2. Okg兔2只，各1.0ml(含2头份)，观察21日，应存活。剩余水分测定按《中国兽药典》规定的方法进行测定，应不超过4. 0%。真空度测定按《中国兽药典》规定的方法进行测定。贮藏与有效期2 8°C保存，有效期至少为18个月。实施例4耐热保护剂配方及冻干曲线的筛选通过10种保护剂基质的“冻融”试验和“冻干”试验，初步明确了各种保护剂基质 的适用浓度，谷氨酸钠(0.5%、2%)、蔗糖(5%、7.5%)冻融试验菌存率最高；1.5%明胶5%蔗糖保护剂中加入0.5% 199培养基或0.5%谷氨酸钠可明显提高冻干菌存率(均达 71%) ；1.5%明胶+5%蔗糖+5%山梨醇可使冻干菌存率达75%。1. 5%明胶、5%蔗糖中添 加0. 5% 2%谷氨酸钠均有明显提高菌体耐老化作用，使疫苗37°C保存7日的活菌减少率 分别为46 %、47 %和43 %、48 %，而明胶蔗糖对照为65 %。据此设计了 4种耐热保护剂配方 1、2、3和4，与猪霍乱沙门氏菌菌液等量混合，分别用冻干曲线1、2进行冻干，结果表明耐热 保护剂配方1及冻干曲线2冻干效果最好。为了提高目前我国仔猪副伤寒活疫苗的菌存率，并方便疫苗的保存及运输，我们 进行了该疫苗耐热保护剂研究，现将结果报告如下。1 材料1. 1猪霍乱沙门氏菌(CVCC79500株)(2006. 8. 29冻干，0. 3ml/支)，由中国兽医药 品监察所提供。1. 2仔猪副伤寒合成培养基(批号0102)由本发明人提供及配制。1. 3保护剂基质水溶性明胶(批号115K0144)购自Sigma公司；PVP购自BASF公司；199培养基 (批号282288)购自GIBCO公司；甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、谷氨酸钠、磷酸二氢钾、磷 酸氢二钾均为分析纯，进口分装，购自北京拜尔迪生物公司。1. 4 冻干机，Edwards 公司，Lyofle X 2. 0。2 方法2. 1猪霍乱沙门氏菌制苗用菌液制备种子液按《规程》进行制备。将种子液按2%接种250ml合成培养基三角瓶6个， 置37°C、200r/min振荡培养12h，菌液经3500r/min离心20min，收集所有的沉淀菌体，用 200ml灭菌pH 7. 2磷酸钾缓冲液(附录1)悬浮，充分混勻后，作为制苗用菌液。2. 2冻融试验2. 2. 1保护剂配制2. 2. 1. 1大分子保护剂配制称取明胶6g及PVP12g，分别用注射用水定容至100ml，配制成6%明胶及12% PVP 贮液，2MNa0H调整pH值至7. 2，116°C灭菌30min。然后各取5ml用等量灭菌pH7. 2磷酸钾 缓冲液稀释成3%明胶及6% PVP。2. 2. 1. 2小分子保护剂配制称取甘露醇10g、山梨醇10g、蔗糖15g、海藻糖15g、谷氨酸钠15g和199培养基 2g，分别用pH 7. 2磷酸钾缓冲液(磷酸氢二钾1. 25g、磷酸二氢钾0. 52g溶解于IOOOml注 射用水中，116°C灭菌30min，pH值为7. 2)定容至100ml，0. 22 μ m滤膜过滤除菌。然后按上 法用灭菌PH 7. 2磷酸钾缓冲液稀释成使用浓度。2. 2. 2 冻融分别取2. 1项制备的菌液Iml与22种单基质保护剂等量混合后(保护剂终浓度 如表1所示)，先置2 8°C 20min，后置_40°C冷冻保存4h。同时设不含保护剂基质的磷 酸钾缓冲液作对照。将各冻存菌液融化后，连同冻融前及对照样品按《中国兽药典》进行活 菌计数，并计算冻干菌存率。2. 3冻干试验
