细菌递送系统的制作方法

专利名称：细菌递送系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物活性剂的体内递送。具体而言，本发明涉及使用用于将生物活性 剂直接体内递送到解剖位点的细菌递送系统来治疗，减轻或预防疾病。在一个实施方案中， 细菌递送系统包括螺杆菌属(Helicobacter)或显示将异源核酸递送到表达所述异源核酸 的动物或动物细胞中的螺杆菌特征的细菌。在另一个实施方案中，对所述螺杆菌进行改造 以包含编码异源核酸的DNA载体，其中在感染后，所述核酸载体表达从而将生物活性剂递 送到动物体，尤其是在黏膜上。
背景技术：
存在向患有先天的和获得性疾病的个体长期递送药剂和免疫试剂的持续的需要。 在大多数情形中，这包括每天数次，每日一次或以一定间隔重复施用治疗性化合物。然而， 要理解的是，任何长期治疗或预防性方案具有这样的问题诸如顺应性，副作用和药物抗性。 因此存在鉴定治疗的持续需要，所述治疗通常是100%有效的，无副作用并且是廉价的。近年来研究的用于各种治疗和预防性药剂的一种递送形式是微生物的使用。出于 指导(directing)这些微生物表达外源蛋白质或赋予某些理想的性质的目的，已经将来自 包括细菌、病毒、寄生虫以及哺乳动物的各种生物的目标基因克隆到多种细菌，病毒和分枝 杆菌中。已经将这些微生物用在接种疫苗的程序，基因替代治疗和治疗性组合物递送中。使用微生物体内转化动物(宿主)细胞。可以使用包含不可复制的病毒的基因递 送载体(见，例如美国专利号5，824，544)，裸DNA,(见例如美国专利号6，261，834)，包含重 组表达盒的脂质体(见例如美国专利号6，271，207)来完成宿主细胞的转化。其它的基于 分子的治疗性组合物递送方法包括使用被设计来表达异源表面蛋白质的不可复制的重组 病毒(见，例如美国专利号6，376，236)。最近，药物研究者还已经尝试使用基于重组生物的载体，无生命的载体和裸 DNA，开发用于体内治疗性组合物表达的方法。基于重组生物的载体实例包括重组细菌 (见例如美国专利号5，547，664)和病毒诸如甲病毒属(alphavirus)(见例如美国专利 号6，391，632)，牛痘病毒(vaccinia viruses)(见例如美国专利号6，267，965)，腺病毒 (adenovirus)(见例如美国专利号5，698，202)和腺病毒相关病毒(AAV)(见例如美国专利 号6，171，597)。无生命载体包括脂质基因递送载体构建体诸如DNA/阳离子脂质体复合 物，包封在中性或阴离子脂质体中的DNA和脂质体-包埋的，聚阳离子浓缩的DNA(LPDI和 LPDII)(见，Ropert，1999，Braz J Med Biol Res, 32 (2) 163-9) 已经由各种细菌递送的其它基因的实例包括将志贺氏菌(shigella)的侵入基 因克隆到正常情况下非侵入的大肠杆菌(E.coli)中，使大肠杆菌具有侵入性并因此更 适合于用作疫苗菌株，或将Plasmodium falciparum的疟疾基因克隆到鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)中，其随后表达这些疟疾蛋白质并且在口服施用所述细菌后，在小鼠中针对疟疾激发诱导特异性细胞毒性T细胞免疫性和保护(见，例如Hone等， 1991，Vaccine,9 :810_816 ；Tacket 等，1992，Infect. Immun. ,60 :536_541 ；Hone 等，1992， J. Clin. Invest. ,90 412-420 ；Chatfield 等，1992，Vaccine, 10 :8_11 ；Tacket 等，1992， Vaccine, 10 443-446 ；禾口 Mims 等，1993，In =Medical Microbiology,Eds. ，Mosby-YearBook Europe Ltd. , London ；Sadoff 等，1988, Science, 240 :336_338 ；Aggrawal 等，1990, J. Exp. Med.，172 1083-1090)。已经将减毒的或毒性更少的志贺氏菌(见，例如Noriega等，1994，Infect. Immun. ,62 :5168_5172 ；美国专利申请号 20020176848)，沙门氏菌(Salmonella)(见例如 美国专利号6，531，313 ；美国专利申请号20030170211)，利斯特氏菌(Listeria)(见例 如，Schafer 等，1992，J. Immunol.，149 :53_59 ；美国专利申请号 20030008839)，和其它的 细菌口服给药以针对随后用这些细菌的更具毒性的形式进行的感染产生免疫性。同样，减 毒的细菌和分枝杆菌生物诸如 Bacille Calmette-Guerin(BCG) (Lagranderie 等，1993， Vaccine, 11 :1283_1290 ；Flynn, 1994, Cell. Molec. Biol.，40(Suppl. 1) :31_36)已经进行 肠胃外给药以针对相关生物诸如M. tuberculosis给出保护。已经被用作载体的一些其它细菌种类包括小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)(van Damme 等，1992， Gastroenterol. ，103 :520_531)禾口 霍舌L 弧 菌(Vibrio cholerae) (Levine 等，1994, In :Vibrio cholerae, Molecular toGlobal Perspective' s, Wachsmuth 等，Eds, ASM Press, Washington, D. C. , 395-414 页)。尽管所有的研究，所有的上述细菌递送系统具有技术难度，需要在这些可以体内 应用前克服这些困难。实际上，大多数细菌系统需要细菌本身产生功能性分子并且取决于 充分减毒从而对于在人中使用是安全但是仍然能够产生生物活性剂的细菌。然而以前使用 的所有的减毒细菌菌株不能够在不导致副作用的前提下，在体内存活过长的时期。更重要 的是，许多这些细菌物种不能将治疗性或预防性药剂递送到动物的黏膜上皮细胞。然而，许 多最重要的治疗性药剂通过黏膜进行吸收；因此，存在对于能够直接将生物活性剂递送到 黏膜的细菌递送系统的需要。授权给Powell等的美国专利号5，877，159，描述了可以在不建立产毒性感染或导 致疾病的情况下侵入黏膜细胞的活细菌由此引入能够由动物细胞表达的编码抗原的真核 表达盒。尽管该方法容许将DNA疫苗递送到黏膜表面，包括易于给药，涉及在发展中国家中 的疫苗递送，其不具有提供可扩增的编码目标基因的mRNA的优势。此外，在Powell等中公 开的细菌不能持续递送。在过去，将非致病性的，非建群性的(non-colonising)，非侵入性的食品等级 的细菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)用于将药剂递送到黏膜(见例如英国专利 GB-2278358B)。然而，尽管乳酸乳球菌是非侵入性的，其不能建立能直接将治疗性药剂持续 递送到黏膜上皮细胞的慢性感染。因此，存在对于这样的递送系统的持续需要，其能够在紧邻动物的黏膜上皮细胞 处建立非侵入性的慢性感染，从而可以将生物活性剂递送到其中。而且，存在对于足以激发 有效和有益免疫应答的在黏膜表面上的药理学活性分子的改进递送机制的持续需要。这将 提供用于药物活性剂的有效的体内递送系统，以及用于免疫的有效方法，即足以激发一般 体液和黏膜免疫应答的在黏膜表面上的抗原暴露。
发明概述本发明涉及克服上述难题并且以许多实施和应用进行例示，其中一些在下面进行 归纳。本发明人已经令人惊奇地发现能够形成慢性感染的螺杆菌，特别是幽门螺杆菌 (helicobacter pylori)，可以用于产生持续的药物递送。而且，可以在不同的时间激活或 灭活本发明的螺杆菌，并且因为其长期性，可以将螺杆菌用于通过胃黏膜递送药物。幽门螺杆菌是一种几乎仅在人的胃黏膜中发现的革兰氏阴性的螺旋形状的细菌。 人胃中的酸性是对于几乎所有细菌建群的有效屏障，但是对于螺杆菌属物种是个例外。幽门螺杆菌具有在人的胃黏膜中建群(colonize)并持续数十年的独特能力，尽 管会形成黏膜炎症和免疫应答。这种特征使得幽门螺杆菌成为用于通过黏膜递送选定的药 剂的令人感兴趣的候选物。按照一些方面，提供组合物，方法和系统用于制备和使用包含螺杆菌序列的基于 螺杆菌的构建体，所述螺杆菌的序列具有启动子区域和编码非螺杆菌的药理学活性分子的 非螺杆菌序列。将在一些实施方案中的这种构建体描述为载体或质粒载体，其中所述启动 子序列能够控制非螺杆菌的目标药理学活性分子的表达。因此，在第一个方面中，本发明提供将一种或多种生物活性剂递送给受试者的方 法，所述方法包括给受试者施用有效量的，优选地治疗或预防有效量的螺杆菌细胞或具有 螺杆菌特征的细菌细胞的步骤，所述细胞表达所述一种或多种生物活性剂。在第二个方面，本发明提供表达一种或多种异源生物活性剂的非侵入性或非致病 性的螺杆菌细胞。优选地，所述螺杆菌是幽门螺杆菌物种。生物活性剂可以与螺杆菌属同源或与该属细胞或用于递送的螺杆菌细胞物种异 源。异源药剂可以来自真核或原核来源。在一些方面，基于螺杆菌的载体和载体质粒构建体包括生物活性剂诸如抗原，有 机或无机分子或物质，药剂例如治疗性药剂或预防性药剂，诸如基因产物或基因序列(分 离的核酸)。作为实例，这些药剂可以包括免疫调节剂，激素，配体，酶或反义RNA，催化RNA， 蛋白质，肽或可以存在于细菌细胞上或由其释放从而可以将其递送给动物或动物细胞的任 何其它分子。在一些实施方案中，生物活性剂由核酸分子编码，所述核酸分子优选地以分离形 式获得并随后将其插入本发明的细菌递送载体中。本领域技术人员可理解的是，本发明的 分离的核酸分子可以是cDNA，基因组DNA，RNA,或其杂交分子。优选地，所述核酸是cDNA。作为实例，目标蛋白质和/或肽可以包括生长素释放肽(ghrelin)，支链淀粉，胰 岛素，促胃动素(motilin)，β-葡糖苷酶，化学蛋白伴侣(chemicalchaperone)，或用在戈 谢病(Gauchers disease)、细胞萎缩(cell wasting)、人免疫缺陷疾病(AIDS)的治疗中的 其它分子，食欲抑制剂，在糖尿病治疗中有用的制剂等。优选地将分离的核酸结合到表达载体中，可以将所述载体转化到螺杆菌属细胞中 并在其中维持。因此，在第三个方面，本发明提供直接将生物活性剂递送到需要其的解剖位点的 重组载体。本发明的螺杆菌属细胞优选地适应于在其表面上分泌和/或表达所述生物活性剂。在第四个方面，本发明提供用于体内递送有效量的生物活性剂的载体或构建体， 其包括a)编码生物活性剂的核苷酸序列；b)可操纵地与其连接的控制或调节序列，所述控制或调节序列能够控制(a)的核 苷酸序列的表达从而当将包含所述载体的递送载体递送到受试者时，使生物活性剂在体内产生。所述载体可以通过化学或酶促处理的方式进行化学修饰，或通过重组DNA技术的 方式进行体内修饰从而产生修饰的或变体载体。按照本发明，这样的构建体可以不同于公开的那些，例如通过一种或多种核苷酸 置换，缺失或插入的方式产生但基本上(substantially)保留了构建体或核酸分子，或其 编码产物的所需要的生物活性的那些。在本发明的另一个实施方案中，提供具有报告基因的螺杆菌属载体或构建体，所 述报告基因通过被克隆到表达载体中的组成型启动子进行表达并被用作筛选工具。适合于 用于本文的报告基因的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(GFP)，半乳糖苷酶，淀粉酶和 氯霉素乙酰转移酶(CAT)。在本发明的另一个实施方案中，使用螺杆菌属细胞来将目标异源基因递送给需要 其的受试者。所述目标基因可以编码治疗产物(转基因产物)，包括但不限于肽激素(诸 如但不限于 α -促黑激素(α -melanocyte-stimulatinghormone) ( α -MSH)，胰岛素，生长 激素和甲状旁腺激素)，细胞因子，包括，但不限于干扰素，白介素(IL)_2，IL-4，IL-10, IL-12，粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)，粒细胞-巨噬细胞集落形成刺激因子(GM-CSF) 和促红细胞生成素(EPO)。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗、减轻或预防受试者中疾病的方法。通 过使用治疗性或预防性组合物来促进这些方法。因此，在第五个方面，本发明提供一种药物 组合物，其包括(a)表达和/或分泌生物活性剂的活的非致病性螺杆菌细胞以及(b)治疗 有效的载体。在第六个方面，本发明提供治疗，预防或减轻疾病的方法，其包括向需要其的受试 者施用有效量的表达所述生物活性剂的本发明的螺杆菌细胞。其中可以应用本发明的受试者的非限制性的实例包括哺乳动物诸如灵长类的动 物，马，牛，猪，绵羊和啮齿动物。还意欲包括鱼和鸟。在本发明的一个实施方案中，进行治疗、预防或减轻的疾病是癌症，免疫/造血系 统的疾病或病症，生殖系统的疾病或病症，肌与骨骼系统的疾病或病症，心血管系统的疾病 或病症，被描述为混合胎(mixed fetal)的疾病或病症，排泄系统的疾病或病症，神经/感 觉系统的疾病或病症，内分泌系统的疾病或病症，呼吸系统的疾病或病症，消化系统的疾病 或病症和与结缔/上皮组织相关的疾病或病症或由细菌、病毒或寄生虫感染导致的疾病或 病症。本发明提供多种药用制剂，其被配制从而诸如通过胃肠道，口服或鼻内递送给患 者。在具体的实施方案中，所述组合物适合于在黏膜表面进行递送。在具体的实施方案中， 所述组合物适合于递送到消化道(gut)的黏膜表面。
