专利名称：多糖蛋白片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及多糖蛋白片及其制备方法，特别涉及一种可使白细胞明显上升，肝功能好转，调节神经系统机能，提高人体免疫能力，用于白细胞减少症，传染性肝炎，神经衰弱等症的辅助治疗的多糖蛋白片。
背景技术：
自从真菌多糖抑制瘤活性被发现以后，真菌多糖引起越来越多的关注，成为一个非常活跃的研究领域。人们发现，真菌多糖具有复杂的生物活性和功能，其中，最主要的活性就是免疫调节活性，作为一种免疫调节剂真菌多糖已广泛应用于免疫性、缺陷性疾病，自身免疫病和肿瘤等疾病的临床治疗。菇类多糖蛋白是从菇类子实体中分离出一种抗肿瘤多糖，它的主链是 β - (1 — 3)-D-葡聚糖，主链上约有23%的葡萄糖残基，通过C6分支点连有侧链。后来研究证实，多糖蛋白是一种免疫激活剂，能激活巨噬细胞和淋巴细胞，提高巨噬细胞的趋化性和淋巴细胞对Yac-I细胞和Ρ-815细胞的毒性反应水平，拮抗BBN对小鼠的致癌作用。其次它是诱生α -干扰作用较明显，表现在能活化⑶4+淋巴细胞，促使⑶4+的增殖和IL-2R的表达。多糖蛋白复合物的特殊生物学活性有文献报道，糖蛋白等多糖蛋白复合物具有抗氧化和清除机体有害自由基的生物学活性，并且其在细胞识别、信号传导、免疫应答、细胞转化等许多生物学过程中也起着非常重要的作用。另外，考虑其活性可经免疫系统传递，特别是通过对免疫系统的特异性或非特异性功能的激发实现，因此，该多糖蛋白复合物将具有毒副作用低等特点。这对于研制出一种疗效高、基本无毒副作用的治疗或预防肝损伤疾病的特效药物，具有重要意义。蜈蚣提取物药理作用的研究进展祖国医学中，蜈蚣入药历史悠久，素来有调达肝经之功效。近年来，对蜈蚣及其提取物药理作用的研究亦日趋深入。已有研究表明，蜈蚣水提取物能显著降低大鼠血清中过氧化脂质及肝、脑组织中脂褐质含量，可使红细胞中超氧化物歧化酶和血中谷胱甘肽过氧化物酶活力明显升高。并且其能使免疫器官胸腺和脾脏重量明显增加，显著提升机体吞噬细胞吞噬活性，特别对吞噬细胞Fc受体有显著增强作用，从而发挥改善机体免疫功能的作用。(王玉芬、韩双红、曲树明等，蜈蚣抗衰老作用的研究，中国中药杂志，1994，19(11) 685)但是，经检索，迄今为止未有一种采用菇类多糖蛋白和蜈蚣多糖蛋白的片剂或胶囊剂等口服制剂被公开或使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于白细胞减少症，传染性肝炎，神经衰弱等症的辅助治疗的多糖蛋白片的配方及其制备方法。以及在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用， 在制备治疗或预防白血球减少症的药物中的应用，在制备治疗或预防轻中型黄疸型肝炎药物中的应用，以及在制备治疗或预防神经衰弱的药物中的应用。本发明采用的技术方案是所述的一种多糖蛋白片，其特征是该片剂由下述原料按重量百分比制成；白蘑菇浸膏10 15 ；灵芝多糖蛋白5 10;香菇多糖蛋白5 10;蜈蚣多糖蛋白复合物5 10 ；硫酸钙50 60;明胶 3 10;硬脂酸镁2 6;1)该片剂白蘑菇浸膏采用其每毫升的白蘑菇浸膏的多糖量以葡萄糖计是 3-15mg,含总氨基酸量是8-40mg，其中谷氨酸占3_20mg，天门冬氨酸占0. 8_5mg。所述的多糖蛋白片，含多糖量以葡萄糖计优选范围是3-10mg，含总氨基酸优选范围是8-40mg，含谷氨酸优选范围是3-20mg，含天门冬氨酸优选范围是0.8-5mg。