专利名称：β-淀粉样多肽的抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的抗体及其用途。具体而言，本发明涉及β-淀粉样多肽的单 克隆抗体、该抗体的人源化以及所述的抗体在治疗阿尔茨海默病等疾病的药物中的用途。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种以老年人中进行性记忆障碍和智 能衰退为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病。老年斑、神经元纤维缠结和神经元丢 失是AD的三大主要病理特征。其中老年斑的主要成分是淀粉样多肽(beta-amyloid ρ印tide，Ai3)聚集形成的纤维，而Αβ被认为是导致神经元损伤及认知功能衰退的主要致 病物质[1]。Aβ主要包括Αβ 40和Αβ 42两种分子，由39 43个氨基酸组成。一般认为 Αβ是由于编码APP的基因发生突变或其他原因导致β-分泌酶活性异常增高时，与γ-分 泌酶共同切割产生。现在也有观点认为AD患者脑内高于正常人浓度的Αβ可能是由于Αβ 的转运清除发生障碍所致。研究证实大脑及脑脊液中Αβ含量的增高与认知能力下降密切 相关。Αβ结构中的疏水区域对于调节Αβ纤维的形成起着重要的作用，其1 观位氨基 酸为亲水的氨基末端二9位之后为疏水的羧基末端。由于疏水氨基酸主要位于羧基端，所以 羧基端的长度决定其溶解性的高低，并影响聚集成纤维的速度。Αβ相互聚集形成的纤维具 有毒性，能够促发炎症级联反应、轴突损伤、突触丢失和细胞凋亡等病理改变，是导致神经 元变性乃至形成痴呆的重要因素[2]。随着全世界人口老龄化程度的不断提高，这种疾病的发病率也在逐渐的上升，给 社会和家庭在物质和精神上都带来了巨大的影响。如何找到一种可以治疗这种疾病的药物 是一个紧迫的需求。但至今尚无特效的治疗措施，临床上主要以对症治疗和康复疗法为主， 如应用乙酰胆碱酯酶抑制剂，以弥补因神经细胞退化而带来的乙酰胆碱神经介质下降。但 这些疗法不能从根本上治疗AD。而针对Αβ多肽在发病中的关键作用，研究开发抗Αβ多 肽抗体就具有治疗AD的实际应用价值。抗Αβ抗体治疗AD，主要通过两种途径清除体内的Αβω。一是抗体经过血脑屏 障进入脑内与老年斑中的A β纤维结合，小胶质细胞通过Fc受体与抗体的Fc片段结合，吞 噬、清除其中的Αβ纤维；二是抗体在外周循环中与可溶性的Αβ结合，增大血脑屏障内外 Αβ的浓度差，促进脑内的Αβ外流，从而降低脑内的Αβ水平，减少Αβ在脑内的聚集和沉 积。目前，已证明抗Αβ抗体(包括多抗、单抗、抗体片段等)在体外试验及动物体内对清 除Αβ有肯定的效果，抗Αβ抗体治疗具有潜在的应用价值。体外试验研究进展主要是观察抗A β抗体中和或清除A β的作用。Legleiter等 分别用m266和3D6单克隆抗体与 10的摩尔比一起孵育，几天之后用原子 力显微镜(AFM)观察Aβ纤维形成情况发现两种单抗都能有效抑制Aβ纤维的形成，其中 m266效果更好一些Μ。抗Αβ抗体可以提高细胞对Αβ的耐受性、对培养的PC12细胞及海 马神经元具有保护作用b’6]。为了检测抗体清除斑块的效应，Bard等用抗A β单抗(10D5、 3D6)经腹腔注射给PDAPP转基因小鼠，六个月后处死小鼠，其冰冻脑切片与小胶质细胞一起孵育M小时，通过免疫染色发现外源小胶质细胞可以吞噬斑块中的Αβ纤维；而对照组， 斑块保持完整且未见小胶质细胞的吞噬现象[7]。有文献报道健康人体内提取的静注免疫 球蛋白(IVIG，intravenous immunoglobulin)中含有抗Αβ抗体[8]，这些抗体不仅能抑制 Αβ聚集成纤维，还能使已经形成的Aβ纤维降解，同时还可以提高小胶质细胞向淀粉样斑 块迁移的能力，并介导小胶质细胞吞噬、降解Αβ[9’1(ι]。Fukuchi等提出，抗Αβ抗体的scFv 片段也可以抑制Αβ寡聚体(Aiioligomers)对HEK293细胞的毒性作用[11]。上述体外试 验表明，抗Αβ抗体可以通过Fc受体介导小胶质细胞吞噬、降解Αβ纤维，也可以通过其他 方式来抑制Αβ聚集成纤维或斑块。动物试验是抗体进入临床研究的前提，目前大多数实验动物采用APP转基因鼠。 抗体经外周(如静脉、腹腔)或经颅腔导入动物体内，然后观察抗体在体内的分布、发挥作 用的部位及作用效果。1999年&&1^等发现抗4 0抗体可以清除小鼠脑内老年斑并可预 防老年斑的形成[12]。DeMattos等将抗Αβ单克隆抗体m266经外周静脉注入仅能在脑组 织中表达APP的PDAPP转基因小鼠体内，结果显示血浆中Αβ浓度增高1000倍，脑组织中 Αβ蓄积明显减少，说明抗体能中和外周循环中的Αβ，使脑内的Αβ逐步扩散入血液而被 清除[13]。Bard等将抗Αβ抗体经腹腔注射到PDAPP转基因小鼠体内，六个月后影像学发现 脑内斑块减少80%以上，抗体能通过血脑屏障结合淀粉样斑块，并激活小胶质细胞，促进了 先前已存在的淀粉样斑块的清除。