抗gcc抗体分子及其相关组合物和方法

专利名称：抗gcc抗体分子及其相关组合物和方法
技术领域：
本发明涉及结合GCC的抗体分子，以及相关分子(例如编码所述抗体分子的核酸)、组合物和相关方法(例如治疗和诊断方法)。
背景技术：
鸟苷酸环化酶C(Guanylyl cyclase C，GCC)是一种跨膜细胞表面受体，其功能在于维持肠液、电解质体内平衡和细胞增殖，参见例如凯里瑟(Carrithers)等人，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 100 :3018-3020 (2003)。GCC 于衬在小肠、大肠和直肠内的粘膜细胞上表达(凯里瑟等人，结肠与直肠疾病(Dis Colon Rectum) 39 171-181(1996))。GCC的表达在肠上皮细胞发生致瘤性转化时被维持，并且在所有原发性和转移性结肠直肠肿瘤中都有表达(凯里瑟等人，结肠与直肠疾病，39 :171-181(1996)；布克(Buc)等人，欧洲癌症杂志(Eur J Cancer) 41 :1618-1627(2005)；凯里瑟等人，胃肠病学 (Gastroenterology)107 1653-1661(1994))。

发明内容
本发明者已经发现众多抗GCC抗体，包括人类与鼠类抗体。因此，在一个方面中， 本发明的特征在于一种抗GCC抗体分子，如本文所揭示。抗GCC抗体分子适用作裸抗体分子且适用作免疫偶联物的组分。因此，在另一个方面中，本发明的特征在于免疫偶联物，其包含抗GCC抗体分子和治疗剂或标记。本发明的特征也在于医药组合物，其包含本文所述的抗GCC抗体分子和免疫偶联物。本发明的特征还在于使用本文所述的抗GCC抗体分子和免疫偶联物用于以下的方法检测GCC和表达GCC的细胞或组织；对GCC介导的疾病进行诊断、预后、成像或分期；调节GCC蛋白的活性或功能；和治疗GCC介导的疾病，如本文所述。 在另一个方面中，本发明的特征也在于编码抗GCC抗体分子氨基酸序列的经分离和/或重组核酸，以及包含所述核酸的载体和宿主细胞，和用于制备抗GCC抗体分子的方法。本文提到的所有出版物、专利申请案、专利和其它参考文献都以全文引用的方式并入本文中。本文所揭示的本发明的其它特征、目的和优势将由实施方式和图式以及权利要求书而显而易知。


图1描绘用5F9vc-MMAF、-DMl和-DM4以ql4d时间表处理的带有^3_GCC#2的 SCID小鼠中的肿瘤生长。
图2描绘用0. 9 % NaCl ；40mg/kg的209抗体；或10或40mg/kg的5F9抗体处理的小鼠在接种后第41天的肺重量。图3描绘用5F9抗体处理的带有CT26_hGCC肿瘤的小鼠的存活曲线。图4描绘测试GCC直系同源物的抗体交叉反应性的ELISA结合分析。
具体实施例方式鸟苷酸环化酶C鸟苷酸环化酶C(GCC)(又称STAR、ST受体、⑶C2C和⑶CY2C)是一种跨膜细胞表面受体，其功能在于维持肠液、电解质体内平衡和细胞增殖(凯里瑟等人，美国国家科学院院刊，100 :3018-3020(2003)；曼恩(Mann)等人，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem Biophys Res Commun) 239 =463-466(1997)；皮塔雷(Pitari)等人，美国国家科学院院刊， 100 :2695-2699(2003))；基因库(GenBank)寄存编号NM_004963，其各自均以引用的方式并入本文中)。此功能是经由结合鸟苷素(guanylin)介导(维嘉德(Wiegand)等人，欧洲生物学化学会联盟快报(FEBS Lett. )311 =150-154 (1992)) 0 GCC也为热稳定肠毒素(ST， 例如氨基酸序列为NTFYCCELCCNPACAGCY，SEQ ID NO :316)的受体，热稳定肠毒素是由大肠杆菌(E.coli)以及其它感染性生物体产生的肽(饶M.C. (Rao，MC.)，诺华基金会研讨会文集(Ciba Found. Symp.) 112 :74-93(1985)；克努普 F. C. (Knoop F. C.)和欧文斯 M. (Owens, Μ.)，药理与毒理方法杂志(J. Pharmacol. Toxicol. Methods) 28 :67-72 (1992))。ST 结合于 GCC活化导致肠道疾病(例如腹泻)的信号级联。人类GCC的核苷環瘦序列(基因库寄存编号\M_004963)
