特异用于胞外基质蛋白的氨基酸序列rgd的人源化抗体及其用途的制作方法

专利名称：特异用于胞外基质蛋白的氨基酸序列rgd的人源化抗体及其用途的制作方法
技术领域：
贯穿本申请，此处引入几个参考。将这些参考的公开以其全部引入此处以作本申请的参考。本发明涉及免疫特异性识别胞外基质蛋白的氨基酸序列RGD(Arg-Gly-Asp)的人源化抗体，并涉及其用于各种疾病或紊乱包括癌症、炎性疾病、自身免疫病、传染病和骨疾病等的治疗和诊断的用途。
2.
背景技术：
细胞黏附在多细胞生物的生命维持中发挥着重要的作用。多细胞生物的细胞黏附 分为细胞-胞外基质(下文中缩写为“ECM”)黏附与细胞-细胞黏附，已阐明整联蛋白介导细胞-ECM黏附，钙黏着蛋白、密蛋白和柄蛋白等介导细胞-细胞黏附。跨膜黏附蛋白，如整联蛋白构成细胞-ECM黏附。据报道，整联蛋白形成a链与3链的异二聚体。目前已鉴定并证实至少18种a链、8种P链以及24种a ^异二聚体。已知各类型的整联蛋白识别特异配体。包括整联蛋白的跨膜黏附蛋白除细胞黏附以外还涉及细胞内信号由ECM向细胞的传导，以及增殖、运动和分化的调节(F. G. Giancotti等人，Science,285，1028-1032，1999)。已知许多蛋白质为ECM蛋白，其分为胶原蛋白类(如I-XIX型)、非胶原糖蛋白类(如骨桥蛋白(osteopontin, 0PN)、玻连蛋白、纤连蛋白、血管性血友病因子(vonWillebrand Factor)、层粘连蛋白、生腱蛋白、纤维蛋白原、血小板反应蛋白)，弹性蛋白类及蛋白聚糖类。这些ECM蛋白与相应的整联蛋白结合并激活细胞内的信号转导通路，进而调节细胞骨架组构、移动、增殖和分化等。ECM蛋白结合的整联蛋白通过传递取决于ECM蛋白类型的特异信号来调控这些信号激活通路。似乎RGD (精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列通常在许多ECM蛋白的细胞黏附区域观察到，并且通过结合至整联蛋白而显示各种功能。已期望ECM蛋白的RGD序列可为药物靶标，已提供多种小分子化合物及人工肽。某些类型的整联蛋白如a 33 I整联蛋白、a 53 I整联蛋白、a 83 I整联蛋白、a V ^ I整联蛋白、a 3整联蛋白、a 5整联蛋白、a 6整联蛋白、a 8整联蛋白已知与R⑶序列结合。已揭示a 50 I整联蛋白与其特异性配体纤连蛋白之间的相互作用来研究整联蛋白介导的信号转导机制，据报道a 50 I整联蛋白不仅调控细胞黏附与细胞移动，还调控细胞分化及细胞死亡(S.M. Frisch等人Curr. Opin. Cell Biol.，9，701-706，1997)。还已表明a 5 P I整联蛋白在肿瘤细胞中高度表达，并涉及癌症的恶化。各整联蛋白介导的信号因结合的ECM蛋白而不同。例如，由生长因子的刺激活化了纤连蛋白结合的内皮细胞的生长，但抑制层粘连蛋白-I结合的内皮细胞的生长。此外，由层粘连蛋白-10/11至a 30 I整联蛋白所传递的信号不同于由纤连蛋白至a 50 I整联蛋白所传递的信号，并显著增强癌细胞的移动(J. Gu等人，J. Biol. Chem.，276，27090-27097，2001)，并显著避免7由血液饥饿而导致的细胞凋亡(J. Gu等人，J. Biol. Chem.，277，19922-19928，2002)。已在破骨细胞和新生血管中观察到结合α V整联蛋白的RGD序列的高度表达，RGD序列和α ν整联蛋白的抑制已期望作为用于骨质疏松症及癌症的治疗药物的靶标。已表明α 5β I整联蛋白在肿瘤细胞中高度表达，并涉及癌症的恶化。从这些发现中，已开发出抗α5β1整联蛋白抗体(伏洛昔单抗)、抗α 4整联蛋白抗体(那他珠单抗(Natalizumab))、抗α νβ 3整联蛋白抗体(维他辛(Vitaxin))作为抑制整联蛋白与ECM蛋白之间相互作用的拮抗性抗整联蛋白抗体药物。同时，已知某些ECM蛋白如胶原蛋白、骨桥蛋白(OPN)、玻连蛋白、纤连蛋白、血管性血友病因子、层粘连蛋白、生腱蛋白、纤维蛋白原和血小板反应蛋白包括R⑶序列。此外，已知某些病毒和某些细菌拥有RGD序列来黏附细胞。OPN为具有对骨中大量含有的钙的结合性的酸性糖蛋白。据报道，OPN在细胞黏附、细胞迁移、肿瘤形成、免疫应答以及补体介导的细胞溶解中起重要作用。OPN敲除小鼠和抗OPN中和抗体的结果表明，OPN涉及肝炎、自身免疫病如风湿性关节炎以及癌转移。因此，期望ECM蛋白与细胞结合的抑制剂可用于骨质疏松症或癌症的治疗。因此，除上述靶向整联蛋白的拮抗性药物以外，已开发作为整联蛋白的结合配偶体(binding partner)的革巴向ECM蛋白的拮抗性药物。
3.

发明内容
尽管已开发出药物如抑制R⑶序列介导的与整联蛋白相互作用的小分子、针对OPN的抗体以及针对整联蛋白的抗体，但并未有关于特异性识别RGD序列的抗体的报道。由于RGD序列为ECM蛋白中的保守序列之一，特异性识别RGD序列的抗体期望具有对人类和治疗模型动物二者的作用，因而被认为是非常有用的用于治疗剂开发的活性成分。因此，已存在对特异性识别RGD序列的抗体的需要。以前，本发明人分离鼠单克隆抗体，其免疫特异性识别RGD序列并由杂交瘤克隆33E10和35B6产生(保藏登录号分别为FERM BP-10440和FERM BP-10441)。此处，杂交瘤克隆的名称可互换地用作由该克隆产生的单克隆抗体的名称。所有这些鼠抗RGD抗体为IgGl同种型。观察到这些单克隆抗体通过结合ECM蛋白如骨桥蛋白的RGD序列来干扰ECM和细胞之间由RGD序列介导的结合。因此，这些抗RGD抗体期望显示对RGD序列相关疾病如癌症，例如癌细胞的生长或转移，并对炎性疾病，例如风湿性关节炎、骨关节炎、传染病、肝炎、支气管哮喘、纤维样变、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化症、肉芽瘤、炎性肠道疾病(溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、自身免疫病和骨质疏松症等的治疗或诊断效果。然而，由于这些单克隆抗体为鼠来源，由于其在人类中的免疫原性所造成的可能的不利影响已妨碍了其对人类诊断或治疗用途的直接应用。为了减少免疫原性，本发明人已制备了具有相应于原鼠抗RGD抗体所显示的那些生物学活性的人源化抗体，所述人源化抗体源自原鼠抗RGD抗体。因此，本发明提供人源化抗体或其抗原结合片段，其免疫特异性识别RGD序列，所述抗体包括部分源自非人源和部分源自人源的抗原结合区域。在本发明的一方面，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包括源自非人源(供体)如33E10和35B6单克隆抗体的互补决定区(下文中缩写为“CDR”)，以及源自人源(受体)的框架区(下文中缩写为“FR”)。所述人源化抗体或其抗原结合片段可抑制RGD序列及其配体间的结合。在本发明的一方面，所述免疫特异性识别RGD序列的人源化抗体或其抗原结合片段包括(i)重链(下文中缩写为“H-链”)，其包括至少一个源自人类H-链的可变区(下文中缩写为“V区”)的H-链FR(下文中缩写为“FRH” )，和至少一个源自免疫特异性识别RGD序列的非人源抗体的⑶RH至少之一的H-链⑶R(下文中缩写为“⑶RH”)；或(ii)轻链(下文中缩写为“L-链”)，其包括至少一个源自人类L-链的V区的L-链FR(下文中缩写为“FRL” )，和至少一个源自免疫特异性识别RGD序列的非人源抗体的CDRL至少之一的L-链CDR(下文中缩写为“CDRL”)；或上述⑴和(ii) 二者。在本发明的优选方面，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包括(i)包括VH的H-链，所述VH包括SEQ ID NO :92、94或96的氨基酸序列；或(ii)包括VL的L-链，所述VL包括SEQ IDN0:98或100的氨基酸序列；或(iii)上述⑴和(ii) 二者。在本发明的另一方面，本发明所述的人源化抗体或其抗原结合片段包括由SEQ ID N0:91、92或93的核苷酸序列编码的氨基酸序列，和所述VL包括由SEQ ID NO :97或99的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在本发明的优选方面，所述VH包括由SEQ ID NO :91、92或93的核苷酸序列编码的氨基酸序列，和所述VL包括由SEQ IDNO 97或99的核苷酸序列编码的氨基酸序列。 在本发明的另一方面，所述VH包括SEQ ID NO 94的氨基酸序列，和所述VL包括SEQ ID NO :100的氨基酸序列。在本发明的另一方面，所述H-链包括SEQ ID NO :25或27的氨基酸序列，和所述L-链包括SEQ ID NO :29或31的氨基酸序列。在本发明的进一步方面，所述H-链包括SEQ ID NO :25的氨基酸序列，和所述L-链包括SEQ ID NO 31的氨基酸序列。本发明进一步提供一种载体，例如表达载体，其包括编码本发明的免疫特异性识别RGD序列的人源化抗体或其抗原结合片段的H-链或L-链或二者的核苷酸序列。在此载体中，本发明的核苷酸序列能够可操作地连接至一种或多种调控元件。本发明的核苷酸序列可包括编码非人源供体抗体(由其衍生CDR)的信号肽、或者异源信号肽的核苷酸序列。此外，本发明提供包括本发明的核酸分子的宿主细胞，其含有包括本发明的核酸分子的载体。在本发明的一方面，本发明提供分离的宿主细胞，其包括编码本发明的人源化H-链的第一核酸分子和编码本发明的人源化L-链的第二核酸分子，所述第一和第二核酸分子各自以表达本发明的生物学功能的人源化抗体或其抗原结合片段这样的方式可操作地连接至调控元件。本发明进一步提供一种用于制备本发明的人源化抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在表达所述人源化抗体或其抗原结合片段的条件下培养本发明的宿主细胞；和收集所产生的人源化抗体。本发明进一步提供包括本发明的人源化抗体或其抗原结合片段至少之一的组合物。此外，本发明提供用于预防或治疗与RGD蛋白相关的紊乱或疾病的药物学组合物，其包括本发明的人源化抗体或其抗原结合片段至少之一，以及药物学可接受载体。所述组合物的二者之一可进一步包括可叠加地或协同地改善紊乱或疾病的另一活性化合物。所述活性化合物包括，但不限于抗炎化合物和化学疗法化合物等。所述活性化合物还包括小分子化合物和抗体或其抗原结合片段，如人α4整联蛋白特异性抗体或人α9整联蛋白特异性抗体。
在另一方面，本发明提供一种用于预防或治疗与RGD蛋白相关或涉及RGD蛋白的紊乱或疾病的方法，所述方法包括将预防或治疗有效量的本发明的人源化抗体或其抗原结合片段至少之一向需要其的受试者给药。对于此类用途，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段可与增强人源化抗体或其抗原结合片段的生物学效应的治疗部分相结合。此类治疗部分的实例包括另一抗体、抑制细胞生长或杀细胞的细胞毒素、放射线元素和/或包括抗炎剂和抗生素等的另一治疗剂。在另一方面，本发明提供一种用于在受试者中诊断与RGD蛋白相关或涉及RGD蛋白的紊乱或疾病的方法，所述方法包括将诊断有效量的本发明的人源化抗体或其抗原结合片段向待检测的受试者给药。对于此类诊断用途，本发明的人源化抗体可用检测性标签如放射性元素标记。3. I 定义如本文所使用的，术语“抗体”是指能够免疫特异性结合期望的抗原或期望的序列如RGD序列的抗体分子，其包含作为整体的抗体分子或可包含包括抗体的抗原结合片段的 抗体的片段。本文所使用的术语“抗原结合片段”是指保持免疫特异性结合目的多肽、蛋白质或序列(特别是RGD序列)的能力的抗体的任一片段，其包括单链抗体、Fab片段、F(ab' )2片段、二硫键连接的Fvs和包含特异性结合目的多肽、蛋白质或序列的VL和/或VH或者CDR的片段。因此，此类人源化抗体的抗原结合片段可包括或可不包括部分或全长人恒定区。用于获得上述抗体片段的各种方法在本领域是众所周知的。本文所使用的术语“免疫特异性识别”是指抗体或其抗原结合片段特异性结合目的多肽、蛋白质或序列，特别是人RGD序列的能力。此类抗体不非特异性结合其他多肽或蛋白质。然而，免疫特异性结合目的多肽或蛋白质(例如，RGD蛋白质)的抗体或其抗原结合片段可与其他抗原交叉反应。例如，本发明的免疫特异性识别人RGD蛋白质的人源化抗体或其抗原结合片段可与鼠源RGD蛋白质交叉反应。优选地，免疫特异性识别RGD蛋白质的抗体或其抗原结合片段不与其他抗原交叉反应。本文所使用的术语“源自人源”或“源自非人源”是指其氨基酸序列分别源自人抗体或非人抗体的相应部分的抗体部分。本文所使用的术语“受体序列”是指来自人抗体VH或VL的FR的核苷酸序列或氨基酸序列，其用作来自通常为非人抗体的供体抗体的CDR的受体。
4.