作为实例，黏膜可以是胃、阴道、鼻、口腔或眼睛表面的黏膜或可以是身体任何其 它部分的黏膜，所述身体的任何其它部分的特征在于存在可渗透的黏膜表面或内层。在一 些实施方案中，所述黏膜表面是胃黏膜表面。考虑到具体的螺杆菌属的菌，螺杆菌构建体和本文所述的其它递送载体的具体 类型和比率，以及配方领域中技术人员已知的那些配制技术，诸如在被具体结合在本文中 作为参考的 Remington’ s Pharmaceutical Sciences，20th edition，Mack Publishing Company中所述的那些，容易地配制各种递送形式的组合物以用在本发明的实践中。预期所述递送系统可以用在动物，特别是灵长类的动物中，包括人、马、牛、绵羊和 啮齿动物、鱼和鸟。还预期所述制剂可以用在婴儿和成人上，以及通过亲本，肠胃外使用，或 用于施用于怀孕或哺乳期动物。还可以将所述制剂和方法描述为适合于雄性和雌性动物。在另一个方面，提供给动物接种疫苗的方法。在一些实施方案中，所述方法包括施 用包含疫苗的组合物，所述疫苗包含用基于螺杆菌_的质粒载体和/或本文所述的质粒载 体转化的细胞。在其它的实施方案中，所述方法提供足以消除或抑制动物中的疾病或生理 状况，或足以激发特异于药理学活性目标分子的免疫应答的有效量的药理学活性目标分子 的递送。作为实例，用在所述疫苗中的非螺杆菌药理学活性目标分子可以包括哺乳动物的 蛋白质，肽，酶，激素或这些的任意的组合。在具体的实施方案中，还将药理学活性目标分子 定义为人药理学活性目标分子。在一些实施方案中，药理学活性目标分子是人病原体分子/ 抗原，人蛋白质抗原诸如支链淀粉或其类似物或衍生物，或生长素释放肽，或其类似物或衍 生物。在具体的实施方案中，疫苗传递针对人病原体，欧鲍拉病毒(Ebolavirus)，HIV病 毒，马堡病毒(Marburg virus)，流感病毒(influenza virus)等的免疫性。Jones等(2005， Nat. Med. 11 :786_90)描述了基于减毒的重组疱疹性口腔炎病毒(vesicular stomatitis virus)载体的可复制的疫苗，其包括欧鲍拉病毒糖蛋白和马堡病毒糖蛋白。因此，预期还可 以按照本发明以及本文提供的公开内容提供使用基于螺杆菌的载体系统和具有这些以及 其它与人病原体相关的糖蛋白的质粒载体系统的构建体。本发明涉及1.组合物，其包括具有螺杆菌属序列和编码非螺杆菌的药理学活性目标分子的非 螺杆菌序列的螺杆菌属分子构建体。2.按照项1的组合物，其中所述螺杆菌属的细菌是幽门螺杆菌。3.按照项1或项2的组合物，其中所述药理学活性目标分子对于所述幽门螺杆菌 菌种是异源的。4.按照项1-3中任一项的组合物，其还包括启动子序列。5.按照项1-4中任一项的组合物，其中所述药理学活性目标分子是生长素释放 肽，支链淀粉或其类似物。6.按照项2-5中任一项的组合物，其中所述幽门螺杆菌是减毒的幽门螺杆菌。7.按照项2-6中任一项的组合物，其中所述药理学活性目标分子包括蛋白质，肽 或核酸分子。8. 一种疫苗，其包括按照项4的组合物和可药用的载体溶液。
9. 一种载体质粒，其包括按照项4的组合物。10. 一种包括疫苗的组合物，其中所述疫苗包括螺杆菌属载体质粒，其包括(a)螺杆菌属核苷酸序列，所述螺杆菌属核苷酸序列包括启动子序列，所述启动子 序列能够控制编码非螺杆菌的药理学活性目标分子的序列的表达；和(b)编码非螺杆菌的药理学活性目标分子的序列。11.按照项10的组合物，其还包括佐剂。12.按照项10或项11的组合物，还将其描述为适合于递送到粘膜。13.按照项10到12中任一项的组合物，其中所述非螺杆菌药理学活性目标分子是 蛋白质，肽或核酸分子。14.按照项10到12中任一项的组合物，其中所述非螺杆菌药理学活性目标分子是 生长素释放肽，支链淀粉或拮抗剂或其类似物。15. 一种制备包括非螺杆菌免疫原的免疫原性组合物的方法，其包括(a)提供包含可用质粒载体转化的幽门螺杆菌细胞的培养物；(b)在适合的条件下，将包含启动子序列和编码非螺杆菌免疫原的序列的质粒载 体引入所述培养物中以提供转化的幽门螺杆菌细胞，和(c)选择表达所述非螺杆菌免疫原的转化细胞来提供免疫原性的组合物，其中所述启动子序列能够控制编码所述非螺杆菌免疫原的序列的表达。16.按照项15的方法，其中所述启动子序列包含可诱导的启动子。17.按照项15或项16的方法，其还包括非抗生素抗性的基因标记。18.按照项15的方法，其中所述启动子在幽门螺杆菌中组成型地表达。19.按照项15的方法，所述启动子是阿拉伯糖诱导的启动子。20.按照项15-19中任一项的方法，其中所述幽门螺杆菌是菌株26695。21.按照项15-20中任一项的方法，其中还将所述质粒载体限定为包括操纵子构 建体。22. 一种治疗动物的方法，其包括下列步骤(a)提供按照项10-14中任一项的组合物；和(b)向所述动物施用有效量的所述组合物。23.按照项22的方法，其中所述动物是人。24.按照项22的方法，其中所述被治疗的动物具有增强的免疫反应。25.按照项22到24中任一项的方法，其中将所述组合物施用在所述动物的黏膜表26.按照项22到25中任一项的方法，其中将一种或多种有效量的所述组合物施用 于所述动物。27. 一种包括重组细胞的组合物，所述重组细胞包括编码非幽门螺杆菌的药理学 活性目标分子的序列，所述序列包括(a)至少一种编码药理学活性目标分子的非螺杆菌序列；和(b)具有能够控制所述非螺杆菌序列表达的启动子序列的螺杆菌属序列，其中所 述重组细胞能够在目标细胞中表达所述核酸或导致所述核酸分子的表达。28.按照项27的组合物，其中编码重组细胞的核苷酸序列还包括分泌的信号多肽。29.按照项27的组合物，其中所述重组细胞是重组幽门螺杆菌。30.按照项29的组合物，其中所述重组幽门螺杆菌是PTM103-8。31. 一种包括重组幽门螺杆菌的组合物，所述重组幽门螺杆菌包括(a)编码包括非螺杆菌的药理学活性目标分子和螺杆菌属序列的融合蛋白的序 列；和(b)可诱导的幽门螺杆菌启动子序列。32. 一种质粒载体，其包括按照项31的组合物。33. 一种药物组合物，其包括作为活性成分的项32的质粒载体，以及可药用的稀 释剂，载体，佐剂或其组合。34. 一种制备重组幽门螺杆菌的方法，其包括(a)提供幽门螺杆菌的培养物；和(b)将按照项32的质粒载体提供到所述培养物中以提供重组幽门螺杆菌，其中所述重组幽门螺杆菌能够在目标细胞中表达所述非螺杆菌药理学活性分子 或导致该分子的表达。35.按照项31的组合物，其中所述重组螺杆菌还包括编码免疫调节多肽的第二核 酸分子，其中所述重组螺杆菌能够在目标细胞中表达所述第二核酸分子。附图简述

图1是质粒构建体pHPAl (2. 8kb)的示意图。图2是质粒构建体pHP3 (3. 4kb)的示意图。图3是质粒载体PTMI03. 8的示意图。图4显示柳氮磺胺吡啶(SSN)的结构。图5是显示使用与染料(Azure-A)缀合的离子交换树脂(AmberliteXE-96)的示 意图。序列简述在本发明的整个描述中提及下列核酸和氨基酸序列SEQ ID NO 质粒pHPl的核苷酸序列(2796核苷酸)；SEQ ID NO :2_ρΗΡ1的核苷酸序列(2796核苷酸)；SEQ ID NO :3_质粒ρΗΡ3的核苷酸序列(3444核苷酸)；SEQ ID NO :4_丙型肝炎病毒是抗原(HCV)核苷酸序列；SEQ ID NO :5_来自丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原的免疫原性编码序列的核苷酸 序列135bp(45个氨基酸)；SEQ ID NO :6_幽门螺杆菌的HopE基因的外露表面环的核苷酸序列(在核苷酸 504，氨基酸位点168)SEQ ID NO -J-上游引物(29核苷酸)；SEQ ID NO :8_下游引物(28核苷酸)；SEQ ID NO :9_寡核苷酸引物(15核苷酸)。术语的定义在提出本发明之前，提出将在下文使用的某些术语的定义可以有助于对其的理
本文定义的“抗生素抗性基因”包括特意提供给载体并被用作选择系统的异源核 酸序列。术语“抗生素抗性基因”不包括将抗生素抗性赋予天然存在的微生物区系生物的 其它机制或基因。将本文所用的例如用于描述细菌菌株，特别是大肠杆菌或螺杆菌属菌株诸如幽门 螺杆菌的术语“减毒的”定义为与天然的，野生型细菌菌株相比较少毒力和/或毒性(侵入 性)的菌株。本文所用的术语“生物活性”指进行生物功能的能力，并且关于多肽指多肽采取与 其天然构象相同或非常类似的稳定构象(折叠形式)。当正确或基本正确折叠，例如形成正 确折叠的单位α "螺旋，β _折叠，结构域，二硫键等时，多肽应该具有进行其天然功能的能 力。多肽中的功能单位一般是结构域。在激发或不激发免疫应答的情况下，由抗体或其它受体结合的仅有的能力是被动 的或不构成“生物活性”。任何抗原都具有被抗体结合的能力但是不一定具有生物活性。本文所用的“临床级别的载体”指能够在螺杆菌或进行改造而具有螺杆菌特征的 非致病性细菌中表达的质粒或其它表达载体。本发明的临床级别的载体不使用用于选择 的抗生素抗性标记物和/或已经进行了修饰从而防止在宿主外进行复制，例如诸如自杀载 体。Panthel等2003已经描述了在幽门螺杆菌中的自杀系统的实例(Infection & Immunity, 71 =109-116) 0这种系统将包含PhiX174裂解基因E的质粒引入幽门螺杆菌中。 为了消除所述菌株，使用了在42°C温育5小时。在体内，这意味着动物将饮用45-50°C的饮 料从而将胃(gastric)环境的温度升高到超过42°C。第二个实例是L-Dap选择系统，其常用于使细菌突变体在补加平板上存活(见例 如 Kirata 等 1997 (Infection & Immunity，65 :4158_4164)。在该系统中，为了使 DapE 缺 陷型幽门螺杆菌突变体存活，动物受试者必须用失去的底物即二氨基庚二酸(DAP)补充它 们的饮食。为了消除它们，接着停止DAP的消耗。第三种可能的系统涉及幽门螺杆菌的甲硝唑敏感性，因为其具有rdxA基因。rdxA 基因的过度复制对于哺乳动物细胞和大肠杆菌是有害的。然而，细菌可以耐受这种复制。因 此，可以改造本发明的螺杆菌物种以包含两个拷贝的rdxA，其阻止正常的突变-依赖型的 rdxA失去。将至少两个功能性rdxA基因引入螺杆菌基因组应导致对甲硝唑永久敏感的螺 杆菌菌株。Jeong等2000 (J. Bacteriol.，182 =5082-5090)显示通过功能性rdxA基因产生 的硝基还原酶将甲硝唑从前药转化为杀菌化合物。活性化合物的作用方式导致螺杆菌基因 组的DNA断裂。用于本文时，“可检测的免疫应答”是在动物中响应于可以通过使用常规的实验室 方法进行测量的抗原形成的抗体(体液)或细胞毒性(细胞的)反应，所述方法包括，但不 限于酶联免疫吸附测定法(ELISA)，放射免疫测定法(RIA)，酶联免疫SPOT (ELISPOT)，免疫 荧光测定法(IFA)，补体激活测定法(CF) ,Western Blot印迹法(WB)或其等价物。用于本文时，“目标基因”指编码需要其表达的多肽或蛋白质的任何核酸序列。目 标基因可以包括或可以不包括启动子或其它调节成分。目标基因还包括能够产生反义RNA 的构建体。
