专利名称：含具有信号肽的细菌毒素作为载体的半抗原-载体缀合物和它们在免疫原性组合物中的用途的制作方法
含具有信号肽的细菌毒素作为载体的半抗原-载体缀合物和它们在免疫原性组合物中的用途
技术领域：
本发明涉及用于诱导针对目标抗原的免疫应答的免疫原性组合物。尤其是，本发明提供包括抗原-载体缀合物的免疫原性组合物，其中载体是含信号肽的细菌毒素。本发明也提供产生具有增强的免疫原性的免疫原性组合物的方法，包括在抗原-载体缀合物 (例如半抗原-载体缀合物)中将信号肽添加到细菌载体。本发明也提供使用这些免疫原性组合物在受试者中诱导针对半抗原的免疫应答的方法。
背景技术：
细菌毒素-半抗原缀合物是目前临床试验中作为对于药物成瘾的治疗剂。在这些持续试验中，当将含半抗原/药物(例如，可卡因-细菌毒素缀合物或烟碱-细菌毒素缀合物)的免疫原性组合物施用于成瘾的个体时，引起特异于药物的抗体。例如，当治疗组合物是可卡因-载体缀合物时，治疗诱导抗-可卡因抗体应答，其降低受试者血流或粘膜组织中的可卡因，由此降低药物的心理学成瘾性质。用烟碱-载体缀合物处理诱导抗-烟碱抗体及减少来自烟碱使用的满足感。发明概述载体是细菌毒素的药物-载体缀合物的初始临床成功提出了对具有甚至更大的免疫原性的药物-细菌毒素缀合物的需求。具有增强的免疫原性的药物-细菌毒素缀合物的产生具有以更少剂量，以更低剂量，和/或以更大的剂量之间的时间间隔施用的临床优势。具有更大的潜力的缀合物的利用度也将大大辅助所述疫苗的大规模产生。本发明部分基于如下发现，包括缀合于含信号肽的霍乱毒素B (CTB)载体的烟碱的半抗原-载体缀合物相比缺乏信号肽的烟碱-CTB缀合物具有增强的免疫原性。本文提供免疫原性组合物，其包括细菌毒素，免疫原性通过含信号肽增强。在一实施方式中，信号肽是细菌毒素的内源性信号肽或其片段。在一实施方式中，信号肽包括氨基酸序列Ala-Pro-Gly-Tyr-Ala-His-Gly。在其他实施方式中，信号肽包括氨基酸序列 Gly-Tyr-Ala-His-Gly。在其他实施方式中，信号肽包括氨基酸序列Tyr-Ala-His_Gly。在其他实施方式中，信号肽包括氨基酸序列Ala-His-Gly。在其他实施方式中，信号肽包括氨基酸序列His-Gly。在其他实施方式中，信号肽包括单Gly残基。在一些实施方式中，本发明的，免疫原性组合物包括一种或更多这些肽的混合物。在本发明的另一实施方式中，免疫原性组合物包括含信号肽的细菌毒素，选自 细菌ADP-核糖基化外毒素亚基肽，霍乱毒素B (CTB)大肠埃希氏菌(Escherichia coli) 热-不稳定的肠毒素(LT)，白喉毒素，破伤风类毒素，百日咳毒素和丝状血凝素，志贺毒素及假单胞菌外毒素。其他有用的细菌毒素载体包括具有增强粘膜应答的能力的任何细菌毒素，例如，细菌毒素的LTB家族中的任何毒素。在一些实施方式中，细菌毒素载体含其内源性信号肽。在一些实施方式中，本发明的细菌毒素载体，例如CTB或任何上述的细菌毒素，含异源信号肽。
本发明提供免疫原性组合物，其包括抗原和载体，其中载体是含信号肽的细菌毒素和抗原是针对其期望产生免疫应答的任何分子。在本发明的一实施方式中，抗原缀合于载体。在一些实施方式中，抗原是半抗原。本发明部分基于如下发，含信号肽的细菌毒素载体相比缺乏信号肽的细菌毒素载体提供更大的针对缀合的半抗原的免疫应答。在一些实施方式中，半抗原是已知当以与缺乏信号肽(或信号肽不稳定，及期望增强的免疫)的细菌毒素的缀合物存在时具有免疫原性的半抗原。在本发明的一些实施方式中，缀合于含信号肽的细菌毒素的半抗原是烟碱或烟碱的衍生物。在一些实施方式中，半抗原是可卡因或另一成瘾药物。在一些实施方式中，半抗原是病原体的抗原。在一些实施方式中，抗原-细菌毒素缀合物中的抗原不是半抗原。本发明也提供使用上述的免疫原性组合物在受试者中诱导针对半抗原的免疫的方法。本发明也提供产生包括含信号肽的细菌毒素载体的免疫原性组合物的方法。在一些实施方式中，方法涉及在细胞内表达细菌毒素，其中细菌毒素含信号肽。在一些实施方式中，细菌毒素是CTB，而产生其的细胞是霍乱弧菌(Vibrio ch0lerae)213株。
