专利名称：预防再激活的结核病tb疫苗的制作方法
技术领域：
本发明公开可向潜伏感染个体施用以通过靶向组成型表达的抗原诸如ESAT6、 CFPlO和来自ESX-I分泌系统的其他抗原而预防结核病复合群微生物(tuberculosis complex microorganisms)物禾中(结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(Mafricanum))引起的潜伏结核病感染的再激活的疫苗。一般背景由结核分枝杆菌(M. tuberculosis)引起的人类结核病是一个严重的全球性健康问题，根据WH0，其造成每年约3百万人死亡。在二十世纪60年代和70年代期间，全世界新的结核病(TB)病例发生率已经处于下降中，但在近十年中，部分由于AIDS的来临和结核分枝杆菌的多药抗性菌株的出现，这种趋势已经发生明显的改变。结核病复合群(tuberculosis complex)的生物体可引起多种疾病，但最常见的侵入途径是通过吸入细菌。这在肺中开始感染，最终可扩散到身体其他部位。通常，这种感染在生长方面被免疫系统限制，使得大多数感染个体除了最终减退的咳嗽和发热以外显示极少的体征。大约30%的个体不能容纳感染，将发展原发性疾病，这在许多情况中最终将是致命的。然而，认为甚至表面上控制感染的那些个体仍保持被感染，很可能持续其余生。当然， 已经健康了数年或甚至数十年的个体可能突然发展结核病，该结核病被证明是多年前其感染的相同生物体引起的。结核分枝杆菌和TB复合群的其他生物体的独特之处在于，分枝杆菌可躲避免疫应答，以难治的非复制或缓慢复制期存活长时间。这称为潜伏TB，目前是非常严重的全球性健康问题，估计影响全世界人群的大约1/3(Αηοη.，2001)。目前唯一可供临床使用的疫苗是BCG，该疫苗的效力仍然有些争议。虽然BCG在原代感染的动物模型中一直表现良好，但它显然未能控制TB流行。与此一致，BCG接种表现为提供抵抗儿科TB(由于原代感染)的保护，而对抵抗成年疾病(通常是童年获得的潜伏感染的再激活)提供极小或没有保护。还已显示，向目前对分枝杆菌敏感或潜伏感染的个体接种疫苗是无效的。结核分枝杆菌感染的过程主要经历3个时期，如
图1所示。在急性期，细菌在器官中增殖，直到免疫应答增强到其可控制感染的点，此时细菌负荷(bacterial load)达到峰值并开始下降。此后，在细菌负荷稳定维持在低水平时形成潜伏期。在这个时期，目前认为结核分枝杆菌由活跃的增殖趋于休眠期，基本上转变为非复制状态并维持在肉芽肿内。然而，近来已经变得明显的是，即使在特征为恒定的低细菌数目的感染阶段，至少部分细菌群体仍保持活性代谢的状态(Talaat AM等2007)。因此，尽管有强的免疫应答，这些细菌存活，保持活性代谢和复制。所以，在感染个体中，存在非复制细菌(因为位于胞内， 免疫系统可能难以检测到)与缓慢复制细菌之间的平衡，所述缓慢复制细菌具有活性但改变的表达谱，试图适应在免疫宿主中遇到的敌对环境。处于这一阶段的细菌通常不被TB领域中目前正开发的大多数预防性疫苗所靶向，例证是当典型的预防性疫苗被提供给潜伏感染的实验动物时缺乏活性(Turner 2000)。在一些情况中，由于病原菌和感染进入再激活阶段，这一平衡被倾斜，在再激活阶段细菌开始快速复制并且感染个体中的细菌数目增加。在潜伏感染个体中、在非常强的免疫压力下复制的细菌是本发明接种策略的靶。处于这一潜伏感染阶段的细菌通常不被TB 领域中目前正开发的大多数预防性疫苗所靶向，例证是当预防性疫苗被提供给潜伏感染的实验动物时缺乏活性(Turner等2000)。这不令人惊讶，因为现在已知强的宿主免疫应答导致许多抗原诸如主要预防性疫苗抗原Ag85和I^stS的下调(Rogerson，BJ等2006)。对于 Ag85B,已经显示，在感染后存在Ag85B表达的最初短暂增加，但在感染后2周，细菌Ag85B 表达水平已经从峰值期间的0. 3转录子/CFU结核分枝杆菌下降到0. 02转录子/CFU，且这一低水平在感染后持续至少达100天。因此在感染后2周的任何时间点，少于2 %的细菌积极地表达Ag85B(同前)。Ag85B的低表达由以下支持感染后3周或之后肺中能够响应于 Ag85B产生IFN-g的T细胞数目快速下降。相反，一些抗原贯穿不同感染阶段更稳定地(组成型)表达，一个实例是ESAT6。 在最初感染阶段后，ESAT-6表达水平稳定在0. 8转录子/CFU结核分枝杆菌。这是比Ag85B 高得多的转录水平，这一水平稳定地保持达感染后至少100天(Rogerson，BJ等2006)。再一次地，转录数据被免疫数据支持，免疫数据显示在感染后期阶段在感染部位，T细胞对 ESAT-6的强的识别(同前)。这一组成型表达模式是个重要特征，说明这些分子实现对于病原体至关重要的必需功能，这些功能依赖于需要组成型表达以使病原体在免疫宿主中存活的基因。这些分子是本发明的基础，对于向潜伏感染个体施用的疫苗是尤其重要的抗原，因为它们靶向细菌生命周期的所有阶段，因而具有尽可能宽的活性基础。这与集中于鉴定在非复制持续期间被分枝杆菌上调的抗原的现有思路不同(AnderSen，P. 2007、W002048391、 W004006952、Lin MY 和 Ottenhoff TH 2008 ；Leyten EM.等 2006)。尽管这些抗原在非复制持续期间被上调，它们可能不总是免疫识别可获得的，因为从非复制细菌可获得的量低于检测或触发保护性免疫效应功能的合理阈值。相反，来自ESX-I分泌系统的多种蛋白已经显示为高度免疫原性和以高水平表达。ESX-I在多种病原性分枝杆菌中是保守的，并参与结核杆菌(tubercle bacilli)的毒性。个体ESX-I蛋白在分泌ESAT-6、CFPl(^nhpA中的贡献已被充分记载(Pym AS等2003 ； Guinn KI 等，2004 ；Stanley，SA等 2003 ；Brodin, P.等 2006 ；MacGurn JA等 2005 ；Raghavan, S.等2008)，效应分子的功能已显示为膜裂解，从吞噬体逃逸和细菌扩散(Gao LY等2004 ； Smith J.等 2008)。控制潜伏性感染的免疫应答的所有特性和引起再活化的因素基本上是未知的。 然而，有一些证据证明与主导细胞类型的转变有关。虽然CD4T细胞对急性期的感染控制是必要的和足够的，但研究揭示⑶8T细胞反应在潜伏期更为重要(van Pinxteren LA 等.2000)。本领域的技术人员将会容易地理解，一种基因的表达不足以使其成为一种好的候选疫苗。确定一种蛋白在结核分枝杆菌潜伏感染期间是否被免疫系统识别的唯一方法是制备出这种给定的蛋白，并按照这里描述的适当试验对该蛋白进行测试。在这方面，我们的研究组已经证实，被分枝杆菌强表达的抗原诸如ESAT-6 (早期分泌抗原靶-6)在所有感染阶段个体中被识别，事实上尤其在潜伏感染个体中被识别(B0esen，RaVn，Doherty 2002)。然而在自然感染期间引发的ESAT-6特异性T细胞虽然可能大量存在，但作为抵抗传染病的保护性T细胞，它们几乎全部是所谓的效应表型，即具有非常有限的寿命和低活性的终末分化T细胞(Seder R，等2008)。