为了说明本发明，图I至27反应了目前优选的形式；然而，应理解，本发明不受限于图I至27所示的精确形式，其中图I示出鼠33E10VH cDNA的核苷酸序列，其与推导出的氨基酸序列一起示出。氨基酸残基以单字母编码示出。信号肽序列为斜体。双下划线为成熟VH的N-末端氨基酸残基(E)。下划线为根据 Kabat 等人(Sequences of Proteins of Immunological Interests,第五版，NIH Publication No. 91-3242, U. S. Departmentof Health and Human Services,1991)所定义的⑶R序列。图2示出鼠33E10VL cDNA的核苷酸序列，其与推导出的氨基酸序列一起示出。氨基酸残基以单字母编码示出。信号肽序列为斜体。双下划线为成熟VL的N-末端氨基酸残基(D)。下划线为根据Kabat等人(1991)所定义的CDR序列。图3示出设计的33E10VH基因的核苷酸序列(33E10VH基因侧翼为SpeI和HindIII位点(下划线))，其与推导出的氨基酸序列一起示出。氨基酸残基以单字母编码示出。信号肽序列为斜体。双下划线为成熟VH的N-末端氨基酸残基(E)。下划线为根据Kabat等人(1991)所定义的CDR序列。内含子序列为斜体。图4示出设计的33E10VL基因的核苷酸序列(33E10VL基因侧翼为NheI和EcoRI位点(下划线))，其与推导出的氨基酸序列一起示出。氨基酸残基以单字母编码示出。信号肽序列为斜体。双下划线为成熟VL的N-末端氨基酸残基(D)。下划线为根据Kabat等人(1991)所定义的CDR序列。内含子序列为斜体。图5示出嵌合和人源化的33E10抗体的表达载体(统称为“表达载体”)的示意性结构。从顶部的SalI位点顺时针开始,质粒包含重链转录单元,其以人巨细胞病毒(CMV)主要介导早期启动子和增强子(CMV启动子)开始来起始抗体重链基因的转录。CMV启动子 之后为VH外显子、包含人γ-l重链恒定区(包括具有间隔内含子的CH1、铰链、CH2和CH3外显子)的基因组序列以及CH3外显子之后的聚腺苷酸化位点。在重链基因序列后，轻链转录单元以CMV启动子开始，随后为VL外显子和包含人K链恒定区外显子(CL)的基因组序列(在其之前具有内含子部分)，CL外显子后为聚腺苷酸化位点。然后轻链基因接着这SV40早期启动子(SV40启动子)、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(gpt)和包含SV40聚腺苷酸化位点(SV40 poly(A)位点)的片段。最后，质粒包含pUC19质粒的部分，其包括细菌复制起点(PUC ori)和β-内酰胺酶基因内酰胺酶)。相关的限制性酶切位点的位置示于该图。图6 示出 33Ε10 VH、人源化 33Ε10 (Hu33E10) VH和人受体U03400 (GenBank登录号)的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母编码示出。序列上方的数字表示根据Kabat等人(1991)的位置。下划线为由Kabat等人定义的CDR序列(Sequences ofProteins ofImmunological Interests,第五版，NIH Publication No. 91-3242, U. S. Department ofHealth and Human Services, 1991)。双下划线残基预计与⑶R接触，鼠残基以人源化的形式保持在这些位置。在该图中省略U03400中的⑶R残基。图7 示出 33E10 VL、人源化 33E10 (Hu33E10) VL和人受体X72452 (Genbank登录号)的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母编码示出。序列上方的数字表示根据Kabat等人(1991)的位置。下划线为由Kabat等人定义的⑶R序列(1991)。在该图中省略X72452中的⑶R残基。图8示出用于构成Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸。图9示出用于构成Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸。图10示出用于构成Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸。箭头表示各核苷酸的位置和方向(5'至3')。氨基酸残基以单一字母编码示出。图11示出用于构成Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸。箭头表示各核苷酸的位置和方向(5'至3')。氨基酸残基以单一字母编码示出。图12示出Hu33E10 VHl基因的核苷酸序列(该基因侧翼为SpeI和HindIII位点(下划线))，其与推导出的氨基酸序列一起示出。氨基酸残基以单字母编码示出。信号肽序列为斜体。双下划线为成熟VH的N-末端氨基酸残基(E)。下划线为根据Kabat等人(1991)所定义的CDR序列。内含子序列为斜体。图13示出Hu33E10 VLl基因的核苷酸序列(该基因侧翼为NheI和EcoRI位点(下划线))，其与推导出的氨基酸序列一起示出。氨基酸残基以单字母编码示出。信号肽序列为斜体。双下划线为成熟VL的N-末端氨基酸残基(D)。下划线为根据Kabat等人(1991)所定义的CDR序列。内含子序列为斜体。图14示出Hu33E10 VL6基因的核苷酸序列(该基因侧翼为NheI和EcoRI位点(下划线))，其与推导出的氨基酸序列一起示出。双下划线为在信号肽编码区域中消除剪接供体位点的沉默突变。氨基酸残基以单字母编码示出。信号肽序列为斜体。双下划线为成熟VL的N-末端氨基酸残基(D)。下划线为根据Kabat等人(1991)所定义的CDR序列。内含子序列为斜体。图15A&15B示出嵌合和人源化的33E10 IgGl/k抗体与h0PN5_BSA的结合的 ELISA分析。在以IOOii g/ml下开始并连续2倍稀释的各种浓度下试验纯化的Ch33E10、Hu33E10-VHl/VL6、Hu33E10-VH5/VL6 和 Hu33E10_VH7/VL6 (图 15A)以及 Ch33E10 和Hu33E10-VH7. 8/VL6 (图15B)对于h0PN5_B SA的结合。重复进行实验两次。图16示出Hu33E10 VH5基因的核苷酸序列(该基因侧翼为SpeI和HindIII位点(下划线))，其与推导出的氨基酸序列一起示出。氨基酸残基以单字母编码示出。信号肽序列为斜体。下划线的为根据Kabat等人(1991)所定义的CDR序列。内含子序列为斜体。双下划线氨基酸残基表示与VHl的差异。图17示出Hu33E10 VH7基因的核苷酸序列(该基因侧翼为SpeI和HindIII位点(下划线))，其与推导出的氨基酸序列一起示出。氨基酸残基以单字母编码示出。信号肽序列为斜体。下划线为根据Kabat等人(1991)所定义的CDR序列。内含子序列为斜体。双下划线氨基酸残基表示与VHl的差异。图18示出Hu33E10 VH7. 8基因的核苷酸序列(该基因侧翼为SpeI和HindIII位点(下划线))，其与推导出的氨基酸序列一起示出。氨基酸残基以单字母编码示出。信号肽序列为斜体。下划线为根据Kabat等人(1991)所定义的CDR序列。内含子序列为斜体。双下划线氨基酸残基表示与VHl的差异。图19 示出 33E10 VL、Hu33E10 VLv2 和人受体 M29467 (GenBank 登录号)的比对。氨基酸残基以单字母编码示出。序列上方的数字表示根据Kabat等人(1991)的位置。下划线为根据Kabat等人(1991)所定义的CDR序列。双下划线残基预计与CDR接触，在人源化形式中鼠残基保持在这些位置。在该图中省略M29467中的⑶R残基。图20示出Hu33E10 VLv2基因的核苷酸序列(该基因侧翼为NheI和EcoRI位点(下划线))，其与推导出的氨基酸序列一起示出。氨基酸残基以单字母编码示出。信号肽序列为斜体。双下划线为成熟VL的N-末端氨基酸残基(D)。下划线为根据Kabat等人(1991)所定义的CDR序列。内含子为斜体。图 21&21B 示出 Ch33E10 和 Hu33E10_VH7/VLv2 IgGl/ k 抗体与 h0PN5_BSA 的结合的ELISA分析。在以200 ii g/ml (图21A)或在100 u g/ml下(图21B)开始并连续2倍稀释的各种浓度下试验纯化的Ch33E10和Hu33E10-VH7/VLv2抗体对于h0PN5_BSA的结合。示出重复两次独立实验的结果(图21A&21B)。
图22示出用于Hu33E10重链和轻链cDNA的PCR扩增和测序的寡核苷酸序列。图23示出NS0-Hu33E10-4和NS0-Hu33E10_6中表达的VH7和Y -I重链恒定区的
编码区的核苷酸序列，其与推导出的氨基酸序列一起示出。氨基酸残基以单字母编码示出。终止密码子用“ ”表示。图24示出NS0-Hu33E10-5中表达的VH7. 8和Y -I重链恒定区的编码区的核苷酸序列，其与推导出的氨基酸序列一起示出。氨基酸残基以单字母编码示出。终止密码子用“ · ”表示。图25示出NS0-Hu33E10-4和NS0-Hu33E10_5中表达的VL6和κ轻链恒定区的编
码区的核苷酸序列，其与推导出的氨基酸序列一起示出。氨基酸残基以单字母编码示出。终 止密码子用“ ”表示。图26示出NS0-Hu33E10-6中表达的VLv2和κ轻链恒定区的编码区的核苷酸序列，其与推导出的氨基酸序列一起示出。氨基酸残基以单字母编码示出。终止密码子用“·”表不。图27示出人源化抗OPN抗体抑制MDA-MB-435S对h0PN5_BSA的黏附。在各种浓度的抗体、人 IgG, Ch33E10、EJ3-1-1 (Hu33E10-VH7. 8/VL6)、R3-1 (Hu33E10-VH7/VL6)、SP2-1 (Hu33E10-VH7/VLv2)和 m33E10 的存在下，使 MDA-MB-435S (4X 104 细胞 / 孔)粘附到用h0PN5-BSA(2mg/ml)预涂布的96孔板。数据以三次重复实验的平均值呈现。
5.