图1. rCTB(重组霍乱毒素B)的氨基酸序列。图2.霍乱弧菌(V. cholerae)213和401中2种rCTB表达系统的比较。当在213 株中产生时，检测rCTB的形式含达7个氨基酸长度的信号序列。当rCTB在401株中产生时检测不到稳定的信号序列。图3. (A)许多可能的，任意标记的，半抗原-载体缀合物的“分支”的表示，鉴定用于容易理解用于本发明的实践的适合的化合物和缀合物。(B)可能的，任意标记的，半抗原-载体缀合物的“分支”的表示，鉴定用于容易理解本发明的实践中使用的适合的化合物和缀合物，其中Q'是修饰的含T-细胞表位的载体，例如修饰的蛋白载体。图4.在本发明的免疫原性组合物的制备中有用的烟碱和一些其衍生物和代谢物的表示。发明详述使用本发明的方法和组合物，及更尤其，本文所示技术，本领域技术人员可将任何选择的含信号肽的细菌毒素载体与任何选择的抗原(例如，半抗原)连接，以制造本发明的抗原-载体缀合物。任意数的载体和抗原和/或半抗原可存在于本发明的单个缀合物分子。1.用于本发明的免疫原性组合物的载体本发明提供包括抗原-载体缀合物(例如半抗原-载体缀合物)的免疫原性组合物，其中载体是含信号肽的细菌毒素。在一些实施方式中，细菌毒素含其内源性信号肽。在一些实施方式中，细菌毒素已经加工为含信号肽。在一些实施方式中，细菌毒素保留其信号肽，例如，其未从细菌毒素去除。在本发明中，免疫原性组合物包括抗原(例如半抗原)及载体，其中载体是含信号肽的细菌毒素。在本发明的一实施方式中，抗原缀合于载体。在一些实施方式中，细菌毒素来自革兰氏阴性细菌。在一些实施方式中，毒素来自革兰氏阳性细菌。在一些实施方式中，革兰氏阴性细菌是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。在一些实施方式中，细菌是革兰氏阳性芽孢杆菌，葡萄球菌，链球菌，链霉菌或柔膜体(支原体)。在一些实施方式中， 载体是细菌外毒素。在一些实施方式中，载体是已经修饰而降低其毒性的细菌毒素。用于根据本发明使用的细菌毒素包括，但不限于，霍乱毒素，优选CTB(包括重组CTB(rCTB))，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)毒素，例如热-不稳定的肠毒素(LT)，热-稳定的外毒素(ST)，细胞毒性坏死因子(CNF)，细胞致死性肿胀毒素(CLDT)，或肠聚集性大肠埃希氏菌 (E. coli)热-稳定的毒素(EAST)，白喉毒素(Dtx)，破伤风毒素，志贺毒素，肉毒毒素，葡萄球菌毒素，例如金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus) α毒素，剥脱素B或杀白细胞素，葡萄球菌毒性休克综合征毒素(TSST-I)，葡萄球菌肠毒素或剥脱性毒素，链球菌毒素， 例如肺炎链球菌(Str印tococcus pneumoniae)的肺炎链球菌溶血素，链球菌溶血素0，红疹毒素(链球菌致热外毒素(SPE))，及酿脓链球菌(Str印tococcus pyogenes)的其他致热毒素，梭菌毒素，例如难辨梭菌(Clostridium difficile)的毒素A/毒素B，ι家族，C2 家族(毒素C和D)，或C3毒素，或肉毒梭菌(Clostridium botulinum)的神经毒素A