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2. 3. 1保护剂配制按2. 2. 1项进行。2. 3. 2冻干分别取2. 1项制备的菌液IOml与14种保护剂等量混合后(保护剂终 浓度如表2所示)，定量分装(2ml/瓶)，按《中国兽药典》附录进行冻干。同时设1. 5%明 胶5%蔗糖作对照。分别取冻干前、后以及冻干后置37°C保存7日样品进行活菌计数。2. 4耐热保护剂配方及冻干曲线优化2. 4. 1保护剂配制依据冻融和冻干试验结果，将能够提高冻干菌存率及疫苗耐老 化性能的保护剂基质，设计成4组耐热保护剂(分别标记为配方1、2、3和4)，其配方及配制 方法见附录3。2. 4. 2冻干分别取2. 1项制备的菌液50ml与4组保护剂等量混合后，定量分装 (2ml/瓶)，按冻干曲线1及冻干曲线2进行冻干。分别取冻干前、后以及冻干后置37°C保 存7日样品进行活菌计数。通过比较结果选择最佳耐热保护剂和冻干曲线。2.结果2. 1冻融试验冻融试验结果见表1。表1冻融试验中活菌计数及菌存率结果 注冻融菌存率计算方法按本发明提供的计算方法计算(下同)。表1结果显示，在10种单基质中，谷氨酸钠(0. 5%、2% )、蔗糖(5%、7. 5% )菌 存率最高，可达60%以上；海藻糖(5% )、甘露醇(5% )、明胶(1.5%、3% )、199培养基 (0. 5% )次之，菌存率达50% 60%。
2. 2冻干试验样品冻干前后及耐老化试验检测结果见表2。表2样品冻干前后及耐老化试验检测结果 注冻干后样品及耐老化试验样品用生理盐水恢复至原量后进行检测，其冻干菌 存率及活菌减少率按本发明提供的计算方法计算(下同)。表2结果显示，1. 5%明胶5%蔗糖保护剂中加入0. 5% 199培养基或0. 5%谷氨酸 钠可明显提高冻干菌存率(均达71%) ；1.5%明胶+5%蔗糖+5%山梨醇可使冻干菌存率 达75 %。1. 5 %明胶、5 %蔗糖中添加0. 5 %、2 %谷氨酸钠均有明显提高菌体耐老化作用，使 疫苗37°C保存7日的活菌减少率分别为43%、48%。另外PVP (0. 1%)、199培养基(0.5%) 也有一定提高菌存率及耐老化作用。2. 3耐热保护剂及冻干曲线优化不同保护剂配方及冻干曲线的冻干结果见表3。表3不同保护剂配方及冻干曲线的冻干结果(活菌数108CFU/ml) 表3结果显示，采用耐热保护剂配方1与冻干曲线2冻干猪霍乱沙门氏菌 (CVCC79500株)效果最好，冻干后不结晶，冻干菌存率达86. 9% ；37°C保存7日不萎缩，活 菌减少率为15.0%。明显优于明胶蔗糖对照(其冻干菌存率为63.0%与55. ；37°C保 存7日后活菌减少率为71. 7%与68. 8% )。3小结与讨论3. 1采用耐热保护剂配方1与冻干曲线2冻干猪霍乱沙门氏菌(CVCC79500株)效
果良好。3. 2某些单保护剂基质(如0. 5%和2%谷氨酸钠、5%和7. 5%蔗糖、5%海藻糖、 5%甘露醇、1. 5%和3%明胶、0. 5% 199培养基)可以提高猪霍乱沙门氏菌(CVCC79500 株)在“冻结-解冻”的活性恢复率，可能是由于它们含有的糖醇羟基、或某些氨基酸成 分和菌膜表面的氨基基团发生类似水合反应，形成范德华表面张力，减少了冰晶对菌体 损伤° Scott (Scott, W. J. , In Recent Resear in Freezing and Drying. 1960,188 202. ) > Cho and Obayashi(Cho, CandObayashi, Y. , Bulletion of the World Health Orgination. 1956，14 :657.)曾报导使用谷氨酸钠，在冷冻干燥过程中对病毒囊膜起到同 样作用。3. 3在明胶大分子中添加少量PVP，可以更好的发挥保护剂与填充剂作用，因为 PVP可以抑制冻干过程中系统PH值降低(华泽钊.冷冻干燥新技术.北京科学出版社， 2006. 1.)。3. 4该耐热保护剂中大分子物质主要形成耐热框架，形成间接的隔热层；小分子 物质主要与菌体形成悬液，起直接作用。实施例5冻干保护剂使用方法
