专利名称：双功能钉接多肽和其用途的制作方法
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肽和蛋白质作为激素、酶抑制剂、底物和神经递质的重要生物作用已经引起使用肽和/或肽模拟物作为治疗剂。肽组合结构元件得到的生物活性构象，例如α-螺旋、 β -折叠、转角和/或环极为重要，因为其允许受体、酶和核酸的选择性生物识别，由此影响细胞-细胞通信和/或控制关键细胞功能，例如代谢、免疫防御和细胞分化(巴宾(Babine) 等人，化学评述(Chem. Rev.) (1997)97 :1359)。不幸的是，肽作为药物的效用受到数个因素的严格限制，包括其在生理条件下被蛋白酶迅速降解、其较弱的细胞渗透性以及其由构象柔性引起的结合特异性的缺乏。α-螺旋是肽的一个主要结构组分。然而，α-螺旋肽倾向于解开并形成随机线圈，这些线圈在大多数情况下具有较低生物活性，或甚至不具有活性，并且特别易于发生蛋白水解降解。许多研究团体已经开发出用于设计和合成更为稳固的肽作为治疗剂的策略。举例来说，一种策略是将较为稳固的官能团并入肽链中，同时仍保持肽的独特构象和二级结构(参看例如，甘特(Gante)，德国应用化学(英文版)(Angew. Chem. Int. Ed. Engl.) (1994)33 :1699-1720 ；里斯克普(Liskamp)，荷兰皇家化学协会杂志(Reel. Trav. Chim. Pays-Bas) (1994) 113 1 ；吉安尼丝(Giannis)，德国应用化学(英文版)(1993)32 1244 ； 拜雷(Bailey)，肽化学(Peptide Chemistry)，威立出版公司(Wiley)，纽约(New York) (1990)，182;和其中引用的参考文献)。另一种方法是通过共价交联使肽稳定(参看例如，费荷兰(Phelan)等人，美国化学协杂志(J. Am. Chem. Soc. ) (1997) 119 :455 ；卢克 (Leuc)等人，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) (2003) 100 :11273 ；布拉肯 (Bracken)等人，美国化学协会杂志(1994) 116 :6432 ；颜(Yan)等人，生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg. Med. Chem.) (2004) 14 1403)。然而，大部分报导的方法都涉及使用极性和/或不稳定的交联基团。“肽钉接(P印tide stapling)”是关于使用烯烃复分解反应共价接合多肽链中存在的两个含烯烃侧链所使用的合成方法而造出的术语(有机化学杂志(J. Org. Chem.) (2001)66(16)；布莱克威尔(Blackwell)等人，德国应用化学(1994)37 3281) 0经显示， 使用由烯烃复分解反应产生的烃交联剂进行肽钉接有助于保持肽的天然构象，尤其是在生理条件下(美国专利第7，192，713号；斯查梅斯特(khafmeister)等人，美国化学协会杂志(J. Am. Chem. Soc.) (2000) 122 :5891-5892 ；瓦伦斯基(Walensky)等人，科学(Science) (2004)305 :1466-1470 ；各文献以引用的方式并入本文中)。这一策略已被应用于细胞凋亡诱导性BID-BH3 α -螺旋，在动物模型中引起比未钉接肽高的针对白血病恶性生长的抑制作用(瓦伦斯基等人，科学0004)305 :1466-1470 ；美国专利申请公开案第2005/02506890 号；美国专利申请公开案第2006/0008848号；各案以引用的方式并入本文中)。
