专利名称：富勒烯衍生物的应用及其疫苗佐剂和疫苗制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种富勒烯衍生物，具体地说，涉及富勒醇颗粒C6(l0xHy(10 < y彡χ < 50)和富勒烯羧基衍生物C6tl (C(COOH)2)n(η为1_4的整数)以及该富勒烯衍生物的疫苗佐剂、疫苗制剂和其在疫苗领域的应用，属于生物技术和疫苗领域。
背景技术：
在预防和治疗重大疾病尤其是传染病方面，疫苗发挥了极其重要的作用。在疫苗的研究和开发过程中，主要通过抗原和疫苗载体或佐剂的设计优化来获得安全有效的疫苗。目前，临床上唯一批准使用的佐剂为铝佐剂，其能较好地促进机体的体液免疫水平，在疾病的预防过程中发挥了重要作用。然而，铝佐剂在一定程度上抑制了机体的细胞免疫水平，同时其在注射部位能引起一定的炎症和过敏反应，这些都在一定程度上限制了铝佐剂在临床中的广泛应用。目前研究开发的传统意义上的疫苗佐剂则由于安全性或有效性方面的缺陷难以投入临床。在免疫反应的发生过程中，抗原呈递细胞尤其是树突状细胞(Dendritic cells, DC)发挥着关键作用，通过抗原呈递细胞的活化，机体的细胞免疫和体液免疫反应得以快速有效地发生。因此，DC疫苗佐剂的研发成为目前人们关注的重点。近年来，纳米技术的快速发展已渗透至各个领域。纳米材料由于其粒径小、比表面积大而呈现出块体材料所不具备的新颖特性。同时纳米材料易进行表面修饰加工，从而实现不同的目的。这将为疫苗载体或佐剂的研发注入新的活力。富勒烯C6tl是一种由碳原子构成的纳米尺度的球状分子，具有独特的物理化学性质，在生物医学和材料科学领域具有极大的应用前景。由于富勒烯本身属疏水性物质，这极大地限制了其在生物医学领域的应用。近年来水溶性富勒烯及其衍生物的成功合成为其应用提供了保证。同时富勒烯衍生物在水环境体系中可通过与自身或其他物质的相互作用而团聚成纳米颗粒物，且其安全性问题得到了解决。在众多的纳米材料中，富勒烯衍生物尤其是金属富勒醇(GdOC82(OH)22)和富勒醇(C6tlOxHy)显示出良好的抗肿瘤活性(专利申请号 200610152170.7,200710175456. 1)。同时研究发现金属富勒醇和富勒醇主要通过增强小鼠机体的细胞免疫反应发挥其抑瘤作用，且金属富勒醇可诱导树突状细胞的成熟，且富勒烯衍生物具有良好的生物安全性(Ying Liu, Fang Jiao, Yang Qiu, et al. Biomaterials, 2009,30 :3934-3945. Ying Liu, Fang Jiao，Yang Qiu, et al. Nanotechnology, 2009, 20 415102. De Yang, Yuliang Zhao, Hua Guo，et al. ACS Nano，2010，4 1178—1186.)。
发明内容
本发明人在对富勒烯衍生物的研究过程中发现，其可作为佐剂，显著提高小鼠机体的细胞免疫和体液免疫水平。因此本发明的目的在于提供一种富勒烯衍生物，在其表面引入亲水基团，如羟基(-0H)、羧基(-C00H)等，能够解决富勒烯水溶性差的问题，为其应用奠定基础。本发明的另一个目的是提供所述富勒烯衍生物疫苗佐剂和疫苗制剂，以及该富勒烯衍生物在疫苗领域的应用，其可以增强疫苗的免疫原性，能够解决传统佐剂在安全性和/或有效性方面的缺陷。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一方面，本发明提供的一种富勒烯衍生物在制备用于基因传递的载体和/或用于提高疫苗的免疫原性的药物中的应用。进一步，所述富勒烯衍生物是由以下分子式1表示的富勒醇或以式2表示的富勒烯羧基衍生物式1 :C6。0xHy，其中，10 < y ^ X < 50 ；优选地，χ = y = 10-50 ；更优选地 χ = y = 15-25 ；式2 C6tl(C(COOH)2)n，其中，η为1_4的整数；优选地，η = 1-3 ；更优选地，η = 2。