用耐热保护剂将离心后菌体重悬浮成不同菌液浓度进行配苗，结果，菌液浓度 100. 3X IO8 312X108CFU/ml，冻干菌存率达75. 7% 89. 8%，37°C保存7日后活菌减少 率为13% 18%，优于其它浓度范围。耐热保护剂与菌液感作时间试验表明，2 8°C作 用24h，冻干菌存率达85. 3% 93. 1%，高于其它作用时间。7ml西林瓶疫苗分装量3ml或 4ml，其冻干菌存率与2ml基本一致，而且耐老化试验中活菌减少率比2ml下降3 8个百 分点。为了明确耐热保护剂在使用中相关参数，进行了配苗比例、保护剂感作时间以及 苗液分装量比较试验。现将结果报告如下。1 材料1. 1猪霍乱沙门氏菌(CVCC79500株)，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。1.2普通琼脂(批号20090102)、普通肉汤培养基(批号20090102)、20%铝胶生 理盐水(批号20090102)，由中国兽医药品监察所培养基组供应。1. 3仔猪副伤寒合成培养基、仔猪副伤寒耐热保护剂，由本发明人配制。1. 4 冻干机，Edwards 公司，Lyofle X 2. 0。2 方法2. 1猪霍乱沙门氏菌制苗用菌液制备种子液按《中华人民共和国兽用生物制品规程(2000版)》(以下简称《规程》[1]) 进行制备。将种子液按2%接种250ml合成培养基三角瓶6个，置37°C、200r/min振荡培养 12h，菌液经3500r/min离心20min，收集所有的沉淀菌体，用200ml灭菌磷酸钾缓冲液(称 取磷酸氢二钾1. 25g、磷酸二氢钾0. 52g溶解于IOOOml注射用水中，116°C灭菌30min，pH值 为7. 2)悬浮，充分混勻后，作为制苗用菌液。2. 2耐热保护剂的配苗试验用适量预热至37°C的耐热保护剂悬浮制苗用菌液成3组不同浓度第1组菌液浓 度约 700 X IO8 900X 108CFU/ml ；第 2 组菌液浓度约 300 X IO8 400 X 108CFU/ml ；第 3 组 菌液浓度约100 X IO8 200 X 108CFU/ml。然后定量分装(2ml/瓶)，每组70瓶，按冻干曲 线2进行冻干。分别取冻干前、后，以及冻干后置37°C保存7日样品进行活菌计数。试验共 进行3次。2. 3耐热保护剂与菌体感作时间的试验用耐热保护剂将沉淀将制苗用菌液悬浮成200 X IO8 300X 108CFU/ml，置2 8°C感作0、24、48h，然后定量分装(2ml/瓶)，每组70瓶，按冻干曲线2进行冻干。分别取 冻干前、后以及冻干后置37°C保存7日样品进行活菌计数。试验共进行3次。2. 4耐热保护剂活疫苗分装量的比较试验将2. 3项3次试验半成品，分别以2ml、3ml、4ml量分装，各分装70瓶，按冻干曲线 2进行冻干。分别取冻干前、后以及冻干后置37°C保存7日样品进行活菌计数。3 结果3. 1耐热保护剂配苗比例试验不同菌液浓度冻干比较结果见表4表4不同菌液浓度冻干比较结果 表4结果显示，菌液浓度在100 X IO8 300 X 108CFU/ml，冻干菌存率高，而37°C保 存7日耐老化结果基本一致。