这显著不同于本研究中证实的防止TB的再激活的疫苗促进的高质量、所谓的多功能T细胞。它远不同于可用作接触后疫苗的所有高表达和免疫原性的蛋白，因为许多这种蛋白将引发超敏反应，反而恶化情况。这在Kock的原始结核菌素疫苗的临床试验中清楚地证实。疫苗作为接触后疫苗向患有不同形式疾病包括皮肤TB和肺部TB的患者提供。试验完全失败，参与的几个患者因为严重的超敏反应而死亡(Guttstadt A. 1891)。在数百种已知在初次感染期表达并作为疫苗被测试的抗原中，少于半打的抗原表现出明显的潜力。迄今为止仅有一种抗原已经被证实具有作为接触后疫苗的所有潜质(LoWrie，1999)。然而这个疫苗仅在作为DNA疫苗(目前还未被批准用于人类的实验技术)施用时起作用。而且，该技术被证明是有争议的，因为有其它研究组声称使用该方案接种疫苗诱导了非特异性的保护或甚至使疾病恶化(Turner，2000)。因此，防止感染个体的疾病再激活的有效接触后接种策略是高度期望的。发明概述本发明涉及由可向潜伏感染个体施用以通过靶向组成型表达的抗原诸如ESAT6、 CFPlO和hpA预防结核病复合群微生物物种(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌) 引起的潜伏结核病感染的再激活的疫苗治疗结核病复合群物种(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌)引起的感染。ESAT6、CFPlO和hpA相互依赖地都是分泌所需的，都属于已知是毒性必需的ESX-I分泌系统。这些分泌的抗原对于细菌散播和裂解细胞膜是决定性的。ESAT6、CFP10和hpA也是在疾病不同阶段组成型表达的抗原-而例如Ag85的表达在感染后立刻被下调。令人惊讶地，免疫原性、组成型表达的抗原当作为接触后疫苗施用时预防潜伏结核病感染的再激活，从而保持感染潜伏。发明详述本发明公开一种疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物接触后地施用于潜伏感染个体，预防结核病的再激活，所述疫苗或免疫原性组合物包含在结核分枝杆菌感染期间组成型表达的抗原或编码所述抗原的核酸。优选地所述组合物包含属于ESX-I分泌系统的组成型表达的抗原，ESAT6 (SEQ ID NO. 1)、CFPlO (SEQ ID NO. 2)、EspA (SEQ ID NO. 3)、Rv3614c(SEQ ID NO. 4)、Rv3615c(SEQ ID NO. 5)、EspR(SEQ ID NO. 6)、Rv3868(SEQ ID NO. 7)、Rv3869(SEQ ID NO. 8)、Rv3870(SEQ ID NO. 9)、Rv3871 (SEQ ID NO. 10)、Rv3872 (SEQ ID NO. 11)、Rv3873 (SEQ ID NO. 12)、 Rv3876 (SEQ ID NO. 13)、Rv3877 (SEQ ID NO. 14)、Rv3878 (SEQ ID NO. 15)、Rv3879c (SEQ ID NO. 16)、Rv3880c (SEQ ID NO. 17)、Rv3881c(SEQ ID NO. 18)、Rv3882c (SEQ ID NO 32)、 Rv3883c (SEQ ID NO 33)、Rv3865c (SEQ ID NO 34)；或这些序列中任一序列的免疫原性部分，如T细胞表位；或与任一序列具有至少70%序列同一性且同时具有免疫原性的氨基酸序列类似物。可选地，所述组合物包含免疫原性部分的混合物，所述免疫原性部分优选地选自以下组成的组SEQ ID NO. 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、四、30 和 31。本发明的另一实施方案是组合物，其中所述多肽与分枝杆菌科的细菌表达的抗原融合，优选地其中所述融合配偶体是组成型表达的抗原。优选的融合蛋白包含与CFP10融合的ESAT6。
根据本发明的组合物优选地包含选自以下的另外的递送系统活的重组疫苗，即基因修饰的生物体诸如表达分枝杆菌基因的细菌或病毒；免疫原性递送系统，诸如DNA疫苗，即表达上述蛋白的基因或基因片段的质粒；蛋白疫苗，即在递送系统诸如佐剂中递送的蛋白本身或来源于蛋白本身的合成肽。佐剂优选地选自以下组成的组二甲基双十八烷基溴化铵(dimethyldioctadecylammonium bromide) (DDA)、Quil Α、聚 I C、氢氧化铝、弗氏不完全佐剂、IFN- y、IL-2、IL-12、单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、海藻糖二山嵛酸酯(dibehenate)和胞壁酰二肽(MDP)，最优选地促进多功能T细胞应答的佐剂诸如 DDA/TDB和IC31。最优选的佐剂包含DDA/TDB和/或聚I :C。可选地所述氨基酸序列被脂化以允许所述多肽的自佐剂作用(self-adjuvanting effect) 0本发明还公开用于治疗潜伏结核病和预防感染的再激活的上述抗原。一种治疗动物包括人类的由毒性分枝杆菌，如，由结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌或牛分枝杆菌引起的结核病感染的再激活的方法，所述方法包括向动物施用上述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物在感染后，诸如急性感染阶段期间或急性感染阶段之后和/或潜伏感染阶段期间施用。所述方法可包括如以诸如以下的诊断方案鉴定潜伏感染毒性分枝杆菌的受治疗者的步骤=Mantoux结核菌素皮肤试验(TST)、Quantiferon试验、体外检测对HBHA的响应或以组成型表达的抗原刺激后检测IP10。本发明还公开上述抗原用于制备接触后疫苗或免疫原性组合物的用途，所述接触后疫苗或免疫原性组合物抵抗由结核病复合群物种如结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌引起的潜伏感染的再激活，其中所述疫苗或免疫原性组合物是用于感染后诸如急性感染阶段期间或急性感染阶段之后和/或潜伏感染阶段期间施用并包含一种或多种上述的免疫原性部分。分枝杆菌作为病原体的成功是因为它与其宿主相互作用的复杂和精巧方式-部分地由专门的ESX-I细菌蛋白-分泌系统控制的过程。ESX-I系统递送细菌蛋白(例如 ESAT-6、CFPlO和EspA)到宿主细胞，这对于毒性是关键的。从杆菌分泌后，ESAT-6蛋白在吞噬体膜上形成孔，允许杆菌逃离吞噬体限制而进入胞质，从而促进细胞间扩散。组成型表达模式是个重要特征，说明这些分子实现对于病原体至关重要的必需功能，这些功能依赖于需要组成型表达以使病原体在免疫宿主中存活的基因。这些分子是本发明的基础，对于向潜伏感染个体施用的疫苗是尤其重要的抗原，因为它们靶向细菌生命周期的所有阶段，因而具有尽可能宽的活性基础。ESAT6、CFPlO和hpA相互依赖地都是分泌所需的，都属于已知是毒性必需的 ESX-I分泌系统。这些分泌的抗原对于细菌散播和裂解细胞膜是决定性的。ESAT6、CFPlO 和hpA也是在疾病不同阶段组成型表达的抗原-而例如Ag85的表达在感染后立刻被下调。免疫原性、组成型表达的抗原当作为治疗疫苗施用时预防潜伏结核病感染的再激活，从而保持感染潜伏。定义多功能T细胞术语多功能T细胞被理解为同时表达所有细胞因子IFN-Y、IL-2和TNF-α，或 IL-2加另外两种细胞因子IFN- γ和TNF- α的至少一种的T细胞。