具体实施例方式5. I针对RGD序列的抗体的制备可通过本领域已知的任何适合的方法产生免疫特异性识别RGD序列的抗体。本发明中包括细胞黏附“RGD”序列的RGD蛋白或肽(下文中缩写为“RGD-肽”)可为(I)源自表达RGD蛋白的人ECM或源自存在这些ECM的所有组织，(2)通过转染细菌、酵母、细胞系如动物细胞等使编码RGD蛋白或RGD肽的DNA(优选cDNA)表达而所获得的重组蛋白或肽，或者⑶合成蛋白或肽。本发明中用作抗原的RGD肽将能够通过免疫生产针对RGD序列的抗体。RGD肽包括RGD肽氨基酸序列CVDVPNGRGDSLAYGLR(SEQ ID NO 71),其为鼠源ECM蛋白的细胞黏附序列。RGD蛋白或RGD肽包括例如0ΡΝ、玻连蛋白、纤连蛋白、血管性血友病因子、胶原蛋白、层粘连蛋白、生腱蛋白、纤维蛋白原和血小板反应蛋白及包括其片段的RGD。只要蛋白或肽包括RGD序列，可将人工或自然变异如氨基酸的取代、缺失、修饰和添加应用于所述蛋白质或所述肽。变异的蛋白质或肽可包括取代、缺失、修饰、添加或插入多个氨基酸、优选I至10个氨基酸，并更优选I至几个(如I至5个)氨基酸的氨基酸序列。此处，RGD肽包括至少约5个氨基酸，优选约5至50个氨基酸，更优选约10至20个氨基酸。本发明中作为抗原的RGD蛋白或RGD肽可通过使用本领域公知的方法来生产，如化学合成法、细胞培养法、基因重组法及其适当的修正。例如，RGD肽可通过适当地用蛋白酶裂解ECM蛋白来获得。RGD蛋白或RGD肽可源于哺乳动物如小鼠(murine)、大鼠、兔、猪、牛、猴和人。任何本领域公知的方法可用于制备能够用于制备抗RGD抗体的RGD蛋白或RGD 肽。用于生产变体多肽的方法的实例包括合成寡核苷酸位点定向诱变(带缺口的双链体法(gapped duplex method))、涉及通过用亚硝酸盐或亚硫酸盐处理而随机引入点突变的点突变法、涉及用Bal31酶或其他酶制备缺失突变的方法、盒式突变(cassettemutagenesis)、接头分区法(linker scanning method)、错误插入法(missincorporation method)、错配引物法和DNA片断合成法等。RGD肽可结合其他生物大分子如甲状腺球蛋白、钥孔虫戚血蓝蛋白(KeyholeLimpet Haemocyanin, KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或牛球蛋白，优选甲状腺球蛋白。将RGD蛋白结合到生物大分子的方法可通过使用偶联剂如具有活性酯基和马来酰亚胺基团的结合剂(活性酯基结合蛋白质或肽的氨基，马来酰亚胺基团结合蛋白质或肽的巯基；S. yoshirake 等人，Eur. J. Biochem.，101,395-399,1979)、通过使用混合酐法(B. F. Erlanger 等人，J. Biol. Chem.，234，1090-1094，1954)，或通过使用活性酯法(A.E. Karu 等人，J. Agric. Food Chem.，42，301-309，1994)来实现。用于将 RGD 肽与生物大分子结合的方法优选通过使用偶联剂来实现。
作为抗原，还可使用过表达RGD蛋白或RGD肽的细胞本身。过表达RGD蛋白或RGD肽的细胞可通过本领域公知的重组DNA技术来制备。使用适当的如上所述制备的抗原，可通过各种本领域公知的各种方法制备特异性针对RGD序列的抗体。对于RGD序列的多克隆抗体可通过各种本领域公知的方法生产。例如，可将感兴趣的抗原向各种宿主动物包括，但不限于兔、小鼠、大鼠等给药，以诱导包含特异性针对抗原的多克隆抗体的抗血清的产生。可使用各种佐剂来增加依赖于宿主物种的免疫应答，其包括但不限于，弗氏(完全和不完全)佐剂、矿物胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇(pluronicpolyols)、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔虫戚血蓝蛋白、二硝基酹和可能有用的用于人的佐剂如BCG(卡介苗(BacilleCalmette-Guerin))和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。此类佐剂也为本领域所公知的。单克隆抗体可通过使用本领域公知的各种各样的技术来制备，所述技术包括使用杂交瘤、重组和曬菌体展示技术(phagedisplay technologies)或其组合。例如，单克隆抗体可通过使用杂交瘤技术来生产,所述杂交瘤技术包括本领域已知的以及在例如Harlow等人，Antibodies A Laboratory Manual, (Cold SpringHarbor Laboratory Press,第二版 1988) ;Hammerling 等人在Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,pp. 563-681 (Elsevier,N. Y，1981)(将其二者的全部内容引入以作参考)中所教导的那些。本文所使用的术语“单克隆抗体”不限定于通过杂交瘤技术所生产的抗体。术语“单克隆抗体”是指源于单一克隆的抗体，并包括任何真核、原核或噬菌体克隆，但不限定于生产其的方法。使用杂交瘤技术生产和筛选特异性抗体的方法是常规的并且是本领域公知的。在非限制性实例中，可用感兴趣的抗原或表达此类抗原的细胞免疫小鼠。一旦检测到免疫应答，例如在小鼠血清中检测到对抗原特异的抗体，获取小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过公知技术将脾细胞与任意适当的骨髓瘤细胞(如，P3U1、P3X63-Ag8、P3X63_Ag8_Ul、P3NSl-Ag4、SP2/0-Agl4、P3X63-Ag8-653等)融合。通过有限稀释法筛选并克隆杂交瘤。然后通过本领域针对分泌能够结合抗原的抗体的细胞的已知方法来分析杂交瘤克隆。可通过腹腔内用阳性杂交瘤克隆接种小鼠来产生通常包含高水平抗体的腹水液(ascitesfluid)。识别特异性抗原表位Gpitope)的抗体片段可通过已知的技术产生。例如，可通过使用酶如木瓜蛋白酶(生产Fab片段)或胃蛋白酶(生产F(ab' )2片段)使免疫球蛋白分子的蛋白水解裂解来生产Fab和F(ab' )2片段。F(ab' )2片段包含完整的L-链和H-链的V区、CHl区和铰链区。本发明的抗体或其抗原结合片段可通过本领域用于抗体合成的任何已知方法，特别是通过化学合成或优选通过重组表达技术来生产。编码抗体的核苷酸序列可从本领域技术人员可获得的任何信息(即，从Genbank、文献或通过常规克隆和序列分析)来获得。如果无法获得包含编码特定抗体或其抗原表位结合片段的核酸的克隆，但已知抗体分子或其抗原表位结合片段的序列，则可化学合成编码免疫球蛋白的核酸，或编码免疫球蛋白的核酸从适当来源(例如，抗体cDNA文库、或由核酸，优选从任何表达抗体的组织或细胞(如，为表达抗体而筛选的杂交瘤细胞)中分离的polyA+RNA所产生的cDNA文库)通过以下来获得使用可与序列的5'末端杂交的合成引物进行PCR扩增或通过使用特异性针对特定基因序列的寡核苷酸探针进行克隆来鉴定例如来自编码抗体的cDNA文库的cDNA克隆。然后可使用任何本领域公知的方法将由PCR所产生的扩增核酸克隆到可复制的克隆载体中。 5. 2重组抗体的制备对于核苷酸序列的操作，可通过使用本领域公知的方法来操作抗体的核苷酸序列，例如，重组DNA技术、位点定向诱变和PCR等(参见，例如Sambrook等人，如前所述；和Ausubel 等人，eds. , 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons,NY,中所描述的技术，将二者的全部内容引入以作参考)。抗体可在抗原表位结合结构域或在任一部分引入突变如氨基酸的取代、缺失和/或插入，从而增强或减少生物学活性。包含编码抗体的核苷酸序列的表达载体可用于抗体或其抗原结合片段的重组表达。用于生产抗体或其抗原结合片段的、包括编码抗体分子、抗体的H-链和/或L-链或其部分的核苷酸序列的载体，可使用上一节所讨论的本领域公知的技术通过重组DNA技术来生产。本领域技术人员公知的方法可用来构建包含抗体或其抗原结合片段的编码序列以及适当的转录和翻译调控信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术以及体内遗传重组。编码VH、VL、VH和VL 二者、VH和/或VL的抗原结合片段或抗体的一个或多个CDR的核苷酸序列可克隆到用于表达的该载体中。此类序列可与编码信号肽的多核苷酸融合，所述信号肽对于原抗体可以是内源的或异源的。然后可将由此制备的表达载体导入适当的用于抗体表达的宿主细胞中。因此,本发明包括宿主细胞,其包含编码免疫特异性识别RGD序列的人源化抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。可用本发明的两个表达载体共转染宿主细胞，其中第一载体编码H-链衍生的多肽，而第二载体编码L-链衍生的多肽。两个载体可包含使H-链和L-链多肽能够同等表达的相同的选择性标记，或确保保持两个质粒的不同的选择性标记。可选地，可使用编码并能够表达H-链和L-链多肽二者的单一载体。H-链和L-链的编码序列可包括cDNA或基因组DNA。在本发明的另一方面，还可使用本领域已知的各种噬菌体展示法产生抗体。在噬菌体展示法中，在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面展示功能性抗体结构域。在本发明的特定方面，可利用此类曬菌体展示抗原结合结构域，如从库(repertoire)或组合的抗体文库(如，人或小鼠)中表达的Fab和Fv或二硫键稳定的Fv。可用抗原，例如，使用标记抗原或与固体表面或微珠结合或捕获的抗原，筛选或鉴定表达与感兴趣的抗原结合的抗原结合结构域的噬菌体。用于这些方法的噬菌体典型地为包括fd和M13的丝状噬菌体。抗原结合结构域作为重组融合蛋白而表达成噬菌体基因III或基因VIII蛋白。本发明的可用于产生免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示法的实例包括在如下公开的那些Brinkman 等人,J. TmmunoI Methods, 182 :41-50,1995 ；Ames 等人,J. TmmunoI Methods,184 177-186,1995 ；Kettleborough 等人，Eur. J. TmmunoI. ,24 :952-958,1994 ；Persic 等人，Gene, 187 :9-18,1997 ;Burton 等人，Advances in Immunology, 57 191-280,1994 ；PCT申请 PCT/GB91/01134 号、PCT 公开 W090/02809、W0 91/10737,WO 92/01047,WO 92/18619、W093/11236, WO 95/15982、WO 95/20401 号；以及美国专利 5，698，426、5，223，409、5，403，484,5, 580, 717,5, 427, 908,5, 750, 753,5, 821，047,5, 571, 698,5, 427, 908、5，516，637,5, 780，225,5, 658，727,5, 733，743 和 5，969，108 号；将它们各自的全部内容引入以作参考。如上述参考文献所述，在噬菌体筛选后，可分离来自噬菌体的编码抗体的区域并用于产生整个抗体，包括人抗体，或任何其他期望的片段，并在任何期望的宿主包括例如，如下详细描述的哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌中表达。例如，还可利用 本领域已知的方法采用重组生产Fab、Fab'和F(ab' )2片段的技术，如以下所公开的那些PCT 公开 W092/22324 ；MulIinax 等人，BioTechniques, 12 (6) =864-869,1992 ;和 Sawai等人，AJRI,34 :26-34,1995 ;和 Better 等人，Science, 240 :1041-1043，1988 (将它们各自的全部内容引入以作参考)。可用于生产单链Fv和抗体的技术的实例包括以下所描述的那些美国专利 4, 946, 778 和 5, 258, 498 号；Huston 等人，Methods inEnzymology,203 :46-88,1991 ；Shu 等人，PNAS，90 :7995-7999,1993 ；和 Skerra 等人，Science,240 1038-1040，1988。一旦通过上述任何方法生产本发明的抗体分子，然后其可通过用于纯化免疫球蛋白分子的本领域任何已知的方法来纯化，例如，通过层析(如，离子交换，亲和力、特别是通过在蛋白A或蛋白G纯化后对特定抗原的亲和力，以及分级柱层析(sizing columnchromatography))、离心、差别性溶解或通过任何其他用于蛋白质纯化的标准技术。此外，本发明的抗体或其片段可融合到本文所述的或在本领域其他方面已知的异源多肽序列以促进纯化。