专利名称：鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因的制作方法
鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，涉及鸡α干扰素与白细胞介素2嵌合基因及 其构建、融合表达和纯化技术。
背景技术：
我国是世界上养鸡大国，鸡的疾病种类繁多，特别是病毒性传染病造成的发病率 和死亡率最高，每年给养鸡业造成巨大的经济损失，而且有些病毒性疾病(如高致病性禽 流感等)还关系到人类自身的健康。因此对这些病毒性疾病的治疗和预防成为养鸡业的首 要任务。
目前，尚无特效药物可以治疗病毒性疾病，尽管一些化学合成的抗病毒药物如盐 酸金刚烷胺、利巴伟林等对少数病毒病有一定的作用，但由于这些药物在人医上也广泛应 用，为防止药物残留及耐药菌株的产生，目前已禁止在兽医临床上应用；因此对病毒病的防 控主要靠疫苗免疫接种进行预防。但是由于病毒血清型众多，毒株基因变异速度快，常常导 致疫苗免疫失败；另外，新的病毒病也可能不断产生，某些病毒病目前仍无疫苗可用；这些 因素往往造成病毒性传染病流行趋势扩大。
干扰素(interferon，IFN)是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫 激活功能活性的细胞因子，其抗病毒活性具有种属特异性，其活性的发挥受细胞基因组的 调节与控制，并涉及RNA和蛋白质的合成。干扰素分为I型和II型两大类，II型干扰素 只有IFN-Y，其主要作用是免疫调节作用；I型干扰素分为五个亚型种类，其中α干扰 素(IFN-α)主要由单核吞噬细胞、B细胞和成纤维细胞合成，是干扰素中最大的一个基 因家族。机体内产生的IFN-α是病毒诱导白细胞产生的，其主要作用有以下几个方面 ①IFN-α通过诱导机体产生抗病毒蛋白而发挥广谱的抑制病毒繁殖活性；②抑制细胞的 增殖(如肿瘤细胞等)从而发挥抗肿瘤活性作用；③加强NK细胞杀伤病毒感染细胞的能力 从而抑制病毒的增殖和扩散；④增强MHC I类抗原表达；调节T、B细胞功能以及许多免疫 反应，特别是增强机体细胞免疫应答水平。
白细胞介素-2 (interleukin-2, IL-2)又称T细胞生长因子，能诱导T淋巴细胞增 殖，增强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活性，刺激细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF- α )、IFN- γ 等细胞因子，促进机体的细胞免疫能力；同时也能激活B淋巴细胞，参与机体的体液免疫应 答，促进抗体分泌；IL-2还可增强巨噬细胞对抗原递呈能力、杀菌力及细胞毒性，从而发挥 其抗病毒和抗肿瘤作用。因而，基因工程重组IL-2蛋白(rIL-幻制剂不仅可作为抗病毒性 疾病、自身免疫病与防治肿瘤方面的治疗药剂，而且还可作为佐剂增强疫苗的免疫效果，具 有广阔的应用前景。
正常情况下，IFN-α、IL_2等细胞因子在动物体内的表达量较低且难以提取应用， 已有的采用体外抗原刺激动物白细胞使其产生IFN-α的方法得到的产品产量和活性都 低，且生产成本较高。基因工程α干扰素及IL-2具有广谱的抗病毒活性和增强疫苗免疫 力作用，对细胞内寄生菌和寄生虫等的增殖和活性也有一定的作用，而且不会产生耐药性和残留，不会对人类健康造成危害，因此一直是研究抗病毒制剂关注的焦点。rChIFN-α蛋 白对NDV、马立克氏病毒及禽流感H9N2型病毒具有抑制作用，rChIL-2蛋白可调节机体免 疫功能，增强疫苗的免疫效果，并能明显提高鸡胚对IBDV、IBV强毒株攻毒的保护力。由于 IFN-α和IL-2都具有广谱的抗病毒活性，因此将二者联合应用可发挥更强的抗病毒作用， 可以对鸡的病毒性疾病能起到很好的预防作用，目前尚未见此方面的相关报道。发明内容
本发明提供一种鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因构建、表达及其蛋白纯化方 法，目的在于提供鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因，以得到抗病毒谱广、抗病毒活性 高、生产成本低、易于生产、无残留、不会使病原体产生耐药性、具有ChIFN-α和ChIL-2抗 病毒功能叠加的高效基因工程复合抗病毒制剂，用于鸡病毒性疾病的防治。
为实现本发明目的，本研究采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR, SOE-PCR)方法将ChIFN-α和ChIL_2成熟肽基因通过一个基因柔性接头 (linker) (G4S)3构建成ChIFN-α -linker-ChIL-2嵌合基因，将嵌合基因连接入pQE30原核 表达载体进行融合表达，采用尿素溶解-低浓度蛋白复性液复性-PBS透析方法对融合蛋白 进行复性和纯化，对纯化后的融合蛋白进行细胞上和鸡体内活性测定。