因《规程》要求每头份不少于3X109CFU/ml，考虑到疫苗的头 份数，因而适宜菌液浓度为200 X IO8 400 X 108CFU/ml。3. 2耐热保护剂与菌体感作时间试验结果见表5。表5保护剂与菌液感作时间比较试验 表5结果显示，保护剂与菌液在2 8°C感作24h，冻干菌存率高于其它时间；而 37°C保存7日耐老化试验结果基本一致。3.3耐热保护剂活疫苗分装量比较试验结果见表6。表6疫苗分装量比较试验 表6结果显示，7ml西林瓶疫苗装量3ml或4ml，其冻干菌存率与2ml基本一致，且 置37°C保存7日的活菌减少率相对降低3 8个百分点。4结论与讨论4. 1配苗比例是影响耐热保护剂作用的重要因素，菌液浓度高，保护剂分子有效保 护菌体的资源相对不足。通过比较试验，确定适宜配苗浓度为200X IO8 400X 108CFU/ml。4. 2适当延长耐热保护剂与菌液混合作用时间，有利于保护剂分子充分渗入菌体 内，提高菌体的抗冻能力。但若细菌暴露在空气中的时间过长，某些菌体体内产生的过氧化 氢蓄积对菌体有毒害作用，造成死亡。耐热保护剂与菌体感作时间结果表明，当菌体与保护 剂2 8°C作用24h，其冻干菌存率最高，为85. 3% 93. 1 %，而耐老化试验结果基本一致 (活菌减少率达10% 20% )。4. 3充分利用西林瓶的空间，提高疫苗分装量，是降低成本，提高疫苗头份数的重 要手段，研究结果发现，在7ml西林瓶中分装量达3 4ml，其冻干菌存率与2ml分装量基本 一致，而其耐老化结果中活菌减少率相对降低3 8个百分点，主要由于瓶中菌液的高度增 加，冻干过程中延长了冷冻时间、升华时间以及解析干燥时间。实施例6耐热保护剂的应用试验采用筛选出耐热保护剂1及冻干曲线2试制仔猪副伤寒耐热保护剂活疫苗 (CVCC79500株)3批。冻干后疫苗不结晶，37°C保存7日不萎缩，其纯粹、活菌计数、安全性、 剩余水分和真空度均符合规定。冻干前活菌计数分别为5. 2X IO9CFU/头份、6. 2X IO9CFU/ 头份和5. 6X IO9CFU/头份；冻干后活菌计数分别为4. 52X IO9CFU/头份、5. 22X IO9CFU/头 份和4. 76 X IO9CFU/头份，冻干菌存率分别为87%、84%和85% ；置37°C保存7日，活菌计 数分别为3. 84 X IO9CFU/头份、4. 36 X IO9CFU/头份和4. OOX IO9CFU/头份，活菌减少率分别 为15%、16.3%和15.9%，用37°C保存7日的耐热保护剂活疫苗免疫兔，30日后攻毒均可 保护4/5 5/5，对照5/5死亡。运用优化的耐热保护剂和冻干曲线试生产3批仔猪副伤寒耐热保护剂活疫苗 (CVCC79500株)，参照《规程》进行检验，现将试验结果报告如下。1 材料1. 1仔猪副伤寒合成培养基及耐热保护剂，本发明人配制及提供。
1.2 菌种生产用菌种为猪霍乱沙门氏菌(CVCC79500株)；检验用菌种为猪霍乱沙门氏菌 (CVCC79102株)，均由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。1.3培养基普通琼脂(批号0102)、普通肉汤培养基(批号0102)、20%铝胶生理盐水(批 号0102)、纯粹检验用硫乙醇酸盐培养基(T.G)、酪胨琼脂(G.A)和葡萄糖蛋白胨汤(G.P) (批号0102)，由中国兽医药品监察所培养基组供应。1.4 动物小鼠ICR系，30 35日龄、体重18 22g，清洁级；大耳白兔体重1. 5 2. 0kg， 普通级；由中国兽医药品监察所实验动物组采购并提供。1. 5 冻干机，Edwards 公司，Lyofle X 2. 