G，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的α毒素，β-2毒素或产气荚膜梭菌细胞溶素0(产气荚膜梭菌肠毒素)，脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的肠毒素，嗜水气单 1 (Aeromonas hydrophila) / ^(#-1 ^ , H H WMWiMMM (Bordetella pertussis) 的丝状血凝素(FHA)，梭菌属(Clostridium)或芽孢杆菌属(Bacillus) 二元毒素，链激酶， 百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的腺苷酸环化酶毒素(百日咳AC; “百日咳毒素”)或其皮肤环死毒素，炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)水肿因子(EF)，炭疽毒素 (致死因子(LF))，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的溶血素，单核细胞增多性利斯特菌 (Listeria monocytogenes)的利斯特菌溶血素，及假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素(外毒素A)。在一些实施方式中，优选使用细菌ADP-核糖基化外毒素，例如，霍乱毒素，白喉毒素，百日咳毒素，假单胞菌属(I^eudomonas)外毒素A，或大肠埃希氏菌(E. coli)LT。在一些实施方式中，将细菌ADP-核糖基化外毒素的催化性亚基(通常，“A”亚基)用作载体。在其他实施方式中，优选细菌ADP-核糖基化外毒素(通常，“B^E基)的受体-结合亚基。再一实施方式中，将亚基或其片段二者用作载体。在一些实施方式中，使用细菌孔隙-形成毒素，例如产气荚膜梭菌细胞溶素0，溶血素，利斯特菌溶血素，炭疽EF，α毒素，肺炎链球菌溶血素，链球菌溶血素0，或杀白细胞素。在一些实施方式中，载体是致热外毒素，或其修饰的形式，例如葡萄球菌肠毒素血清型A E，G和H，组A链球菌致热外毒素A C，葡萄球菌剥脱素毒素，及葡萄球菌TSST-I。尤其有用的细菌毒素载体包括具有增强粘膜免疫应答的能力的任何细菌毒素，例如，CTB或细菌毒素的大肠埃希氏菌(E. coli)热-不稳定的肠毒素(LTB)家族中的任何毒素。在本发明的一些实施方式中，细菌毒素载体含其内源性信号肽(即，当蛋白翻译时存在于细菌毒素上的信号肽)或其片段。在其他实施方式中，细菌毒素载体含存在于毒素所来源的相同的细菌的信号肽，但信号肽通常存在于该细菌的不同的蛋白上。在一些实施方式中，使用毒素载体或其免疫原性片段，其正常不具有信号肽及向其添加信号肽。在一个所述实施方式中，破伤风毒素加工为含信号肽。在一些实施方式中，本发明的细菌毒素载体，例如CTB或任何上述的细菌毒素，含异源信号肽。在一些实施方式中，异源信号肽是分泌前导序列，例如本领域技术人员已知的那些及包括，例如，组织纤溶酶原活化物(tpa)前导序列，烟草发病机制-相关的Ib(PRlb)信号肽，或本领域已知的任何其他信号肽或其片段。在一些实施方式中，信号肽是细菌信号肽。