所述的白蘑菇浸膏是从白蘑菇中提取出的含有多糖、总氨基酸，其中有谷氨酸、天门冬氨酸等有效成分的提取物，可以采用市售产品，如本实施例中采用澄海市金嘉生化有限公司出品的蘑菇浸膏，也可用其他的现有技术提取的白蘑菇浸膏，但每毫升白蘑菇浸膏的多糖量以葡萄糖计是3-15mg，含总氨基酸量是8-40mg，谷氨酸占3-20mg，天门冬氨酸占0. 8_5mg。白蘑菇浸膏制备方法取水洗过的蘑菇1公斤，0.4%柠檬酸，0.05%界面活性剂(蔗糖脂肪酸酯和失水山梨醇三油酸酯span85和失水山梨醇单月桂酸酯span20)以 2:1: 1的比例是混合，以80%的乙醇溶液浸渍，在室温下减压，使溶液容易浸透，15分钟后取出，置于均质器中。加入含有0. 植酸、01%维生素C、0. 3%偏磷酸钠的热溶液，一边添加一边均质，全部(5升)加完后，以温度不低于95°C加热10分钟，用4000转/分离心机进心分离，得抽出液5. 2升。沉淀物中加入5升含有0. 碳酸钠的0. 3%食盐水，在 30°C下抽提20分钟，分离后得抽出液4. 7升。经二次抽提后的残渣，使分散于1升pH4. 0 的柠檬酸缓冲液中，加入果胶酶(Macerozyme)〗克、蛋白分解酶YPSS5克，在40°C振荡(70 转/分)50分钟，充分反应后，离心分离，所得抽提液并入以上二次的抽提液，以高温瞬时浓缩器浓缩至2升，用活性碳和尼龙66 (100目)进行脱色后，再次浓缩，得浸膏200毫升。2)所述的蜈蚣多糖蛋白复合物可以是市售产品，也可以采用下述工艺制成所述的蜈蚣多糖蛋白复合物是从节肢动物蜈蚣全虫中提取、分离、纯化得到，其制备步骤为① 以少棘蜈蚣作为原料母体，清洗4次，烘干3小时，烘干温度控制在70°C ；②研磨第1步骤中干燥后的原料母体并过100目筛得蜈蚣粉；③将第2步骤中的蜈蚣粉用3倍体积蒸馏水抽提2小时，温度控制在82°C，纱布过滤得一份提取液，取残渣再用2倍体积蒸馏水重复提取三次得三份提取液，合并以上四份提取液，2500r/min离心25分钟，获取上清；④将第 3步骤中的上清减压浓缩至0. IMPa，温度控制在在60°C，加入5倍体积95%乙醇，于4°C 静置过夜，倾去上清，取沉淀，2500r/min离心10分钟，收集沉淀；⑤将第4步骤中的沉淀用500ml蒸馏水溶解，计量40%饱和度所需要的固体硫酸铵量，于4°C缓慢加入，搅拌4h、 10000r/min离心20分钟后，收集上清并计量体积，重复此步骤的操作1次，收集60%饱和度的沉淀物；⑥将第5步骤中的沉淀物用30ml蒸馏水溶解后，上DEAE-50离子交换层析柱
5(2. 6 X 40cm)纯化，以蒸馏水平衡，用0. 05 0. 25mol/L NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，用透析袋在双蒸水中透析48小时脱盐，再用聚乙二醇20000浓缩；⑦将第6步骤中的浓缩液上 Sephadex G-200 层析柱(2. 6 X 60cm)纯化，用 0. 02mol/L、pH 为 7. 2 的 Tris-HCl 溶液洗脱后，经真空冷冻干燥，预冻温度控制在_20°C，加热温度控制在30°C，干燥9小时后得蜈蚣多糖蛋白复合物纯品。3)灵芝多糖蛋白为一种结合蛋白多糖，简称GL-PP。可以采用现有的产品或以下方法制作的产品。灵芝多糖蛋白GL-PP的制备方法1、挑选草栽灵芝，将灵芝干品子实体清洁后，烘干，用粗颗粒粉碎机破碎成20目的烟丝状物质。2、称取300克的已经粉碎的烟丝状灵芝，用95%的乙醇3000 4000毫升回流3 小时，回收乙醇，干燥灵芝丝状物。