对于某些用途，包括在人类体内的抗体用途和体外检测分析，其可优选使用嵌合的、人源化的或人抗体。以下在5. 3节中详细讨论嵌合抗体和人源化抗体。与其他化合物或异源多肽融合或结合的抗体可在体外免疫试验、纯化方法(如亲和层析)以及体内治疗或诊断用途中使用。参见，例如，PCT公开号WO 93/21232 ；EP439，095 ；Naramura 等人，Immunol. Lett. ,39 :91-99,1994 ;美国专利 5，474，981 ；Gillies等人，PNAS，89 :1428-1432,1992 ;和 Fell 等人，J. Immunol, 146 :2446-2452,1991，在此将其全部内容引入以作参考。例如，可使用已知方法或商购可得的试剂盒以各种方式标记抗体(如，生物素标记、FITC标记、APC标记)。作为另一实例，抗体可与在体内增强抗体的生物学效应的治疗部分结合。此类治疗部分的实例包括另一抗体、作为细胞生长抑制剂或杀细胞的细胞毒素、放射性元素和/或包括消炎剂和抗生素等的其他治疗剂。在本发明中，人源化抗RGD抗体可与另一抗体结合形成双特异抗体。作为另一实例，本发明的人源化抗体对于体内诊断用途，可用可检测标签如放射性元素标记。5. 3嵌合和人源化抗体嵌合抗体为其中抗体的不同部分源于不同动物物种的分子，如具有源于鼠源单克隆抗体的V区和源于人源免疫球蛋白的恒定区的抗体。用于生产嵌合抗体的方法为本领域已知的。参见，例如，Morrison, Science, 229 :1202,1985 ;0i 等人，BioTechniques,4 214 1986 ;Gillies 等人，J. Immunol. Methods, 125 :191-202,1989 ;美国专利 5,807,715、4，816，567和4，816，397号，在此将其全部内容引入以作参考。人源化抗体为结合期望抗原并包括V区的分子，该V区包含一个或多个源自非人物种的CDR和一个或多个源于人免疫球蛋白分子的FR。用于人源化非人抗体的典型方法已在各种文献中记载，例如以下所述的那些Queen等人，1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 :10029-10033 和美国专利 5，585,089 和 5,693，762 号；Riechmann 等人，Nature, 33 2 323，1988 ;和Tsurushita等人，Methods 36 :69_83，2005，将所有这些的全部内容引入此处以作参考。例如，Tsurushita等人的文献(2005,如前所述；下文为“Tsurushita”)提供了基于由Queen等人(1989，如前所述)最初开发的抗体人源化方法的用于鼠单克隆抗体的人源化的实用和指导性的方法。以下简要总结Tsurushita公开的通用方法。5. 3. I制备人源化抗体的通用方法_4] 克隆并测序鼠V基因各种方法可用于克隆编码目的鼠单克隆抗体的VH和VL的cDNA。例如，使用SMARTRACE cDNA 扩增试剂盒(Amplification Kit) (BD Biosciences, CA)或 GeneRacer 试剂盒的5' RACE (快速扩增cDNA末端)法是常用的。用于5' RACE的基因特异引物可基于目的单克隆抗体的H-链和L-链的同种型来制备，以便其可迅速结合VH和VL的下游。因此，5' RACE引物可设计为特异性针对鼠中的各亚型，如Yl、Y2a、Y2b或γ3。可选地，可基于亚型间的一致或高度同源区域设计用于所有亚型的通用引物。在Tsurushita中，公开了下列5' RACE引物作为实例(i)5/ -GCCAGTGGATAGACTGATGG-(SEQ ID NO :82)(用于克隆鼠 Y 1，Y 2a，Y 2b和Y 3H-链)(ii)5/ -GATGGATACAGTTGGTGCAGC-(SEQ ID NO :83)(用于克隆鼠 κ L-链)。例如，使用Zero Blunt T0P0 PCR克隆试剂盒(Invitrogen)，可将PCR扩增的V区基因片段直接克隆到质粒载体中，并测定它们的DNA序列。所获得的序列应通过，例如，通过使用，例如Model241蛋白质测序仪(Hewlett-Packard, CA)的N末端氨基酸测序测定的目的单克隆抗体的氨基酸序列，来比较所获得序列所编码的氨基酸序列来证实。典型地，例如，通过Edman降解检测目的抗体的N末端处至少15至20个氨基酸残基，充分证实所克隆的DNA序列的可靠性。Tsurushita警示，当谷氨酸(其为小鼠中最常见的两种N末端氨基酸之一)为N末端氨基酸时,其可能已被转换成焦谷酰胺(pyroglutamine)并阻断N末端的测序。在该情况下，必须使N末端去阻断以获得序列。V区的三维樽型基于VH和VL的序列，首先通过例如由R. Levy等人(1989Biochemistry 28:7168-7175)和 B. Zilber 等人(1990，Biochemistry29 :10032-10041)所描述的方法，鉴定潜在的对保持CDR构象结构重要的目的抗体的框架残基。典型地，将各VH和VL分成14个结构上有意义的片段，其为包括免疫球蛋白超家族的结构域结构的P折叠股(Pstrand)和环状结构。在PDB数据库中，将来自目的抗体的各片段的氨基酸序列与已知结构的抗体的相应片段比对(参见 H. MBerman 等人，2000，Nucleic Acids Res. 28 :235-342)。通过多重序列比对，筛选与各目的片段具有最高序列同源性的相应片段，并构建V区的三维模型。为了优化结构，使模型进行多循环共轭(conjugate)梯度能量最小化(例如，使用ENCAD,或如以下所述Press 等人，1990,在"NumericalRecipes, Cambridge UniversityPress, Cambridge ；AMBER, Weiner 等人，1981，J. Comp. Chem. 2 :287-303 ；3D-JIG-SAff,可在 BioMolecularModelling 或由 Cancer Research UK 运行的"BMM "网站上获得；或 SWISS-MODEL(可在由 Swiss Institute ofBioinformatics, Geneva 运行的 ExPASyProteomics Server 网站上获得))。人框架的诜择在构建V区结构模型的同时，分别由鼠VH和VL的cDNA克隆推导出的氨基酸序列与如 Kabat 数据库(参见 Johnson 等人，2000, Nucleic Acids Res. 28 :214-218)和 GenBank 70 %、至少约75 %、至少约80 %、至少约85 %、至少约90 %或至少约95 %同一性的人FR，可使用例如 Smith-Waterman算法(Gusfield, 1997, in" Algorithms on Strings,Trees,andSequences " , Cambridge University Press, Cambridge),或 BLAST (Karlin 等人，1990,Proc. Natl. Acad. Sci. USA87 :2264-2268)等检索。这些人序列可基于cDNA类或蛋白质来源的序列；然而，种系的使用通常是优选的，这是因为其在消除在cDNA类或蛋白质来源的序列中与体细胞超突变相关的潜在的免疫原性中是有用的。可选地，如Queen等人(1989，如前所述)所述，也可鉴定共有框架序列的使用并除去从cDNA类或蛋白质来源的序列获得的框架中的此类超突变残基。在将种系VH片段用作受体框架的情况下，应当使用在染色体14，而不是15和16上编码的VH片段，因为只有染色体14上的那些才产生功能性VH。人源化V区的设计根据Queen等人(1989，如前所述)，必须鉴定在⑶R的约4至6人内的框架氨基酸，
这是因为这些残基被认为是潜在的支持正确的⑶R结构的关键框架残基。可使用计算机程序如可从由美国国家科学基金会(National Science Foundation,NSF)支持的MolecularVisualization Freeware网站获得RASMOL实现此方法,该软件从原子坐标或通过计算机模型的人工检验来计算原子间距。如果在关键框架位置的氨基酸在鼠供体和人受体序列间不同，则通常将鼠供体的那些来替换人残基。然而，如果此类残基对支持CDR结构具有最小贡献，则典型地使用相应的人残基。此外，如果所选择的人受体包含“非典型”氨基酸(其以小于V区序列约10至20%发生)，则它们可为亲和突变期间体细胞超突变的结果，并应当用供体残基替换以避免人类中潜在的免疫原性。此外，为了设计人源化V区，其他因素，如潜在的N-连接的糖基化信号的残基需要仔细考虑(参见Tsurushita详情)。人源化抗体可包含来自人K或X L-链的人恒定区或其一部分，和/或人抗体的Y 1> Y 2> y 3> Y 4> U > a I、a 2、8或e H-链,或其突变体,取决于对于治疗用途所需要或待消除的效应物功能。例如，包含突变的恒定区的Fe部分可融合到本发明的嵌合或人源化抗体的V区，以便减少抗体与Fe受体的结合和/或减少其固定补体的能力(参见，例如Winter 等人，GB 2，209, 757B ；Morrison 等人，WO 89/07142，Morgan 等人，WO 94/29351)。抗体分子的此类操作可通过如5. 2节所述的重组DNA技术来进行。优选地所得嵌合或人源化抗体具有与非人供体抗体相同的特异性和具有与非人供体抗体的亲和力类似的或至少约1/3、至少约1/2或至少约2/3的亲和力。在另一方面，所得嵌合或人源化抗体具有至少约I X IO7M'优选至少约IXlO8M'并最优选至少约IXlO9M-1的亲和力常数。除了上述通用方法，可使用本领域已知的各种技术来人源化抗体，包括，例如⑶R移植(EP 239，400 ；PCT 公开 WO 91/09967 ;美国专利 5，225，539 ;5，530，101 和 5，585，089号)、饰面(veneer)或表面重塑(resurfacing) (EP 592, 106 ；EP 519, 596 ；Padlan,Molecular Immunology, 28 (4/5) :489-498,1991 ;Studnicka 等人，Protein Engineering,7(6) :805-814,1994 ;Roguska 等人，ProcNatl. Acad. Sci. USA，91 :969-973,1994)以及链改组(美国专利5，565，332号)，将其全部内容在此引入以作参考。5. 3. 2对于制备人源化抗体作为药物的额外考虑 为了提供人源化抗体作为药物，因此需要制备有效且一致的生产系统。例如，通过插入H-链和L-链序列来制备用于人源化抗体的适当的表达载体，可获得用表达载体转染的高生产率细胞系作为主细胞库(MCB)的种子细胞，其用作工作细胞库(WCB)的稳定和半永久性的来源。然后可通过培养来自WCB的工作细胞并收集培养基来制备人源化抗体。含有适当调控基因的各种表达载体可用于制备此类生产细胞系。作为宿主细胞，可使用通常用于表达哺乳动物蛋白质的那些来表达人源化抗体。此类宿主细胞包括，但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、SP2/0-Agl4. 19细胞和NSO细胞等。人源化抗体的生产率可通过选择表达载体和宿主细胞的最佳组合来最大化。此外，应探究培养基的组合物以便从各种无血清培养基和补充剂选择适当的介质，从而可优化通过宿主细胞的人源化抗体的表达。基于有效性和终产量，可使用本领域公知的各种方法从培养上清液中纯化通过宿主细胞生产的人源化抗体，所述方法包括亲和层析、离子交换层析和疏水相互作用层析等。5. 4药物学组合物和治疗用涂本发明提供包括上述免疫特异性识别RGD序列的人源化抗体或其抗原结合片段的药物学组合物。包括本发明的人源化抗体作为活性成分的药物学组合物可用作用于预防和/或治疗与RGD蛋白相关的紊乱或疾病的试剂，所述紊乱或疾病包括，但不限于，癌症如癌细胞的生长或转移，和炎性疾病如风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维样变、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化症、肉芽瘤、炎性肠道疾病(溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)和自身免疫病等。包括本发明的人源化抗体的药物学组合物还可用来治疗器官移植后的慢性排斥反应和自身免疫病如系统性自身免疫病、全身性红斑狼疮、葡萄膜炎、白塞病、多发性肌炎、增生性肾小球肾炎和结节病等。包括本发明的人源化抗体的用于预防或治疗上述紊乱或疾病的预防和/或治疗剂具有低毒性，并可直接通过在适当的溶剂中混合而作为液体制剂，或以适当剂型作为药物学组合物口服或肠外给药到人类。用于上述给药的药物学组合物包含前述抗体或其盐以及药物学可接受载体、稀释剂或赋形剂。以适用于口服或肠外给药的剂型提供此类组合物。剂量可取决于待给药的受试者的年龄和体型、目的疾病、病症和给药途径等而变化。当抗体用于预防和/或治疗，例如成人患者中的风湿性关节炎时，通常以单剂量约0.01至约20mg/kg体重、优选约0. I至约10mg/kg体重、并更优选约0. I至约5mg/kg体重,大约I至5次每天，优选大约I至3次每天，将本发明的抗体静脉注射给药是有利的。