用于本发明的实践的细菌信号肽可选自CTB信号肽(本文所述的片段或，例如，登录号NO.P01556)，大肠埃希氏菌(E. coli)热不稳定的肠毒素亚基B信号肽(例如，登录号 No. P13811)，白喉毒素信号肽(例如，登录号No. P00588)，百日咳毒素信号肽(见，例如， 美国专禾IJ 4，883，761或登录号No. P04977和P04978)，志贺毒素信号肽(见，例如，登录号 No. Q9FBI2 和 Q7BQ98)，假单胞菌属 G^seudomonas)外毒素 A (例如，登录号 No. Pl 1439)，FHA 毒素的长信号肽，TSST-I信号肽，链球菌毒素信号肽，葡萄球菌蛋白A信号肽，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens) α 毒素信号月太，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens) β-2毒素信号肽(见，例如，美国专利7，144，998)，梭菌属(Clostridium)和芽孢杆菌属 (Bacillus) 二元毒素的A和B亚基信号肽。见以下表1的用于本发明的例示细菌毒素信号肽的非-限制列表。显示了全长信号肽序列；但是，片段，例如，10个氨基酸或更少，或5个氨基酸或更少的C-端片段，等，可用于本发明的实践。信号肽或其片段可为1 3个氨基酸长度，3 5个氨基酸长度，5 10，优选7个氨基酸长度，10 15个氨基酸长度，15 20个氨基酸长度，20 25个氨基酸长度，25 30个氨基酸长度，30 35个氨基酸长度， 35 40个氨基酸长度，或40 50个或更多氨基酸长度。在其他实施方式中，本发明中所用的信号肽或其片段与天然存在的信号肽具有90 %或更佳，85 %或更佳，80 %或更佳，75 % 或更佳，70 %或更佳，65 %或更佳，或60 %或更佳序列同一性。在一些实施方式中，CTB信号肽或其片段，例如以下部分1. 1中描述的，是非CTB的细菌毒素载体上的异源信号肽。为本申请的目的，信号肽是引导蛋白的翻译后或共-翻译运输的短的(通常3 60个氨基酸长，但如果使用片段可更短，且可更长，例如，在FHA中)肽链。信号肽可也已知靶向信号，信号序列，转运肽或定位信号。通常，信号肽的氨基酸序列在真核生物中引导蛋白到内质网及在原核生物中到细胞膜。例如，许多细菌外毒素是用由几个(1 3)带电的氨基酸组成的氨基末端信号肽和(14 20)疏水氨基酸延伸段合成的。信号肽可在翻译期间结合及插入到细胞质膜，从而其合成期间分泌毒素。通常，信号肽被切割作为毒素释放到周质。或者，毒素可在胞浆内合成，然后结合到前导序列用于穿过膜。包括以所述方式发挥作用的信号肽，或通过其他机理发挥作用的那些以用于本发明。表1.用于本发明的例示细菌毒素信号肽
权利要求
1.免疫原性组合物，所述组合物包括(i)具有包括氨基酸序列Ala-Pro-Gly-Tyr-Ala-His-Gly，或其C-端片段的信号肽的霍乱毒素B (CTB)；及 ( )半抗原，其中组合物能诱导针对成瘾药物的免疫应答。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其中针对成瘾药物的免疫应答大于由与权利要求1 的相同但缺少所述信号肽的免疫原性组合物诱导的针对成瘾药物的免疫应答。
3.权利要求1的免疫原性组合物，其中成瘾药物是可卡因。
4.权利要求1的免疫原性组合物，其中成瘾药物是烟碱。
5.权利要求1 4中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包括佐剂。
6.权利要求5的免疫原性组合物，其中所述佐剂是氢氧化铝。
7.免疫原性组合物，所述组合物包括(i)具有包括氨基酸序列Ala-Pro-Gly-Tyr-Ala-His-Gly，或其C-端片段的信号肽的 CTB ；及( )烟碱或其衍生物，其中组合物能诱导针对烟碱的免疫应答。
8.权利要求7的免疫原性组合物，其中针对烟碱的免疫应答大于由与权利要求7的相同但缺少所述信号肽的免疫原性组合物诱导的针对烟碱的免疫应答。