用于本文时，将“基因治疗”定义为使用重组载体将目标基因递送给需要其的动 物。目标基因可以是编码治疗性或预防性的蛋白质或多肽，包括，但不限于细胞因子，抗炎 药(anti-inflammatories)，抗增殖药，抗生素，代谢抑制剂/激活剂和免疫活性抗原及其 片段的转基因。此外，用于本文时，“基因治疗”还包括定向在遗传和非遗传疾病上的基因替 代技术。术语螺杆菌(Helicobacter)包括螺杆菌属的所有细菌，包括幽门螺杆菌和鼬鼠 螺杆菌OLmustelae)。所述术语还包括与幽门螺杆菌具有类似生物学的细菌，所述生物 学在于它们能够建群在灵长类动物的胃黏膜上和/或能够建立慢性，但是分离的黏膜感 染。所述术语还包括已经进行了修饰从而使所述细菌具有幽门螺杆菌的特征诸如建群 (reside)在胃黏膜上的能力的细菌。“异源”多肽是对于螺杆菌而言非天然的多肽，即所述生物活性剂的编码核酸天然 地或在引入螺杆菌之前不由螺杆菌所表达，或者是其祖先。用于本文时，“宿主”定义本发明的治疗性组合物的倾向受体。宿主包括所有的动 物。具体而言，宿主包括，但不限于，灵长类动物(包括人)，牛，马，犬，猫，猪，绵羊，兔，啮齿 动物，鸟和鱼。用于本文时，“免疫惰性的(inert) ”意味着任何物质，包括微生物诸如在其宿主中 不激发显著免疫应答的微生物区系。用于本文时，免疫惰性物质的实例包括不锈钢，生物相 容性聚合物诸如聚-L-丙交酯，医疗级别的塑料和本发明的微生物区系生物。“显著的免疫” 应答是将限制或局限按照本发明的教导使用的物质或生物的体内效用的任何免疫应答。可 检测的免疫应答不一定是“显著的免疫应答”。“分离的核酸”是这样的核酸，其结构与任何天然存在的核酸的结构或与跨越超过 三个单独的基因的天然存在的基因组核酸的任何片段的结构不相同。因此所述术语包括， 例如(a)DNA分子，其具有天然存在的基因组DNA分子的部分的序列，但是在其两侧没有侧 接这样的编码序列，所述编码序列侧接其中其天然存在的生物的基因组中所述分子的部 分；(b)以这样的方式结合到载体或原核生物或真核生物的基因组DNA中的核酸从而使得 到的分子与任何天然存在的载体或基因组DNA都不相同；(c)分离的分子诸如cDNA，基因组 片段，通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段，或限制片段；和(d)作为杂交基因，即编码融 合蛋白的基因的部分的重组核苷酸序列。特别由此定义中排除出去的是存在于(i)DNA分 子，(ii)转染的细胞，和(iii)细胞克隆的混合物中的核酸，例如存在于诸如cDNA或基因 组DNA文库中的核酸。利用Karlin和 Altschul，1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 =2264-2268,1990 的 算法来测定两条氨基酸序列或两条核酸的“百分比同一性(同源性)”，所述算法Karlin和 Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877,1993)中得以改进。将这种算法整合 Λ Altschul 等(J. Mol. Biol. 215 :403_410，1990)的 NBLAST 和 XBLAST 程序中。用 NBLAST 程序进行BLAST核苷酸检索，分值(score) = 100，词长(wordlength) = 12，以获得与本发 明的核酸分子同源的核苷酸序列。用XBLAST程序进行BLAST蛋白质检索，分值=50，词长= 3，以获得与参照多肽(例如，SEQ ID NO 2)同源的氨基酸序列。用了获得带缺口(gapped) 的比对来进行比较,利用在Altschul等(Nucleic AcidsRes. 25 :3389_3402，1997)中介绍 的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。这些可以在国际互联网URL "ncbi. nim. nih. gov. ”上找到。术语“报告基因”用于本文时是并入(或邻接)编码目标基因的异源核酸中的核 酸序列，其为表达目标基因的转化载体提供可识别的表型。报告基因的非限制性例子包括 GFP, β -半乳糖苷酶，淀粉酶，和CAT。“筛选标记”用于本文时指对根据本发明的教导制备的转化载体提供的鉴定特征 (表型)。在本发明的一个实施方案中，所述筛选标记是报告基因。“可选择标记，” “可选择基因，” “报告基因”和“报告标记”(本文称作“可选择标 记”)用于本文时指编码表型性状的核酸序列，所述表型性状允许快速鉴定和分离转化的细 菌载体。一般，认为是“临床级别”和根据本发明的教导制备的细菌载体是具有并不编码抗 生素抗性的可选择标记的载体。“转基因”用于本文时指利用cDNA技术插入细胞中的基因，所述插入是以确保其作 为正常基因的功能，复制和传递的方式而进行的。“转化性核酸序列(transforming nucleic acid sequence) ”用于本文时意指包 含编码目标基因的核酸序列的质粒，或其它的表达盒。在本发明的一些实施方案中，所述核 酸序列可以编码一种或多种治疗剂。根据本发明的某些实施方案，“转化性核酸序列”还可 以用来意指“转基因”。在本发明的其它实施方案中，转化性核酸序列包括编码启动子和/ 或其它调控元件的核酸序列。术语“癌症”用于本文时指瘤性(neoplastic)疾病(例如，白血病，癌和“过度增 生性病症(hyperproliferative disorders)”)。肿瘤可以位于选自下列的组织中结肠， 腹部，骨，乳房，消化系统，肝，胰，前列腺，腹膜，肺，血液(例如，白血病)，内分泌腺(肾，副 甲状腺，垂体，睾丸，卵巢，胸腺，甲状腺)，子宫，眼，头和颈，神经(中枢和外周)，淋巴系统， 骨盆，皮肤，软组织，脾，胸(thoracic)，和泌尿生殖器。在一个实施方案中术语“癌症”还包括肿瘤前的病症，其选自增生(例如，子宫内 膜增生)，组织变形(例如，结缔组织变形)和/或发育不良(例如，子宫颈发育不良，和支 气管肺发育不良)。在其它的实施方案中，术语“癌症”还包括选自良性肿瘤，纤维囊性病症和组织肥 大的良性增生异常型症症。术语“免疫/造血系统的疾病或病症”用于本文时指选自下列的疾病或病症贫血 症、全血细胞减少症、白血球减少症、血小板减少症、白血病、霍金斯(Hodgkin’ s)病、非霍 金斯淋巴瘤、急性淋巴细胞贫血症(ALL)、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、伯基特氏(Burkitt’ s) 淋巴瘤、关节炎、哮喘、爱滋病(AIDS)、自体免疫疾病、风湿性关节炎、肉芽肿疾病、免疫缺 陷、炎症性肠病、脓毒病、中性白细胞减少症、中性白细胞增多症、银屑病(psoriasis)、对于 移植器官和组织的免疫反应、系统性红斑狼疮、血友病、高凝性(hypercoagulation)、糖尿 病、心内膜炎、脑膜炎、莱姆病、乳糜泻和变应性(allergies)。术语“生殖系统的疾病或病症”用于本文时指选自下列的疾病或病症隐睾病、 前列腺炎、腹股沟疝、精索静脉曲张、间质细胞瘤(leydig cell tumor)、疣状癌、前列腺 炎、软化斑、佩罗尼氏病(Peyronie’ s disease)、阴茎癌、扁平细胞增生、痛经、卵巢腺癌、 特纳(Turner’ s)综合征、粘液脓性宫颈炎、Sertoli-Ieydig瘤、卵巢癌、子宫癌、骨盆炎 症性疾病、睾丸癌(testicular cancer)、前列腺癌、格来弗德氏(Klinefelter’ s)综合征、Young' s综合症、早泄、糖尿病、囊性纤维化、Kartagener' s综合症、睾丸萎缩、睾 丸雌化、无睾、睾丸异位、附睾炎、睾丸炎、淋病、梅毒、睾丸扭转(testicular torsion), vasitisnodosa、生殖细胞瘤、基质瘤、痛经、子宫后倾(retroverted uterus)、子宫内膜 异位、纤维瘤、子宫内膜异位、无排卵出血、闭经、垂体嗜碱细胞增殖、葡萄胎、阿谢曼氏 (Asherman' s)综合征、早熟绝经、青春期早熟、子宫息肉、功能性月经失调(dysfunctional uterine bleeding)、宫颈炎、慢性子宫颈炎、粘液浓性宫颈炎、子宫颈非典型增生、宫颈息 肉、Nabothian cysts、子宫颈糜烂、宫颈功能不全、颈赘生物、假两性畸形，和经前期综合 征。术语“肌肉骨骼系统的疾病或病症”用于本文时指选自下列的疾病或病症骨癌 (例如，软骨骨瘤、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤、巨细胞瘤、 多发性骨髓瘤、骨肉瘤)，畸形性骨炎(Paget’ sDisease)、风湿性关节炎、全身性红斑狼 疮、骨髓炎、莱姆病、痛风、粘液囊炎、肌腱炎、骨质疏松症、骨关节炎、肌肉萎缩(muscular dystrophy)、线粒体肌病、恶病质，和多发性硬化。术语“心血管系统的疾病或病症”用于本文时指选自下列的疾病或病症粘液瘤、 纤维瘤、横纹肌瘤、心血管异常(例如，先天性心脏病、大脑动静脉畸形、中隔缺损)，心脏病 (例如，心力衰竭、充血性心脏病、心律不齐、心动过速、纤维性颤动、心包疾病、心内膜炎)， 心动停止、心瓣膜疾病(例如，狭窄、回流、脱垂)，血管病(例如，高血压、冠状动脉病、心绞 痛、动脉瘤、动脉硬化、外周血管疾病)，低血钠、hypematremia、低血钾，和高血钾症。术语“混合胎儿的疾病或病症”用于本文时指选自下列的疾病或病症脊柱裂、积 水性无脑畸形、神经纤维瘤、胎儿乙醇综合征、糖尿病、PKU、唐氏(Down's)综合症、Patau综 合征、爱德华(Edwards)综合症、特纳综合征、阿佩尔(Apere)综合征、卡彭特(Carpenter) 综合征、Conradi综合征，Crouzon综合征，皮肤松弛症，Cornelia de Lange综合征， Ellis-van Creveld 综合征，Holt-Oram 综合征，Kartagener 综合征，Meckel-Gruber 综合 征，Noonan 综合征，Pallister-Hall 综合征，Rubinstein-Taybi 综合征，Scimitar 综合 征，Smith-Lemli-Opitz 综合征，thromocytopenia-absent radius (TAR)综合征，Treacher Collins综合征，Williams综合征，Hirschsprung病，麦克尔憩室，多囊肾疾病，特纳综合 征，和性腺发育不全，Klippel-Feil综合征，ostogenesisimperfecta、肌肉萎缩、台-萨二 氏(Tay-Sachs)病、维尔姆斯(Wilm’ s)瘤、神经母细胞瘤，和视网膜母细胞瘤。术语“分泌系统的疾病或病症”用于本文时指选自下列的疾病或病症膀胱癌、前 列腺癌、良性前列腺增生、膀胱病症(例如，尿失禁、尿潴留、尿路梗阻、尿路感染、间质性膀 胱炎、前列腺炎、神经原膀胱、血尿症)，肾病症(例如，肾积水、蛋白尿、肾衰竭、肾盂肾炎、 尿石病、逆流肾病，和单侧梗阻性尿路病)。术语“神经/感觉系统的疾病或病症”用于本文时指选自下列的疾病或病症脑 癌(例如，脑干神经胶质瘤、脑瘤、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴 瘤、小脑星形细胞瘤，和大脑星形细胞瘤、神经变性疾病(例如，阿尔茨海默氏病、克-雅 病(Creutzfeldt-Jakob Disease) Λ Parkinson‘ sDisease, 禾口 Idiopathic Presenile Dementia)，脑脊髓炎、脑型疟、脑膜炎、新陈代谢型脑病(例如，苯酮尿和丙酮酸羧化酶缺 陷)，小脑共济失调、共济失调性毛细血管扩张，和爱滋病痴呆混合症、精神分裂症、注意力 缺损病、亢进性注意力缺损病(hyperactive attention deficit disorder)、孤独症，和强制性障石导(obsessive compulsive disorders)。术语“呼吸系统的疾病或病症”用于本文时指选自下列的疾病或病症呼吸系统癌 症如喉癌、咽癌、气管癌、会厌癌、肺癌，鳞状细胞癌、小细胞(燕麦形细胞)癌，大细胞癌，和 腺癌。过敏反应、囊性纤维化、结节病、组织细胞增多病X、浸润型肺病(例如，肺纤维化和淋 巴细胞性间质性肺炎)，阻塞性气道病(例如，哮喘、肺气肿、慢性或急性支气管炎)，职业性 肺病(例如，硅肺和石棉肺)，肺炎和胸膜炎。