在其他肠外给药和口服给药中，抗体可以相应于上述所给出剂量的剂量给药。当病症特别恶劣时，剂量可根据病症而增加。已知各种输送系统并可用于给药本发明的药物学组合物，例如在脂质体中包封、微粒、微囊体、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见，例如Wu和Wu，1987，J. Biol. Chem. 262 :44294432)。引入方法包括但不限于真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口途径。化合物可通过任何常规途径，例如通过输液或剂团注射(bolus injection)、通过由上皮细胞或皮肤黏膜内膜(lining)(例如，口腔黏膜、直肠和肠粘膜等)给药，并可与其他生物学活性试剂一起给药。给药可为全身或局部。还可采用肺部给药，例如通过吸入器或喷雾器的使用，并与粉雾剂(aerosolizing agent) 一起制剂。 在本发明的一方面，可期望将本发明的药物学组合物局部给药至需要治疗的区域；这可通过例如并非限制的以下方式实现例如，通过注射、借助导管、借助栓剂、借助鼻喷雾或借助植入体，连同手术后的伤口敷药一起的在手术期间的局部输液、局部施用等，所述植入体为多孔、非多孔或包括膜，如娃橡胶膜(sialastic membrane)的凝胶状材料或纤维。在本发明的一个方面，可能通过在感染组织的位点(或前述位点)处进行直接注射来给药。在本发明的另一方面，药物学组合物可在囊泡，特别是脂质体中输送(Langer，1990, Science 249 :1527-1533 ;Treat 等人，inLiposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler(eds. ), Liss, New York,pp. 353-365 (1989) ；Lopez-Berestein,同上，pp. 317-327 ；一般参见同上)。在本发明的另一方面，药物学组合物可在控释系统中输送。在本发明的一方面，可使用泵(参见 Langer,如前所述，Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 201 ；Buchwald 等人，1980, Surgery 88 :507 ；和 Saudek 等人，1989, N. Engl. J. Med. 321 574)。在本发明的另一方面，可使用聚合材料(参见MedicalApplications ofControlled Release, Langer and Wise(eds. ), CRCPres. , Boca Raton, Florida(1974)；Controlled DrugBioavailability, Drug Product Design and Performance, SmolenandBall(eds. ), Wiley, New York(1984) ；Ranger 和 Peppas, J. MacromoI. Sci. Rev. MacromoI.Chem. 23 :61 (1983);还参见 Levy 等人，1985，Science 228 :190 ；During 等人，1989，Ann.Neurvl. 25 :351 ；Howard 等人，1989, J. Neurosurg. 71 :105)。仍在本发明的另一方面，控释系统可置于组合物的目标附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，如Goodson，inMedicalApplications of Controlled Release,如前所述，第 2 卷，pp. 115-138 (1984))。在Langer的综述(Science 249:1527-1533(1990))中讨论了其他控释系统。用于口服给药的组合物的实例包括固体或液体剂型，特别是，片剂(包括糖衣丸和涂膜片剂)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包括软胶囊)、糖浆、乳剂、悬浮剂等。此类组合物通过公知方法制造，并包含常规用于药物学制剂领域的载体、稀释剂或赋形剂。用于片剂的载体或赋形剂的实例为乳糖、淀粉、蔗糖和硬脂酸镁等。可注射制剂可包括用于静脉、皮下、皮内和肌内注射、点滴输液等的剂型。这些可注射制剂可通过公知方法制备。例如可注射制剂可通过以下制备在常规用于注射的无菌水介质或油介质中溶解、悬浮或乳化上述抗体或其盐。作为用于注射的水介质，例如，有生理盐水、包含葡萄糖和其他助剂的等渗溶液等，其可与适当的增溶剂如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂(例如，聚山梨酸酯80、HC0-50 (氢化蓖麻油的聚氧化乙烯(50mol)加合物))等组合使用。作为油介质，采用例如芝麻油、大豆油等，其可与增溶剂如苯甲酸苄酯、苯甲醇等组合使用。由此制备的注射剂优选填入适当的安瓿中。用于直肠给药的栓剂可通过共混前述抗体或其盐以及常规用于栓剂的基质来制备。有利地，将上述口服或肠外使用的药物学组合物以适合于符合活性成分剂量的单位剂量来制备成剂型。以单位剂量的此类剂型包括，例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂等。前述抗体的含量在单位剂量中通常为每剂型约5至500mg ;特别是以注射剂 的形式，优选以约5至IOOmg并以约10至250mg其他剂型包含前述抗体。上述各组合物可进一步包含其他活性组分，除非制剂与上述抗体引起任何不利反应。本发明还涉及细胞和/或组织重建的抑制剂和/或促进剂，其包括RGD序列结合功能分子(例如，整联蛋白等)作为活性成分；并涉及抑制和/或促进细胞和/或组织重建的方法，其包括使表达RGD蛋白的细胞和/或组织(例如，肿瘤细胞、嗜中性粒细胞、平滑肌等)与RGD蛋白结合功能分子接触。在此治疗剂中活性成分的剂量、给药方法、药物学制剂等可适当地由关于包括本发明的人源化抗体的药物的前述描述来确定。如上所述，本发明进一步提供用于预防或治疗与RGD蛋白相关或涉及RGD蛋白的紊乱或疾病的方法，所述方法包括将至少一种有效量的本发明的人源化抗体给药到需要其的受试者。5. 5诊断用涂包括本发明的人源化抗体的药物学组合物可用作癌症如癌细胞的生长或转移，和炎性疾病如风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维样变、糖尿病、癌症转移、动脉硬化、多发性硬化症、肉芽瘤等的诊断剂，或作为器官移植后的慢性排斥反应、自身免疫病如系统性自身免疫病、全身性红斑狼疮、葡萄膜炎、白塞病、多发性肌炎、增生性肾小球肾炎和结节病等的诊断剂。本发明的人源化抗体能够特异性识别RGD序列，因而可用于定量试验液体中的RGD蛋白，特别是用于通过夹心免疫测定、竞争性测定、免疫测量法(immunometry)、池度法等的定量,或免疫染色等。在将这些免疫学方法应用到本发明的测定方法中时，无需阐明任何特别的条件、步骤等。通过向常规条件和步骤添加本领域普通技术考虑来充分构建测定系统。对于这些常用技术方法的细节，可参考综述或课本等。如上所述，RGD蛋白可通过使用本发明的抗体而高灵敏度地定量。通过在体内应用用于定量RGD蛋白的方法，本发明的人源化抗体特别用于诊断各种与RGD蛋白相关的疾病。例如，在检测RGD蛋白的表达水平增加或降低的情况下，可诊断目前极可能患RGD蛋白相关疾病，例如癌症或炎性疾病，或者诊断未来极可能患这些疾病。因此，本发明还提供用于在受试者中诊断与RGD蛋白相关或涉及RGD蛋白的紊乱或疾病的方法，所述方法包括将有效量的本发明的人源化抗体的至少之一或二者向需要其的受试者给药。此类体内诊断的所需剂量可小于治疗用途所需的那些，并可由本领域技术人员根据常规步骤确定。本发明的人源化抗体还可用于具体检测存在于试样(例如，体液的试验液、组织等)中的RGD蛋白。人源化抗体还可用于制备纯化RGD蛋白用抗体柱，用于检测纯化时包含于各组分的RGD蛋白或用于分析RGD蛋白在待试验细胞中的行为。本发明的序列表中的序列鉴定号表示以下序列。[SEQ ID NO:I]其示出鼠33E10和人33E10共有的CDRHl氨基酸序列。[SEQ ID NO:2]其示出鼠33E10和人33E10共有的CDRH2氨基酸序列。
[SEQ ID NO:3]其示出鼠33E10和人33E10共有的CDRH3氨基酸序列。[SEQ ID NO 4]其示出鼠33E10和人33E10共有的CDRLl氨基酸序列。[SEQ ID NO:5]其示出鼠33E10和人33E10共有的CDRL2氨基酸序列。[SEQ ID NO 6]其示出鼠33E10和人33E10共有的CDRL3氨基酸序列。[SEQ ID NO:7]其示出Hu33E10 VH5基因的核苷酸序列，其包括编码信号肽的序列和内含子序列，侧翼为SpeI和HindIII位点。[SEQ ID NO 8]其示出包括信号肽的由Hu33E10 VH5基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO 9]其示出Hu33E10 VH7基因的核苷酸序列，其包括编码信号肽的序列和内含子序列，侧翼为SpeI和HindIII位点。[SEQ ID NO: 10]其示出包括信号肽的由Hu33E10 VH7基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO: 11]其示出Hu33E10 VH7. 8基因的核苷酸序列，其包括编码信号肽的序列和内含子序列，侧翼为SpeI和HindIII位点。[SEQ ID NO: 12]其示出包括信号肽的由Hu33E10 VH7. 8基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO: 13]其示出Hu33E10 VL6基因的核苷酸序列，其包括编码信号肽的序列和内含子序列，侧翼为NheI和EcoRI位点。[SEQ ID NO: 14]其示出包括信号肽的由Hu33E10 VL6基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO: 15]其示出Hu33E10 VLv2基因的核苷酸序列，其包括编码信号肽的序列和内含子序列，侧翼为NheI和EcoRI位点。[SEQ ID NO: 16]其示出包括信号肽的由Hu33E10 VLv2基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO: 17]其示出用于Hu33E10的重链和轻链cDNA的PCR扩增和测序的寡核苷酸[CMV2]。[SEQ ID NO: 18]其示出用于Hu33E10的重链和轻链cDNA的PCR扩增和测序的寡核苷酸[JNT026]。[SEQ ID NO: 19]
其示出用于Hu33E10的重链和轻链cDNA的PCR扩增和测序的寡核苷酸[JNT080]。[SEQ ID NO:20]其示出用于HU33E10的重链和轻链cDNA的PCR扩增和测序的寡核苷酸[JNT082]。[SEQ ID NO 21]其示出用于Hu33E10的重链和轻链cDNA的PCR扩增和测序的寡核苷酸[JNT084]。[SEQ ID NO 22]其示出用于HU33E10的重链和轻链cDNA的PCR扩增和测序的寡核苷酸[JNT097]。[SEQ ID NO 23]其示出用于HU33E10的重链和轻链cDNA的PCR扩增和测序的寡核苷酸[JNT098]。[SEQ ID NO:24]其示出NS 0-Hu33E10-4和NS0-Hu33E10_6中表达的VH7和Y -I重链恒定区的编码区的核苷酸序列。[SEQ ID NO 25]其示出NS0-Hu33E10-4和NS0-Hu33E10_6中表达的VH7和Y -I重链恒定区的编码区的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO:26]其示出NS0-HU33E10-5中表达的VH7. 8和Y -I重链恒定区的编码区的核苷酸序列。[SEQ ID NO 27]其示出NS0-HU33E10-5中表达的VH7. 8和Y -I重链恒定区的编码区的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO:28]其示出NS0-Hu33E10-4和NS0-Hu33E10_5中表达的VL6和κ轻链恒定区的编码区的核苷酸序列。[SEQ ID NO:29]其示出NS0-Hu33E10-4和NS0-Hu33E10_5中表达的VL6和κ轻链恒定区的编码区的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO:30]其示出NS0-HU33E10-6中表达的VLv2和κ轻链恒定区的编码区的核苷酸序列。[SEQ ID NO:31]其示出NS0-HU33E10-6中表达的VLv2和κ轻链恒定区的编码区的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO 32]其示出33E10 VL的氨基酸序列。