另一方面，本发明提供的一种疫苗佐剂，所述佐剂包含富勒烯衍生物，该佐剂可以与疫苗同时混合后对受试者进行免疫，还可以先为受试者注射该佐剂，之后对受试者进行疫苗免疫，或者可以对受试者进行疫苗免疫后再注射该佐剂，优选该佐剂与疫苗同时混合后对受试者进行免疫。所述佐剂与疫苗对受试者免疫的部位相同或不同。进一步，所述富勒烯衍生物在溶剂中的纳米颗粒物的直径范围为l-400nm。又一方面，本发明提供的一种疫苗制剂，所述制剂包含所述的疫苗佐剂。进一步，所述疫苗包括，但不限于艾滋病病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗和人乳头状瘤病毒疫苗等重大传染病疫苗。本发明人以编码艾滋病病毒包膜蛋白基因的(HIV-1 Env)表达质粒(DNA)为研究对象，比较了富勒烯衍生物作为佐剂对HIV DNA疫苗免疫原性的影响，发现该佐剂与DNA疫苗混合免疫小鼠后，可显著增强DNA的免疫原性，且在相同的免疫次数情况下，低剂量DNA+佐剂和单独高剂量DNA引发的免疫反应水平无显著差异。同时，相同剂量的DNA+佐剂在少免疫一次的情况下，所引发的免疫反应水平和单独免疫DNA 疫苗无显著差异。进一步，所述疫苗制剂的免疫途径选自皮下注射、滴鼻免疫、腹腔注射、肌肉注射和皮内注射，上述免疫途径均可发挥富勒烯衍生物的免疫佐剂作用。本发明提供的一种富勒烯衍生物疫苗佐剂与传统佐剂相比，其有益效果如下1.本发明提供的疫苗佐剂安全性好，对注射部位无明显的刺激作用；2.本发明提供的疫苗佐剂可显著提高机体的细胞免疫和体液免疫水平，同时可减少抗原的使用剂量或减少免疫次数；3.本发明提供的疫苗佐剂具有抗氧化和清除自由基的功能，在充当免疫佐剂的同时，还可能提高机体抗氧化的防御能力，使机体维持稳态。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图1为本发明富勒醇的原子力显微镜表征图片；图2为本发明富勒醇的扫描电子显微镜表征图片；图3为本发明富勒醇的动态光散射仪检测结果；图4为本发明富勒醇对HEK(Human embryonic kidney) 293细胞活力的影响；图5为本发明富勒醇对HEK293细胞形态的影响；
图 6 为本发明富勒醇对 NIH3T3(Mouse embryonic fibroblast cell line)细胞活力的影响；图7为本发明富勒醇对NIH3T3细胞形态的影响；图8为本发明富勒醇对HEK293细胞的转染效果；图9为本发明富勒醇对小鼠细胞免疫水平的影响；图10为本发明富勒醇对特异性抗体滴度的影响。图11为采用不同免疫途径时本发明富勒醇对小鼠细胞免疫水平的影响。
具体实施例方式下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。实施例1富勒醇C=(OH)^的合成首先，将Iml的40 %四丁基氢氧化铵溶液(TBAH)和2ml氢氧化钠溶液(2. 22g/ ml)加至30ml的C6tl (Sigma公司)甲苯溶液(1. 5mg/ml)中，剧烈搅拌下反应24h ；弃去有机相，并用真空旋转蒸发仪(RV06-ML 1-B，德国)除去水相；用50ml甲醇洗涤样品，甲醇通过真空蒸发除去，如此反复洗涤3-5次；之后，将IOml去离子水加至样品中，持续搅拌至溶液呈透明的红棕色，继续加入20ml去离子水，并用kphadex G-25色谱柱(Amersham公司，英国)纯化样品，最后真空干燥，即可获得富勒醇纳米颗粒。通过调节氢氧化钠的加入量可获得含不同数量羟基的富勒醇。利用原子力显微镜(Atomicforce microscopy, AFM) (BMT AFM3OOO,德国)和扫描电子显微镜(banning electron microscope, SEM) (S-4800,日本日立公司)对所得富勒醇进行表征，结果如图1和图2所示，富勒醇的平均粒径约为120nm。利用动态光散射粒度分析仪(DLS) (Zetasizer Nano，英国马尔文公司)检测所得富勒醇的电位，结果如图3所示，富勒醇表面带负电荷，平均电势约为-51. 6mv。利用X射线光电子能谱仪(XPS，日本电子株式会社)对富勒醇所含的羟基数量进行检测，结果见表1，由表1可知羟基(-0H)数量为(18. 78/55. 73) X60 = 20。表1不同碳原子的XPS检测结果