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(SEQ ID NO :227)
人类GCC的氨基酸？序列(基因肽(GenPept)寄存编号NP—004954)
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Purif. )8 :151-159(1996))能够抑制ST肽结合于人类和大鼠GCC，并且抑制ST介导的人类GCC产生cGMP。GCC已经表征为一种涉及到癌症(包括结肠癌)的蛋白质。也参见凯里瑟等人，结肠与直肠疾病，39 :171-181(1996)；布克等人，欧洲癌症杂志，41 :1618-1627(2005)；凯里瑟等人，胃肠病学，107 :1653-1661(1994)；乌尔班斯基等人，生物化学与生物物理学学服， 1245 =29-36(1995)。针对GCC的抗体分子治疗剂可以未偶联形式单独使用，由此抑制表达 GCC的癌性细胞。本发明的抗GCC抗体分子可结合人类GCC。在一些实施例中，本发明的抗 GCC抗体分子可抑制配体(例如鸟苷素或热稳定肠毒素)与GCC的结合。在其它实施例中， 本发明的抗GCC抗体分子不抑制配体(例如鸟苷素或热稳定肠毒素)与GCC的结合。对GCC具特异性的单克隆抗体包括GCC:B10 (兰迪等人，细胞生物化学杂志 (J. Cell. Biochem.) 66 :500-511 (1997))、GCC: 4D7 (维亚查得拉(Vijayachandra)等人，生物化学(Biochemistry) 39 16075-16083 (2000))和 GCC:C8(贝克尔(Bakre)等人，欧洲生物化学杂志(Eur. J. Biochem. )267 179-187 (2000)) GCC:B10 具有 κ 轻链和 IgG2a 同型， 并与大鼠、猪和猴GCC交叉反应。GCC:B10结合于GCC细胞内结构域的前63个氨基酸，具体说来结合于SEQ ID NO :2 的残基470-480(兰迪等人，蛋白质科学(Protein Sci. )7 2175-2183(1998))。GCC:4D7结合于在GCC的残基491-568内的激酶同源结构域(班达瑞 (Bhandari)等人，生物化学，40 =9196-9206 (2001)) GCC:C8结合于在GCC的细胞质部分中的蛋白激酶样结构域。定义和方法除非本文另外定义，否则与本发明结合使用的科技术语应具有一般所属领域技术人员通常了解的含义。一般说来，结合本文所述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或聚核苷酸化学和杂交利用的命名法及其技术是此项技术中已知的。基因库或基因肽寄存编号以及适用的核酸和肽序列可见于由位于马里兰州贝赛思达市的美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnological Information，Bethesda MD)所维护的网站。使用标准技术进行重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化与转染 (例如电穿孔、脂质体转染)。根据制造商的说明或如此项技术中通常完成或如本文所述来执行酶促反应和纯化技术。前述技术和程序一般是根据此项技术中已知的方法(例如，如本说明书全篇所引用和论述的各种一般和更特定的参考文献中所述)执行。参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning :A Laboratory Manual) (第3版，冷泉港实验出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor, N. Y.) (2000))或一般参见哈洛 Ε· (Harlow, Ε.)和莱恩 D. (Lane，D.) (1988) 抗体实验指南(Antibodies =ALaboratory Manual)，冷泉港实验出版社，纽约冷泉港。结合本文所述的分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学利用的命名法及其实验程序和技术是此项技术中已知的。使用标准技术进行化学合成、化学分析、药物制备、调配和传递以及患者的治疗。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。如本文所用的术语“抗体分子”是指抗体、抗体肽或免疫球蛋白，或上述任一者 (例如抗体)的抗原结合片段。