采用灵芝丝状物热水=1 15的比例对灵芝丝状物进行热水回流提取3次，时间分别为2. 5小时、2小时、1小时，并合并过滤后的水提取液。3、在90°C的温度下浓缩水提取液至原体积的十分之一，再用速度为3000r/min， 时间为15min的离心机进行离心分离，将上清液浓缩至相当于每毫升含灵芝生药量1克为标准。4、用三倍量的95%乙醇处理浓缩液，搅拌，恒温5°C静置得第一沉淀物。将第一沉淀物再离心得第二沉淀物，将第二沉淀物溶于适量的蒸馏水，将此溶液用2 3倍量的95 % 乙醇沉淀，搅拌，5°C左右静置M小时得第三沉淀物，将第三沉淀物再离心得第一多糖蛋白沉淀。5、将第一多糖蛋白沉淀用95%乙醇，丙酮和乙醚各洗涤3次，用速度为3000r/ min，时间为15min的离心机进行离心分离，去上清液，取沉淀物于低温5°C干燥得第一多糖蛋白。6、将第一多糖蛋白溶于蒸馏水，放置于透析袋内，逆流透析48小时得透析液，将透析液在90°C下浓缩而得浓缩液。7、用三倍量于浓缩液的95%乙醇处理浓缩液，得第二多糖蛋白沉淀，将第二多糖蛋白沉淀用95%乙醇，丙酮和乙醚各洗涤3次，用速度为3000r/min，时间为15min的离心机进行离心分离，去上清液，取沉淀物于低温5°C干燥即得灵芝多糖蛋白，该灵芝多糖蛋白的重均分子量Mw在45万 M万之间，多糖蛋白呈黄褐色至褐色粉末状，其多糖组成为鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、葡萄糖，且各糖摩尔比为0. M9 3.614 3.167 0.556 6.89。4)香菇多糖蛋白1.原料的处理取已烘干的香菇体1000克，研磨粉碎至30目以上的香菇粉。2、复合酶的配制取果胶酶59克，纤维素酶2. 0克、淀粉酶1. 5克，半纤维素酶3. 5克，蛋白酶4. 0 克，糖化酶2. 0克混合均勻成70克重的复合酶液待用。3.热水浸提将1000克的香菇粉加入7000毫升的水，加热至90°C，搅拌均勻后保持90°C、时间 60分钟进行热水浸提。
4.酶解、灭活将浸提混合液从90°C下降至90°C，加入预先配制好的复合酶液70克，搅拌均勻后保持43°C、进行60分钟时间酶解。然后迅速升温至95°C进行快速灭活，灭活1分钟后自然冷却降温。5.离心、浓缩利用框式离心机，以3000r. p. η转速甩滤，去渣滤液以真空薄膜浓缩7_8小时。6.干燥浓缩液中加入适量淀粉后在70°C条件下进行喷雾干燥，得到多糖蛋白干品。5)硫酸钙、明胶、硬脂酸镁均为食用级产品或药用级产品，如明胶采用药用明胶。本发明所述的多糖蛋白片的制造方法，包括如下步骤(1)将白蘑菇浸膏倒入蒸发皿，加热并不断搅拌，使成稠膏；(2)加入适量硫酸钙、明胶混勻，继续加热搅拌，使混合物成稠膏；(3)将步骤⑵中的稠膏摊于不锈钢盘中，置烘箱中干燥，得干膏；(4)将步骤(3)中的干膏粉碎成细粉；(5)称取上述配方量的蜈蚣多糖蛋白复合物磨成细粉；(6)称取上述配方量的香菇多糖蛋白、灵芝多糖蛋白磨成细粉；(7)将步骤(4)、(5)和(6)的细粉混合均勻，加入适量硫酸钙混合均勻，制成颗粒， 干燥处理后，加入适量的润滑剂，用压片机进行压片，将冲压后的素片置于糖衣锅中包成糖衣片。上述步骤(1)的加热温度为60_80°C，搅拌时间为1. 5-2. 5小时。步骤⑵的加热温度为60-80°C，搅拌时间为0. 5-1小时。上述步骤(3)中干燥温度为80-90°C，干燥时间为16-24小时。