术语“内分泌系统的疾病或病症”用于本文时指选自下列的疾病或病症内分 泌组织和器官的癌症(例如，下丘脑、脑下垂体、甲状腺、甲状旁腺、胰腺、肾上腺、卵巢， 和睾丸的癌症)，糖尿病(例如，尿崩症、I型和II型糖尿病)，肥胖症，涉及垂体腺的病 症(例如，垂体机能亢进、垂体机能减退，和垂体性矮小症(pituitary dwarfism))，甲状 腺机能减退、甲状腺机能亢进、甲状腺肿、生殖疾病(例如，男性和女性不育)，涉及肾上 腺的病症(例如，Addison病，皮质类固醇缺陷症，和Cushing' s综合征)，肾癌(例如， hypem印hroma，移行细胞癌，和威尔姆斯瘤)，糖尿病型肾病、间质性肾炎、多囊肾疾病、肾 小球肾炎(例如，IgM肾小球系膜增生性肾小球肾炎和由自身免疫病症引发的肾小球肾炎 (glomerulonephritis) JnGoodpasture' s 综合征)，禾口肾 丐沉着症。术语“消化系统的疾病或病症”用于本文时指选自下列的疾病或病症溃疡性结肠 炎、阑尾炎、克罗恩氏病(Crohn’ s)、肝炎、肝性脑病、门静脉高压症、胆石病、消化系统癌症 (例如，胆道癌、胃癌、结肠癌、胃癌、胰癌、胆管癌、结肠肿瘤(例如，息肉或癌症)，和硬化 症)，胰腺炎、溃疡疾病、幽门狭窄、肠胃炎、胃炎、胃萎缩、良性十二指肠瘤、膨胀、过敏性肠 综合征、吸收障碍、先天性小肠病、细菌和寄生虫传染、赫希施普龙氏病(megacolon)、赫希^ R>Hirschprung' sdisease>aganglionic megacolon、—lit生、结 肠炎、肛门直肠病症(例如，肛瘘、痔)，先天性肝病(例如，威尔逊病、血色素沉着病、囊性纤 维化、胆道闭锁，和阿尔法1-抗胰蛋白酶缺陷症)，门静脉高压症、胆石病，和黄疸。术语“结缔/上皮的疾病或病症”用于本文时指选自下列的疾病或病症结缔组 织变形、混合结缔组织病、局灶性上皮增生、上皮化生、粘膜上皮发育异常、移植物对抗宿 主的疾病、多肌炎、囊性增生、大脑发育异常、组织肥大(hypertrophy)、阿尔茨海默氏病、 淋巴组织增生病症、Waldenstron' s巨球蛋白血症、克罗恩氏病、恶性贫血、突发性阿狄 森氏病(idiopathicAddison，s disease)、肾小球肾炎、大疱性类天疱疮、Sjogren ‘ s 综合征、糖尿病、囊性纤维化、骨母细胞瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、骨质疏松症、 osteocarthritis、牙周病、伤口愈合、复发性多软骨炎、脉管炎、多发性结节性动脉炎、 Wegener肉芽肿病、蜂窝织炎、风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、盘状红斑狼疮、全身性红斑狼 疮、硬皮病、CREST综合征、Sjogren' s综合征、多肌炎、皮肤肌炎、混合结缔组织病、复发 性多软骨炎、脉管炎、Henoch-Schonlein综合征、结节性红斑、多发性结节性动脉炎、暂时性 (巨细胞)动脉炎、Takayasu动脉炎、Wegener肉芽肿病、Reiter' s综合征、Behcet' s综 合征、关节强硬性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、蜂窝织炎、瘢痕瘤、EhlerDanlos综合 征、Marfan综合征、弹性假黄色瘤、成骨不全、软骨发育不良、大疱性表皮松解、Alport综合 征，和皮肤松弛症。本说明书中的术语“a”和“the”意欲包括一个(单数)和多个(复数)。本文所述的活性剂或活性剂的组合的“治疗有效量”可以理解为包含这样的有效量，其引起所需的反应但不足以引发毒性反应。所需的反应，例如，可以在血液样品中形成 足够和/或可接受的可检测抗体滴定水平。施用给受试者的剂量和持续时间将由需要治疗 的受试者的主治医生来确定，并且将考虑年龄、性别、体重、现有患病状态和/或受试者组 织损伤程度，将螺杆菌和目标基因产品的特定制剂用作受试者的治疗。短语“有效水平”指所需分子活性的水平并且不一定限于分子数。例如，可以通过 支链淀粉(amylin)拮抗剂降低支链淀粉的有效水平来刺激生长素释放肽分泌，而不必伴 随着受试者体内游离支链淀粉量的减少。短语“生长素释放肽相关的疾病和病症”指任何能够通过调节生长素释放肽活 性来预防或减轻的病症。这些包括由生长素释放肽加剧或刺激的病症，例如，生长激素释 放或drive to eat。生长素释放肽的生理作用被认为包括，例如，刺激生长激素释放，刺 激泌乳细胞和促肾上腺皮质素细胞分泌激素，orexigenic和心血管作用，抗甲状腺和乳 腺癌(breast tumor)增生作用，以及通过迷走神经介导调节胃活动性和酸分泌。(见WO 2005021026)。在整个说明书中，除非上下文另外要求，单词“包含(comprise)”或其变体“包含 (comprises) ”或“包含(comprising) ”将理解为意味着包括指定的事物或事物组合，但不 排除任何其它的事物或事物组合。当术语的定义背离通常所用的术语意义时，申请人意在采用本文提供的定义，除 非明确指出。发明详述在详细描述本发明之前，要理解的是本发明不受限制于具体举例的方法并且当然 可以变化。还要理解是本文所用的术语仅出于描述本发明的具体的实施方案的目的，并且 不倾向于限制仅由后附的权利要求所限制的本发明。本文所引用的所有的出版物，专利和专利申请，不管是在上文还是下文，特此将其 全部内容并入作为参考。然而，出于描述和公开在所述出版物中报道并且可以与本发明结 合使用的方法，试剂和载体的目的，引用本文提及的出版物。本文的任何内容都不应被视为 承认本发明不可以根据在先发明而早于这些公开(本发明可以早于这些公开)。此外，除非另外指出，本发明的实践应用本领域技术中的常规免疫和分子生物学 技术和药理学。这些技术是技术人员所熟知的，并且在文献中进行了充分的解释。见，例 如 Coligan 等"Current protocols in ProteinScience，，(1999) Volume I and II (John Wiley & Sons Inc.) ；Sambrook 等，(Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd & 3rd Editions，Cold SpringHarbor Laboratory press (1989) (2001)；禾口Bailey，J. E.禾口Ollis， D. F. , Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company，NY，1986。必须注意，用于本文和后附的权利要求时，除非文中另外清楚指出，单数形式 “一，” “一种，”和“所述”包括复数形式。因此，例如，在提到“核酸”时包括多种这样的核 酸，并且提到“分离的肽”时，是指一种或多种肽等。除非另外定义，本文所用的所有的技术 和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管可以使 用与本文所述的那些相似的或等价的任何材料和方法来实践或测试本发明，优选本文所述 的材料和方法。将治疗性组合物和核酸递送到动物体的特异性目标位点是药物开发工业正在面临的挑战。本发明人已经开发能够携带编码生物活性剂的载体的基于螺杆菌的细菌递送系 统，其中这些药剂在细菌的表面上表达或从其中分泌。在一个实施方案中，所述细菌是螺杆 菌物种，更优选地，是幽门螺杆菌。在一些实施方案中，幽门螺杆菌的菌株可以是本领域已 知的任何菌株。在一些实施方案中，所述幽门螺杆菌菌株是非致病性菌株诸如基因组菌株 26695。在另一个实施方案中，使用除了螺杆菌之外的细菌，其中所述细菌已经进行了遗 传改造从而使其具有螺杆菌或幽门螺杆菌特征，所述特征包括慢性建群在胃黏膜或胃肠 道，泌尿道，支气管的上皮或其它黏膜器官的其它区域，而不会对宿主造成明显的毒性的能 力。在一个实施方案中，已经对幽门螺杆菌进行了操控从而去除和/或减弱一些致病 性特征。例如，可以去除空泡细胞毒素和cag致病岛基因从而使所述幽门螺杆菌的致病性 降低。在一个实施方案中，已经对幽门螺杆菌进行了操控从而去除和/或减弱一些致病性 特征。例如，可以去除空泡细胞毒素和cag致病岛基因从而使所述幽门螺杆菌的致病性降 低。可以使用应用N-甲基-N-硝基-N-nitrosoquanidine进行的化学非特异性诱变或应 用重组DNA技术的非特异性诱变来将减毒突变引入螺杆菌中。技术人员将理解本发明的方法能够用于递送广泛的生物活性剂。适合的药剂的实 例包括能够在局部或全身发挥功能的药剂，例如能够发挥内分泌活性影响局部或全身代谢 的药剂和/或能够调节属于免疫/造血系统的细胞的活性的药剂，和/或能够影响身体的 多种正常或赘生性细胞的生存，生长和分化或影响对于伤口和感染的急性期炎症反应的免 疫调节或诱导的药剂和/或能够增加或诱导针对由作用在它们的靶细胞受体上的趋化因 子，或上皮细胞的增殖或伤口愈合的促进所介导的细胞和组织的感染的抗性的药剂和/或 调节体内细胞表达或产生物质的药剂。这样的生物活性剂的具体实例包括胰岛素，生长激素，促乳素，降钙素，黄体生成 素，甲状旁腺激素，生长激素抑制素，甲状腺刺激激素，血管活性肠肽，采取反平行的4 α螺 旋状束结构的结构组1细胞因子诸如IL-2, IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-T, IL-9，IL-10， IL-11，IL-12, IL-13, GM-CSF，M-CSF, SCF，IFN- γ，ΕΡ0, G-CSF, LIF, OSM, CNTF，GH, PRL 或 IFNa/β,通常是细胞表面相关的，形成对称同源三聚体并且亚基采取对于某些病毒包被 蛋白质所述的β-胶冻卷(jelly roll)构象的结构组2细胞因子诸如细胞因子的肿瘤坏死 因子(TNF)家族，例如TNF a，TNF β，CD40，CD27或FAS配体，细胞因子的IL-1家族，成纤维 细胞生长因子家族，血小板衍生生长因子，转化生长因子β和神经生长因子，包含短链a/ β分子的结构组3细胞因子，其作为大的跨膜前体分子产生，所述前体分子每个在细胞外 区域中包含至少一个表皮生长因子(EGF)结构域，例如细胞因子的EGF家族，特征在于它们 在氨基酸序列周围存在保守的半胱氨酸残基(C-C或C-X-C趋化因子亚基)的趋化因子 或胰岛素相关趋化因子，显示嵌合结构的结构组4细胞因子诸如由不同结构域，例如EGF， 免疫球蛋白样和三环结构域组成的调蛋白(heregulins)或神经调节蛋白。或者，所述生物活性剂可以是如上定义的生物活性剂的受体或拮抗剂。在一些实施方案中，使用基于幽门螺杆菌的载体和/或载体质粒构建体来产生转 化的细胞(诸如大肠杆菌或螺杆菌细胞)，其容许来自被包含在其中的分离的核酸分子的 生物活性剂在宿主的黏膜表面上的表达和/或分泌，所述转化的细胞制剂被施用于所述宿主。被包含在转化的细胞(或载体)中的分离的核酸可以包含一种或多种核酸构建体，其 中编码所述生物活性剂的核酸在用于在幽门螺杆菌中表达的适当调节序列的控制下。可以选择或构建包含用于介入幽门螺杆菌的核酸的适合的载体和穿梭载体序列， 以包含适当的调节序列，包括启动子序列，终止子片段，增强子序列，标记基因和适合的其 它序列。如果合适，载体可以是质粒，病毒，例如噬菌体或噬菌粒。关于进一步的细节，见 例如 Sambrook 等，上文。在 Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel等eds. ,Johnffiley & Sons，1992中详细描述了操控核酸，例如在制备核酸构建体， 诱变，测序，将DNA引入细胞和基因表达中的许多已知的技术和方法。将Sambrook等上文 和Ausubel等的公开内容结合在本文作为参考。在一些实施方案中，将生物活性剂的编码序列包含在操纵子中，即进行多顺反子 表达的核酸构建体。在操纵子中，自启动子的转录导致包含超过一个的编码序列的mRNA，所 述编码序列的每个具有其本身适当定位的核糖体结合位点上游。因此，超过一种药剂可以 从单一的mRNA进行翻译。使用操纵子能够使生物活性剂协同表达。包含本发明的生物活性剂的编码序列的核酸构建体或载体优选地在用于在幽门 螺杆菌的表达的启动子的控制下。在一个实施方案中，按照本发明的所用的启动子在幽门螺杆菌中组成性地表达。 组成型启动子的应用避免提供用于表达发生的诱导物或其它调节信号的需要。优选地，启 动子在幽门螺杆菌宿主细胞保持有生活力，即保持一些代谢活性，甚至即使生长没有被减 少的水平上指导表达。那么有利的是，这样的表达可以在低水平上进行。例如，当表达产物 在细胞内积累时，表达水平可以导致表达产物在少于细胞蛋白质的约10%，优选地约或少 于约5%例如约1-3%的积累。