单词“多肽”在本发明中具有其通常的含义。即任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白、寡肽、短肽及其片段，其中氨基酸残基经由共价的肽键连接。多肽可以是经化学修饰的，被糖基化、脂化(例如Mowat等1991年所述的用棕榈酰基氧基琥珀酰亚胺或Lustig等1976年所述的用十二烷酰氯化学脂化(Iipidation))、包含辅基或者包含另外的氨基酸如组氨酸标签或信号肽。因此，每一多肽可由具体的氨基酸表征并由具体的核酸序列编码。应理解，这种序列包括重组或合成方法制备的类似物和变体，其中这种多肽序列已经通过重组多肽中一个或多个氨基酸残基的取代、插入、添加或者缺失而被修饰，但在这里所描述的任何生物检测中仍具有免疫原性。取代优选是“保守性的”。这些保守性取代根据下表定义。在第二列相同单元格里的氨基酸和优选在第三列相同行中的氨基酸，可以彼此取代。第三列中的氨基酸由单字母代码表示。
脂肪族非极性GAPILV极性-不带电CSTMNQ极性-带电DEKR芳香族HFWY本发明的优选多肽是当结核分枝杆菌经受潜伏感染带来的压力时，从该生物体产生的免疫原性抗原。这样的抗原还可例如来源于结核分枝杆菌细胞和/或结核分枝杆菌培养物滤液。如此，包含以上抗原之一的免疫原性部分的多肽可完全由免疫原性部分组成，或可包含另外的序列。另外的序列可以来源于天然的结核分枝杆菌抗原或者是异源的，且这种序列可以但并非必需具有免疫原性。每一多肽由具体的核酸序列编码。应理解，这种序列包括其中这种核酸序列已经通过一个或多个核酸的取代、插入、添加或缺失而被修饰的类似物和其变体。在密码子使用中，取代优选是沉默取代，从而不会引起氨基酸顺序的任何一种改变，但可以被引入以提高蛋白质的表达。在本发明上下文中，术语“基本上纯的多肽片段”指多肽制品，其包含至多5%重量的天然伴随所述多肽的其它多肽物质(较低百分数的其它多肽物质是优选的，例如至多 4%、至多3%、至多2%、至多和至多0. 5% )。优选基本上纯的多肽是至少96%纯的， 即多肽占存在于制品中的总的多肽物质重量的至少96%，并优选更高的百分数，例如至少 97%、至少98%、至少99%、至少99. 25%、至少99. 5%和至少99. 75%。特别优选多肽片段是“基本上纯的形式”，即多肽片段基本上不含天然伴随它的任何其它抗原，也就是不含有来自属于结核病复合群或毒性分枝杆菌的细菌的任何其它抗原。这可以通过在非分枝杆菌宿主细胞中经重组方法制备多肽片段实现，如以下将详细描述的一样，或通过公知的固相或液相肽合成方法例如通过Merrifield描述的方法或其变化形式合成多肽片段。为了本发明的目的，应理解以上定义“基本上纯的多肽或多肽片段”不排除与分枝杆菌或非分枝杆菌来源的其他纯化或合成抗原组合存在的多肽或多肽片段。术语“毒性分枝杆菌”理解成能引起动物或者人中结核疾病的细菌。毒性分枝杆菌的例子包括但不限于结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌和牛结核杆菌。相关动物的例子是牛、 负鼠、獾和袋鼠。“感染个体”被理解成通过培养或者显微镜检查证实感染了毒性分枝杆菌的个体， 和/或临床上诊断有TB并对抗-TB化疗有反应的个体。培养、显微镜检查和临床诊断TB 为本领域任何技术人员所熟知。术语“PPD阳性个体”被理解为具有阳性Mantoux试验的个体、或其中PPD (纯化的蛋白衍生物)引起由IFN-Y的释放确定的阳性体外回忆应答的个体。“潜伏感染个体”被理解为已被毒性分枝杆菌如结核分枝杆菌感染，但未显示活跃结核病体征的个体。已被接种疫苗如BCG，或已被治疗TB的个体可能仍在体内保留分枝杆菌，而这目前是不可能证明的，因为这样的个体如果检验PPD反应性将预计是阳性的。然而，以其最准确的含义，“潜伏感染”可用于描述其组织中驻留结核分枝杆菌但临床上未发病的任何个体。潜伏感染个体可由目前临床使用的大量方法鉴定，诸如Mantoux结核菌素皮肤试验(TST)、Quantiferon试验，未来可能存在甚至更灵敏的诊断这一特定感染阶段的手段，诸如近来提出的体外检测对HBHA的响应(Hougardy 2007)或在以ESAT6体外刺激后检测 IPlO (Ruhwald 2008)。术语“再激活”被理解为这样的情况，其中非复制细菌(因为位于胞内，免疫系统可能难以检测到它们)与试图适应在免疫宿主中遇到的敌对环境而具有活性但改变的表达谱的缓慢复制细菌之间的平衡向利于病原菌倾斜而感染进入该阶段，其中细菌又开始快速复制，感染个体中的细菌数目增加。在潜伏感染个体中、在非常强的免疫压力下复制的这些细菌是本发明接种策略的靶。术语“ IFN-Y”被理解为干扰素-Y。IFN-Y的测量用作免疫应答的指示。术语“核酸片段”和“核酸序列”被理解成任何一种核酸分子，包括DNA、RNA、 LNA (锁核酸，locked nucleic acid)、PNA、RNA、dsRNA 和 RNA-DNA 杂合体。还包括含有非天然存在的核苷酸的核酸分子。该术语包括取决于用途的任何长度的核酸分子，例如从10 到10000个核苷酸。当核酸分子被用作例如在DNA治疗中的药品，或者用于制备根据本发明多肽的方法中时，优选使用编码至少一种表位的分子，其长度从约18到约1000个核苷酸， 所述分子可任选地插入载体中。贯穿于说明书的全部，除非上下文另外要求，否则单词“包含/包括(comprise)” 或者其变化形式如“包含/包括(comprises) ”或者“包含/包括(comprising) ”，将被理解成表示内含所称的组成部分或者整数或者组成部分或整数的组但不排除任何其它的组成部分或整数或组成部分或整数的组。组成型表达的基因定义为在感染后3周之后的时间点，经群体水平详细分析 mRNA,与肺中结核分枝杆菌CFU数目关联后，在肺中体内表达同样好的基因。从这一定义推断，组成型基因可能在单个细菌水平差异地表达。定量基因表达的方法是定量PCR。“同样好”定义为在此前测量的水平+/-5倍之内。比较通常是与在现在之前紧接着的时间点。各次测量之间的时间间隔不能长于感染时间与此前测量之间的时间间隔。例如，如果基因的表达在感染后第3周第一次测量，则第二次测量不能晚于感染后6周进行，第三次测量不能晚于感染后12周进行，等等。组成型表达的抗原是为组成型表达的基因的产物的多肽或这些多肽的部分。