本发明的多糖蛋白片的有效成分多糖、总氨基酸、谷氨酸、天门冬氨酸等，在以上所述的含量范围内具有很好的药理作用，它能作为治疗或预防肿瘤的药物，治疗或预防白血球减少症的药物，治疗或预防轻中型黄疸型肝炎药物，以及治疗或预防神经衰弱的药物， 具体药理作用详见如下所述。本发明的多糖蛋白片药理作用1、抗肿瘤作用对同种异基因和原来发生肿瘤具有显著的抑制作用，可防止化学因素或病毒引起的致癌作用，抑制肿瘤的转移。2、增强人体免疫功能低下作用是一种宿主防卫增强剂。它能恢复或加强宿主对淋巴细胞、激素及其他生物活性因子的反应，通过刺激免疫活性细胞的成熟、分化和繁殖。3、免疫调节作用可激活补体系统的经典途径或变更途径，增强中性白细胞对肿瘤结的浸润，促使宿主尽快恢复因癌症及感染而引起的体内平衡失调状况。4、抗HIV和抗肝炎病毒作用，增强免疫，促进肝损伤修复作用，有助于肝功能恢复。特别是蜈蚣多糖蛋白复合物在防治肝损伤疾病中具有以下特点①不仅能治疗多种化学性肝损伤，如酒精性肝损伤、四氯化碳肝损伤、大剂量地塞米松肝损伤，而且对免疫性肝损伤也具有显著疗效；②上述抗肝损伤活性直接与其清除自由基、提高抗氧化物酶的活性、 降低脂质过氧化物水平以及免疫调节等一系列保肝降酶作用有关；③急性毒性试验表明其毒副作用低。5、降低高血脂作用6、抗衰老作用本发明的多糖蛋白片药效学试验表1多糖蛋白对小鼠(荷H22)体重的影响
权利要求
1.一种多糖蛋白片，该片剂由下述原料按重量百分比制成；白蘑菇浸膏10 15 ；灵芝多糖蛋白5 10;香菇多糖蛋白5 10 ；蜈蚣多糖蛋白复合物5 10;硫酸钙50 60 ；明胶3 10 ；硬脂酸镁2 6 ；该片剂所用的白蘑菇浸膏，其每毫升的白蘑菇浸膏中多糖的量以葡萄糖计是3-15mg;所述的蜈蚣多糖蛋白复合物由下述工艺制成，步骤为①以少棘蜈蚣作为原料母体， 清洗4次，烘干3小时，烘干温度控制在70°C ；②研磨第1步骤中干燥后的原料母体并过 100目筛得蜈蚣粉；③将第2步骤中的蜈蚣粉用3倍体积蒸馏水抽提2小时，温度控制在 82°C，纱布过滤得一份提取液，取残渣再用2倍体积蒸馏水重复提取三次得三份提取液， 合并以上四份提取液，2500r/min离心25分钟，获取上清；④将第3步骤中的上清减压浓缩至0. IMPa，温度控制在在60°C，加入5倍体积95%乙醇，于4°C静置过夜，倾去上清，取沉淀，2500r/min离心10分钟，收集沉淀；⑤将第4步骤中的沉淀用500ml蒸馏水溶解，计量40%饱和度所需要的固体硫酸铵量，于4°C缓慢加入，搅拌4h、10000r/min离心20分钟后，收集上清并计量体积，重复此步骤的操作1次，收集60%饱和度的沉淀物；⑥将第5步骤中的沉淀物用30ml蒸馏水溶解后，上DEAE-50离子交换层析柱O. 6 X 40cm)纯化，以蒸馏水平衡，用0. 05 0. 25mol/L NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，用透析袋在双蒸水中透析48 小时脱盐，再用聚乙二醇20000浓缩；⑦将第6步骤中的浓缩液上kphadex G-200层析柱 (2. 6X60cm)纯化，用0. 02mol/L、pH为7. 2的Tris-HCl溶液洗脱后，经真空冷冻干燥，预冻温度控制在-20°C，加热温度控制在30°C，干燥9小时后得蜈蚣多糖蛋白复合物纯品。
2.根据权利要求1所述的多糖蛋白片，其特征在于每毫升的白蘑菇浸膏中含有氨基酸的总量是8-40mg，其中谷氨酸占3-20mg，天门冬氨酸占0. 8_5mg ；所述的灵芝多糖蛋白的重均分子量在45万 M万之间，其多糖组成为鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖和葡萄糖，且各糖摩尔比为 0. M9 3.614 3.167 0.556 6.89。