抗体分子包括单链抗体分子(例如scFv)(参见例如博德 (Bird)等人，(1988)科学(Science) 242 :423-426 ；和休斯顿(Huston)等人，(1988)美国国家科学院院刊，85 :5879-588 和单结构域抗体分子(参见例如W09404678)。尽管不属于术语“抗体分子”，但本发明也包括“抗体类似物”，基于其它非抗体分子蛋白质的骨架，例如使用CDR提供特异性抗原结合的融合蛋白和/或免疫偶联物。“抗GCC抗体分子”是指与GCC (例如人类GCC)相互作用或识别(例如结合，例如特异性结合)GCC(例如人类GCC)的抗体分子(即抗体、抗体或抗体类似物的抗原结合部分)。示范性抗GCC抗体分子为例如表1和2中概述的分子。如本文所用的术语“抗体”、“抗体肽”或“免疫球蛋白”是指单链、双链和多链蛋白质以及糖蛋白。术语抗体包括多克隆、单克隆、嵌合、CDR移植和人类或人源化抗体，所有这些抗体在本文别处更详细地论述。所述术语内也包括骆驼类抗体(camelid antibody) (参见例如US2005/0037421)和纳米抗体(nanobody)(例如IgNAR(鲨鱼抗体)，参见例如 W003/014161)。术语“抗体”也包括合成和遗传工程改造的变体。如本文所用的术语“抗体片段”或抗体的“抗原结合片段”是指例如Fab、Fab'、 F(ab' )2和Fv片段、单链抗体、功能性重链抗体(纳米抗体)以及抗体的对至少一种所需表位具有特异性且与完整抗体竞争特异性结合的任何部分(例如具有足够CDR序列且具有足够框架序列以特异性结合于表位的片段)。举例来说，抗原结合片段可竞争结合于与作为所述片段来源的抗体结合的表位。本文和类似情形中所用的来源(derived)不是指任何特定衍生方法或工艺，而仅指序列类似性。抗原结合片段可通过重组技术或通过酶促或化学裂解完整抗体而产生。术语抗原结合片段当用于具有轻链和重链的抗体的单一链(例如重链)时意谓所述链的所述片段足以使得在与另一链(例如轻链)的完整可变区配对时其结合可达成使用完整重链和轻链可变区可见的结合的至少25、50、75、85或90%。如本文所用的术语“CDR的抗原结合集群(antigen binding constellation ofCDR) ”或“足以允许结合的多个CDR” (和类似措辞)是指一条链(例如重链)的CDR当放于框架中且与另一链(例如轻链)的完整可变区或与另一链可变区的具有类似长度且具有相同数目的CDR的一部分配对时足以使得其结合可达成使用完整重链和轻链可变区可见的结合的例如至少25、50、75、85或90%。如本文所用的术语“人类抗体”包括具有来源于人类生殖系免疫球蛋白序列的序列的抗体，例如来源于具有人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠(例如XEN0M0USE 遗传工程改造小鼠(艾伯吉尼斯公司(Abgenix)，加利福尼亚州费力蒙(Frem0nt，CA)))、人类噬菌体呈现文库、人类骨髓瘤细胞或人类B细胞的抗体。如本文所用的术语“人源化抗体”是指来源于非人类抗体(例如啮齿动物，例如鼠类)的抗体，其保留或实质上保留亲本抗体的抗原结合特性，但在人类中具有较低免疫原性。如本文所用的人源化意图包括脱免疫化抗体(deimmunized antibody)。通常人源化抗
10体包括非人类CDR和人类或人类来源的框架和恒定区。如本文所用的术语“经修饰”抗体是指通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；自重组、组合抗体文库分离的抗体；自转殖人类免疫球蛋白基因的动物(例如小鼠、绵羊或山羊)分离的抗体；或通过涉及使人类免疫球蛋白基因序列拼接到其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。这些经修饰抗体包括人源化抗体、⑶R移植抗体(例如⑶R来自第一抗体而框架区来自不同来源(例如第二抗体或共同框架)的抗体)、嵌合抗体、体外产生(例如通过噬菌体呈现)的抗体，且可任选包括来源于人类生殖系免疫球蛋白序列或人类免疫球蛋白基因，或通过涉及使人类免疫球蛋白基因序列拼接到替代性免疫球蛋白序列的任何方式制备、表达、产生或分离的抗体的可变区或恒定区。在实施例中，经修饰抗体分子包括序列相比参考抗体有所变化的抗体分子。术语“单特异性抗体”是指对特定表位呈现单一结合特异性和亲和力的抗体或抗体制剂。此术语包括“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”。