[SEQ ID NO:33]其示出Hu33E10 VLv2的氨基酸序列。[SEQ ID NO:34]其示出鼠33E10 VH cDNA的核苷酸序列。[SEQ ID NO 35]其示出由鼠33E10 VH cDNA的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO:36]其示出鼠33E10 VL cDNA的核苷酸序列。[SEQ ID NO 37]其示出由鼠33E10 VL cDNA的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO:38]其示出所设计的33E10 VH基因的核苷酸序列，其包括编码信号肽的序列和内含子序列，侧翼为SpeI和HindIII位点。[SEQ ID NO 39]其示出包括信号肽的由设计的33E10 VH基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO 40]其示出所设计的33E10 VL基因的核苷酸序列，其包括编码信号肽的序列和内含子序列，侧翼为NheI和EcoRI位点。[SEQ ID NO 41] 其示出包括信号肽的由设计的33E10 VL基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO 42]其示出33E10 VH的氨基酸序列。[SEQ ID NO 43]其示出人源化33E10(Hu33E10)VHl的氨基酸序列。[SEQ ID NO 44]其示出33E10 VL的氨基酸序列。[SEQ ID NO 45]其示出人源化33E10(Hu33E10)VLl的氨基酸序列。[SEQ ID NO 46]其示出用于构建HU33E10VH1基因的寡核苷酸[JNJ220]。[SEQ ID NO 47]其示出用于构建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ206]。[SEQ ID NO 48]其示出用于构建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ207]。[SEQ ID NO 49]其示出用于构建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ208]。
[SEQ ID NO :50]其示出用于构建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ209]。[SEQ ID NO 51]其示出用于构建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ210]。[SEQ ID NO 52]其示出用于构建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ211]。[SEQ ID NO 53]其示出用于构建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ212]。
[SEQ ID NO 54]其示出用于构建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ213]。[SEQ ID NO 55]其示出用于构建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ214]。[SEQ ID NO 56]其示出用于构建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ215]。[SEQ ID NO 57]其示出用于构建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ216]。[SEQ ID NO 58]其示出用于构建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ217]。[SEQ ID NO 59]其示出用于构建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ218]。[SEQ ID NO 60]其示出用于构建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ219]。[SEQ ID NO 61]其示出用于构建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ221]。[SEQ ID NO 62]其示出用于构建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ116]。[SEQ ID NO 63]其示出用于构建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ193]。[SEQ ID NO 64]其示出用于构建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ194]。[SEQ ID NO 65]其示出用于构建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ195]。[SEQ ID NO 66]其示出用于构建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ196]。[SEQ ID NO 67]其示出用于构建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ197]。[SEQ ID NO 68]其示出用于构建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ198]。[SEQ ID NO 69]
其示出用于构建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ199]。[SEQ ID NO 70]其示出用于构建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ200]。[SEQ ID NO 71]其示出用于构建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ201]。[SEQ ID NO 72]其示出用于构建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ202]。[SEQ ID NO 73] 其示出用于构建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ203]。[SEQ ID NO 74]其示出用于构建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ204]。[SEQ ID NO 75]其示出用于构建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ205]。[SEQ ID NO 76]其示出用于构建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ101]。[SEQ ID NO 77]其示出用于构建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ117]。[SEQ ID NO 78]其示出Hu33E10 VHl基因的核苷酸序列，其包括编码信号肽的序列和内含子序列，侧翼为SpeI和HindIII位点。[SEQ ID NO 79]其示出包括信号肽的由Hu33E10 VHl基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO 80]其示出Hu33E10 VLl基因的核苷酸序列，其包括编码信号肽的序列和内含子序列，侧翼为NheI和EcoRI位点。[SEQ ID NO 81]其示出包括信号肽的由Hu33E10 VLl基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO 82]其示出5' RACE引物的核苷酸序列。[SEQ ID NO 83]其示出5' RACE引物的核苷酸序列。[SEQ ID NO 84]其示出GeneRacerS'引物的核苷酸序列。[SEQ ID NO 85]其示出33E10VH3'引物的核苷酸序列。[SEQ ID NO 86]其示出33E10VL3'引物的核苷酸序列。[SEQ ID NO 87]其示出33E10VH5'引物的核苷酸序列。
[SEQ ID NO :88]其示出33E10VH3'引物的核苷酸序列。[SEQ ID NO :89]其示出33E10VL5'引物的核苷酸序列。[SEQ ID NO 90]其示出33E10VL3'引物的核苷酸序列。[SEQ ID NO 91]其示出Hu33E10 VH5基因的核苷酸序列。 [SEQ ID NO 92]其示出由Hu33E10 VH5基因的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO 93]其示出Hu33E10 VH7基因的核苷酸序列。[SEQ ID NO 94]其示出由Hu33E10 VH7基因的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO 95]其示出Hu33E10 VH7. 8基因的核苷酸序列。[SEQ ID NO 96]其示出由Hu33E10 VH7. 8基因的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO 97]其示出Hu33E10 VL6基因的核苷酸序列。[SEQ ID NO 98]其示出由Hu33E10 VL6基因的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。[SEQ ID NO 99]其示出Hu33E10 VLv2基因的核苷酸序列。[SEQ ID NO :100]其示出由Hu33E10 VLv2基因的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。6.实施例以下实施例说明免疫特异性识别RGD序列的单克隆抗体的制备、单克隆抗体V区的测序、表位作图及抗体和此类抗体的嵌合和人源化的其他特征，以及所得嵌合和人源化抗体的特征。这些实施例不应解释为限制本发明的范围。6. I鼠33E10可变区基因的克隆和测序在7. 5%的CO2培养箱中，37°C下使鼠33E10杂交瘤细胞在包含10%胎牛血清(FBS ；HyClone, Logan, UT)的 TIL 培养基 I (Immunology-Biological Laboratories, Gunma,Japan)中生长。根据供应商的方法，使用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)从大约3X IO6个杂交瘤细胞中提取总RNA。使用GeneRacerKit(Invitrogen)根据供应商的方法合成Oligo dT引导的cDNA。使用分别与鼠Y-I和κ链恒定区退火的3'引物，以及GeneRacer Kit 中提供的 GeneRacer 5'引物(5' -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3' (SEQID NO :84)),通过用 Phusion DNA 聚合酶(New England Biolabs, Beverly, MA)的聚合酶链式反应(PCR)扩增33E10重链和轻链的可变区cDNA。对于重链可变区(VH)的PCR扩增，3'引物具有序列5' -GCCAGTGGATAGACAGATGG-3' (SEQ ID NO :85)。对于轻链可变区(VL)的 PCR 扩增，3'引物具有序列 5' -GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3 ' (SEQ ID NO :86)。将扩增的VH和VL cDNA克隆到pCR4Blunt_T0P0载体(Invitrogen)中用于序列测定。在Tocore (Menlo Park, CA)下进行可变区的DNA测序。测序多个重链和轻链克隆,鉴定与典型鼠重链和轻链可变区具有同源性的单一序列。与推导的33E10 VH和VL氨基酸序列一起分别将33E10 VH和VL的共有cDNA序列示于图I和2。6.2嵌合33已10 IgGl/k抗体的构建使用33E10 VH cDNA做为模板，5' -GGGACTAGTACCACCATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATT-3' (SEQ ID NO :87) (SpeI 位点加下划线)作为 5'引物和 5' -GGGAAGCTTGAAGTTAGGACTCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3' (SEQ ID NO 88) (HindIII 位点加下划线)作为 3'引物(图3)，通过PCR产生编码33E10 VH的基因作为包括剪接供体信号以及适当的侧翼限制性酶切位点的外显子。