3.根据权利要求1或2所述的多糖蛋白片，其特征在于白蘑菇浸膏由下述工艺制成 取水洗过的蘑菇加入0. 4%柠檬酸和0. 05%界面活性剂，界面活性剂由蔗糖脂肪酸酯和失水山梨醇三油酸酯span85及失水山梨醇单月桂酸酯span20)以2 1 1的比例混合而成的，以80%的乙醇溶液浸渍，在室温下减压，使溶液容易浸透，15分钟后取出，置于均质器中；加入含有0. 植酸、01%维生素C、0. 3%偏磷酸钠的热溶液，一边添加一边均质，全部加完后，以温度不低于95°C加热10分钟，用4000转/分离心机进心分离，得抽出液；沉淀物中加入含有0. 碳酸钠的0. 3%食盐水，在30°C下抽提20分钟，分离后得抽出液；经二次抽提后的残渣，使分散于1升PH4. 0的柠檬酸缓冲液中，加入果胶酶、蛋白分解酶，在40°C 以70转/分振荡50分钟，充分反应后，离心分离，所得抽提液并入以上二次的抽提液中，以高温瞬时浓缩器浓缩得浓缩液，用活性碳和100目尼龙66进行脱色后，再次浓缩，得浸膏。
4.权利要求1 3之任一所述的多糖蛋白片的制造方法，包括如下步骤(1)将配方量的白蘑菇浸膏倒入蒸发皿，加热并不断搅拌，使成稠膏；(2)加入适量硫酸钙、明胶混勻，继续加热搅拌，使混合物成稠膏；(3)将步骤O)中的稠膏摊于不锈钢盘中，置烘箱中干燥，得干膏；(4)将步骤(3)中的干膏粉碎成细粉；(5)称取配方量的蜈蚣多糖蛋白复合物磨成细粉；(6)称取配方量的香菇多糖蛋白、灵芝多糖蛋白磨成细粉；(7)将步骤0)、(5)和(6)的细粉混合均勻，加入余下的硫酸钙混合均勻，制成颗粒， 干燥处理后，加入润滑剂压片，将冲压后的素片置于糖衣锅中包成糖衣片。
5.根据权利要求4所述的多糖蛋白片的制造方法，其特征在于步骤(1)的加热温度为 60-80°C，搅拌时间为1. 5-2. 5小时。
6.根据权利要求4所述的多糖蛋白片的制造方法，其特征在于步骤O)的加热温度为 60-80°C，搅拌时间为0. 5-1小时。
7.权利要求1 3之任一所述的多糖蛋白片，在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用， 在制备治疗或预防白血球减少症的药物中的应用，在制备治疗或预防轻中型黄疸型肝炎药物中的应用，以及在制备治疗或预防神经衰弱的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种多糖蛋白片及其制备方法，该片剂由下述原料按重量百分比制成；白蘑菇浸膏10～15；灵芝多糖蛋白5～10；香菇多糖蛋白5～10；蜈蚣多糖蛋白复合物5～10；硫酸钙50～60；明胶3～10；硬脂酸镁2～6；该片剂所用的白蘑菇浸膏，其每毫升白蘑菇浸膏中的多糖量以葡萄糖计是3-15mg，含总氨基酸量是8-40mg，其中谷氨酸占3-20mg，天门冬氨酸占0.8-5mg；将其细粉混合均匀，加入适量硫酸钙混合均匀，制成颗粒，干燥处理后，加入适量的润滑剂，用压片机进行压片。它能作为治疗或预防肿瘤的药物，治疗或预防白血球减少症的药物，治疗或预防轻中型黄疸型肝炎药物，以及治疗或预防神经衰弱的药物。
文档编号A61P25/20GK102379904SQ201010272550
公开日2012年3月21日 申请日期2010年9月6日 优先权日2010年9月6日
发明者柯依坤 申请人:柯依坤