启动子可以与所用的幽门螺杆菌菌株同源，即在天然存在的幽门螺杆菌菌株中发 现的启动子。在一些实施方案中，所述启动子是阿拉伯糖诱导型启动子。其它的启动子包 括FlaB sigma 54 启动子(Josenhans 等，1998，FEMS Microbiol Lett, 161 (2) :263_73)，T7 启动子，和沙门氏菌的nir B 启动子(Chatfield等，1992，Biotechnology，10 (8) :888_92)。在另一个实施方案中，所述启动子是可诱导的。可以与临床级别的载体一起使用 的可诱导的启动子包括，但不限于，如在授权给Kullen等的美国专利号6，242，194中所述 的PH诱导型启动子，乳糖诱导型启动子诸如在大肠杆菌质粒(例如，来自Stratagene的 pBluescript )中所用的启动子，或在乳酸菌(Lactobacillus)中的内源乳糖启动子；在厌 氧生长过程中诱导的启动子诸如在Aristarkhov等，1999，J. Bacteriology, Vol. 178 (14)， 4327-4332中所述的醇脱氢酶(adhE)的启动子。在一个实施方案中，本发明的构建体还包括毒性基因。这些毒性基因优选地在可 诱导的启动子的控制下，从而在处理结束后，本发明的螺杆菌可以容易地通过诱导毒性基 因的表达而进行去除。毒性基因的非限制性实例包括在可诱导启动子控制下的细菌自溶 素。接着，所述自溶基因可以在适合的时间和在胃肠道中的适合位置，通过使用刚在前面描 述的一种或多种可诱导的启动子进行引发。在一些实施方案中，被改造的螺杆菌载体和质粒载体构建体对于氧敏感。这种氧 敏感性是限制本发明的临床级别的载体的传播的另一种方法。人消化道的环境中氧含量是 非常低的，适合于包括螺杆菌的厌氧和微量需氧的微生物的生长。因此，一旦在肠内废物排泄到富氧的外部环境后，它们已经离开人体时，消除螺杆菌递送载体的有效方式是将赋予 氧敏感性的基因改造到被转化的微生物中。本发明的一种或多种核酸构建体可以包括分泌信号序列。因此，在一些实施方案 中，编码生物活性剂例如非螺杆菌多肽的核酸可以通过将编码分泌信号序列的核酸序列与 编码分子(多肽)的核酸序列进行适当偶联在细胞膜上提供所述药剂的分泌。可以在维持 螺杆菌生存力的培养条件下，体外测试具有分泌多肽的核酸的螺杆菌的能力。适合的分泌信号序列包括具有在革兰氏阴性生物诸如埃希氏菌属(Escherichia) 细菌，克雷伯氏菌(Klebsiella)，和沙门氏菌(Salmonella)中活性的那些中的任何。分 泌信号序列可以包括由一些葡萄球菌(Staphylococcus)菌株分泌的葡萄球菌激酶的分泌 前导序列，这是在革兰氏阳性和革兰氏阴性宿主中都发现的功能(见“Gene Expression Using Bacillus，，，Rapoport (1990) Curr Opin Biotech 1 :21_27)。可以使用的其它的分泌信号序列包括，例如β-内酰胺酶基因(Talmadge等， 1980，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3369-3373)或肠侵染性大肠杆菌溶血素 A(hlyA) (Su 等，1992，Microbial Pathogen，13 :465_476)。在 Pugsley，1988，Protein secretion across the outer membrane of gram-negative bacteria. In Protein Transfer and organelle Biogenesis, R. C. Dand and P. W. Robbins(eds), Academic Press, Inc. , San Diego, pp 607-652中列举了分泌信号序列的举例性列表。可选择的标记给研究者和技术人员提供了在混合的群体中，区分转化的微生物和 未转化的微生物的方便的方法。鉴定转化的生物的一种方式是将可选择的标记核酸序列结 合到包含目标基因的质粒中。通常将可选择的标记序列插入目标基因的下游并且用相同的 启动子进行驱动。结果，成功用目标基因转化的细胞还将用可选择的标记核酸序列转化。 当将抗生素抗性用作可选择标记时，仅有被转化的细胞将在包含抗生素的培养基上生存和 /或生长。因此，当开发转化体时，抗生素抗性是方便的并且是大量使用的表型。然而，具有 抗生素抗性基因作为选择标记的载体会发生水平基因转移，这可以导致其它的生物具有抗 生素抗性表型。当将螺杆菌用作治疗性载体的部分时，这种风险是尤其尖锐的。为了将螺杆菌用作针对动物的基因递送系统，本发明公开内容在一些实施方案中 提出了不使用抗生素选择标记的临床级别的载体系统。本发明提供的使用抗生素抗性基因 的备选之一包括在必要的“持家”基因中具有染色体缺失或具有致死突变的临床级别的载 体。接下来，将在功能上类似的持家基因插入编码目标基因的质粒中。结果，“持家”基因成 为容许快速分离和鉴定转化体的可选择的标记。必要的“持家”基因的实例包括编码许多代谢调节物和/或酶的基因，所述酶包括 但不限于激酶，蛋白酶，合成酶，脱氢酶及其它。由本发明提供的对于抗生素抗性基因的另 一个备选包括具有报告基因的临床级别的载体，所述报告基因被结合到包含目标基因的质 粒中。按照本发明的教导使用的报告基因的其它的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(GFP)， β-半乳糖苷酶和淀粉酶。在一个实施方案中，生物活性多肽优选地具有细胞因子活性。细胞因子在“The Cytokine Facts Book，，，Callard 禾口 Gearing(1994) ,Academic Press 中进 亍了讨论。具有 细胞因子活性的优选的多肽是白介素，包括白介素_2(IL-2)和白介素-6(IL-6)。
在一些实施方案中，将包括如上所述的核酸构建体的螺杆菌递送系统，载体或载 体质粒系统引入螺杆菌或其它的适合的宿主细胞中以提供被转化的细胞。因此，本发明的 另一个方面提供包括将公开的核酸引入非致病性螺杆菌中的方法。转化宿主细胞，诸如螺 杆菌的培养物可以使用任何可获得的技术。对于幽门螺杆菌细胞而言，适合的技术可以包 括氯化钙转化，电穿孔和使用噬菌体的转染。将载体质粒引入螺杆菌细胞后，可以例如通过在表达所述基因的条件下培养幽门 螺杆菌来导致或容许所述核酸的表达。在表达生物活性多肽的条件下，在培养物中培养所 述螺杆菌可以用于证实所述螺杆菌包含编码核酸并且能够产生被编码的物质。在另一个方面，本发明提供体内递送治疗性或预防性剂量的生物活性剂的方法， 所述方法包括向受试者施用有效量的本发明的幽门螺杆菌组合物和疫苗的非致病性的制 剂。要理解的是，本发明的方法和使用本文所述的非侵入性和非致病性螺杆菌提供广 泛种类的治疗性方法，所述方法将使技术人员能够操纵，例如受试者的免疫应答。因此，在 一个方面，本发明提供调节存活、生长、分化、效应子功能或对于细胞或组织的感染的易感 性的方法，所述方法包括向受试者施用本文定义的非侵入性或非致病性螺杆菌。在另一个方面，提供加强针对建群在黏膜表面或在临近或远端组织上的肿瘤细胞 或感染的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用本文定义的非侵入性或非致病性螺 杆菌。在另一个方面中，提供调节针对致病性传染物的免疫应答的类型(抗体对细胞介 导的)的方法，所述方法包括向受试者施用本文定义的非侵入性或非致病性螺杆菌。在另一个方面中，提供用炎症或肿瘤细胞调节正常组织的渗透的方法，所述方法 包括向受试者施用本文定义的非侵入性或非致病性螺杆菌。在一些方面中，提供控制肿瘤细胞的生长速率，侵入速率或存活的方法，所述方法 包括向受试者施用本文定义的非侵入性或非致病性螺杆菌。在另一个方面中，提供在肿瘤细胞中诱导调亡的方法，所述方法包括向受试者施 用本文定义的非侵入性或非致病性螺杆菌。其它的方面提供下调免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用表达生物活性 剂的非侵入性或非致病性细菌。在另一个方面中，提供治疗变应性自体免疫的或其它的免疫调节异常的疾病状态 的方法，所述方法包括向受试者施用表达生物活性剂的非侵入性或非致病性螺杆菌。所述受试者可以是任何灵长类动物，马，牛，猪，绵羊，啮齿动物，鱼或鸟。在一个实 施方案中，所述受试者是人。施用可以方便地是通过鼻或口进行。在治疗的情况中，即当生物活性剂向受试者的递送的生物效果有益于该受试者 时，施用优选地以“治疗有效量”进行，这足以向受试者显示益处。这样的益处可以是至少 缓和或减少至少一种症状的严重性或发生。在预防的情况中，该量可以例如通过增加免疫 应答减少对随后受到致病性刺激的受试者的不利影响。所用实际的量，和施用的速率和时 间进程将取决于施用的目的，例如鉴于所述刺激的性质和严重性所寻求的生物效果，并且 是通常优化的目标。治疗的处方，包括预防性接种疫苗，例如在剂量等上的决定，在一般的 执业者和其它的医生的责任范围内。
包括螺杆菌的组合物可以按照本发明单独施用或组合以其它的治疗同时或顺序 地进行施用。本发明还提供包含公开的螺杆菌的药物组合物。这样的药物组合物在优选地适合 应用于黏膜上的一个实施方案中。按照本发明并且按照本发明应用的药物组合物除了螺杆菌之外，可以包含药用赋 形剂，载体，缓冲剂，稳定剂或本领域技术人员熟知的其它物质。这些物质应该是无毒的并 且应该不会干扰活性成分的功效。载体或其它物质的精确的性质可以取决于施用的路径。 对于口服施用而言，可以应用肠胃外可接受的水溶液，所述水溶液无致热原并且具有适合 的PH，等渗性和稳定性。本领域的相关技术人员完全能够制备适合的溶液。如果需要，可以 包括防腐剂，稳定剂，缓冲剂，抗氧化剂和/或其它的添加剂。如所讨论的，用于按照本发明 施用的包含螺杆菌的药物可以包括一种或多种营养物质，例如能源诸如葡萄糖，氨基酸等。在另一个方面中，本发明提供制备药物制剂的方法，所述药物制剂包含公开的配 制的螺杆菌以及适合于施用给个体的适合的载体介质。在一个实施方案中，所述药物适合 应用于个体的黏膜。在另一个方面，本发明提供表达异源生物活性多肽的非致病性螺杆菌，所述生物 活性多肽用于药用，例如用在通过外科手术或疗法，包括预防(“接种疫苗”)治疗人或动物 体的方法中。在一个实施方案中，本发明的方法可以用于治疗，预防或减轻疾病诸如癌症。所 述方法和递送系统还可以用于治疗或预防免疫/造血系统的疾病或病症，生殖系统的疾病 或病症，肌与骨骼系统的疾病或病症，心血管系统的疾病或病症，被描述为混合胎(mixed fetal)的疾病或病症，排泄系统的疾病或病症，神经/感觉系统的疾病或病症，内分泌系统 的疾病或病症，呼吸系统的疾病或病症，消化系统的疾病或病症和与结缔/上皮组织相关 的疾病或病症或由细菌、病毒或寄生虫感染导致的疾病或病症。在另一个实施方案中，本文所述的螺杆菌递送系统能够同时或顺序递送许多不同 的核酸分子，所述核酸分子编码能够治疗本文所述的许多病症或疾病的产物。而且，优选的 递送系统还将递送能够产生另外的理想生理作用诸如食欲抑制或增加的组合物。Panthel 等 2003 (Infection & Immunity, 71 :109_116)已经描述了在幽门螺杆菌 中的自杀系统的实例。这种系统将包含PhiX174裂解基因E的质粒引入幽门螺杆菌中。为 了消除所述菌株，应用在42°C进行5小时的温育。在体内，这意味着动物将饮用45-50°C的 饮料从而将胃环境的温度升高到超过42°C。第二个实例是L-Dap选择系统，其常用于使细菌突变体在补加平板上存活(见例 如 Kirata 等 1997 (Infection & Immunity，65 :4158_4164)。在该系统中，为了使 DapE 缺 陷型幽门螺杆菌突变体存活，动物受试者必须用失去的底物即二氨基庚二酸(DAP)补充它 们的饮食。为了消除突变体，接着停止DAP的消耗。因为其具有rdxA基因，第三种可能的系统涉及幽门螺杆菌的甲硝唑敏感性。rdxA 基因的过度复制对于哺乳动物细胞和大肠杆菌是有害的。然而，复制可以被细菌所耐受。因 此，可以改造本发明的螺杆菌物种以包含两个拷贝的rdxA，其阻止正常的突变-依赖型的 rdxA失去。将至少两个功能性rdxA基因引入螺杆菌基因组中导致形成对甲硝唑永久敏感 的螺杆菌菌株。Jeong等2000 (J. Bacteriol.，182 =5082-5090)显示通过功能性rdxA基因产生的硝基还原酶将甲硝唑从前药转化为杀菌化合物。活性化合物的作用方式导致螺杆菌 基因组的DNA断裂。现在本发明将仅参考下面的非限制性实施例来进一步进行描述。