同样地，使用33E10 VLcDNA作为模板，5' -GGGGCTAGCACCACCATG AAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3' (SEQ ID NO :89) (NheI 位点加下划线)作为 5'引物和 5' -GGGGAATTCTTTGGATTCTACTTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC~3/ (SEQ ID NO :90) (EcoRI 位点加下划线)作为3'引物(图4)，通过PCR产生编码33E10 VL的基因作为包括剪接供体信号和适当地侧翼限制性酶切位点的外显子。33E10 VH和VL外显子的剪接供体信号分别源自鼠种系的 JH3 和 J K I 序列(Kabat 等人，Sequences ofProteins of ImmunologicalInterests,第五版,NIH Publication No. 91-3242,U. S. Department of Health and HumanServices, 1991) 使用 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiangen, Valencia, CA)来凝胶纯化PCR扩增片段，用SpeI和HindIII (对于VH)或者NheI和EcoRI (对于VL)消化，并克隆到载有人Y-I和K恒定区的哺乳动物表达载体中，用来生产嵌合33E10 IgGl/K抗体。所得表达载体pCh33E10的示意性结构示于图5。6. 3人源化33E10 VH和VL基因的产生如Queen 等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :10029-10033，1989)所概述的那样进行33E10可变区的人源化。首先，在计算机程序的辅助下构建33E10可变区的三维分子模型。接下来，基于针对人源可变区序列的同源性检索，选择与33E10VH具有高度同源性的U03400 (Genbank登录号)的人VH氨基酸序列作为受体从而提供人源化33E10VH的框架。同样地，选择X72452 (GenBank登录号)的人VL氨基酸序列作为33E10 VL人源化的受体。在三维模型显示出与互补决定区(⑶Rs)显著接触的框架位置，来自鼠33E10可变区的氨基酸残基被人框架的残基所替换。其在30和48位进行，以产生人源化33E10(Hu33E10)VHl (图6)。对于轻链，无需替换而产生Hu33E10VLl (图7)。33E10、设计的Hu33E10和人受体氨基酸序列的比对，对于VH示于图6和对于VL示于图7。将编码各Hu33E10 VHl和VLl的基因设计为包括信号肽、剪接供体信号和用于随后克隆到哺乳动物表达载体中的适当的限制性酶切位点的外显子。Hu33E10 VHl和VLl外显子的剪接供体信号分别源自人种系的JH3和Jk I序列(Kabat等人，1991)。通过 SIG-Pred 信号妝预测软件(http://bmbpcu36. leeds. ac. uk/prot_analysis/Signal.html)表明鼠33E10 VLl基因的信号肽序列对于精确裂解是次优的。因此，在Hu33E10 VLl外显子中使用通过SIG-Pred软件预测被有效且精确地裂解的鼠单克隆抗体35B6 (GeneTechno Science)的VL基因的信号肽。Hu33E10 VHl外显子的信号肽序列源自相应的鼠33E10 VH序列。SIG-Pred软件表明Hu33E10 VHl基因的信号肽被有效且精确地裂解。如He 等人(J. Immunol. 160 :1029-1035，1998)所概述的，使用 Phusion DNA 聚合酶，通过几个重叠合成的寡核苷酸引物的延伸和PCR扩增来构建Hu33E10 VHl和VLl基因。用于构建Hu33E10 VHl和VLl基因的寡核苷酸分别列于图8和9OHU33E10 VHl和VLl基因中的寡核苷酸的位置分别示于图10和11。使用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)来凝胶纯化PCR扩增片段，并克隆到pCR4Blunt-T0P0载体用于序列测定。用SpeI和HindIII (对于VH)或者NheI和EcoRI (对于VL)消化后，Hu33E10VHl和VLl基因亚克隆到用于生产人IgGl/κ形式的哺乳动物表达载体的相应位点。所得表达载体pHu3E10-l的示意结构示于图5。所获得的Hu33E10 VHl和VLl基因的核苷酸序列分别与推导的氨基酸序列一起示于图12和13。6. 4嵌合和人源化33E10抗体的表达为了获得稳定生产各嵌合和人源化33E10 IgGl/κ抗体的细胞系，分别将表达载体 pCh33E10 和 pHu33E10_l 导入小鼠骨髓瘤细胞系 NSO (European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury,Wiltshire,UK)的染色体中。在 7· 5% CO2 培养箱中，37°C下使NSO细胞在包含10% FBS的DME培养基中生长。通过如Bebbington等人(Bio/Technology10 :169-175,1992)所述的电穿孔对NSO细胞进行稳定转染。转染前，使用FspI使各表达载体线性化。用10 μ g线性质粒转染大约IO7个细胞，悬浮于包含10% FBS的DME培养基中，并在几个96孔板中铺板。24至48小时后，应用选择性培养基(包含10%FBS、HT培养基补充剂(Sigma, St. Louis,MO)、0· 25mg/ml黄嘌呤和I μ g/ml霉酚酸的DME培养基)。选择起始后的大约10天,分析培养上清液的抗体产物。通过夹心ELISA测量培养上清液中的由pCh33E10和pHu3E10_l表达的重组抗体(分别为Ch33E10和Hu3E10-VHl/VLl)的表达水平。在典型的实验中，4°C下用100 μ I/孔的1/2，000稀释的PBS中的羊抗人IgG Fe Y链特异性多克隆抗体(SouthernBiotech,Birmingham, AL)铺ELISA板过夜，用洗涤缓冲液(包含0. 05%吐温20的PBS)洗漆，并在室温下用3001 μ /孔的封闭缓冲液(包含2%脱脂牛奶和0. 05%吐温20的PBS)封闭I小时。用洗涤缓冲液洗涤后，将ELISA缓冲液(包含1%脱脂牛奶和0. 025%吐温20的PBS)中适当稀释的100 μ I/孔的试样铺于ELISA板。将从人骨髓瘤血清中纯化的人IgGl/κ抗体(SouthernBiotech)或纯化的Ch33E10用作标准。室温下温育ELISA板2小时并用洗涤缓冲液洗涤后，使用100 μ I/孔的1/2，000稀释的HRP结合的羊抗人κ链多克隆抗体(SouthernBiotech)来检测结合的抗体。室温下温育I小时并用洗涤缓冲液洗涤后,通过添加100 μ I/孔的ABTS底物进行显色，并用100 μ I/孔的2%草酸终止。在405nm下读取吸光度。使产生高水平Ch33E10的NSO稳定转染子之一(NS0_Ch33E102Cll ;也称作L4-2C11)适应于在使用杂交瘤SFM的无血清培养基(Invitrogen)中生长，在滚瓶中增长至密度约106/ml,用6mg/ml超滤大豆水解产物(Irvine Scientific Cat#96857)补给,并进一步生长至细胞活性变成小于50%。离心并过滤后，将培养上清液上样(load)到蛋白A琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare, Piscataway, NJ)中。在用 0. IM 甘氨酸-HCl (pH 3. 0)洗脱抗体前，用PBS清洗柱。用IM Tris-HCl (pH8)中和后，通过透析将洗脱抗体的缓冲液改为PBS。通过测量280nm下的吸光度来测量抗体浓度(lmg/ml = I. 40D)。
虽然易于获得表达Ch33E10的NSO稳定转染子，但稳定转染有pHu33E10_l的所有NSO转染子为Hu33E10-VHl/VLl的不良生产者。重链和轻链mRNA的分析揭示缺失VL编码区的异常轻链mRNA的存在，这是由于在VLl基因的信号肽编码区偶然产生剪接供体位点。为了解决该问题，使用重叠延伸PCR法,通过位点定向诱变(Higuchi,R.,在PCR Technology Principlesand Applications for DNA Amplification. Erlich, H. A. , ed.pp. 61-70,Stockton Press, New York, 1989)来消除在信号肽编码区的剪接供体位点。所得突变体Hu33E10 VL基因的序列，VL6，不于图14。VLl和VL6之间的VL区氣基酸序列彼此相同。在表达载体pHu33E10-l中将VL6基因替换VLl以产生pHu33E10_2。通过上述方法获得用pHu33E10-2稳定转染的并产生高水平的重组抗体(Hu33E10-VHl/VL6)的NSO细胞。在用pHu33E10-2稳定转染的NSO细胞中未观察到异常轻链mRNA。产生高水平Hu33E10_VHl/VL6 (NS0-Hu33E10-2#2)的NSO稳定转染子之一在杂交瘤SFM中适应并增长，如上所述将培养上清液用于纯化Hu33E10-VHl/VL6。6. 5Hu33E10-VHl/VL6 的表征
通过ELISA检测 Ch33E10 和 Hu33E10-VHl/VL6 IgGl/k 抗体与 h0PN5_BSA 的结合。作为抗原，使用与牛血清白蛋白结合的合成寡肽(Cys-Val-Asp-Thr-Tyr-Asp-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Val-Val-Tyr-Gly-Leu-Arg-Ser ；由 Gene TechnoScience 提供)(h0PN5_BSA)。在典型的实验中，在4°C下，用100111/孔0.211 Na2CO3缓冲液(pH9. 4)中的I y g/mlh0PN5-BSA铺ELISA板过夜，用洗涤缓冲液洗涤，并在室温下用300 U I/孔封闭缓冲液封闭I小时。用洗涤缓冲液洗涤后，将适当溶于ELISA缓冲液中的样品以IOOiU/孔施加到ELISA板上。4°C下温育ELISA板过夜并用洗涤缓冲液洗涤后，使用100 U I/孔的1/2，000稀释的HRP结合的羊抗人Y链多克隆抗体(SouthernBiotech)检测结合的抗体。室温下温育I小时并用洗涤缓冲液洗涤后，通过添加100 iil/孔的ABTS底物来进行显色，并用100 iil/孔的2%草酸终止。在405nm下读取吸光度。如图15A所示，对于与 h0PN5-BSA 的结合，Hu33E10-VHl/VL6 比 Ch33E10 弱大约 100倍。6. 6Hu33E10 VH5、VH7 和 VH7. 8 的产生和表征为了鉴定人源化VHl和VL6基因哪一个导致HU33E10-VH1/VL6的抗原结合亲和力的减少，产生两个重组IgGl/K抗体，一个由鼠VH和人源化VL6组成(MoHu33E10)，及另一个由人源化VHl和鼠VL组成(HuMo33E10)。通过分析MoHu33E10和HuMo33E10抗体，发现Hu33E10-VHl/VL6亲和力的减少主要由于VHl基因，部分由于VLl基因(数据未示出)。基于VHl基因的初步突变分析，怀疑73至77位氨基酸对于维持抗原结合亲和力是重要的(数据未示出)。选择由使用重叠延伸PCR法(Higuchi，1989)的位点定向诱变所构建的VHl基因的三个突变体(VH5、VH7和VH7. 8)用于进一步的分析。与VHl相比，VH5中77位的Ile替换Ser (图6和16)，VH7中76位的Ser和77位的Ile分别替换Asn和Ser (图6和17)，VH7. 8中74位的Ser、76位的Ser和77位的Ile分别替换Ala、Asn和Ser (图 6 和 18)。将用SpeI和HindIII消化的各VH5、VH7和VH7. 8基因替换pHu33E10_2中的VHl以分别构建表达载体pHu33E10-3、pHu33E10_4和pHu33E10_5。如第4节所述产生用各 pHu33E10-3、pHu33E10-4 和 pHu33E10_5 稳定转染的 NSO 细胞。产生 Hu33E10_VH5/VL6的 NS0-Hu33E10-3#65、产生 Hu33E10-VH7/VL6 的 NS0-Hu33E10_4 3(也称作 R3-1 5D3)以及产生 Hu33E10-VH7. 8/VL6 的 NS0-Hu33E10_5 1E5 (也称作 EJ3-3 1E5)适应于在杂交瘤SFM中生长并在滚瓶中增长。如第4结所述，使用蛋白A柱从相应的培养上清液中纯化Hu33E10-VH5/VL6、Hu33E10_VH7/VL6 和 Hu33E10_VH7. 8/VL6 抗体。如第5 节所述，通过 ELISA 将 Hu33E10_VH5/VL6、Hu33E10_VH7/VL6 和Hu33E10-VH7. 8/VL6 抗体与 h0PN5_BSA 的结合同 Ch33E10 的比较。