0。1. 6 水分测定仪，METTLER TOLEDO。1. 7真空度测定仪，76-1型高频电火花真空度测定仪。2 方法2.1菌液制备及配苗种子液按《规程》[1]进行制备。将种子液按2%接种250ml合成培养基三角瓶6 个，置37°C、200转/分振荡培养12h，菌液经3500转/分离心20min，弃去培养液，菌体沉 淀换以250ml耐热保护剂悬浮混勻，取样进行半成品检验(活菌计数及纯粹检验)，悬浮菌 液置2 8°C保存24h。2. 2 冻干待半成品检验合格，定量分装(3ml/瓶)。按冻干曲线2进行冻干。试生产3批仔 猪副伤寒耐热保护剂活疫苗(CVCC79500株)。2. 3 检验2. 3. 1按《规程》进行性状、纯粹、活菌计数、安全性、剩余水分和真空度等检验。2. 3. 2耐老化试验将实验室制备的3批疫苗，每批随机抽取疫苗8瓶，其中3瓶分别进行活菌计数， 以其平均数作为耐老化试验前的活菌数标准。另5瓶置37°C保存7日，任取其中3瓶，分别 按上述方法进行活菌计数。然后计算疫苗的活菌减少率。2. 3. 3效力试验从37°C保存7日的3批疫苗中，每批随机抽取疫苗5瓶，按瓶签注明头份，注射组 用20%铝胶生理盐水混合稀释成1头份/ml ；灌服组用生理盐水混合稀释成1头份/2ml ； 大腿内侧肌肉注射和经口灌服体重1. 5 2. OKg家兔各5只，1头份/只，30日后，连同条 件相同的不接种对照兔5只，各皮下注射经肉肝胃(膜)消化汤培养2代的猪霍乱沙门氏 菌(CVCC79102株)菌液1. Oml (含3MLD的活菌)，观察30日，记录存活情况。3 结果3. 1菌液制备结果见表7。表7菌液制备及半成品检验结果
3.2疫苗检验结果见表8、表9、表10。
表8仔猪副伤寒耐热保护剂活疫苗检验结果(一) 表9仔猪副伤寒耐热保护剂活疫苗检验结果(二) 表8、9结果显示，3批仔猪副伤寒耐热保护剂活疫苗纯粹，性状、剩余水分、真空 度、安全检验符合《规程》要求。表10疫苗冻干前后活菌数及耐老化试验结果 表10结果显示，3批耐热活疫苗冻干菌存率达80%以上(分别为87%、84%及 85% ) ；37 保存7日，活菌减少率低于20% (分别为15%、16. 3%及15. 9% )。
3. 3效力试验结果见表11。表11 3批耐热保护剂疫苗家兔效力检验结果 表11中显示，3批耐热保护剂活疫苗37°C保存7日后，以1头份口服及肌肉注射 免疫家兔攻毒均可保护4/5 5/5，效力确实。4 结论耐热冻干保护剂1和冻干曲线2，适用于仔猪副伤寒耐热保护剂活疫苗 (CVCC79500株)的生产。实施例7耐热保护剂保存期试验将3批耐热保护剂置2 8°C保存0日、10日、20日、30日和40日，分别制备冻干 疫苗，测定其冻干菌存率及冻干后置37°C保存7日耐老化试验的活菌减少率。结果保存40 日的耐热保护剂制备的疫苗冻干菌存率为83. 7% 87. 5%，置37°C保存7日耐老化试验活 菌减少率为12.6% 17. 1%，与新鲜配制的保护剂(制备的疫苗冻干菌存率达82. 9% 87. 0%，37°C保存7日耐老化试验活菌减少率为15. 0% 16. 3% )结果基本一致。为确保 效果，耐热保护剂2 8°C有效期定为30日。1 材料1. 1耐热保护剂3批，批号分别为0101、0115、0210，由本发明人提供及配制。1. 2生产用菌种为猪霍乱沙门氏菌(CVCC79500株)由中国兽医药品监察所鉴定、