主要内容如下
1、鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因，其构建、表达及其蛋白纯化
1. 1引物序列
共设计4条引物用于SOE-PCR的扩增，Ρ1/Ρ2引物对分别为扩增 ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的ChIFN-α -linker部分所用上/下游引物；P3/P4引 物对分别为扩增ChIFN- α -linker-ChIL-2嵌合基因的linker+ChIL2部分所用上/下游引 物。引物核苷酸序列如下
Pl :tcagcatgcg cctgcaacca ccttcgcc 28
P2 :gccaccgcca gagccacctc cgcctgaacc gcctccacca gtgcgcgtgt tgcctgtg 58
P3 :ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggatcgg catctctatc atcagcaaa 59
P4:tacaagcttt ttttgcagat atctcacaaa g 31
1. 2 ChIFN-α-linker-ChIL-2 嵌合基因的构建
1. 2. 1 ChIFN-a -linker 基因片段的 PCR 扩增
采用P1/P2引物对，以含ChIFN- α基因的重组pQE_30质粒(rpQE-30/ChIFN- a ) 为模板，按照 TaKaRa 的 Pyrobest DNA Chlymerase 说明书进行 ChIFN-α -linker 基因 片段的PCR扩增。扩增产物3’端带有39个核苷酸的linker序列，反应总体系为50 μ L， 其中 10XPCR Buffer 5 μ L, dNTP (2. 5mM each) 4 μ L, rpQE-30/ChIFN- α 质粒模板添加量Ρ1/Ρ2 引物各 50pmol，Pyrobest DNA Chlymerase 2. 5U，用灭菌双蒸水补齐至 50 μ L0反应条件如下94°C预变性:3min，进入循环94°C变性lmin，64°C退火45s，72°C延 伸45s，进行5个循环；接着94°C lmin,65°C lmin,72°C lmin共进行30个循环，最后72°C 延伸lOmin。利用低熔点琼脂糖凝胶回收试剂盒回收大小为529bp左右的PCR产物，利用紫 外-可见光分光光度计检测回收的PCR产物的纯度和含量。
1. 2. 2 linker-ChIL-2 基因片段的 PCR 扩增采用P3/P4引物对，以含ChIL-2基因的的重组pQE-30质粒(rpQE-30/ChIL_2) 为模板，按照TaKafci的Pyrobest DNA Chlymerase的说明书进行linker-ChIL-2基因片 段的扩增。PCR扩增产物5’端带39个核苷酸的linker序列，反应总体系为50 μ L，其中 rpQE-30/ChIL-2 质粒添加量为 1 μ g，10 X PCR Buffer 5 μ L, dNTP (2. 5mM each) 4 μ L，P3/P4 引物各50pmol，Pyrobest DNA Chlymerase 2. 5U，用灭菌双蒸水补齐至50 μ L。反应条件 如下94°C预变性3min，进入循环94°C变性lmin，64°C退火45s，72°C延伸45s，进行5个循 环；接着94°C lmin, 65°C 45s, 72°C 45s共进行30个循环，最后72°C延伸lOmin。利用低 熔点琼脂糖凝胶回收试剂盒回收linker-ChIL-2基因片段的PCR产物(约40!3bp)，利用紫 外-可见光分光光度计检测回收的PCR产物的纯度和含量。
1. 2. 3 ChIFN- α -linker 与 linker-ChIL-2 基因片段的拼接
将回收的ChIFN- α -1 inker和1 inker-ChIL-2基因片段的PCR产物按质量比 1.2 1的比例混合后，取0.3yg混合物用作拼接模板，拼接反应体系中另加入IOXExTaq buffer (Mg2+ plus) 5 μ L ;2· 5mM dNTP 4 μ L，ExTaq 聚合酶 1. 25U,用无菌去离子水补至总体 系 50μ L。94°C预变性 anin，进入循环94°C变性 lmin，65°C退火 1. 5min，72°C延伸 1. 5min， 共进行20个循环。
1. 2. 4 ChIFN- α -linker-ChIL-2 嵌合基因的 PCR 扩增