序列同一性术语“序列同一性”指两个等长的氨基酸序列或两个等长的核苷酸序列之间同源性程度的定量的度量标准。待比较的两个序列必须被比对成最佳可能的吻合，允许插入空位或者在蛋白序列末端截短。序列同一性可以通过公式(Nref-Ndif)100/N,rf计算，其中 是比对时两个序列中不同残基的总数，其中Nref是两个序列之一的残基的数量。因此，DNA 序列AGTCAGTC与序列AATCAATC具有75%的序列同一性( = 2和Nref = 8)。空位被算作是具体残基的不一致，即DNA序列AGTGTC与DNA序列AGTCAGTC将有75%的序列同一性 (Ndif = 2和Nref = 8)。序列同一性另外可以通过BLAST程序例如BLASTP程序(Pearson， 1988或www. ncbi. nlm. nih. gov/cgi-bin/BLAST)计算。在本发明的一个方面，比对是用序列对比方法ClustalW、采用如Thompson J.等1994年描述的缺省参数进行的，这些可以通过网址 http//www2. ebi. ac. uk/cIustalw/ 获得。优选序列同一性的最低百分数是至少80 %，例如至少85 %、至少90 %、至少91 %、 至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和至少99. 5%o免疫原性部分在本发明的一个优选实施方案中，多肽包含多肽的免疫原性部分如B细胞或T细胞表位。多肽的免疫原性部分是多肽的一部分，其引起动物或者人中和/或由这里描述的任一生物实验测定的生物样品的免疫应答。多肽的免疫原性部分可能是T细胞表位或B细胞表位。免疫原性部分可以涉及多肽的一个或者几个相对小的部分，它们可以分散于多肽序列或者位于多肽特定的部分中。对于一些多肽而言，甚至已经证实表位分散于多肽的全部序列(Ravn等，1999)。为了鉴定免疫应答期间被识别的相关T细胞表位，有可能使用重叠寡肽用于探测II类MHC表位，优选合成的、长度为例如20个的来自于多肽的氨基酸残基的寡肽。这些肽可以在生物学分析(例如这里描述的IFN-Y分析)中被测定，并且它们中的一些将产生阳性反应(因此是免疫原性的)，这种反应是肽中存在T细胞表位的证据。对于ESAT-6和CFP10，这种研究已经显示抗原的每个部分包含T细胞表位(Mustafa等2000， Arend SM等2000)。为了检测I类MHC表位，可能预测那些将会结合的肽(Mryhn等，1996)， 之后合成制备出这些肽并在相关的生物学分析如这里描述的IFN-Y检测中进行测试。肽优选具有例如8到11个长度的来源于多肽的氨基酸残基。可以通过如Harboe等1998年描述的分析B细胞对覆盖感兴趣多肽的重叠肽的识别来确定B细胞表位。与此定义一致的是，本文描述的多肽的免疫原性部分可被鉴定为引发免疫应答的部分，参见下文对“免疫应答”的定义。尽管T细胞表位的最短长度已显示为至少6个氨基酸，这种表位由更长的氨基酸段组成是正常的。因此，优选地，本发明的多肽片段长度为至少7个氨基酸残基，诸如至少 8、至少9、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少22、至少M和至少30 个氨基酸残基。因此，在本发明方法的重要实施方案中，优选多肽片段具有至多50个氨基酸残基诸如至多40、35、30、25和20个氨基酸残基的长度。预计长度为10至20个氨基酸残基的肽被证明是最有效地作为II类MHC表位，因此本发明方法中使用的多肽片段的尤其优选长度是18，诸如15、14、13、12和甚至11个氨基酸残基。预计长度为7至12个氨基酸残基的肽被证明是最有效地作为I类MHC表位，因此本发明方法中使用的多肽片段的尤其优选长度是11，诸如10、9、8和甚至7个氨基酸残基。多肽的免疫原性部分可以被遗传上不均一人群的大部分(高频率)或者小部分 (低频率)识别。另外，一些免疫原性部分诱导高免疫应答(优势的)，而其它的则诱导较低的但是仍然有效的应答(亚优势的)。高频率><低频率可与广泛分布的MHC分子(HLA型) 结合的乃至被多个MHC分子结合的免疫原性部分相关(Sinigaglia，1988，Kilgus，1991)。然而在为抵抗结核病的新疫苗提供候选分子的背景中，亚优势的表位与优势的表位同样相关，因为已经显示(Olsen，2000)，这样的表位可诱导保护，而不论其未被强烈地或广泛地识别的事实。变体本发明多肽的共同特征是如实施例中举例说明的，它们诱导免疫应答的能力。当然，通过取代、插入、添加或者缺失制备的本发明多肽的变体也可以具有免疫原性，如任何这里描述的检测测定的。免疫个体免疫个体被定义成已经清除或控制了毒性分枝杆菌的感染或已经接受了诸如牛分枝杆菌BCG接种的预防性接种的人或动物。免疫应答免疫应答可以通过以下方法之一监测·体外的细胞反应通过诱导相关细胞因子例如IFN-Y从淋巴细胞释放或者通过诱导淋巴细胞的增殖来确定，所述淋巴细胞取自当前或者以前感染毒性分枝杆菌或被相关多肽免疫的动物或者人。诱导是通过添加多肽或者多肽的免疫原性部分到含有2 X IO5个细胞到4X IO5个细胞每孔的悬浮液中进行的。细胞分离自血液、脾、肝或者肺，添加多肽或者免疫原性部分至浓度不超过20 μ g/ml悬浮液，刺激进行二到五天。为了监测细胞增殖， 细胞用放射性标记的胸苷脉冲，孵育16-22小时后，通过液体闪烁计数检测增殖。阳性反应定义为大于背景值加上两个标准偏差的反应。IFN- γ的释放可以通过本领域技术人员熟知的ELISA方法确定。阳性反应是大于背景值加上两个标准偏差的反应。在监测对多肽的免疫应答时，IFN-Y 以外的细胞因子如 IL-12、TNF-a、IL-4、IL-5、IL-10、IL-6、TGF-e 也是相关的。用于检测免疫应答的另一个更灵敏的方法是ELISpot方法，其中确定IFN-Y产生细胞的频率。在预包被抗鼠IFN-Y抗体(PharMingen)的ELIspot板(MAHA，Millipore) 中，将分离自血液、脾或者肺的梯度数量的细胞(通常1 X IO5到4X IO5细胞/孔)在存在浓度不超过20 μ g/ml的多肽或者免疫原性部分下孵育M-32个小时。板随后与生物素化的抗-IFN-Y抗体孵育，然后与链霉亲和素-碱性磷酸酶孵育。通过加入BCIP/NBT(Sigma) 来鉴定IFN-γ产生细胞，该相关底物产生斑点。这些斑点可以使用解剖显微镜来计数。也可能通过使用PCR技术确定编码相关细胞因子的mRNA的存在。通常一种或多种细胞因子将利用如PCR、ELISP0T或者ELISA测定。本领域技术人员可以理解，由特定多肽诱导的任何所述细胞因子量的显著增加或减少可被用于评定多肽的免疫活性。·还可以通过利用来源于免疫个体或结核分枝杆菌感染者的T细胞系来确定体外的细胞反应，其中所述T细胞系已经由活的分枝杆菌、细菌细胞提取物或培养物滤液外加 IL-2启动了 10到20天。通过添加不超过20 μ g/ml悬浮液的多肽到含有1 X IO5个细胞至 3X IO5个细胞每孔的T细胞系并进行两到六天孵育来进行诱导。IFN-Y的诱导或其它相关细胞因子的释放通过ELISA检测。