发明内容
本发明源自对于钉接或接结肽的新用途的认识。已知这些肽的稳定性，故其可用作将蛋白质或其它生物分子募集到特定蛋白质、核酸、其它生物分子、细胞或细胞器(即， 将两个细胞组件系栓在一起或使其紧密接近)的试剂。具体说来，本发明提供双功能肽，其中一个或两个结构域可经钉接或接结。所述双功能肽的一个结构域充当结合于靶的靶向部分；另一结构域充当效应结构域以将蛋白质或蛋白质复合物募集到所述靶。效应结构域通常作用于或改变靶的活性。实质上，双功能肽用于使两个蛋白质或其它生物分子彼此紧密接近。靶向结构域、效应结构域或两个结构域可经钉接或接结以使所述肽的构象稳定。这两个结构域经由连接子连接在一起，所述连接子的结构范围可为简单的共价键到双功能分子到聚合物连接子。一方面，本发明提供一种双功能肽，其中靶向结构域和效应结构域中一者或两者经钉接或接结。本发明的双功能肽包括靶向结构域缔合效应结构域。必要时，每一肽包含 5到100个氨基酸以充当靶蛋白质的配体。必要时，所述肽可包括具有烯烃侧链的非天然氨基酸以形成钉或接针，用于使肽的构象稳定。在某些实施例中，钉接或接结的肽是螺旋肽。通常，这两个结构域通过连接子彼此共价缔合；但也可使用非共价缔合。在某些实施例中，双功能肽是SAH P53-8的钉接型式缔合Bcl-9的钉接型式。在其它实施例中，双功能肽是SAH p53-8的钉接型式缔合Tcf4。所述本发明的双功能肽通过将E3泛素连接酶募集到 β-连环蛋白来促进连环蛋白降解。随后Ε3泛素连接酶催化连环蛋白泛素化，引起蛋白酶体对其的降解。在某些实施例中，包含靶向结构域、连接子和效应结构域的发明性双功能钉接或接结肽是本发明的焦点。本发明提供双功能钉接或接结肽，以及其制备和使用方法。本发明还提供包含本发明双功能钉接或接结肽和医药学上可接受的赋形剂的医药组合物。在某些实施例中，本发明提供双功能、α螺旋钉接或接结肽，其中所述肽中至少一者是α螺旋且通过钉接或接结来稳定。在某些实施例中，本发明的α-螺旋肽在生理条件下(例如在个体体内，例如在胃肠道中；在血流中)保持其α-螺旋结构。在某些实施例中，包含靶向结构域、连接子和效应结构域的钉接或接结双功能肽一般布置如下其中A和E是肽或类肽；A和/或E是钉接或接结肽；且L是连接子(例如共价键； 聚乙二醇(PEG)；基于氨基己酸的连接子；聚甘氨酸肽、单分散聚合物等)，且其中如果A是靶向结构域，那么E是效应结构域。一方面，本发明提供一种双功能钉接或接结肽，其中一个或两个结构域(即A或E)具有下式
权利要求
1.一种双功能钉接肽，其包含 靶向结构域；连接子部分；和效应结构域，其中至少一个结构域经钉接或针接。
2.根据权利要求1所述的肽，其中两个结构域都经钉接或针接。
3.根据权利要求1所述的肽，其中至少一个结构域经接结或针接。
4.根据权利要求1所述的肽，其中两个结构域都经接结或针接。
5.根据权利要求1所述的肽，其中所述经钉接或针接的肽包含α-螺旋。
6.根据权利要求1所述的肽，其中至少一个结构域包含下式
7.根据权利要求6所述的肽，其中两个结构域都包含下式
8.根据权利要求6所述的肽，其中至少一个结构域包含下式
9.根据权利要求8所述的肽，其中两个结构域都包含下式
10.根据权利要求6所述的方法，其中至少一个结构域包含下式
11.根据权利要求10所述的方法，其中两个结构域都包含下式
12.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个结构域包含下式
13.根据权利要求12所述的肽，其中两个结构域都包含下式
14.根据权利要求12所述的肽，其中至少一个结构域包含下式
15.根据权利要求14所述的肽，其中两个结构域都包含下式