9.权利要求7或8的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包括佐剂。
10.权利要求9的免疫原性组合物，其中所述佐剂是氢氧化铝。
11.在受试者中诱导针对成瘾药物的免疫应答的方法，包括给受试者施用有效量的免疫原性组合物，所述组合物包括(i)具有包括氨基酸序列Ala-Pro-Gly-Tyr-Ala-His-Gly，或其C-端片段的信号肽的霍乱毒素B (CTB)；及 ( )半抗原，其中组合物能诱导针对成瘾药物的免疫应答。
12.权利要求11的方法，其中成瘾药物是烟碱。
13.权利要求11的方法，其中成瘾药物是可卡因。
14.在受试者中诱导针对烟碱的免疫应答的方法，包括给受试者施用有效量的免疫原性组合物，所述组合物包括(i)具有包括氨基酸序列Ala-Pro-Gly-Tyr-Ala-His-Gly，或其C-端片段的信号肽的霍乱毒素B (CTB)；及( )烟碱或其衍生物，其中组合物能诱导针对烟碱的免疫应答。
15.权利要求11 14中任一项的方法，其中免疫原性组合物随佐剂施用。
16.权利要求15的方法，其中所述佐剂是氢氧化铝。
17.疫苗接种受试者抵抗成瘾药物的方法，包括给受试者施用有效量的免疫原性组合物，所述组合物包括(i)具有包括氨基酸序列Ala-Pro-Gly-Tyr-Ala-His-Gly，或其C-端片段的信号肽的霍乱毒素B (CTB)；及 ( )半抗原，其中组合物能诱导针对成瘾药物的免疫应答。
18.权利要求17的方法，其中成瘾药物是烟碱。
19.权利要求17的方法，其中成瘾药物是可卡因。
20.疫苗接种受试者抵抗烟碱的方法，包括给受试者施用有效量的免疫原性组合物，所述组合物包括(i)具有包括氨基酸序列Ala-Pro-Gly-Tyr-Ala-His-Gly，或其C-端片段的信号肽的霍乱毒素B (CTB)；及( )烟碱或其衍生物，其中组合物能诱导针对烟碱的免疫应答。
21.权利要求17 20中任一项的方法，其中免疫原性组合物随佐剂施用。
22.权利要求21的方法，其中所述佐剂是氢氧化铝。
23.治疗有需要的受试者的药物成瘾或药物依赖性的方法，包括给受试者施用有效量的免疫原性组合物，所述组合物包括(i)具有包括氨基酸序列Ala-Pro-Gly-Tyr-Ala-His-Gly，或其C-端片段的信号肽的霍乱毒素B (CTB)；及 ( )半抗原，其中组合物能诱导针对成瘾药物的免疫应答。
24.权利要求23的方法，其中药物成瘾或依赖性是烟碱成瘾或依赖性。
25.权利要求23的方法，其中药物成瘾或依赖性是可卡因成瘾或依赖性。
26.治疗有需要的受试者的烟碱成瘾或烟碱依赖性的方法，包括给受试者施用有效量的免疫原性组合物，所述组合物包括(i)具有包括氨基酸序列Ala-Pro-Gly-Tyr-Ala-His-Gly，或其C-端片段的信号肽的霍乱毒素B (CTB)；及( )烟碱或其衍生物，其中组合物能诱导针对烟碱的免疫应答。
27.权利要求23 沈中任一项的方法，其中免疫原性组合物随佐剂施用。
28.权利要求27的方法，其中所述佐剂是氢氧化铝。
全文摘要
本发明涉及用于诱导针对目标抗原的免疫应答的免疫原性组合物。尤其是，本发明提供免疫原性组合物，其包括抗原-载体缀合物，其中载体是含信号肽的细菌毒素。本发明也提供产生具有增强的免疫原性的免疫原性组合物的方法，包括在抗原-载体缀合物(例如半抗原-载体缀合物)中将信号肽添加到细菌载体。本发明也提供使用这些免疫原性组合物在受试者中诱导针对半抗原的免疫应答的方法。
文档编号A61K47/48GK102427828SQ201080017587
公开日2012年4月25日 申请日期2010年3月9日 优先权日2009年3月9日
发明者威廉·亨利 申请人:威廉·亨利