对T细胞的刺激还可以通过使用如上所述的放射性标记的胸苷检测细胞增殖进行监测。对于两种检测而言，阳性反应是大于背景值加上两个标准偏差的反应。 在对临床上或者亚临床上感染了毒性分枝杆菌的个体进行皮内注射或者局部应用贴片(patch)至多IOOyg多肽或者免疫原性部分后，如果在注射或者应用后72-96小时产生了至少5mm直径的阳性反应，则体内的细胞反应可以被确定为阳性DTH反应。 通过免疫个体或者被感染个体中的特异性抗体反应，可以确定体外的体液反应。 存在的抗体可以通过ELISA技术或者蛋白质印迹测定，其中多肽或者免疫原性部分被吸附至硝酸纤维膜或者聚苯乙烯的表面。血清优选用PBS稀释，稀释比例从1 10至1 100， 并被添加到已被吸附的多肽上，孵育进行1到12个小时。通过利用标记的第二抗体，如通过ELISA经测定OD可以确定特定抗体的存在，其中阳性反应是大于背景值加上两个标准偏差的反应，或者可选地通过蛋白质印迹中的可视反应来确定特定抗体的存在。·另一个相关参数是用存在于佐剂中的多肽接种之后或者DNA接种后动物模型中所诱导的保护的测量。适合的动物模型包括经毒性分枝杆菌的感染激发的灵长类、豚鼠或者小鼠。诱导的保护的读数可以是靶器官中相对于未接种动物减少的细菌负荷、相对于未接种动物延长的存活时间和相对于未接种动物减少的重量损失。制备方法通常，结核分枝杆菌抗原、编码这种抗原的DNA序列可以使用各种各样的方法中的任何一种制备。它们可以通过如上述的方案从结核分枝杆菌细胞或培养物滤液纯化为天然蛋白。 免疫原性抗原还可以使用编码该抗原的DNA序列重组制备，其中DNA序列被插入表达载体中并在适合的宿主中表达。宿主细胞的例子为大肠杆菌。具有少于约100个氨基酸和通常少于50个氨基酸的多肽或其免疫原性部分还可以被合成制备，并可以使用本领域普通技术人员所熟知的技术产生，例如市售可供的固相技术，该技术是向生长的氨基酸链上按顺序加入氨基酸。在构建和制备定义用于DNA接种的编码多肽的质粒DNA时，可使用宿主菌株诸如大肠杆菌(E. coli)。然后可从携带目的质粒的宿主菌株培养物制备质粒DNA，使用如，包括内毒素去除步骤的Qiagen Giga-质粒纯化试剂盒(Qiagen，Santa Clarita，CA，USA)纯化。 优选用于DNA接种的质粒DNA不含内毒素。融合蛋白免疫原性多肽还可以制备为融合蛋白，通过该方法可以获得本发明多肽优越的特性。例如，在重组制备时促进多肽输出(export)的融合配偶体、促进多肽纯化的融合配偶体和提高本发明多肽片段的免疫原性的融合配偶体均是感兴趣的可能性。因此，本发明还涉及含有至少一种以上定义的多肽或免疫原性部分和至少一种融合配偶体的融合多肽。为了增强免疫原性，融合配偶体可以是来源于结核分枝杆菌的另一种多肽，诸如来源于属于结核病复合群的细菌的多肽片段，诸如ESAT-6、CFP10、EspA、TB10. 4、RD1-0RF5、RD1-0RF2、 Rvl036、MPB64、MPT64、Ag85A、Ag85B (MPT59)、MPB59、Ag85C、19kDa 脂蛋白、MPT32 和 α -晶体蛋白，或上述任一抗原的至少一个T细胞表位(Skj0t等2000 ；W00179274 ；W00104151 ；美国专利申请09/0505, 739 ；Rosenkrands等1998 ；Nagai等1991)。本发明还涉及包括两种或多种本发明的多肽(或其免疫原性部分)的相互融合物的融合多肽。其它能提高产物免疫原性的融合配偶体有淋巴因子，例如IFN-y、IL-2和IL-12。为了促进表达和/或纯化， 融合配偶体可以例如，是细菌菌毛蛋白(fimbrial protein)，例如菌毛组分菌毛素(pilin) 和PapA ；蛋白A ；ZZ-肽(ZZ-融合体由瑞典Wiarmacia销售)；麦芽糖结合蛋白；谷胱甘肽 (gluthatione) S-转移酶；β -半乳糖苷酶 ’或聚-组氨酸。融合蛋白可以在宿主细胞如大肠杆菌中重组生产，在不同的融合配偶体间诱导形成一个连接区域也是可行的。其他感兴趣的融合配偶体是被脂化使得免疫原性多肽以一种适合的方式存在于免疫系统中的多肽。这种效果是例如从如WO 96/40718Α中所描述的基于包柔氏螺旋体(Borrelia burgdorferi) OspA多肽的疫苗或基于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) OprI脂蛋白的疫苗(Cote-Sierra J, 1998)获知的。另一个可能性是在免疫原性多肽N末端融合已知的信号序列和N末端半胱氨酸。当在适合的生产宿主中制备时，这种融合引起免疫原性多肽在N-末端半胱氨酸处的脂化。用途疫苗疫苗是建立或改进对具体疾病的免疫的生物制品。疫苗可以是预防性的(如，预防或改善未来被任何天然或“野生”病原体感染的作用)、接触后的(如，预防无临床症状的潜伏感染个体中的再激活)或治疗性的(如，用于单独或为缩短治疗与抗生素疗法联合治疗活跃疾病的疫苗)。 用于潜伏TB的动物模型为了以结核分枝杆菌诱导低等级的潜伏感染，利用正常剂量的结核分枝杆菌(肺中大约150个细菌)首先对动物提供气雾剂感染。感染6周后，然后对动物提供次优的6 周化疗，在此期间大多数-但并非所有-细菌被根除。剩余细菌将建立潜伏感染。化疗后一些动物被接种疫苗以检查疫苗预防潜伏感染再激活的能力，再激活将在化疗后5-15周自发地发生。参见图2。蛋白疫苗本发明的另一部分涉及包含本发明多肽(或其至少一个免疫原性部分)或融合多肽的疫苗组合物。为了确保这种疫苗组合物的最佳性能，优选它包含免疫学上和药学上可接受的载体、赋形物或者佐剂。相对于未接种疫苗的动物，其中本发明多肽被动物识别的有效疫苗在动物模型中能够在毒性分枝杆菌攻击后减少靶器官内的细菌负荷，延长存活时间和/或减少重量损失。适合的载体选自由以下组成的组(多个)多肽经疏水的非共价相互作用结合的聚合物，所述聚合物比如塑料，如聚苯乙烯，或(多个)多肽共价结合的聚合物，如多糖或者多肽如牛血清清蛋白、卵清蛋白或者匙孔青贝(keyhole limpet)血蓝蛋白。适合的赋形物选自稀释剂和悬浮剂所组成的组。佐剂优选选自下列所组成的组二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)、Quil A、聚I :C、氢氧化铝、弗氏不完全佐剂、IFN- y , IL_2、IL-12、单磷酰脂质 A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、海藻糖二山嵛酸酯和胞壁酰二肽(MDP)。包含肽序列作为活性成分的疫苗的制备是本领域通常所知晓的，如美国专利 4，608，251,4, 601，903,4, 599，231和4，599，230中例举的，它们全部被引入本文作为参考。