16.根据权利要求12所述的肽，其中至少一个结构域包含下式
17.根据权利要求16所述的肽，其中两个结构域都包含下式
18.根据权利要求1所述的肽，其中所述靶向结构域是钉接或针接的蛋白质。
19.根据权利要求1所述的肽，其中所述效应结构域是钉接或针接的蛋白质。
20.根据权利要求1所述的肽，其中所述连接子是蛋白质的。
21.根据权利要求1所述的肽，其中所述连接子是非蛋白质的。
22.根据权利要求1所述的肽，其中所述连接子是聚合物。
23.根据权利要求1所述的肽，其中所述连接子是氨基己酸的单体或聚合物。
24.根据权利要求23所述的肽，其中所述连接子是由1到10个氨基己酸单元构成。
25.根据权利要求1所述的肽，其中所述连接子是聚乙二醇。
26.根据权利要求1所述的肽，其中所述靶向结构域结合蛋白质、核酸或磷脂。
27.根据权利要求沈所述的肽，其中所述靶向结构域结合β-连环蛋白、Myc、RaS或缺氧诱导因子。
28.根据权利要求1所述的肽，其中所述靶向结构域将所述效应结构域定位于相关位点ο
29.根据权利要求1所述的肽，其中所述靶向结构域是连环蛋白的配体。
30.根据权利要求四所述的肽，其中所述靶向结构域是Bcl9的钉接型式。
31.根据权利要求30所述的肽，其中所述Bcl9的钉接型式是截短的。
32.根据权利要求30所述的肽，其中所述靶向结构域是Tcf-4的钉接型式。
33.根据权利要求32所述的肽，其中所述Tcf-4的钉接型式是截短的。
34.根据权利要求1所述的肽，其中所述靶向结构域是Myc的配体。
35.根据权利要求34所述的肽，其中所述靶向结构域是Max的钉接型式。
36.根据权利要求35所述的肽，其中所述Max的钉接型式是截短的。
37.根据权利要求34所述的肽，其中所述靶向结构域是Mad的钉接型式。
38.根据权利要求37所述的肽，其中所述Mad的钉接型式是截短的。
39.根据权利要求34所述的肽，其中所述靶向结构域是Mxi的钉接型式。
40.根据权利要求39所述的肽，其中所述Mxi的钉接型式是截短的。
41.根据权利要求1所述的肽，其中所述靶向结构域是Ras的配体。
42.根据权利要求1所述的肽，其中所述靶向结构域是缺氧诱导因子的配体。
43.根据权利要求1所述的肽，其中所述效应结构域调节酶的活性。
44.根据权利要求43所述的肽，其中所述酶是泛素化酶、糖基化酶、组蛋白去乙酰化酶、组蛋白乙酰转移酶或磷酸化酶。
45.根据权利要求1所述的肽，其中所述效应结构域是泛素化酶的配体。
46.根据权利要求45所述的肽，其中所述效应结构域是E3泛素连接酶的配体。
47.根据权利要求46所述的肽，其中所述E3泛素连接酶是hDM2。
48.根据权利要求47所述的肽，其中所述hDM2的配体是p53的钉接型式。
49.根据权利要求48所述的肽，其中所述p53的钉接型式是截短的。
50.根据权利要求46所述的肽，其中所述E3泛素连接酶是mDM2。
51.根据权利要求46所述的肽，其中所述E3泛素连接酶是泛素蛋白连接酶E3A。
52.根据权利要求46所述的肽，其中所述E3泛素连接酶是环指结构域。
53.根据权利要求46所述的肽，其中所述E3泛素连接酶是SCFE3连接酶复合物。
54.根据权利要求1所述的肽，其中所述效应结构域是糖基化酶的配体。
55.根据权利要求1所述的肽，其中所述效应结构域是组蛋白去乙酰化酶的配体。
56.根据权利要求1所述的肽，其中所述效应结构域是组蛋白乙酰转移酶的配体。
57.根据权利要求1所述的肽，其中所述效应结构域是激酶的配体。
58.根据权利要求1所述的肽，其中所述效应结构域是磷酸酶的配体。
59.根据权利要求1所述的肽，其具有下式