利用P1/P4引物对、以上步的拼接反应产物为模板进行ChIFN- α -linker-ChIL-2 嵌合基因的PCR扩增，反应体系为50 μ L，其中上步的拼接反应产物2 μ L，Ρ1/Ρ4引物各 50pmol, IOXPyrobest Buffer 5μ L,2. 5mM dNTP 4 μ L, Pyrobest DNA Polymerase 2. 5U。 按以下条件进行PCR扩增，94°C预变性:3min，进入30个循环(94°C lmin，65°C lmin，72°C lmin)，最后72°C延伸lOmin。用低熔点琼脂糖凝胶回收试剂盒回收915bp左右的PCR产物， PCR产物两端分别带有Sph I和Hind III限制性内切酶位点。
1.3 ChIFN-a-linker-ChIL-2嵌合基因的克隆、测序与表达
将上步中回收的915bp左右的PCR产物克隆入pGEM-T fesy载体，筛选阳性 克隆质粒(pGEM-T/ChIFN-a-linker-ChIL-2)送大连(宝)生物工程有限公司自两端 测序。阳性克隆质粒经Sph I和Hind III双酶切后粘端连接到经相同酶双切后的表 达载体PQE30，将构建好的重组pQE30/ChIFN- a -linker-ChIL-2表达质粒(rpQE30/ ChIFN-a-linker-ChIL-2)转入宿主菌大肠杆菌(Ε. coli.) JM109中，筛选阳性重组菌送大 连(宝)生物工程技术公司测序。选取核苷酸序列和插入方向都正确的重组菌、JM109空 菌对照、PQE30/JM109空载体菌对照进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表达产物，经凝胶成 像系统薄层扫描分析表达蛋白的含量。
1. 4 重组 ChIFN- a -linker-ChIL-2 融合蛋白(rChlFN- a -linker-ChIL-2)的表 达和纯化
具体方法见申请单位已申请专利，申请号200910064233. 7。其核苷酸序列见序列 表NO. 1中所表述。
2、合成(G4S)3基因柔性接头(linker)
设计并合成富含甘氨酸(G)和丝氨酸⑶的柔性接头(&S)3，通过(QS)3基因柔 性linker连接的2个基因表达后各自的蛋白空间构象和活性不会相互影响，保证了表达后 融合蛋白的生物学活性，其核苷酸序列见序列表N0. 2。
本发明创新点及优点1、通过采用基因柔性linker将鸡α干扰素与白细胞介 素2基因构建成嵌合基因并对其进行表达、复性和纯化从而得到在鸡体内外具有α干扰 素和白细胞介素2抗病毒活性叠加的融合蛋白。2、设计合成了富含甘氨酸(G)和丝氨酸 (S)的柔性接头(G4S)3,通过该Linker连接鸡α干扰素与白细胞介素2基因，使表达后 各自的空间构向和活性不相互影响，保证了 Linker两端所连接的基因表达蛋白的双重活 性。3、采用“尿素溶解-低浓度蛋白复性液复性-PBS透析”进行融合蛋白的快速复性、纯 化，免去过镍铬亲合层析柱进行纯化的步骤，得到的rChIFN-a-linker-ChIL-2融合蛋白 纯度可达96%以上，大大简化了操作过程，使基因工程重组鸡α干扰素/白细胞介素2融 合蛋白可以商品化应用。4、该融合蛋白在细胞上、鸡体内外均具有好的抗病毒活性，在鸡 胚成纤维细胞(CEF)上具有抑制水泡性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)的增 殖活性；在鸡胚上具有抑制新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV Η9Ν2)的增殖活性；在 鸡体内具有显著的抗NDV和IBDV活性和免疫增强活性。在体外具有促ConA刺激的鸡T 淋巴细胞增殖活性，可以和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应；从实验数据上可以看出， rChIFN- α -linker-ChIL-2融合蛋白在细胞上、鸡体内外的活性均具有ChIFN- α与ChIL_2 蛋白活性的叠加，其抗病毒活性优于rChIFN-α蛋白。作为抗病毒制剂的主要成分，用于鸡 病毒性疾病的预防和治疗，对鸡的病毒性疾病能起到很好的防治作用，高效、广谱、安全、价 格低廉。
图1 :S0E-PCR 扩增全长 ChIFN-α -linker-ChIL-2 嵌合基因图；图中 M. IOObp 梯度 DNA 分子量标记，1. ChIFN-α -linker 部分；2. linker-ChIL-2 部分； 3. ChIFN-α -linker-ChIL-2 嵌合基因；
图2 =ChIFN- α -linker-ChIL-2的表达与纯化SDS-PAGE电泳图；图中M.低分 子量蛋白Marker ；1. JM109诱导表达对照；2. pQE30空载体菌表达对照；3.含pQE_30/ ChIFN-a-linker-ChIL-2重组质粒的全菌诱导表达产物；4.包涵体沉淀；5.纯化后的 rChIFN-a -linker-ChIL-2 蛋白；
图3 :rChIFN_a -linker-ChIL-2蛋白促鸡外围血T淋巴细胞促增殖活性(MTS 法)；图中，
权利要求