当与 Hu33E10_VHl/VL6 相比时，Hu33E10-VH5/VL6与h0PN5_BSA的亲和力稍微改进，但仍比Ch33E10的亲和力弱(图15A)。Hu33E10-VH7/VL6 与 h0PN5-BSA 的亲和力比 Ch33ElO 的亲和力弱 3 至 4 倍(图 15A)。在该实验中，Hu33E10-VH7. 8/VL6的亲和力大约比Ch33E10的亲和力低3倍(图15B)。在重复实验中，对于同h0PN5-BSA的结合，Hu33E10-VH7/VL6和Hu33E10_VH7. 8/VL6彼此表现类似。6. 7Hu33E10 VLv2 的产生和表征VLl基因的初步突变分析未能鉴定任何有助于HU33E10-VH1/VL6的结合亲和力减 少的特别的框架氨基酸残基(数据未示出)，即使怀疑VLl基因部分地导致亲和力的减少。代替进一步表征的VLl基因，基于不同人框架设计新的人源化33E10 VL(VLv2)(图19)。对于VLv2，选择M29467 (GenBank登录号)的人氨基酸序列作为受体。在预测与⑶R显著相互作用的22和37位，鼠33E10 VL的氨基酸残基在人源化形式中得到保留。在GenScriptUSA Inc. (Piscataway，NJ)合成侧翼为 Nhe I 和 EcoRI 位点的 Hu33E10 VLv2 基因(图 20)。VL6和VLv2基因共享相同的信号肽序列和剪接供体信号(图14和20)。将用NheI和EcoRI消化的Hu33E10 VLv2基因替换pHu33E10_4中的VLl以构建新的表达载体pHu33E10-6。如第4节所述，产生用pHU33E10_6稳定转染的NSO细胞以产生 Hu33E10-VH7/VLv2 IgGl/κ。转染子之一，NS0-Hu33E10_15 (也称作 SP2-1 1-15)在杂交瘤SFM适应并增长，并使用第4节中所述的步骤从培养上清液中纯化Hu33E10-VH7/VLv2抗体。如第5节所述，通过ELISA分析Hu33E10_VH7/VLv2与h0PN5_BSA的结合。两个独立的实验结果示于图21。在两个实验中，Hu33E10-VH7/VLv2的结合亲和力为Ch33E10的结合亲和力的2倍以内。6.8 NSO稳定转染子的表征用PCR 支原体检测装置(Takara Bio USA, Madison, WT)试验表明，NS0_Ch33E102Cll、NS0-Hu33E10-4 5D3、NS0-Hu33E10_5 1E5 和 NS0-Hu33E10_6 1-15 对于支原体的存在全部为阴性。通过cDNA 测序证实分别在 NS0-Hu33E10_4 5D3, NS0-Hu33E10_5 1E5 和NS0-Hu33E10-6 1-15 中产生的 Hu33E10_VH7/VL6、Hu33E10_VH7. 8/VL6 和 Hu33E10_VH7/VLv2 IgGl/ κ抗体的重链和轻链的可靠性。使用TRIzol试剂(Invitrogen)从这些细胞中提取总RNA，并使用RT-PCR用上标III第一链合成系统(InvitiOgen)根据供应商的方法合成oligo dT引导的cDNAo使用CMV2和JNT098作为引物(图22)和PhusionDNA聚合酶通过PCR扩增Y -重链的编码区。将PCR片段凝胶纯化并用CMV2、JNT082、JNT097和JNT098作为引物(图22)进行测序。类似地，使用CMV2和JNT026 (图22)扩增κ轻链的编码区并用CMV2、JNT026、JNT080和JNT084作为引物(图22)使凝胶纯化的DNA片段进行测序。所获得的重链和轻链编码区序列与各NS0-Hu33E10-4 5D3, NS0-Hu33E10-5 1E5和NS0-Hu33E10-6I-15稳定转染子的表达载体中的相应序列完全匹配。由Hu33E10VH7和VH7. 8组成的Y -I重链的全部编码区序列分别示于图23和24。由Hu33E10 VL6和VLv2组成的K轻链的全部编码区序列示于图25和26。此外，通过cDNA测序证实在NS0-Ch33E10 2C11中产生的Ch33E10 IgGl/k抗体的VH和VL区的可靠性。如上所述进行总RNA的提取和cDNA的合成。使用CMV2和JNT082作为引物和Phusion聚合酶通过PCR扩增VH编码区。将PCR片段凝胶纯化并用CMV2和JNT082作为引物进行测序。类似地，使用CMV2和JNT026扩增VL编码区并用CMV2和JNT026作为引物使凝胶纯化的DNA片段进行测序。所获得的VH和VL区的核苷酸序列与pCh33E10表达载体中相应序列完全匹配(分别为图3和4)。6. 9 总结确定Hu33E10-VH7/VLv2 IgGl/k 与 h0PN5_BSA 的亲和力为 Ch33E10 IgGl/k 的亲和力的3倍以内。
6. 10细胞黏附抑制试验图27示出人源化抗OPN抗体抑制MDA-MB-435S与h0PN5_BSA的黏附。从美国模式培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection, ATCC)获得 MDA-MB-435S 人乳腺癌细胞系，并在含10%胎牛血清的DMEM补充剂中培养。37°C下用h0PN5_BSA (2 y g/ml)铺96孔板I小时，随后在室温下用0. 5% BSA处理I小时。将人免疫球蛋白Gl k、Ch33E10、Hu33E10-VH7. 8/VL6 (EJ3-1-1)、Hu33E10-VH7/VL6 (E3-1)、Hu33E10-VH7/VLv2 (SP-2)和鼠33E10抗体溶于0. 25% BSA的DMEM中，并在37°C下在以100 u g/ml开始并连续2倍稀释的各种浓度下处理20分钟。将2X IO4个MDA-MB-435S细胞添加到各孔。37°C下温育I小时后，除去培养基并用温PBS(加热至37°C)轻轻洗涤两次。固定黏附细胞并用溶于20%甲醇的0.5%结晶紫染色，并用20%乙酸裂解。在590nm下测量吸光度。用不添加抗体的吸光度标准化抑制率。7.保藏2005年10月27日，依照微生物保藏的布达佩斯条约，将本文所命名的产生鼠抗RGD单克隆抗体的33E10和35B6杂交瘤保藏于位于茨城县筑波东中央第6 (邮政编码305-8566)的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，相应的登陆号分别为FERM BP-10440和FERM BP-10441，将其全部内容引入此处以作参考。8产业上的可利用性本发明的人源化抗体抑制RGD蛋白的功能从而显示对癌症如癌细胞的生长或转移，以及炎性疾病如风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维样变、糖尿病、癌转移、动脉硬化、多发性硬化症、肉芽瘤、炎性肠道疾病(溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)和自身免疫病等的治疗效果。包括本发明的抗RGD抗体和抗整联蛋白抗体的药物学组合物对癌症和炎性疾病发挥更加改善的治疗效果。尽管本文已说明并描述了具体实施方案，但本领域技术人员应理解各种更改和/或等同实施在不偏离本发明的范围的情况下可替代所示出和描述的具体实施方案。该申请意于覆盖任何此处所讨论的具体实施方案的更改或变化。因此，本发明仅受权利要求及其等同物的限制。
权利要求
1.一种免疫特异性识别RGD序列的人源化抗体或其抗原结合片段，其包括 ⑴包括VH的H-链，所述VH包括SEQ ID NO :92、94或96的氨基酸序列；或 (ii)包括VL的L-链，所述VL包括SEQID NO 98或100的氨基酸序列；或 (iii)上述⑴和(ii)二者。
2.根据权利要求I所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包括由SEQIDNO :91、93或95的核苷酸序列编码的氨基酸序列，和所述VL包括由SEQ ID NO :97或99的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
3.根据权利要求I所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包括SEQID NO94的氨基酸序列，和所述VL包括SEQ ID NO :100的氨基酸序列。
4.根据权利要求I所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述H-链包括SEQIDNO :25或27的氨基酸序列，和所述L-链包括SEQ ID NO :29或31的氨基酸序列。
5.根据权利要求I或2所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述H-链包括SEQID NO 25的氨基酸序列，和所述L-链包括SEQ ID NO 31的氨基酸序列。
6.—种分尚的核酸分子，其包括编码SEQ ID NO :SEQ IDNO :92、94或96的氨基酸序列的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的分尚的核酸分子,其中所述核苷酸序列具有SEQID NO :91、93或95的核苷酸序列。
8.一种分离的核酸分子，其包括编码SEQ ID NO SEQ IDNO :98或100的氨基酸序列的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的分尚的核酸分子,其中所述核苷酸序列具有SEQID N0:97或99的核苷酸序列。
10.一种分离的核酸分子，其包括编码SEQ ID NO :25或27的氨基酸序列的核苷酸序列。
11.根据权利要求10所述的分尚的核酸分子,其中所述核苷酸序列具有SEQID NO 24或26的核苷酸序列。
12.—种分离的核酸分子，其包括编码SEQ ID NO :29或31的氨基酸序列的核苷酸序列。
13.根据权利要求10所述的分尚的核酸分子,其中所述核苷酸序列具有SEQID NO 28或30的核苷酸序列。
14.一种载体，其包括根据权利要求6或8或二者所述的核酸分子，其中所述核酸分子可操作地连接至一种或多种调控元件。
15.一种载体，其包括根据权利要求10或12或二者所述的核酸分子，其中所述核酸分子可操作地连接至一种或多种调控元件。
16.一种分离的宿主细胞，其包括根据权利要求14或15所述的载体。
17.一种用于制备人源化抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在使所述人源化抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养根据权利要求16所述的宿主细胞，和收集被表达的人源化抗体。
18.一种用于抑制细胞黏附的组合物，其包括根据权利要求I至5任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段。
19.一种用于干扰胞外基质蛋白与细胞的结合的组合物，其包括根据权利要求I至5任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段。
20.根据权利要求18或19所述的组合物，其中所述组合物用于治疗或诊断与RGD蛋白相关的紊乱或疾病。
21.一种用于预防或治疗与RGD蛋白相关的紊乱或疾病的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求I至5任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段给药到需要其的受试者。
22.—种用于检测试样中的RGD蛋白的方法，其包括分析试样中根据权利要求I至5任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段与所述RGD蛋白的结合。
23.一种用于体内诊断与RGD蛋白相关的紊乱或疾病的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求I至5任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段给药到待检测的受试者。
全文摘要
本发明提供免疫特异性识别RGD序列的人源化抗体。这些抗体中的某些抑制RGD蛋白的生物学功能，从而显示对与RGD蛋白相关的各种紊乱或疾病的治疗效果，所述与RGD相关的紊乱或疾病包括癌症如癌细胞的生长和转移，以及炎性疾病如风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、子宫内膜异位症、支气管哮喘、纤维样变、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化症、肉芽瘤、炎性肠道疾病(溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)和自身免疫病等。
文档编号A61K39/395GK102712921SQ20108004235
公开日2012年10月3日 申请日期2010年9月22日 优先权日2009年9月24日
发明者尚卡·库马, 曹仲欣, 鹤下直也 申请人:株式会社遗传科技