60.根据权利要求59所述的肽，其中〔SAH包含序列QSQQTFR8NLWRLLS5QN(SEQID NO 29)。
61.根据权利要求59所述的肽，其中〔Tcf4)包含序列DELISFKDEGEQE(^Ala)2ERDL s5dvks5slvn (seq id n0:30)，其中 β Ala 是 β-丙氨酸。
62.根据权利要求59所述的肽，其中〔Tcf4)包含序列DELISFKDEGEQE ( β Ala) 2ER8DLADVKS5SLVN(SEQ ID NO :31)，其中 β Ala 是 β -丙氨酸。
63.根据权利要求59所述的肽，其中丨…是包含2、3或4个氨基己酸残基的连接子。
64.根据权利要求59所述的肽，其具有序列DELISFKDEGEQE( β Ala) 2ERDLS5DVKS5SLVN ( Ahx) nQSQQTFR8NLWRLLS5QN (SEQ ID NO: 15)，其中 β Ala 是 β -丙氨酸，Ahx 是氨基己酸，且 η 是2、3或4。
65.根据权利要求59所述的肽，其具有序列DELISFKDEGEQE( β Ala) 2ER8DLADVKS5SLVN ( Ahx) nQSQQTFR8NLWRLLS5QN (SEQ ID NO: 16)，其中 β Ala 是 β -丙氨酸，Ahx 是氨基己酸，且 η 是2、3或4。
66.根据权利要求1所述的肽，其具有下式
67.根据权利要求66所述的肽，其中〔SAH包含序列QSQQTFR8NLWRLLS5QN(SEQID NO 29)。
68.根据权利要求66所述的肽，其中〔Tcf4)包含序列DELISFKDEGEQE ( β Ala) 2ERDL S5DVKS5SLVn (SEQ ID NO :30)，其中 β Ala 是 β-丙氨酸。
69.根据权利要求66所述的肽，其中〔Tcf4)包含序列DELISFKDEGEQE ( β Ala) 2ER8DLADVKS5SLVN(SEQ ID NO :31)，其中 β Ala 是 β -丙氨酸。
70.根据权利要求66所述的肽，其中丨…是包含2、3或4个氨基己酸残基的连接子。
71.根据权利要求66所述的肽，其具有序列QSQQTFR8NLWRLLS5QN(Ahx) nDELISFKDEGEQE (β Ala) 2ERDLS5DVKS5SLVN (SEQ ID NO: 13)，其中 β Ala 是 β -丙氨酸，Ahx 是氨基己酸，且 η 是2、3或4。
72.根据权利要求66所述的肽，其具有序列QSQQTFR8NLWRLLS5QN(Ahx) nDELISFKDEGEQE (β Ala) 2ER8DLADVKS5SLVN (SEQ ID NO: 14)，其中 β Ala 是 β -丙氨酸，Ahx 是氨基己酸，且 η 是2、3或4。
73.根据权利要求1所述的肽，其具有下式
74.根据权利要求73所述的肽，其中〔SAH包含序列QSQQTFR8NLWRLLS5QN(SEQID NO 29)。
75.根据权利要求73所述的肽，其中〔Bcl9)包含序列 SQEQLR8HRERSLS5TLRDIQRMLF (SEQ ID NO :32)。
76.根据权利要求73所述的肽，其中〔Bcl9)包含序列 SQEQLEHRERSLS5TLRS5IQRMLF(SEQ ID NO :33)。
77.根据权利要求73所述的肽，其中〔Bcl9)包含序列 SQEQLEHRS5RSLS5TLRDIQRMLF(SEQ ID NO 34)
78.根据权利要求73所述的肽，其中^/w”是包含2、3或4个氨基己酸残基的连接子。
79.根据权利要求73所述的肽，其具有序列SQEQLR8HRERSLS5TLRDIQRMLF(Ahx)nQSQQTFR8NLWRLLS5QN(SEQ ID NO :4)，其中 Ahx 是氨基己酸，且 η 是 2、3 或 4。