Chauhan等直接将抗体注射到第三脑室中，并且在注射 后不同时间段检查小鼠的大脑组织，检测结果表明，到第四周时，治疗组淀粉样蛋白的密度 比对照组小鼠减少了 67%，同时也证明了抗Αβ单抗脑室内注射后第四周效果达到高峰， 八周后开始消失[14’15]。近来发现脑内Αβ寡聚体也有较强的毒性，Ma等将抗Αβ抗体注射 到Tg2576转基因小鼠脑内，发现其可以清除小鼠脑内Αβ寡聚体，对保护动物脑神经损伤 有积极意义[16]。Levites等发现，抗Αβ 1_40及Αβ 1-42的单克隆抗体注入APP转基因小 鼠体内后，脑内淀粉样斑块总量减少50%左右[17’18]。除了上述全抗体以外，抗体片段也能 在动物体内发挥效应。研究人员已经成功应用抗Αβ单克隆抗体片段，如特异F (ab' )2片 段、scFv片段等，经腹腔注射、颅内注射或经腺病毒介导等不同给药途径导入APP转基因小 鼠体内，都明显减少了脑内的老年斑块[19’2°]。抗Αβ抗体治疗AD在体外试验和动物试验中是比较成功的。但最终要用于人体 治疗的抗体必须是经过人源化的，以克服鼠单克隆抗体在人体引起人抗鼠抗体(HAMA)反 应的局限性。在获得人源化抗体时，最新的方法是利用噬菌体抗体库技术，通过链更替将鼠 单抗Fab片段换成完全人源化抗体，这种形式抗体具有100%的人抗体序列，但是其不能解 决经免疫的人B细胞来源，所得抗体往往亲和力较低，该方法还需要进一步改善。因此，需要要获得特异性强、亲和力高并且不引起人抗鼠抗体(HAMA)反应的人源 化抗体。
发明内容
本发明人发明了分泌的抗Αβ特异性鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞株mZl (该 杂交瘤细胞株于2009年12月观日在中国科学院微生物保藏中心保藏中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo. 3547)，在此基础上，采用RT-PCR扩 增出其全长基因，经过序列比对分析、设计引物，再通过PCR扩增出重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段，并将鼠源性V区基因和人源C区基因拼接后分别与PCDNA3. 1(+)， PCDNA3. 1 (-)真核表达载体连接并将人IgGl Fc段的234L、235L和237G突变为234A、235A 和237A，转染至C0S-7细胞内成功表达，进一步降低机体免疫反应。此外，在嵌合抗体基础 上，发明人对可变区上的FR区进一步人源化改造，真核表达后的抗体人源化达到90%以 上。在拼接V区基因与人源C区基因以及Fc段定点突变过程中，本试验利用重组PCR技 术，与利用设计酶切位点连接方法相比，前者完全保持原抗体的基因序列，后则可能会改变 整个抗体基因序列从而改变抗体的结构。此外，在各种表达体系中，原核，酵母表达系统虽 然周期短，成本低，表达量高，但是不能正确装配，折叠，糖基化，难以表达出完全有生物功 能的蛋白质。而哺乳动物表达的蛋白质尽管周期长，表达量低，但是能够表达出正确折叠 完全有生物学功能的蛋白质，以成为基因工程抗体表达的常选宿主。在本研究中，利用脂 质体2000共转染含有轻重链嵌合基因和人源化基因的表达载体至CHO细胞，使用G418和 kocin筛选，得到稳定且高表达嵌合抗体和人源化抗体的细胞株，其所分泌的抗体出具有 良好生物学活性。因此，本发明一方面提供一种β-淀粉样多肽的单克隆抗体，所述抗体的重链可 变区序列为SEQ ID No :3，轻链可变区序列为SEQ ID No :4。本发明另一方面提供一种对上述的抗体人源化后的抗体，其重链全长序列为SEQ ID No :7，轻链全长序列为SEQ ID No :8。本发明又一方面提供一种上述抗体人源化后的抗体，其重链可变区序列为SEQ ID No :9，轻链可变区序列为SEQ ID No :10。优选地，本发明提供的人源化抗体的恒定区是人IgG抗体恒定区。优选地，本发明提供的人源化抗体的恒定区序列为SEQ ID No :13。本发明又一方面提供本发明的抗体在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。本发明又一方面提供编码本发明的抗体的多核苷酸。本发明又一方面提供分泌本发明抗体的杂交瘤，其于2009年12月观日在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo. 3547。本发明又一方面提供分泌嵌合抗体的稳定转染细胞株，其于2009年12月观日在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo. 3546。本发明又一方面提供分泌人源化抗体的稳定转染细胞株，其于2009年12月观日 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo. 3545。本发明获得的抗Αβ人鼠嵌合抗体和Fc段突变后的嵌合抗体(约70%为人源 的)，以及人源化抗体(约90%为人源的)，降低了鼠源性恒定区引起HAMA反应，并且ELISA 结果检测显示其能特异地与Aβ结合。保藏信息本发明所用的杂交瘤mZl已于2009年12月观日在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo. 3547。本发明所用的嵌合抗体稳定转染细胞株CB3，其于2009年12月观日在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo. 3546。本发明所用的人源化抗体的稳定转染细胞株HE10，其于2009年12月观日在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo. 3545。