用于获得疫苗佐剂效果的其它方法包括使用试剂，诸如使用氢氧化铝或者磷酸铝 (明矾)，糖的合成聚合物(聚羧乙烯(Carbopol))，通过热处理使疫苗中蛋白凝聚，通过胃蛋白酶处理的白蛋白(Fab)抗体再活化的凝聚，与细菌细胞如微小隐孢子虫(C.parvum) 或者内毒素或者革兰氏阴性细菌的脂多糖成分相混合，在生理学上可接受的油类赋形物如二缩甘露醇(marmide)单油酸酯(Aracel A)中进行乳化或者与作为封闭替代物(block substitute)的20%全氟化碳溶液(全氟萘烷和全氟三丙胺混合乳剂(Fluosol-DA))乳化。其它的可能包括使用免疫调节物质如细胞因子或者合成IFN-Y诱导物如与上述佐剂结合的聚I:C。实现佐剂效果的另一种感兴趣的可能性是使用Gosselin等1992年描述的技术 (将其引入这里作为参考)。简言之，相关抗原诸如本发明的抗原可以与抗单核细胞/巨噬细胞上的Fc γ受体的抗体结合(或结合抗原的抗体片段)。疫苗以与剂量配方相容的方式施用，施用的量例如将是免疫原性的并有效预防再激活。施用的量取决于治疗的受试者，包括如引发免疫应答的个体免疫系统的能力和所需的防护程度。适合的剂量范围具有每次接种几百微克活性成分的数量级，优选从约0. 1 μ g 到1000 μ g的范围，例如在约Iyg到300 μ g的范围，特别是在约10 μ g至Ij 50 μ g的范围。 适合用于初次给药和加强注射的用药法也是可以变化的，但是代表性的是在初次给药后接着进行接种或者其它的给药。施用的方式可以广泛地变化。任何用于疫苗施用的常规方法均适用。认为这些方法包括基于生理学上可接受的固态或以生理学上可接受的分散液口服施用，肠胃外，通过注射，等等。疫苗的剂量取决于给药途径，并根据待接种疫苗人的年龄和次要程度上待接种疫苗人的身材大小而变化。疫苗通常经肺内例如通过气雾剂或吸入、经注射例如经皮下或者肌内注射进行肠胃外给药。适合于其它给药方式的其它制剂包括栓剂和某些情况下的口服制剂。对于栓剂而言，传统的粘合剂和载体可以包括例如聚亚烷基二醇或者甘油三酯；这种栓剂可以形成自含有0.5%到10%范围的、优选1-2%范围的活性成分的混合物。口服制剂包括诸如通常使用的赋形剂，例如药品级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠(sodium saccharine)、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或者粉末的形式，有利的是含有10-95%的活性成分，优选25-70%。在许多情况下，必须多次施用疫苗。在个体已经变得感染或怀疑已经变得感染的情况中，此前的疫苗接种可能已经提供了足够的免疫来预防原发性疾病，但如此前讨论的， 强化这一免疫应答将不会有助于抵抗潜伏感染。在这样的情况下，疫苗将必须是设计为有效抵抗感染的潜伏阶段或再次出现的活跃结核病感染的接触后疫苗。
由于遗传变异，不同的个体可以与相同多肽产生不同强度的免疫应答。因此，本发明的疫苗可以包含几种不同的多肽以提高免疫应答。疫苗可包含两种或更多种多肽或者免疫原性部分，其中所有多肽如上定义，或者某些(但并非全部)多肽可来源于毒性分枝杆菌。在后者的实例中，不一定达到上述多肽标准的多肽可能由于它们自身的免疫原性而发挥作用或者仅仅充当佐剂。疫苗可包含1-20、如2-20或乃至3_20种不同的多肽或者融合多肽，诸如3_10种不同的多肽或者融合多肽。DNA 疫苗本发明的核酸片段可用于实现抗原的体内表达，即该核酸片段可用在所谓的DNA 疫苗中，如Ulmer等1993年所评述的，其被引入作为参考。因此，本发明还涉及包含本发明的核酸片段的接触后疫苗，该疫苗引起施用了疫苗的动物包括人体内抗原的表达，表达的抗原的量有效地赋予对动物包括人的毒性分枝杆菌引起的感染的治疗。通过联合施用编码表达产物的基因与编码具有调节免疫应答能力的多肽的DNA 片段，这种DNA疫苗的效力可以得到加强。活的重组疫苗用于有效激活对接触后疫苗的细胞免疫应答的一种可能性可以通过在非病原的微生物或者病毒中表达疫苗中相关的抗原来实现。这种微生物的公知实例是牛结核杆菌 BCG、沙门氏菌和假单胞菌，病毒的例子是牛痘病毒和腺病毒。因此，本发明另一个重要的方面是对目前可用的活的BCG疫苗进行加强，其中通过特定方式将一个或多个拷贝的编码一种或多种如上定义的多肽的DNA序列引入微生物的基因组中，所述特定方式使微生物得以表达和分泌所述多肽。预期超过一个拷贝的本发明的核苷酸序列的弓I入增强了免疫应答。另一个可能性是将编码根据本发明的多肽的DNA整合入减毒病毒如牛痘病毒或者腺病毒中(Rolph等，1997)。重组牛痘病毒可以在受感染宿主细胞的细胞质内复制，由此感兴趣的多肽可以诱导预期诱导抗TB的保护的免疫应答。本申请中提及的所有专利和非专利参考文献通过引用全文并入本文。现在以以下非限制性实施例进一步详细描述本发明。附例图1 结核分枝杆菌感染的过程基本上经历3个阶段。图2 接触后接种疫苗以预防再激活的模型图3:TB接种模型。用于在SSI检验接触后疫苗的模型的示意性概括。通过气雾剂途径以毒性结核分枝杆菌感染小鼠。从感染后第6周到第12周，用抗生素治疗小鼠以建立潜伏TB状态。在感染后第10周开始，以3周的间隔，用接触后疫苗候选物接种小鼠2至3次。为小鼠留出时间来再激活疾病，大约20周后评价肺的细菌数目以评价疫苗的保护效力。图4 :ESAT6而不是Ag85的接触后疫苗诱导保护。按照实施例1的示意性概括将小鼠感染、治疗和接种疫苗。在感染后第30-40周杀死小鼠，在此时间点评价肺的细菌负荷(图A、C-E)或如图4B所示，其中对ESAT6，在感染期间多个时间点确定细菌负荷。(A和B)ESAT6接种的动物与对照动物相比的细菌负荷。 (C)Ag85B接种的动物与对照动物相比的细菌负荷。(D)ESAT-6肽混合物(覆盖完整ESAT6 序列的重叠肽池)接种的动物与Ag85B接种的动物和对照动物二者相比的细菌。(E)接触后接种疫苗Ag85B-ESAT-6(Hl)接种的小鼠与未接种疫苗的对照小鼠相比抵抗再激活的保护。图4A、C-E中的所有数据展示为代表每个个体动物的点图，并绘出平均值，而图4B中的每个时间点代表6个个体动物，展示为平均值士平均值的标准误差(SEM) (B)。所有统计分析利用非配对t检验(图A-C和E)或Tukey多重比较检验(图D)进行，其中ρ < 0. 05被认为是显著的。图5 接触后接种疫苗ESAT-6诱导多功能T细胞。来自未接种疫苗的动物或ESAT-6接种的动物的感染的肺的细胞体外用ESAT-6刺激，随后以抗-⑶4、抗-⑶8、抗-IFN-Y、抗-TNF-α和抗_IL_2染色。(A和B)通过首先将 ⑶4T细胞分为IFN-Y阳性⑴或IFN-γ阴性㈠细胞来确定细胞因子谱。对IFN-γ +细胞和IFN-γ-细胞二者分析TNF-α和IL-2的产生。饼形图(A和B)按照细胞因子产生谱以颜色编码，概括了对指定细胞因子产生谱为阳性的CD4+T细胞响应的比例(占ESAT-6特异性CD4T细胞)。(C)细胞因子的每种可能的组合展示在条形图的χ轴，未接种疫苗的小鼠(灰色条)或ESAT-6接种的小鼠(黑色条)中表达细胞因子的任何组合的ESAT-6特异性⑶4+T细胞百分比对每个免疫组给出。D.用ESAT-6对潜伏感染小鼠接种2次，最后一次接种后20周，评价肺的细菌数目以确定保护效力。