80.根据权利要求73所述的肽，其具有序列SQEQLEHRERSLS5TLRS5IQRMLF(Ahx) nQSQQTFR8NLWRLLS5QN(SEQ ID NO :5)，其中 Ahx 是氨基己酸，且 η 是 2、3 或 4。
81.根据权利要求73所述的肽，其具有序列SQEQLEHRS5RSLS5TLRDIQRMLF(Ahx) nQSQQTFR8NLWRLLS5QN(SEQ ID NO :6)，其中 Ahx 是氨基己酸，且 η 是 2、3 或 4。
82.根据权利要求1所述的肽，其具有下式
83.根据权利要求82所述的肽，其中〔SAH包含序列QSQQTFR8NLWRLLS5QN(SEQID NO 29)。
84.根据权利要求82所述的肽，其中〔Bcl9)包含序列 SQEQLR8HRERSLS5TLRDIQRMLF (SEQ ID NO :32)。
85.根据权利要求82所述的肽，其中〔Bcl9)包含序列 SQEQLEHRERSLS5TLRS5IQRMLF(SEQ ID NO :33)。
86.根据权利要求82所述的肽，其中〔Bcl9)包含序列 SQEQLEHRS5RSLS5TLRDIQRMLF(SEQ ID NO 34)
87.根据权利要求82所述的肽，其中丨…是包含2、3或4个氨基己酸残基的连接子。
88.根据权利要求82所述的肽，其具有序列QSQQTFR8NLWRLLS5QN(Ahx) nSQEQLR8HRERSLS5TLRDIQRMLF (SEQ ID NO 1)，其中 Ahx 是氨基己酸，且 η 是 2、3 或 4。
89.根据权利要求82所述的肽，其具有序列QSQQTFR8NLWRLLS5QN(Ahx) nSQEQLEHRERSLS5TLRS5IQRMLF (SEQ ID NO :2)，其中 Ahx 是氨基己酸，且 η 是 2、3 或 4。
90.根据权利要求82所述的肽，其具有序列QSQQTFR8NLWRLLS5QN(Ahx) nSQEQLEHRS5RSLS5TLRDIQRMLF (SEQ ID NO :3)，其中 Ahx 是氨基己酸，且 η 是 2、3 或 4。
91.一种医药组合物，其包含根据权利要求1所述的钉接肽。
92.一种治疗个体的疾病、病症或病况的方法，所述方法包含对有需要的个体投予治疗有效量的根据权利要求1所述的钉接肽。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述疾病是癌症。
94.一种筛选根据权利要求1所述的肽的文库的方法，其包含提供根据权利要求1所述的肽的文库；和筛选具有使靶生物分子和效应生物分子紧密接近的能力的肽。
95.一种筛选靶向结构域的文库的方法，其包含提供钉接的靶向结构域的文库，和关于针对所述靶生物分子的活性进行筛选。
96.一种筛选效应结构域的文库的方法，其包含提供钉接的效应结构域的文库，和关于针对所述效应生物分子的活性进行筛选。
97.一种合成双功能钉接肽的方法，其包含提供钉接的靶结构域；提供钉接的效应结构域；和使所述钉接的靶结构域与钉接的效应结构域交联。
98.一种合成双功能钉接肽的方法，其包含提供未钉接的靶结构域，其中所述靶结构域包含适于接结或钉接的非天然氨基酸残基；提供未钉接的效应结构域，其中所述效应结构域包含适于接结或钉接的非天然氨基酸残基；使所述未钉接的靶结构域与未钉接的效应结构域交联；和钉接所述肽。
99.一种合成双功能钉接肽的方法，其包含提供接结或钉接的靶结构域；提供接结或钉接的效应结构域；和将所述靶结构域连接到所述效应结构域。