1. 一种鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因，其特征在于，其有如下DNA序列gcctgcaaccaccttcgcctccaggatgccaccttctctcacgacagcctccagctcctc60cgggacatggctcccacactaccccagctgtgcccacagcacaacgcgtcttgctccttc120aacgacaccatcctggacaccagcaacacccggcaagccg3. C 3.3.3.3. C C 3. Cccacgacatc180cttcagcacctcttcaaaatcctcagcagccccagcactccagcccactggaacgacagc240caacgccaaagcctcctcaaccggatccaccgctacacccagcacctcgagcaatgcttg300gacagcagcgacacgcgctcccggacgcgatggcctcgcaaccctcacctC 3. C C 3. C 3.3.3.360aaacacttcagctgcctccacaccttcctccaagacaacgattacagcgcctgcgcctgg420gaacacgtccgcctgcaagctcgtgcctggttcctgcacatccacaacctcacaggcaac480acgcgcactggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggcatct540ctatcatcagcaaaaaggaaacctcttcaaaggatttagaaatattggaa600aacatcaagaacaagattcatctcgagctc 3. C 3. C 3. C C 3.3.ctgagacccaggagtgcacc660cagcaaactctgcagtgttacctgggagaagtggttactctgaagaaagaaactgaagat720gacactgaaattaaagaagaatttgtaactgctattcaaaatatcgaaaagaacctcaag780agtcttacgggtctaaatcacaccggaagtgaatgcaagatctgtgaagctaacaacaag840ctgattttctccatgaactgaccatctttgtgagatatctgcaaaaa897。
2. 一种用于构建如权利要求1所述的鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因所用 物，其特征在于，其分别有如下DNA序列引物 Pl :tcagcatgcg cctgcaacca ccttcgcc 28引物P2 :gccaccgcca gagccacctc cgcctgaacc gcctccacca gtgcgcgtgt tgcctgtg 58 引物 P3 :ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggatcgg catctctatc atcagcaaa59引物 P4 :tacaagcttt ttttgcagat atctcacaaa g 310
3. 一种用于构建如权利要求1所述的鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因所用的基 因柔性接头，其特征在于，其DNA序列如下ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcg 45。
全文摘要
本发明属生物基因工程技术领域，公开了一种鸡α干扰素(ChIFN-α)/白细胞介素2(ChIL-2)嵌合基因。该技术采用重叠延伸PCR方法通过一基因柔性接头(linker)(G4S)3将ChIFN-α与ChIL-2的成熟肽基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-T Easy载体，将嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达并对表达的重组融合蛋白(rChIFN-α-linker-ChIL-2)进行快速复性和纯化。纯化的rChIFN-α-linker-ChIL-2融合蛋白在细胞上、鸡体内外的活性均具有ChIFN-α与ChIL-2蛋白活性的叠加，其抗病毒活性优于rChIFN-α蛋白。作为抗病毒制剂的主要成分，用于鸡病毒性疾病的预防和治疗，高效、广谱、安全、价格低廉。
文档编号A61K38/21GK102041263SQ201019097009
公开日2011年5月4日 申请日期2010年2月8日 优先权日2010年2月8日
发明者刘先敏, 刘光辉, 刘梅芬, 吴志明, 孙清莲, 安春霞, 张健, 张志凌, 张盼盼, 李桂喜, 王东方, 盛敏, 程俊贞, 荆汝顶, 谢彩华, 钱勇, 闫若潜 申请人:河南省动物疫病预防控制中心