(#p < 0. 01，单向ANOVA Tukey多重比较检验)。图6 所有接触后实验的汇集分析对于其中ESAT6、Rv3871、Ag85B、Rv3905、Rv3445、Rv0569 或 Rv2031c(图 A)、 Ag85B-ESAT6 (HI)或Ag85B_ESAT6-RW660 (H56)(图B)用于接触后接种疫苗的单独实验，将佐剂对照组的细菌负荷中值与以上述任一种抗原接种的接种组中的每个个体小鼠的细菌负荷比较。图A和B中，每个点对应接种组相比于佐剂对照组赋予的保护水平，S卩ALoglO CFU，并由多次独立实验组成。(A)单个抗原 ESAT6、Rv3871、Ag85B、Rv3905、Rv3445、Rv0569 或Rv2031c的LoglO保护；(B)或与仅ESAT6相比杂合抗原Hl和H56的LoglO保护。使用 Kruskall Wallis多重比较检验，统计分析用于比较不同组之间的中值。ρ < 0. 05被认为是显著的。图7 接触后用Rv3871接种的效力与ESAT6和对照动物比较。将小鼠感染、治疗、并在感染后第10、13和18周接种疫苗。在感染后第36周，处死小鼠，用Rv3871 (图7A)或ESAT6(图7B)体外再次刺激来自接种疫苗的小鼠和未接种疫苗的盐水对照小鼠的肺淋巴细胞。IFN-Y释放由ELISA评价，样品以三份进行。数据表示为平均值士SEM。疫苗赋予的保护效力通过计算从全肺勻浆培养的肺中的细菌来确定(n = 16-18)。数据展示为点图，其中每个点代表个体动物，并绘有中值(红线)。
实施例实施例1 用于接种疫苗的鼠TB模型Cornell模型已经广泛用作鼠模型来研究潜伏ΤΒ。在我们的实验室中这一模型已被修改用于检验疫苗候选物预防再激活的能力。最初将小鼠气雾地感染毒性结核分枝杆菌，感染后第6周开始抗生素治疗以减少细菌负荷。这是为了模拟人类感染的潜伏阶段，其在小鼠不会自发地发生。在这一潜伏阶段期间(具有持续低的细菌数目的阶段)，小鼠被免疫两次，疫苗预防再激活的能力通过在最后一次免疫后20周，培养脾和肺的活结核分枝杆菌来确定。实验的长时间间隔是必需的，以允许足够时间来再激活疾病，这是读出疫苗效力的前提(图3)。实施例2 :ESAT6而不是Ag85的接触后疫苗诱导保护。ESAT-6和Ag85B已被证明作为单组分以及作为融合分子Ag85B_ESAT6 (Hl)在预防性接种中是保护性的。然而，当在接触后模型中检验这些抗原时(如实施例1中上述)， 只有ESAT6具有保护作用，在再激活阶段期间控制细菌生长(图4)。而且，如图4B中可见，ESAT6抵抗再激活的保护早在感染后第18周就表现出，且这种保护在实验过程中一直保持(直到感染后第40周)。这不同于Ag85B用作接触后疫苗时观察到的(图4C和D)， Ag85B用作接触后疫苗时细菌负荷与对照相比没有显著下降。此外，我们评价了包括TB抗原Ag85B和ESAT-6的Hl融合蛋白，它在预防性情况中显示了有希望的效力。当这一分子在SSI接触后模型中用作接触后疫苗时，其能够显著减少细菌数目(图4E)。实施例3 :ESAT6肽混合物的接触后疫苗诱导保护如以上实施例所示，ESAT-6分子在接触后提供时非常有活性，导致与对照组相比和与Ag85B相比细菌负荷的降低。而且，我们还显示，作为重叠肽的池而不是重组蛋白提供的ESAT-6也导致与对照组和Ag85B 二者相比，抵抗再激活的更好的保护，证明ESAT6的强活性，和作为接触后疫苗起作用的能力(图4D)。用于保护实验的重叠ESAT-6肽(P1-P13)PlMTEQQffNFAGIEAAA(SEQIDNO.19)
P2NFAGIEAAASAIQGN(SEQIDNO.20)
P3ASAIQGNVTSIHSLL(SEQIDNO.21)
P4NVTSIHSLLDEGKQS(SEQIDNO.22)
P5SLLDEGKQSLTKLAA(SEQIDNO.23)
P6KQSLTKLAAAffGGSG(SEQIDNO.24)
P7AAffGGSGSEAYQGVQ(SEQIDNO.25)
P8GSEAYQGVQQKffDAT(SEQIDNO.26)
P9QQKffDATATELNNAL(SEQIDNO.27)
PlOTATELNNALQNLART(SEQIDNO.28)
Pll ALQNLARTISEAGQA(SEQIDNO.29)
P12 TISEAGQAMASTEGN(SEQIDNO.30)
P13 QAMASTEGNVTGMFA(SEQIDNO.31)实施例5 接触后以ESAT-6接种诱导多功能T细胞为了检查接触后以ESAT-6接种对ESAT-6特异性细胞的细胞因子表达谱的作用， 首先用毒性结核分枝杆菌气雾感染小鼠，在感染后第6周开始抗生素治疗以减少细菌负荷和建立潜伏感染。在潜伏阶段期间以3周的间隔将小鼠接种疫苗(如图3所示)3次，在最后一次接种疫苗后20周确定ESAT-6疫苗影响多功能T细胞的数目和预防结核分枝杆菌再激活的能力。结果显示，在未接种疫苗组有明显的ESAT-6响应，但细胞因子表达谱显著不同于ESAT-6接种组(图5)，尤其是在多功能T细胞(IFN- y +TNF- α +IL-2+CD4T细胞) 方面。因此，与未接种疫苗组相比，我们观察到IFN-γ/TNF-α⑶4Τ细胞数目减少，共表达 IFN- y /TNF- α /IL-2的三重阳性多功能⑶4 T细胞数目增加。多功能T细胞的存在增加与 ESAT-6接种的动物肺中细菌数目减少相关联(图5D)。实施例6 与早期感染和晚期感染关联的其他抗原相比，接触后用ESAT6接种更持续地防止再激活。为了确定哪种抗原最持续地防止再激活，我们对基于进行的所有接触后实验的标准化数据进行汇集分析。通过比较组中每个个体小鼠的细菌负荷与对照组的中值将来自单独实验的数据集标准化，即每个数据点代表对照中值CFU与每个个体动物的CFU之间的差(LoglO CFU对照中值-LoglOCFU疫苗组)(图6)。图6Α中，对潜伏相关抗原Rv0569、 Rv2031c与早期抗原Ag85B、ESAT6、Rv3871、Rv3905和Rv;3445 (其中后两个为ESAT6家族蛋白)的保护的汇集数据集的比较显示，ESAT6接种的动物与评价的其他抗原相比显著更好地防止再激活。而且，在接触后以Rv3871 (—种ESX-I蛋白)接种后获得的保护水平也表现为比其他抗原提高(图6A)。为了进一步证明尤其是ESAT6的活性，我们比较了 ESAT6赋予的保护与两种融合构建体Hl(Ag85B-ESAT6)和H56 (Ag85B_ESAT6-RW660)赋予的保护， 二者都包含ESAT6 (图6B)。分析显示，当被包括在上述两种融合构建体中时，ESAT6活性仍导致抵抗再激活的保护。实施例7 接触后以ESX-I家族另一成员Rv3871接种表现为对再激活过程具有抑制作用。我们与ESAT6平行地评价了 ESX-I家族的其他成员，发现接触后接种Rv3871导致诱导Rv3871特异性免疫应答(图7B)，尽管未达到ESAT6诱导的免疫应答(图7A)的程度。 然而ESAT6和Rv3871 二者诱导的免疫应答比盐水对照动物大。