然而，应该理解 的是，下面的实施例是举例说明性的并且决不应该将其视为对本文所述发明的共性的限 制。具体而言，尽管本发明详细描述了具体的幽门螺杆菌菌株的应用，显而易见的是本文的 发现不受限于该菌株。棚列1讲#夕卜滅__棘汰薩本禾口·_1丨、舊描物对幽门螺杆菌的遗传操纵是不常见的。本实施例证实了本发明提供遗传转化的螺 杆菌，特别是转化的幽门螺杆菌的应用性。使用质粒和来自螺杆菌的质粒载体制备转化的 细菌，以前在非螺杆菌生物诸如大肠杆菌的操作中，已经将这作为了研究的对象。可以将在文献中所述的一些幽门螺杆菌质粒成功地转化到幽门螺杆菌/大肠杆 菌穿梭载体中。已经报道了许多大肠杆菌菌株对于DNA吸收天然是有活性的。还已经将对 于链霉素，利福平和甲硝唑的抗性标记成功转化到大多数幽门螺杆菌的菌株中。然而，尽管 可以将来自大肠杆菌和其它生物的质粒DNA引入幽门螺杆菌中，但是不能稳定地维持这些 质粒。而且，不能将幽门螺杆菌质粒转化到大肠杆菌或螺杆菌物种中。因此，必须构建幽门 螺杆菌穿梭载体。在图1和2中所显示的示意图中举例说明了来自幽门螺杆菌的两个质粒。已经 对载体PHPAI (2. 8kb)(图1)和pHP3 (3. 4kb)(图2)进行了测序并且揭示了 pHPAl通过θ 质粒复制模式进行复制。与滚环复制质粒相反，在复制过程中，θ (theta)质粒不产生单 链DNA中间体，并且因此是更稳定的载体候选物，因为它们不易发生不正常的重组。此外， pHPAl的复制起点(ori)包含一系列的涉及复制控制和维持稳定的拷贝数的定向重复序列 (称为“重复区”)。载体PHP623共享许多这样的特征。在下面显示了这两个载体的核苷酸 序列。(1)以双链形式显示的质粒pHPl (上面的链是SEQ ID NO :1 ；下面的链是SEQ ID NO 2)GTCATGCGCGTTGTTTTTMTTACATTTTAMCMCTTGTTGTTGTTTTTACATGTTTTACTCGC 65CAGTACGCGCAACAAAAATTAATGTAAAATTTGTTGAACAACAACAAAAATGTACAAAATGAGCGATGCGCGCGCGTGAGGGATTGGGGGTTGCMCCCCCTAMTMCGMGCTGTAGGGTTTCTCATT 130TACGCGCGCGCACTCCCTAACCCCCAACGTTGGGGGATTTATTGCTTCGACATCCCAAAGAGTAA
TTTGTGGTGAAMTGMTAAMCAGMCTTCTTGCCMCACTMCAGMCTTCTTGCCMCACTA 195AAACACCACTTTTACTTATTTTGTCTTGAAGAACGGTTGTGATTGTCTTGAAGAACGGTTGTGATACAGMCTTCTTGCCMCACTMCAGMCTTCTTGCCMCACTMCAGMCTTCTTTATTTTAM 260TGTCTTGAAGAACGGTTGTGATTGTCTTGAAGAACGGTTGTGATTGTCTTGAAGAAATAAAATTTGTTATGATTATTMCMTTTTTAGACATMTMCAGCGTGTGMGATACTTTTGTAGCGGTATTT 325CAATACTAATAATTGTTAAAAATCTGTATTATTGTCGCACACTTCTATGAAAACATCGCCATAAACCTATGTGCGGCAAMTTTGGAGCMTTAGCTTGACTTGGTTGAGTTAGTGGGTTGGAGGATAGA 390GGATACACGCCGTTTTAAACCTCGTTAATCGAACTGAACCAACTCAATCACCCAACCTCCTATCTGAGGGCGACACCTCGTTAGGAGGTATCMTGTGAMGTATTTGTCGTATTAGTTCTAGTATTAGT 455CTCCCGCTGTGGAGCAATCCTCCATAGTTACACTTTCATAAACAGCATAATCAAGATCATAATCA
MTTCTCGCACMTTGCTATATTAGGCTTATTCGTGGTCTMCCCCTTGTTTATGGGGGTTGGCT 520TTAAGAGCGTGTTAACGATATAATCCGAATAAGCACCAGATTGGGGAACAAATACCCCCAACCGACGTTATMGCATACTGATACGATCACACTTATTATACACCAAMGATMGGAGTATAGAGTGGM 585GCAATATTCGTATGACTATGCTAGTGTGAATAATATGTGGTTTTCTATTCCTCATATCTCACCTTTTTGATCMTCAGATTTACAAAMGCGTTGAAMTATTAGATACACTCCCACAMCCCCACAMT 650AAACTAGTTAGTCTAAATGTTTTTCGCAACTTTTATAATCTATGTGAGGGTGTTTGGGGTGTTTATGAGCTACAAAMCMGAMTACAAMCCGCATCMCAAMTMCAGAGACMTCATTAMGMT 715ACTCGATGTTTTTGTTCTTTATGTTTTGGCGTAGTTGTTTTATTGTCTCTGTTAGTAATTTCTTATACTATCAMGCATGAMTCMGAMGMGMCTAGMCCCACTCTMCCCCAAMCCCACACCA 780ATGATAGTTTCGTACTTTAGTTCTTTCTTCTTGATCTTGGGTGAGATTGGGGTTTTGGGTGTGGT
CTCAMGAGCCACAMCCACCCCMCACCATGCAMGATTTAGTGGTTAGCACCCCTAMGATM 845GAGTTTCTCGGTGTTTGGTGGGGTTGTGGTACGTTTCTAAATCACCAATCGTGGGGATTTCTATTMCCTMTATCACCTACCACMTMCGCTMTMGGTCMTCTAGGGAMTTGAGCGAMGGGM 910TTGGATTATAGTGGATGGTGTTATTGCGATTATTCCAGTTAGATCCCTTTAACTCGCTTTCCCTTGCCMTCTTTTATTCGCTATTTTTCAAAMCTCAMGCCCMGGGMTACCCTCATTCGTTTTGA 975CGGTTAGAAAATAAGCGATAAAAAGTTTTTGAGTTTCGGGTTCCCTTATGGGAGTAAGCAAAACTACCGCAAGATTTGAAACGCATGCTAAACATAGATATTTCTAATGAGCGCTTATCAGAAGTCGTTA 1040TGGCGTTCTAAACTTTGCGTACGATTTGTATCTATAAAGATTACTCGCGAATAGTCTTCAGCAATTTAAGCTGTGGGATAGCATTAAAACCGCTGATTTTTGGAAAATTAGCGAAACCGAAACTTCAATC 1105AATTCGACACCCTATCGTAATTTTGGCGACTAAAAACCTTTTAATCGCTTTGGCTTTGAAGTTAGATTCAAGAAAATTACATGCTTTTTAGTCGGTGTAAAATTGAATTGAACAAACCGAGTAAAGATTT 1170TAAGTTCTTTTAATGTACGAAAAATCAGCCACATTTTAACTTAACTTGTTTGGCTCATTTCTAAAGAAGTATTTAGAAATCCAACTCAACGATAACTATCAAGACTTACTCAACAATCTGGGCATGGGTC 1235CTTCATAAATCTTTAGGTTGAGTTGCTATTGATAGTTCTGAATGAGTTGTTAGACCCGTACCCAGAATACACTTCTTTCAATCTGTTAGAATTTCAAAGAGTGAGGGGTAAATACGCTAAAACGCTCTAT 1300TTATGTGAAGAAAGTTAGACAATCTTAAAGTTTCTCACTCCCCATTTATGCGATTTTGCGAGATACGCTTGCTCAAGCAATACAAAAGCACAGGGATTTTGAGCGTGGAATGGACTCAATTCAGGGAGCT 1365GCGAACGAGTTCGTTATGTTTTCGTGTCCCTAAAACTCGCACCTTACCTGAGTTAAGTCCCTCGATTTAGACATTCCAAAAGACTACAAAATGGAAAACATCGATCAAAAAGTCTTAACCCCCTCTCTCA 1430AAATCTGTAAGGTTTTCTGATGTTTTACCTTTTGTAGCTAGTTTTTCAGAATTGGGGGAGAGAGTAAGAACTCAGAAAAATCTACCCTTTTGAACACTTGAGCTATAAAAAAGAACGCAAAAGCCATTAC 1495TTCTTGAGTCTTTTTAGATGGGAAAACTTGTGAACTCGATATTTTTTCTTGCGTTTTCGGTAATGAAGCGCAAAGTAACCCACATTGATTTTTATTTTGAGCAATTTCCTTAAGGCGAAAATAAGAAACA 1560TTCGCGTTTCATTGGGTGTAACTAAAAATAAAACTCGTTAAAGGAATTCCGCTTTTATTCTTTGTAAACAAAGCCGACAAGCAACGCGCTCAAAGGGACATCAAGCTTGTAGCATGGGATATTCACAACC 1625TTTGTTTCGGCTGTTCGTTGCGCGAGTTTCCCTGTAGTTCGAACATCGTACCCTATAAGTGTTGGAAATCGCTAAAAGAAACGCAAAAGCCACTATGGAAGCTAGGTTTCTTGAATTGAAAACTTTGATC 1690TTTAGCGATTTTCTTTGCGTTTTCGGTGATACCTTCGATCCAAAGAACTTAACTTTTGAAACTAGGGCTATCAGTTCAGGAACAATGACAGTAGGAACAAATTAAAGATTGACAACACCACTTTTGAAAG 1755
CCGATAGTCAAGTCCTTGTTACTGTCATCCTTGTTTAATTTCTAACTGTTGTGGTGAAAACTTTCAATCAAATGTATTTACATGTATCTTAACCCTAAAAATAAGCATAACCCCCAAAAATTCCTTGTAT 1820TTAGTTTACATAAATGTACATAGAATTGGGATTTTTATTCGTATTGGGGGTTTTTAAGGAACATACCAACAAGACATTCGCATTGGAACTACTATATATCAATAGATACAGCCTAAAAAAAAGACAACTT 1885GGTTGTTCTGTAAGCGTAACCTTGATGATATATAGTTATCTATGTCGGATTTTTTTTCTGTTGAAGCTAGAAGAATTTAACCCCCCAAAATCCACCCTATCACCAACGAACCTATCAAGGAATTTGCAGA 1950CGATCTTCTTAAATTGGGGGGTTTTAGGTGGGATAGTGGTTGCTTGGATAGTTCCTTAAACGTCTATACATCGGCAAAACGATTAACATCACCAACTTCAATGTGGATCAATGCCATGAGGGAATCAGCA 2015TATGTAGCCGTTTTGCTAATTGTAGTGGTTGAAGTTACACCTAGTTACGGTACTCCCTTAGTCGTACTACCTGACAATCACTAGGATCGTGAACTGGACGTAATCGGATCTGTATTTGGTCCAGATGTGG 2080TGATGGACTGTTAGTGATCCTAGCACTTGACCTGCATTAGCCTAGACATAAACCAGGTCTACACCATAAGCCTGGGACTTCTCAAGCCTTTCATTGCTAAAGTGAGAAAATTTGGGGATTGGTTCAAGAA 2145TATTCGGACCCTGAAGAGTTCGGAAAGTAACGATTTCACTCTTTTAAACCCCTAACCAAGTTCTTCACTACAGGTGAAAAGACAGATGCATGCTGACTAAACTCATAGAAAAACTGAATCACGAAAGAAA 2210GTGATGTCCACTTTTCTGTCTACGTACGACTGATTTGAGTATCTTTTTGACTTAGTGCTTTCTTTGAATGCAAGCAGAAAACAAACACCTAAAAGAACAAGGACTAGAAAAAATCTACACTCAAAAAGAC 2275CTTACGTTCGTCTTTTGTTTGTGGATTTTCTTGTTCCTGATCTTTTTTAGATGTGAGTTTTTCTGTACGAGCAGTTAAAAGAACAGCATTTGAAAGAAATTGAAGCACTCAAAAAAGAAATCCAAAAAAC 