权利要求
1.一种富勒烯衍生物在制备用于基因传递的载体和/或用于提高疫苗的免疫原性的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述富勒烯衍生物是由以下分子式1表示的富勒醇或以式2表示的富勒烯羧基衍生物式 1 =C6tlOxHy，其中，10 < y ^ χ < 50 ；优选地，χ = y = 10-50 ；更优选地，χ = y = 15-25 ；式2 :C6(1 (C(COOH)2)n，其中，η为1_4的整数；优选地，η = 1-3 ；更优选地，η = 2。
3.一种疫苗佐剂，其特征在于，所述佐剂包含由以下分子式1表示的富勒醇或以式2表示的富勒烯羧基衍生物式 1 =C6tlOxHy，其中，10 < y ^ χ < 50 ；优选地，χ = y = 10-50 ；更优选地，χ = y = 15-25 ；式2 :C6(1 (C(COOH)2)n，其中，η为1_4的整数；优选地，η = 1-3 ；更优选地，η = 2。
4.根据权利要求3所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述佐剂为富勒烯衍生物纳米颗粒溶液制剂，其中，所述富勒烯衍生物在溶剂中的纳米颗粒物的直径范围为l-400nm。
5.根据权利要求3或4所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述佐剂以以下方式对受试者进行免疫1)与疫苗同时混合后对受试者进行免疫；2)先为受试者注射该佐剂，之后对受试者进行疫苗免疫；或3)对受试者进行疫苗免疫后再注射该佐剂。
6.根据权利要求5所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述佐剂与疫苗同时混合后对受试者进行免疫。
7.根据权利要求5所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述佐剂与疫苗对受试者免疫的部位相同或不同。
8.一种疫苗制剂，其特征在于，所述制剂包含根据权利要求3-7任一项所述的疫苗佐剂。
9.根据权利要求8所述的疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗包括艾滋病病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗和人乳头状瘤病毒疫苗。
10.根据权利要求8或9所述的疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗的免疫途径选自皮下注射、滴鼻免疫、腹腔注射、肌肉注射和皮内注射。
全文摘要
本发明提供一种富勒烯衍生物，所述富勒烯衍生物是以通式C60OxHy(10＜y≤x＜50)表示的富勒醇或以通式C60(C(COOH)2)n(n为1-4的整数)表示的富勒烯羧基衍生物，该富勒烯衍生物在溶剂中的纳米颗粒物的直径范围为1-400nm。本发明还提供了所述富勒烯衍生物疫苗佐剂在疫苗领域的应用，其安全性好且能通过不同的免疫途径显著提高疫苗的免疫原性，具有极大的应用前景。
文档编号A61K39/12GK102552901SQ201010621120
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者刘野, 刘颖, 许利耕, 邵一鸣, 郝彦玲, 陈春英 申请人:中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心, 国家纳米科学中心