保管和供应。1. 3 冻干机，Edwards 公司 Lyofle X 2. 0。1.4普通琼脂(批号0102)、普通肉汤培养基(批号0102)由本发明人制备供应。2 方法2. 1耐热保护剂保存温度及时间将本发明人按本法制备的3批配制好耐热保护剂，批号分别为01、02、03，每批 1000ml，置2 8°C保存40日，并在0日、10日、20日、30日及40日等时间阶段分别取样 50ml。2. 2菌液制备、配苗及冻干
2. 2. 1种子液按《规程》方法进行制备。然后按2%接种500ml合成培养基三角瓶 6个(装量250ml/瓶)，37°C、200r/min振荡培养12h，菌液经3500r/min离心20min后，菌 体沉淀用200ml灭菌pH 7. 2磷酸钾缓冲液悬浮混勻，作为菌液。2. 2. 2将50ml耐热保护剂样品，各加入50ml抗原液，充分混匀后，定量分装(3ml/ 瓶)，按冻干曲线2进行冻干。2. 3活菌计数分别取冻干前、后以及冻干后置37°C保存7日样品进行活菌计数。3 结果3批耐热保护剂的保存期试验结果见表12。表12耐热保护剂的保存期试验结果 结果显示，3批耐热保护剂置2 8°C保存40日冻干菌存率为83. 7% 87. 5%， 置37°C保存7日活菌减少率为12. 6% 17. 1 %，与保存前的结果基本一致(冻干菌存率为 82. 9% 87% ；活菌减少率为15% 16. 3% )。4 结论因耐热保护剂置2 8°C保存40日与保存前的冻干菌存率、活菌减少率结果基本 一致。为确保效果，将耐热保护剂2 8 有效期定为30日。实施例8与同类产品的比较研究报告仔猪副伤寒耐热保护剂活疫苗(01、02和03)与常规仔猪副伤寒活疫苗(0205、 0306和0912)，进行冻干菌存率、37°C保存7日耐老化试验、安全和效力试验比较。结果 3批耐热保护剂活疫苗冻干菌存率分别为87 %、84 %和85 %，而常规疫苗为52 %、57 %和 60% ；37°C保存7日耐老化试验，耐热保护剂活疫苗活菌减少率为15%、16%和18%，而常 规疫苗为75%、67%和73%;安全试验中，常规疫苗1 2日内分别有1/5、2/5和1/5头出现体温升高、减食等过敏症状，然后自行恢复，耐热保护剂活疫苗均无不良反应，而口服免 疫两者均无不良反应；效力试验中，两者攻毒保护结果基本一致。1 材料1.1 疫苗仔猪副伤寒耐热保护剂活疫苗(CVCC79500株)，批号分别为01、02和03，均为15
头份/瓶，由北京海淀中海动物保健科技公司实验室制备。仔猪副伤寒活疫苗(以下简称“常规疫苗”)，批号分别为0205、0306和0912，均为 15头份/瓶，由吉林正业尘物制品有限公司提供。1. 2检验用猪霍乱沙门氏菌(CVCC79102株)，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和提供。1. 3仔猪30日龄、体重12kg以上、断乳，普通级，由中国兽医药品监察所实验动物 组采购和提供。2 方法2. 1冻干菌存率及耐老化试验分别按各自《规程》制备仔猪副伤寒常规疫苗3批(01、02和03)和仔猪副伤寒耐 热保护剂活疫苗3批(0205、0306和0912)。各取冻干前和后、37°C保存7日样品按现行《中 国兽药典》附录进行活菌计数。2. 2安全检验取耐热保护剂活疫苗和常规疫苗各3批，每批10瓶，按瓶签注明头份，其中5瓶用 生理盐水混合稀释至2头份/5. 0ml，灌服仔猪5头，每头5. 0ml，共30头；另5瓶用20%氢 氧化铝胶生理盐水混合稀释至2头份/ml，耳后浅层肌肉注射仔猪5头，每头1. 0ml，共30 头。同时设5头不免疫仔猪对照，隔离饲养，观察21日，记录仔猪的采食、饮水和体温情况。2. 3效力检验取耐热保护剂活疫苗和常规疫苗各3批，每批10瓶，按瓶签注明头份，其中5瓶用 生理盐水混合稀释至1头份/5. 