2340ATGCTCGTCAATTTTCTTGTCGTAAACTTTCTTTAACTTCGTGAGTTTTTTCTTTAGGTTTTTTGCAAGCAAGAAACATACACGCAACCAAAAGAATGTAGCCATTTAGCGCATTCTTTTAGCCCTAATT 2405GTTCGTTCTTTGTATGTGCGTTGGTTTTCTTACATCGGTAAATCGCGTAAGAAAATCGGGATTAACATTCTTTCAATCAAAATCCGACTAATTCATCGGCTAAACGCTAAAAATCGCTTAAAACGAAAAA 2470GTAAGAAAGTTAGTTTTAGGCTGATTAAGTAGCCGATTTGCGATTTTTAGCGAATTTTGCTTTTTTACAAAGCAAAAAACTTCATTCCCCTTTTAGTCGTTAACCATTTAGCCAATCTAACTAGTTTAGC 2535ATGTTTCGTTTTTTGAAGTAAGGGGAAAATCAGCAATTGGTAAATCGGTTAGATTGATCAAATCGATCTAAAGGCGAATCTATCTTGTGTTAGACATCCAACCTTACCAAAACCGCAGAGCGAGCTTAAG 2600TAGATTTCCGCTTAGATAGAACACAATCTGTAGGTTGGAATGGTTTTGGCGTCTCGCTCGAATTCAGAGATTCAAGCGGTTTTGCACGATTGTTTGCTGCCAAGAAAACCAACAAGCGAAGTAAGGCGCA 2665TCTCTAAGTTCGCCAAAACGTGCTAACAAACGACGGTTCTTTTGGTTGTTCGCTTCATTCCGCGTTAGACAAMGCGCATCGCAGTTTGAMGCGTAGGCGTCAGMGTGGTTTGCGTTAGMTCAMCA 2730ATCTGTTTTCGCGTAGCGTCAAACTTTCGCATCCGCAGTCTTCACCAAACGCAATCTTAGTTTGTAGATAGCGCAMCCTGGCGTTAGGCTAAAAMCCCCTAAAMCTAAMCCCCAAMTATGTAGTGC 2796TCTATCGCGTTTGGACCGCAATCCGATTTTTTGGGGATTTTTGATTTTGGGGTTTTATACATCACG(2)以单链形式显示的质粒pHP3 (SEQ ID NO 3)TCTACACAATTAACAATCTTTAGCTACAATAACAGCGTGTGAAGATGCTTTCACAGCGGT 60ATTTCCTATGTGCGGCAAAATTTGGAGCAATTAACTTGACTTGGTTGGGTTAGTGGGTTG 120GAGGATAGAGAGGGCGACACCTCGTTAGGAGGTATCAATGTGAAAGTATTTGTCGTATTA 180GTTCTAGTATTAGTAATTCTCGCACAATTGCTATATTAGGCTTATTTGTGGTCTAACCCC 240TTGTTTATGGGGGTTAGATCCTTATAAGCATACTGATACGATCACACTTATTATACACCA 300
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GAAGCCAATCTTTTATTCGCTATTTTTCAAAGGCTTAAAGATCAAGGGAATACCCTCATT720
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AGTGGTAATCTTGACACAGCCACTATATTAAAACCTTAGCGTTTTAATAACCCTTATAAG3000
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ATTAAAAGGCGCTTAAATGCCCATGAATACGAATTTTGAACAGCTTAGAAAACAAGAATT3120
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GCAAAAACAAAAAATACAAACTTACATAGACAAGATAACACCAAGTATTTTGAGCGGTTT3240
TGATCAAAAATTCAAAGAAATTATAGAAAATCTATCAAATGAATTTGAAAAAGAAAAATC3300
CACACCACTCAAAGAGCCACAAACCACCCCCACACCATGCAAAGATTTAGTGGTTAGCAC3360
CCCTAAAGATAACACCTATACCACCTACCACAATAACGCTAATAAGGTCAATCTAGGGAA3420
ATTGAGCGAAAGGGAAGCCAATCT3444
在SEQ ID NO :4中提供克隆的另外的核苷酸序列，其包括编码45个氨基環_的肽的
135bp片段(SEQ ID NO :5)。这种更小的45个氨基酸的肽是丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原 的免疫原性多肽。在下面用指定的具有下划线的135个核苷酸显示编码所述45个氨基酸 肽的核酸序列(SEQ ID NO 5)。CATGAGCAOG AATCCTAAAC CTCAAAGAAA AACCAAACGT AACACCAACC GTOGCCCACA GGA0GTCAAGTTCCOGGGTG GOGGTCAGAT OGTTGGTGGA GTTTACTTGT TGC0G0GCAG GGGCCCTAGA TTGGGTGTGCGCGCGAOGAG GAAGACTTCC GAGCGGTCGC AACCTCGAGG TAGACGTCAG CCTATCCCCA AGGCA0GTCGGCCCGAGGGC AGGACCTGGG CTCAGCCCGG GTACCCTTGG CCCCTCTATG GCAATGAGGG TTG0GGGTGGGCGGGATGGC TCCTGTCTCC CCGTGGCTCT CGGCCTAGCT GGGGCCCCAC AGACCCCCGG CGTAGGT0GCGCAATTTGGG TAAGGTCATC GATACCCTTA CGTGOGGCTT CGCOGACCTC ATGGGGTACA TAC0GCT0GTOGGCGCCCCT CTTGGAGGCG CTGCCAGGGC CCTGGCGCAT GGCGTCCGGG TTCTGGAAGA CGG0GTGAACTATGCAACAG GGAACCTTCC TGGTTGCTCT TTCTCTATCT TCCTTCTGGC CCTGCTCTCT TGCCTGACTGTGCCCGCTTC AGCCTACCAASEQ ID NO 4AATCCTAAAC CTCAAAGAAA AACCAAACGT AACACCAACC GTCGCCCACA GGACGTCAAG TTCCCGGGTGGCGGTCAGAT CGTTGGTGGA GTTTACTTGT TGCCGCGCAG GGGCCCTAGA TTGGGTGTGC GOGOGSEQ ID NO 5将SEQ ID NO 4的核酸在SEQ ID NO 4的nt504位置(以粗体/下划线指出，对 应于蛋白质产物的氨基酸残基168)克隆到幽门螺杆菌26695的hopE基因(SEQ ID NO :6， 在下面显示)中，从而使表达产物作为HopE基因产物的外露表面环的部分定位。这种构建 体，被称为载体pTMI03.8(图3)，在大肠杆菌的表面上进行表达。ATGCCATAGC ATTTTTATCC ATAAGATTAG CGGATCCTAC CTGACGCTTTTTATCGCAAC TCTCTACTGT TTCTCCATAC CCGTTTTTTG GGCTAACAGGAGGAATTAAC C1 ATGGAATTTA TGAAAAAGTT TGTAGCTTTA GGGCTTCTAT CCGCAGTTTT
51AAGCTCTTCGTTGTTAGCCGAAGGTGATGGTGTTTATATAGGGACTAATT
101ATCAGCTTGGACAAGCCCGTTTGAATAGTAATATTTATAATACAGGGGAT
151TGCACAGGGAGTGTTGTAGGTTGCCCCCCAGGTCTTACCGCTAATAAGCA
201TAATCCAGGAGGCACCAATATCAATTGGCATGCTAAATACGCTAATGGGG
251CTTTGAATGGTCTTGGGTTGAATGTGGGTTATAAGAAGTTCTTCCAGTTC
301AAGTCTTTTGATATGACAAGCAAGTGGTTTGGTTTTAGAGTGTATGGGCT
351TTTTGATTATGGGCATGCCACTTTAGGCAAGCAAGTTTATGCACCTAATA
401AAATCCAGTTGGATATGGTCTCTTGGGGTGTGGGGAGCGATTTGTTAGCT
451GATATTATTGATAACGATAACGCTTCTTTTGGTATTTTTGGTGGGGTCGC
501TATCGGCGGTAACACTTGGAAAAGCTCAGCGGCAAACTATTGGAAAGAGC
551AAATCATTGAAGCTAAGGGTCCTGATGTTTGTACCCCTACTTATTGTAAC
601CCTAACGCTCCTTATAGCACCAAAACTTCAACCGTCGCTTTTCAGGTATG
651GTTGAATTTTGGGGTGAGAGCCAATATTTACAAGCATAATGGCGTAGAGT
701TTGGCGTGAGAGTGCCGCTACTCATCAACAAGTTTTTGAGTGCGGGTCCT
751AACGCTACTAATCTTTATTACCATTTGAAACGGGATTATTCGCTTTATTT
801AGGGTATAACTACACTTTTTCTCGAGATCT GCAGCTGGTA CGATATGGGA ATTCGAAGCT TTCTAGAACAAAAACTCATC TCAGAAGAGG ATCTGAATAG CGCCGTCGAC CATCATCATCATCATTGAGT TTAACGGTCT CCAGCTTGGC TGTTTTGGCG GATGAGAGAAGATTTTCAGC CTGATACAGA TTAAATC (SEQ ID NO 6)简而言之，成功分离hopE基因的一种方法是通过使用Taq DNA聚合酶从幽门螺杆 菌22695中进行扩增。可以通过使用DNA合成仪诸如Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc. model 332 (ABI ；Mississauga, Ontario, Canada)，BamHI ^ ^ 白勺字弓L 5' AAGGATCCGATAGGAATGTAAAGGAATGG-3' (SEQ ID NO :7)和包含 EcoRI 位点的下游引物 5' CCGAATTCTAAAGGCATGAACGCTTGCA-3‘ (SEQ ID NO :8)。可以以与 lac 启动子相同的方 向将得到的PCR片段平端克隆到pBluescript II KS(+)中的EcoRV位点。接着，可以设计PCR引物以将两个独特的限制性酶切位点克隆到hopE基因中以插 入来自丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原的135bp的免疫原编码序列。可以使用如下的递降扩 增程序来进行使用TaqDNA聚合酶的PCR扩增。设计PCR热循环仪的程序为开始在96°C变 性4分钟，随后在65°C的起始退火温度上(达90s)进行18个循环，每个连续的循环减少 0. 5°C，在72°C延伸6分钟，并在96°C变性1分钟。在完成开始的18个循环后，可以通过使 用72°C的延伸和96°C的变性步骤，和55°C的不变退火温度来进行另外的14个扩增循环。 接着，通过柱纯化得到的扩增子，用乙醇沉淀，并通过用DNA聚合酶的Klenow片段消化制造 平端。可以用限制性酶消化所述PCR产物以去除模板DNA，将其连接于适合的载体诸如在阿 拉伯糖诱导启动子控制下的PTM103. 8，并转化到大肠杆菌JM105中。可以在PCR扩增反应中通过使用寡核苷酸引物5' -AGATCTAAGGACGTC-3‘ (SEQ ID NO 9)加反应测序引物鉴定重组克隆。可以对鉴定的克隆进行测序以证实插入的限制 性核酸内切酶位点在框中并且在hopE基因中没有引入错误。接着，可以使用标准技术插入 来自丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原的135bp的免疫原性编码序列。