疫苗特异性免疫应答的诱导伴随着两个疫苗组中与盐水组相比(中值)细菌负荷下降。这表示，Rv3871在防止再激活方面可具有与ESAT6相比相似的作用，这由与对照组中略微升高的水平相比，这两组中细菌数目水平相似证明(图7C)。参考文献Andersen，P. 2007 15(1)，7-13Anon. 2001. Global Tuberculosis Control. WHO Report.Arend, SM.，Infect Immun. 200068(6) :3314-3321.Brodin, P.等 Infect Immun. 2006，74，88—98Cote-Sierra J，等 1998，Gene Oct 9 ；221 (1) :25-34Doherty TM 等，2002，J Clin Microbiol. Feb ；40 (2) :704-6.Gao LY 等 2004，Molecular Microbiology 1677—93Gosselin 等，1992. J. Immunol. 149 :3477-3481Guinn KI 等，2004，Mol Microbiol. 51,359-70Guttstadt, A 1891.Die Wirksamkeit des Koch ' schen Heilmittels gegen Tuberculosis, Polykliniken und Pathologisch/Anatomischen Institute der Preussischen Universitaten. Springer, Berlin.Harboe, M.，等 1998 Infect. Immun. 66 :2 ；717-723
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权利要求
1.一种疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物接触后地施用于潜伏感染个体，预防结核病的再激活，所述疫苗或免疫原性组合物包含在结核分枝杆菌 (M. tuberculosis)感染期间组成型表达的抗原或编码所述抗原的核酸。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述组成型表达的抗原属于ESX-I分泌系统，选自以下组成的组i)SEQID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、32、33 和 34 ；ii)(i)中任一序列的免疫原性部分，如，T细胞表位；和iii)与(i)或(ii)中任一序列具有至少70%序列同一性且同时具有免疫原性的氨基酸序列类似物。
3.如权利要求2所述的组合物，所述组合物包含免疫原性部分的混合物，诸如2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12或13种免疫原性部分的混合物。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述抗原选自以下组成的组SEQID NO. 19,20, 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 和 31。
5.如权利要求1-2所述的组合物，其中所述多肽与分枝杆菌科的细菌表达的抗原融I=I ο
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述融合配偶体是组成型表达的抗原。
7.如权利要求6所述的组合物，所述组合物包含与CFPlO融合的ESAT6。
8.如前述权利要求任一项所述的组合物，所述组合物包含选自以下的另外的递送系统活的重组疫苗，即基因修饰的生物体诸如表达分枝杆菌基因的细菌或病毒；免疫原性递送系统，诸如DNA疫苗，即表达上述蛋白的基因或基因片段的质粒；蛋白疫苗，即在递送系统诸如佐剂中递送的蛋白本身或来源于蛋白本身的合成肽。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述佐剂包含DDA/TDB和/或聚I:C。
10.如前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述氨基酸序列被脂化以允许所述多肽的自佐剂作用。
11.一种选自权利要求1-7任一项中定义的组的抗原，所述抗原用于治疗潜伏结核病。
12.—种治疗动物包括人类的由毒性分枝杆菌，例如，由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、与分枝!flif (Mycobacterium africanum)或牛分枝!flif (Mycobacterium bovis)引起的结核病感染的再激活的方法，所述方法包括向动物施用根据权利要求1-10 任一项所述的疫苗或免疫原性组合物。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物在感染后诸如急性感染阶段期间或急性感染阶段之后和/或潜伏感染阶段期间施用。
14.如权利要求12所述的方法，所述方法包括鉴定潜伏感染毒性分枝杆菌的受治疗者的步骤。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述潜伏感染毒性分枝杆菌的受治疗者以诸如以下的诊断方案鉴定=Mantoux结核菌素皮肤试验(TST)、Quantiferon试验、体外检测对HBHA 的响应或在以组成型表达的抗原刺激后检测IP10。
16.选自权利要求1-7任一项中定义的组的抗原用于制备接触后疫苗的用途，所述接触后疫苗抵抗由结核病复合群的物种如结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌引起的潜伏感染的再激活。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述疫苗是用于感染后诸如急性感染阶段期间或急性感染阶段之后和/或潜伏感染阶段期间施用。
18.如权利要求16-17任一项所述的用途，其中所述疫苗包含一种或多种权利要求1-7 中定义的免疫原性部分。
全文摘要
本发明公开可向潜伏感染个体施用以预防结核病复合群微生物物种(结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum))引起的潜伏结核病感染的再激活的疫苗或者免疫原性组合物。本发明是基于在感染的不同阶段组成型表达的大量结核分枝杆菌来源的蛋白和蛋白片段。本发明涉及这些多肽、其免疫活性片段和编码它们的基因用于免疫组合物诸如疫苗的用途。
文档编号A61P11/00GK102413837SQ201080017717
公开日2012年4月11日 申请日期2010年4月23日 优先权日2009年4月24日
发明者J·迪特里希, 卡里纳·温斯波·伦德贝里, 彼得·安德森, 特吕克·蒂·吉姆·坦·候昂 申请人:国立血清研究所