专利名称：肠道病毒71型感染的7日龄小鼠模型的建立方法
技术领域：
本发明涉及一种肠道病毒71型感染的7日龄小鼠模型的建立方法。
背景技术：
肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属，是引起婴幼儿手足口病的 主要病原之一。EV71感染的主要症状是手、足、口等部位皮疹或疱疹，部分患儿可并发无菌 性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、脊髓灰质炎样麻痹等神经系统并发症，呼吸道感染 和心肌炎等，可致残、致死。自2008年安徽阜阳爆发手足口病以来，EV71的感染呈加剧的 趋势，已经成为备受关注的公共卫生问题，但目前EV71的感染途径、致病机制及流行规律 仍不明确，并且缺乏有效的治疗药物及疫苗。缺乏成熟稳定的动物模型是造成上述情况的最重要的原因之一。目前，国内外采 用的动物模型都是4日龄以内的乳鼠，但这种模型很不稳定，给EV71致病机理、临床治疗及 疫苗研发带来了很大困难。因此，稳定的EV71感染动物模型就显得尤为重要。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种肠道病毒71型感染的7日龄小鼠模型的建 立方法，动物模型的建立可加深对肠道病毒71型病原学的了解，促进肠道病毒71型致病机 制的研究，用于高效抗病毒药物的筛选和疫苗的研制。本发明是通过以下技术方案实现的一种肠道病毒71型感染的7日龄小鼠模型的建立方法，包括以下步骤取7日龄 乳鼠，脑内注射病毒液，即得肠道病毒71型感染的小鼠模型。所述病毒液注射量为20 μ L，是通过以下方法制得的将EV71毒种，以 200 μ L/100mL细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞，37°C,5% CO2培养，每天观察细胞病变 情况；接种EV71后第2天，MA104细胞有约70%出现了凝集、皱缩，将整瓶细胞冻融后，离心 取上清，即得到EV71的病毒液。所述EV71毒种，为现有技术中已有的，常规取得即可，本发明对此无限制，不再赘 述。所述乳鼠为7日龄BALB/c小鼠。所述建立方法，还包括以下小鼠模型的鉴定步骤饲养上述接种肠道病毒71型的 小鼠，两天后，后肢出现反应迟缓，四天后后肢瘫痪，七天后死亡的，即为感染成功的小鼠模 型。本发明成功地建立了稳定的肠道病毒71型感染的7日龄小鼠模型，其后肢瘫痪率 一般为70% 100%，死亡率为30 100%。本发明为科研人员研究肠道病毒71型病原 学、肠道病毒71型致病机制以及高效抗病毒药物的筛选和疫苗的研制提供了基础，具有广 阔的应用前景。
图1为临床分离毒株的RT-PCR鉴定的电泳图，其中，M = Maker (D2000)，N=阴性 细胞对照，B =空白试剂对照，1 =分离毒株。图2为病毒组动物后肢瘫痪示意图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1建立感染肠道病毒71型的小鼠模型步骤如下1、EV71的分离鉴定本发明所采用的EV71毒株是从临床的重症手足口病人的大便标本中分离的，同 时采用人横纹肌肉瘤细胞株(RD)、恒河猴肾细胞株(MA104)和非洲绿猴肾细胞株(Vero)三 种细胞对标本中的病毒进行分离，结果三种细胞上菌出现了细胞病变，传代后冻存毒种。然 后提取分离到的EV71的基因组RNA，逆转录成cDNA，采用EV71国家标准引物对分离毒株进 行鉴定，结果表明分离毒株在226bp处出现了很亮的条带(如图1所示)，可证实从临床手 足口重症病人大便标本中分离的毒株为EV71。2、EV71感染动物模型的建立2.1小鼠的准备购买清洁级的新生BALB/C乳鼠(带母鼠)两组，每组乳鼠6只，25°C、湿度50%， 分格饲养在P2实验室的净化动物饲养柜内，每天观察动物生长情况。连续观察至第7天， 两组BALB/C乳鼠生长状态良好。2. 2毒种的准备将分离的EV71毒种，以200yL/100mL细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞， 37°C、5% CO2培养，每天观察细胞病变情况。接种EV71后第2天，MA104细胞有约70%出 现了凝集、皱缩，将整瓶细胞冻融后，离心取上清，即得到EV71的病毒液。2. 3EV71感染动物模型的建立2. 3. 1动物分组将两组动物分别设为病毒组和正常对照组，病毒组脑内接种EV71病毒，正常对照 组脑内接种含2%胎牛血清的1640培养液。2·3·2接种EV71采用无菌的微量进样器，病毒组每只BALB/C乳鼠脑内注射病毒液20 μ L，正常对 照组每只BALB/C乳鼠脑内注射含2%胎牛血清的1640培养液20 μ L。然后将动物按相同 的条件饲养在净化动物饲养柜内，每天观察动物。2. 3. 3接毒后的观察前两天病毒组和正常对照组均无异常；第3天病毒组动物后肢出现反应迟缓，正 常对照组无异常；第4天病毒组全部出现明显后肢瘫痪，正常对照组无异常，取两组动物各 3只分别进行解剖固定；第7天病毒组动物均死亡，正常对照组无异常。病毒组动物瘫痪的 情况如图2所示，证明动物模型建立成功。
权利要求
一种肠道病毒71型感染的7日龄小鼠模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤取7日龄乳鼠，脑内注射病毒液，即得肠道病毒71型感染的小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的肠道病毒71型感染的7日龄小鼠模型的建立方法，其特征在 于所述病毒液注射量为20 μ L，是通过以下方法制得的将EV71毒种，以200 μ L/100mL细 胞培养瓶的接种量接种MA104细胞，37°C、5% CO2培养，每天观察细胞病变情况；接种EV71 后第2天，MA104细胞有约70%出现了凝集、皱缩，将整瓶细胞冻融后，离心取上清，即得到 EV71的病毒液。
3.根据权利要求1所述的肠道病毒71型感染的7日龄小鼠模型的建立方法，其特征在 于还包括以下小鼠模型的鉴定步骤饲养上述接种肠道病毒71型的小鼠，两天后，后肢出 现反应迟缓，四天后后肢瘫痪，七天后死亡的，即为感染成功的小鼠模型。
全文摘要
本发明公开了一种肠道病毒71型感染的7日龄小鼠模型的建立方法取7日龄乳鼠，脑内注射病毒液，即得肠道病毒71型感染的小鼠模型。所述病毒液注射量为20μL，是通过以下方法制得的将EV71毒种，以200μL/100mL细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞，37℃、5％CO2培养，每天观察细胞病变情况；接种EV71后第2天，MA104细胞有约70％出现了凝集、皱缩，将整瓶细胞冻融后，离心取上清，即得到EV71的病毒液。本发明成功地建立了稳定的肠道病毒71型感染的7日龄小鼠模型，为科研人员研究肠道病毒71型病原学、肠道病毒71型致病机制以及高效抗病毒药物的筛选和疫苗的研制提供了基础，具有广阔的应用前景。
文档编号A61K35/76GK101982181SQ20101053850
公开日2011年3月2日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者孟红, 宋楠楠, 岳盈盈, 李志会, 李鹏 申请人:山东省医学科学院基础医学研究所