0ml，灌服仔猪5头，每头5. 0ml，共30头；另5瓶用20%氢 氧化铝胶生理盐水混合稀释至1头份/ml，耳后浅层肌肉注射仔猪5头，每头1. 0ml，共30 头；同时设立5头不免疫仔猪对照。在免疫后30日，各静脉注射经肉肝胃(膜)消化汤培 养2代的猪霍乱沙门氏菌(CVCC79102株)菌液2. Oml (含IMLD活菌)。隔离饲养，观察21 日，记录仔猪的存活情况。3 结果3. 1冻干菌存率及耐老化试验结果见表13表13 3批实验室制品与常规疫苗的冻干菌存率及耐老化试验比较结果 *表中冻干后及耐老化试验样品用生理盐水恢复至原量后进行检测，冻干菌存率 及活菌减少率计算按本发明提供的方法进行。表13显示，耐热保护剂活疫苗的冻干菌存率为84% 87% ；常规疫苗为52% 60% ；37 保存7日，耐热保护剂活疫苗的活菌减少率为15% 18% ；常规疫苗为67% 75%。3. 2安全检验 表14显示，耐热保护剂活疫苗以2头份肌肉接种仔猪，其采食、饮水、体温均正常。
19 表15显示，3批耐热保护剂活疫苗与常规疫苗以1头份口服及肌肉注射免疫仔猪， 攻毒均可保护4/5 5/5，无显著差异。4 结论通过比较试验，发现耐热保护剂活疫苗与已有的仔猪副伤寒活疫苗相比，冻干菌 存率高(达84% 87% ) ；37°C保存7日的活菌减少率低(达15% 18% )；其过敏反应 低；两者效力检验结果一致。
而常规疫苗肌肉注射后1 2日部分猪出现体温升高、减食等过敏症状，但可自行恢复；口 服免疫猪，两者结果一致，均无不良反应。3. 3效力检验表15 3批耐热保护剂疫苗与常规疫苗的效力检验结果
护况 保情
观间} 毒时日 攻察<
攻毒途径弓剂量
观间} 疫时H 免察C
疫量 免剂
疫径 免途
猪数量 (头)
批号
权利要求
一种仔猪副伤寒活疫苗，其特征是该疫苗含有猪霍乱沙门氏菌CVCC79500株及水溶性明胶、PVP、山梨醇、蔗糖、199培养基、L 谷氨酸钠、磷酸氢二钾及磷酸二氢钾组成的耐热冻干保护剂。
2.一种仔猪副伤寒活疫苗的生产方法，其特征是将种子液按培养基总量的 2% 接种于普通肉汤或本发明提供的液体合成培养基中，37°C发酵或通气培养18 21h，培养 过程中根据需要加入适量消泡剂，并根据PH升高情况加入适量灭菌40%葡萄糖以控制pH 值；培养结束后，3500r/min离心20min，去上清，菌泥立即加入经过灭菌并预热至37°C的耐 热冻干保护剂，充分混勻，分装后经冷冻真空干燥而成，每头份活菌数不少于3X 109CFU。
3.按照权利要求1和2所述的仔猪副伤寒活疫苗及其生产方法，其特征是其中所使用 耐热冻干保护剂的最佳配方是水溶性明胶10g，PVP lg,山梨醇50g，蔗糖50g，199培养基 5g, L-谷氨酸钠5g，磷酸氢二钾1. 25g，磷酸二氢钾0. 52g，注射用水1000ml。
全文摘要
本发明涉及一种仔猪副伤寒活疫苗的生产方法。在本发明提供的生产方法中采用了合成培养基和耐热冻干保护剂及其相适应的冻干曲线一整套技术，提高猪霍乱沙门氏菌CVCC79500株培养菌数，保证批次间稳定性，减少冻干过程的损失率，降低菌体死亡和代谢副产物产生的过敏反应，将成品疫苗的保存温度提高到2～8℃，有效期达到18～24个月，并可实现较高温度短期保存(37℃保存7日，活菌减少率低于20％)。
文档编号A61K47/42GK101912608SQ20101025459
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者刘延亭, 孙晔, 朱良全, 王栋 申请人:北京海淀中海动物保健科技公司