100.一种合成双功能钉接肽的方法，其包含提供未钉接的靶结构域，其中所述靶结构域包含适于接结或钉接的非天然氨基酸残基；提供未钉接的效应结构域，其中所述效应结构域包含适于接结或钉接的非天然氨基酸残基；将所述靶结构域连接到所述效应结构域；和接结或钉接所述未接结或未钉接的肽。
101.根据权利要求1所述的肽，其中所述靶向结构域是Sin3的配体。
102.根据权利要求101所述的肽，其中所述靶向结构域是Madl的Sin3相互作用结构域SID的钉接型式。
103.根据权利要求102所述的肽，其中所述SID的钉接型式包含以下序列 VRMNIQMLLEAADYLERREREAEH(SEQ ID NO 85)；或VRMNIQMLLEAADYLERRER(SEQ ID NO :86)。
104.根据权利要求102所述的肽，其中所述SID的钉接型式包含以下序列 β Ala-VRRRIS5MLLS5AANYLER (SEQ ID NO :88)；或β Ala-VRRRIQMLLEAANKS5ERRS5R(SEQ ID NO :91)，其中所述非天然氨基酸&是交联的。
105.根据权利要求104所述的肽，其中所述效应结构域调节Sin3调控的基因的活性。
106.根据权利要求1所述的肽，其中所述效应结构域是MLL的钉接型式。
107.根据权利要求1所述的肽，其中所述效应结构域是cMyb的钉接型式。
108.根据权利要求106所述的肽，其中MLL是截短的。
109.根据权利要求107所述的肽，其中cMyb是截短的。
110.根据权利要求108所述的肽，其中所述效应结构域包含以下序列 ILP*DIM*FVLKNT(SEQ ID NO :81)，ILP*RIM*FVLKNT(SEQ ID NO :82)， ILPSDIM*FVL*NT(SEQ ID NO :83)，或ILPSRIM*FVL*NT(SEQ ID NO :84)，其中“*”是适于交联的非天然氨基酸，且所述氨基酸经交联。
111.根据权利要求109所述的肽，其中所述效应结构域包含以下序列 K*KRI*ELELLLMSTENELKG(SEQ ID NO 73),K*KRI*RLELLLMSTENELKG(SEQ ID NO 74), KE*RIK*LELLLMSTENELKG(SEQ ID NO :75)， KR*RIK*LELLLMSTENELKG(SEQ ID NO :76)， KE*RIKELE*LLMSTENELKG(SEQ ID NO :77)， KE*RIKRLE*LLMSTENELKG(SEQ ID NO :78)， KR*RIKELE*LLMSTENELKG(SEQ ID NO:79)，或KEKRIKELELLLMSTE*ELK* (SEQ ID NO :80)，其中“*”是适于交联的非天然氨基酸，且所述氨基酸经交联。
全文摘要
本发明涉及包含靶向结构域、连接子部分和效应结构域的双功能钉接或针接肽，其可用于系栓至少两个细胞实体(例如蛋白质)或使至少两个细胞实体(例如蛋白质)紧密接近。某些方面涉及通过所述效应结构域结合到效应生物分子且通过所述靶向结构域结合到靶生物分子的双功能钉接或针接肽。由本发明的双功能钉接或针接肽系栓的多肽和/或多肽复合物，其中结合于所述双功能钉接或针接肽的所述效应结构域的效应多肽修饰或改变结合于所述双功能肽的所述靶向结构域的靶多肽。还提供本发明双功能钉接或针接肽的用途，包括治疗疾病(例如癌症、发炎性疾病)的方法。
文档编号A61K38/00GK102510755SQ201080040139
公开日2012年6月20日 申请日期2010年7月13日 优先权日2009年7月13日
发明者格雷戈里·L·维尔戴恩, 梁乐, 汤姆·N·格罗斯曼, 玉柳斌, 约翰尼斯·松汉·叶, 雷蒙德·E·莫勒林 申请人:哈佛大学校长及研究员协会