图1 嵌合抗体重轻链可变区、恒定区及全长基因PCR结果。其中M 标记物；1 PVH ；2 =PVL ；3 =PCH ；4 =PCL ；5 =PCHmZl ；6 =PCLmZl0图2 嵌合抗体和人源化抗体重链Fc段突变PCR结果。其中M 标记物；1 =PHCFcf ； 2 =PHHFcf ；3 =PHCFcb ；4 =PMCHmZl ；5 :PMHHmZl。图3 嵌合抗体的特异性检测和人源化检测。图4 人源化抗体的生物活性检测。图5 真核细胞稳定分泌的嵌合抗体及人源化抗体生物活性检测。图6 嵌合抗体及人源化抗体均能与AD病变鼠脑切片中老年斑结合。图6A 抗Αβ 人鼠嵌合抗体；图6Β:抗A β人源化抗体。
具体实施例方式主要材料分泌抗Αβ的杂交瘤细胞株mZl由本室制备(具体制备过程见实施 例，该杂交瘤细胞株于2009年12月观日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心保藏，保藏号为CGMCCNo. 3547)，C0S-7细胞和CHO细胞购自中国医学科学院基础医 学研究所基础医学细胞中心，PCDNA3. 1(+)、PCDNA3. l/zeo(+)载体购自invitrogen公司， Lipofectamine 2000⑧购自hvitrogen公司，各种限制性内切酶，T4连接酶，Pyrobest酶 购自大连TaKaRa公司，DH5 α感受态细菌购自天根公司，小量质粒抽提试剂盒及凝胶回收 试剂盒购自美国OMEGA，BIO-TEK公司，基因重组人β -淀粉样多肽A β，由北京三元生物科 技发展有限公司提供，AD病变鼠脑切片由中国医学科学院实验动物研究所提供，HRP标记 羊抗鼠IgG抗体、生物素化山羊抗人IgG、辣根酶标记链亲和素、DAB显色试剂盒均购于北京
中衫金桥生物公司，引物均在北京奥科生物公司合成，本发明使用的引物详细见下表
权利要求
1.一种β-淀粉样多肽的单克隆抗体，所述抗体的重链可变区序列为SEQ ID No :3，轻 链可变区序列为SEQ ID No :4。
2.一种对如权利要求1所述的抗体人源化后的抗体，其重链全长序列为SEQ IDNo -J, 轻链全长序列为SEQ ID No :8ο
3.—种对如权利要求1所述的抗体人源化后的抗体，其重链可变区序列为SEQID No 9，轻链可变区序列为SEQ ID No =IO0
4.如权利要求3所述抗体，所述抗体的恒定区为人IgG抗体恒定区。
5.如权利要求4所述的抗体，所述的人IgG抗体恒定区序列为SEQID No :13。
6.如权利要求1-5中任意一项所述的抗体在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。
7.编码如权利要求1-5中任意一项所述的抗体的多核苷酸。
8.分泌如权利要求1所述抗体的杂交瘤，其于2009年12月观日在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo. 3547。
9.分泌嵌合抗体的稳定转染细胞株，其于2009年12月观日在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo. 3546。
10.分泌人源化抗体的稳定转染细胞株，其于2009年12月观日在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo. 3545。
全文摘要
本发明涉及β-淀粉样多肽的抗体及其用途。本申请的发明人发明了重链可变区序列为SEQ ID No3，轻链可变区序列为SEQ ID No4的β-淀粉样多肽的抗体；分泌上述抗体的杂交瘤；对上述抗体人源化后的抗体以及进一步改进从而降低人抗鼠抗体反应的抗体；编码本发明抗体的多核苷酸；本发明抗体在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。本发明的抗体特异性强、亲和力高并且不引起人抗鼠抗体反应。
文档编号A61K39/395GK102146137SQ20101911403
公开日2011年8月10日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者常德, 张建华, 梁平 申请人:中国医学科学院基础医学研究所