一旦产生载体PTMI03.8，将其转化到大肠杆菌中，在37°C培养所述大肠杆菌。接 着，收获细胞并通过蛋白质印迹证实HCV插入物的表达。简而言之，如下进行该程序。从约20个平板收集细胞，将其重悬在在IOmM Tris-HCl (ρΗ8· 0)中具有 50mg 的 DNase I (Boehringer Mannheim)的 20 % 蔗糖中。接 着，用French pressure cell在15，0001b/in2破坏细胞。将破裂的细胞覆盖在在IOmM Tris-HCl (pH8. 0)中的Iml的70%和6ml的70%蔗糖的蔗糖分级梯度上。收集外膜级分， 在150，OOOXg上沉淀，并将所述沉淀物重悬在100 μ 1的蒸馏水中。或者，可以将来自500ml的对数期培养物的外膜溶解在IOmM Tris-HCl (pH 8. 0)-3% η-辛基-聚氧化乙烯中，在23°C温育1小时，并在173，000X g离心30分钟。将 沉淀物重悬在IOmM Tris-HCl-3% η-辛基-聚氧化乙烯-5mMEDTA(pH8. 0)中，在23°C温 育1小时，并在173，OOOXg离心30分钟，收集上清液。蛋白质免疫印迹法指示在第二个 溶解步骤的上清液中的HCV/hopE的存在。将包含HCV/hopE的上清液与等体积的0. 125M Tris-HCKpH 6. 8),4% (wt/vol)十二烷基硫酸钠(SDS)，和 20% (vol/vol)甘油混合并 进行SDS-12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。如果需要，可以将HCV/hopE条带从凝胶的 未染色部分切除并在4°C过夜洗脱到IOmM Tris-HCl (pH8.0)，ImMEDTA(pH8.0)，和IOOmM NaCl中。接着，可以在SDS-PAGE凝胶上运行洗脱上清液以检查纯度，并使用标准技术进 行蛋白质免疫印迹法。例如，可以以15yg/泳道的浓度上载分离的外膜。接着，在不连续 的12%聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE进行电泳。接着，用考马斯亮蓝对蛋白质进行染 色。对于蛋白质免疫印迹法，可以将未染色的凝胶电印迹到Immobilon-P膜(Millipore， Bedford, Mass.)上。在23°C，用在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的3%牛血清白蛋白(BSA ； Boehringer Mannheim) -0. 1% Tween 20 (Sigma)封闭 2 小时后，接着，在 37°C，将所述膜与 在BSA-0. 05%吐温20中的1/10，000稀释的抗-HCV兔抗血清一起在PBS中温育1小时。 接着，所述膜用PBS洗涤并与1/5，000稀释的碱性磷酸酶缀合的二抗(Bio-Rad，Richmond， Calif.) 一起在37 °C温育1小时。用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP, Calbiochem, LaJolla, Calif.)和氮蓝四唑(NBT，Sigma)检测结合的抗体。实施例2进行稳定表达的表达载体和抗原的选择因为HopE是幽门螺杆菌的天然蛋白质并且为该生物所耐受，因此可以形成用于 在幽门螺杆菌中表达外源抗原或其它异源基因产物的构建体。如上述可以容易开发的其它 的幽门螺杆菌/大肠杆菌穿梭载体包括，例如，包含两个质粒复制起点的载体和适合于每 个宿主的标记。标记可能包括氯霉素/卡那霉素抗性基因以及可以由大肠杆菌和幽门螺杆 菌转录系统二者识别的启动子。可以通过使用许多大肠杆菌质粒(例如pBR32》来满足对于在大肠杆菌中复制的 要求。构建的穿梭载体可以在大肠杆菌和幽门螺杆菌二者中进行复制的体外测试，并且 与在文献中所述的现存的穿梭质粒进行比较。理想地，待表达的抗原或其它异源基因产物的选择将是对于幽门螺杆菌和大肠杆 菌无毒并且在递送到哺乳动物的选定位点时，具有高度免疫原性(或具有另外的理想的性 质)的抗原和其它异源基因产物。在用于哺乳动物免疫的被表达抗原的情况中，这样的位 点可以是黏膜位点。
如在实施例1中所述，可以在大肠杆菌的表面表达hopE/HCV核心抗原融合蛋白。 PTMI03. 8的产物(图幻优选地靶向幽门螺杆菌外膜，从而使其在黏膜环境中显示HCV核心 抗原。已经对作为人抗原的破伤风类毒素(TT)进行了广泛的研究，并且对针对其的免 疫应答进行了特征鉴定。当在细菌孢子的表面上显示，通过口服或鼻内施用时，TT激发良 好的黏膜免疫应答(Due & Cutting, 2003, ExpertOpinion Biol Ther, 3 (8), 1263-70) 所 述破伤风毒素C片段可以融合到上述的hopE基因产物中或被改造以包含膜固着点和细胞 表面靶序列。该系统的优势是存在充分表征的鼠模型来评价接种疫苗程序的有效性，而在 HCV的情况中，已知的鼠模型典型地依赖于免疫缺陷型小鼠。已经显示用巨细胞病毒(CMV) 的gB蛋白质针对致死剂量的表达gB抗原的被改造的牛痘病毒来免疫小鼠。因此，可以使 用在实施例1中所述的方法构建包含取代HCV抗原的gB抗原的穿梭载体诸如本文所述的 那些。可以在穿梭载体中使用许多启动子。理想地，所用的启动子可通过螺杆菌的天 然体内建群机制或通过用无毒的食品或可以食用的化学品诱导来进行诱导。例如来自幽 门螺杆菌组氨酸激酶HP165，被报道通过酸性pH进行诱导，并且可以作为涉及胃黏膜建群 (colonization)的毒力因子的启动子是一种这样的启动子。这种启动子的益处是可以用仅 在暴露于胃黏膜的酸性环境时才表达的外源抗原来体外制备构建体。其它的启动子包括在pTMI03. 8中所用的启动子和FlaB sigma M启动子 (Josenhans 等，1998，FEMS Microbial Lett.，161 (2)，263-73)，在许多组成型和可诱导的 大肠杆菌系统中使用的广泛研究的T7启动子和在厌氧环境中诱导的沙门氏菌的nir B启 动子(Chatfield 等，1992，Biotechnology，10(8) :888-92)。可以利用 Angelini 等(2004) (Plasmid,51 :101-107)发展的系统测试这些启动子的任一种在幽门螺杆菌中发挥作用的 能力，所述系统使用CAT和GFP报告基因作为幽门螺杆菌质粒载体中启动子活性的指示。表达的靶位点将依赖于所用的抗原或其它基因产物。最初的研究集中在HopE蛋 白和融合多肽上，其将表达的多肽(例如，抗原)靶向到幽门螺杆菌的细胞表面上。质粒稳定性也是非常重要的，尽管抗生素抗性基因作为质粒维持的选择性决定子 的用途可以用于体外，在体内则实用性较弱。一种备选方案为平衡致死系统，例如，在沙门 氏菌属中失活使用的asd基。天然存在于幽门螺杆菌中的asd基因编码天冬氨酸酯-半醛 脱氢酶(diaminopimelic酸(DAP)的生物合成途径中的酶，革兰氏阴性细菌细胞壁糖的基 本组分)。在DAP缺失的条件下，asd突变体进行裂解。由于DAP并不存在于哺乳动物组织 中，这种平衡致死系统要求所有存活的幽门螺杆菌携带包含重组asd基因的质粒。为了使用asd基因系统，利用标准基因敲除方案灭活asd基因的基因组拷贝。随 后这种幽门螺杆菌菌株将只能在提供DAP或具有包含asd基因的质粒时生长。可以用于类似目的的其它系统包括大肠杆菌肠毒素(enterotoxin)或霍乱毒素 (cholera toxin) (CT)作为黏膜佐剂。还可以使用佐剂强化黏膜免疫反应。两种这类佐剂 为CT和大肠杆菌肠毒素(LT)，其中将表达的抗原融合到LTB和CTB突变体上，其保持它们 的强效黏膜佐剂特性但具有显著减弱的毒性。实施例3毒力，LD^n如在实施例1和2中所述，基于螺杆菌的载体诸如pHP3和pHPl能够提供针对在哺乳动物诸如小鼠或人中的感染的保护。在本实施例中，使用小鼠模型来证实使用基于螺 杆菌的系统将药理学活性目标分子递送给哺乳动物包括人的应用性。使用鼠模型来证实幽 门螺杆菌的转基因菌株体内激发针对表达的表面抗原的血清学反应的活性。用野生型幽门螺杆菌来感染小鼠，同时如在实施例2中所述用温度敏感性的幽门 螺杆菌管饲接种其它的小鼠。按照在表1中显示的计划表，对来自对照和测试动物的血清 测试抗体，并且在处死的动物上进行胃组织学研究。还可以使用小鼠尿素呼吸测试。如在表2中显示，观察到毒力减少了 50% (从75%到40% )。特异性抗体滴度在 基线上增加4倍，显示血清学反应。在基线，12，M，48周采血清样品。在这些时间，处死10， 10和20只动物并且进行胃的组织学研究。^ 1体内研究
权利要求
1.组合物，其包括含有核酸的螺杆菌属细胞，所述核酸包含(a)至少一种编码与分泌信号肽连接的非螺杆菌的药理学活性目标分子的非螺杆菌序 列；和(b)能控制所述非螺杆菌序列在所述螺杆菌属细胞中表达的调节序列；其中所述螺杆 菌属细胞不是DapE突变菌株。
2.按照权利要求1的组合物，其中所述螺杆菌属的细菌是幽门螺杆菌。
3.组合物，其包括含有核酸的幽门螺杆菌细胞，所述核酸包含(a)编码包含非螺杆菌的药理学活性目标分子的融合蛋白的序列，其可操作连接于(b)诱导型启动子序列；其中所述幽门螺杆菌细胞不是DapE突变菌株。
4.按照权利要求3的组合物，其中所述序列在质粒载体中。
5.药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求4的组合物，和可药用的稀释剂、载 体、佐剂或它们的组合。
6.按照权利要求3的组合物，其中所述幽门螺杆菌还包含编码免疫调节多肽的第二核 酸分子。
7.按照权利要求2的方法，其中所述幽门螺杆菌是菌株沈695。
8.按照权利要求1的组合物，其还包括佐剂。
9.按照权利要求1的组合物，其中所述螺杆菌属细胞是减毒的螺杆菌属细胞。
10.按照权利要求1的组合物，其中所述螺杆菌属细胞是非侵入性的。
11.按照权利要求1的组合物，其中所述螺杆菌属细胞是非致病性的。
12.按照权利要求1的组合物，其中所述调节序列是诱导型启动子。
13.按照权利要求1的组合物，其中所述调节序列是阿拉伯糖诱导的启动子。
14.按照权利要求1的组合物，其中所述调节序列是来自幽门螺杆菌组氨酸激酶HP165 的启动子。
15.按照权利要求1的组合物，其中所述调节序列是FlaBsigma讨启动子。
16.按照权利要求1的组合物，其中所述调节序列是T7启动子。
17.按照权利要求1的组合物，其中所述调节序列是沙门氏菌的nir启动子。
18.药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求27的组合物，和可药用的稀释剂、载 体、佐剂或它们的组合。
19.权利要求1的组合物，其中所述幽门螺杆菌是菌株沈695。
20.按照权利要求1的组合物，其还包括佐剂。
21.按照权利要求1的组合物，其中所述幽门螺杆菌细胞是减毒的幽门螺杆菌细胞。
22.按照权利要求1的组合物，其中所述幽门螺杆菌细胞是非侵入性的。
23.按照权利要求1的组合物，其中所述幽门螺杆菌细胞是非致病性的。
24.按照权利要求1的组合物，其中所述诱导型启动子是阿拉伯糖诱导的启动子。
25.按照权利要求3的组合物，其中所述诱导型启动子是来自幽门螺杆菌组氨酸激酶 HP165的启动子。
26.按照权利要求3的组合物，其中所述诱导型启动子是沙门氏菌nir启动子。
27.按照权利要求3的组合物，其中所述融合蛋白包含螺杆菌属序列。
28.按照权利要求3的组合物，其中所述融合蛋白包含表层蛋白质序列。
29.按照权利要求28的组合物，其中所述表层蛋白质是HopE。
全文摘要
本发明涉及细菌递送系统，更具体地，本发明公开了包含药理学活性目标分子的基于螺杆菌的制剂，以及制备和使用所述制剂的方法。具体而言，提供了幽门螺杆菌载体，载体质粒和重组细胞，其包括有效用于针对疾病的治疗性处理和/或接种疫苗的药理学目标分子的序列。在黏膜表面诸如胃黏膜或鼻膜提供所述药理学活性分子的递送，从而提供药理学活性剂的有效和持续的递送。还提供载体和穿梭载体构建体。
文档编号A61K48/00GK102078622SQ20101051082
公开日2011年6月1日 申请日期2005年8月12日 优先权日2004年8月13日
发明者巴里·J·马沙尔 申请人:巴里.J.马沙尔