术语“双特异性抗体”或“双功能抗体”是指对两个表位呈现双重结合特异性的抗体，其中各结合位点不同且识别不同表位。术语“非偶联抗体”和“裸抗体”可互换使用，意思指未结合于非抗体部分(例如治疗剂或标记)的抗体分子。术语“免疫偶联物”、“抗体偶联物”、“抗体药物偶联物，，和“ADC”可互换使用且指偶联于非抗体部分(例如治疗剂或标记)的抗体。术语“试剂(agent) ”在本文中用于表示化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制得的萃取物。术语“治疗剂”是指具有生物活性的试剂。术语“抗癌剂”或“化学治疗剂”在本文中用于指具有抑制人类赘瘤，尤其恶性(癌性)病变(例如癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病)发生或发展的功能特性的试剂。抑制转移或血管生成通常为抗癌剂或化学治疗剂的特性。化学治疗剂可为细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。术语“细胞生长抑制剂”是指抑制或抑止细胞生长和/或细胞繁殖的试剂。“细胞毒性剂”是指主要通过直接干扰细胞功能而引起细胞死亡的化合物，包括 (但不限于)烷化剂、肿瘤坏死因子抑制剂、嵌入剂、微管抑制剂、激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂和拓扑异构酶抑制剂。如本文所用的“毒性有效负载(toxic payload) ”是指当传递到细胞时导致细胞死亡的足量细胞毒性剂。毒性有效负载的传递可通过投予足量包含本发明的抗体或抗原结合片段和细胞毒性剂的免疫偶联物来实现。毒性有效负载的传递也可通过投予足量包含细胞毒性剂的免疫偶联物来实现，其中所述免疫偶联物包含识别且结合本发明的抗体或抗原结合片段的第二抗体或其抗原结合片段。如本文所用的短语“来源于指定序列，，或“对指定序列具特异性”的序列是指包含与例如指定序列的邻接区域对应(即，一致或互补)的约至少6个核苷酸或至少2个氨基酸、至少约9个核苷酸或至少3个氨基酸、至少约10到12个核苷酸或4个氨基酸或者至少约15到21个核苷酸或5到7个氨基酸的邻接序列的序列。在某些实施例中，所述序列包含指定核苷酸或氨基酸序列的全部。所述序列可与特定序列特有的序列区域互补(在聚核苷酸序列的情况下)或一致，如由此项技术中已知的技术所确定。可作为序列来源的区域包括(但不限于)编码特定表位的区域、编码CDR的区域、编码框架序列的区域、编码恒定结构域区的区域、编码可变结构域区的区域以及非翻译和/或非转录区。所得序列未必在物理上来源于所研究的相关序列，而可基于由作为聚核苷酸来源的区域的碱基序列所提供的信息以任何方式产生，包括(但不限于)化学合成、复制、反转录或转录。因此，其可表示原始聚核苷酸的有义或反义定向。另外，对应于指定序列区域的区域的组合可用此项技术中已知的方式修饰或组合成符合预定用途。举例来说，序列可包含两个或两个以上邻接序列，其各包含指定序列的一部分，且穿插有与指定序列不一致但意图表示来源于指定序列的序列的区域。对于抗体分子，“来源于其”者包括在功能上或结构上与比较抗体有关的抗体分子，例如“来源于其”者包括具有类似或实质上相同的序列或结构(例如具有相同或类似CDR、框架或可变区)的抗体分子。对于抗体，来源于其者也包括以下残基，例如一个或一个以上，例如2、3、4、5、6个或更多个以下残基，所述残基可能邻接或可能不邻接，但根据编号方案或与比较序列的一般抗体结构的同源性或三维接近度(three-dimensional proximity)(即在⑶R或框架区内)进行定义或鉴别。术语“来源于其”不限于在物理上来源于其，而是包括通过任何方式、例如通过使用来自比较抗体的序列信息设计另一抗体而产生。如本文所用的短语“由……编码”是指核酸序列编码多肽序列，其中所述多肽序列或其部分含有来自由所述核酸序列所编码的多肽的至少3到5个氨基酸、至少8到10个氨基酸或至少15到20个氨基酸的氨基酸序列。计算两个序列之间的“同源性”可如下执行。出于最佳比较目的对准序列(例如， 为达成最佳对准可在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一者或两者中引入间隙，且出于比较目的可忽略非同源序列)。出于比较目的对准的参考序列的长度是参考序列长度的至少 30 %、40 %或50 %、至少60 %或至少70 %、80 %、90 %、95 %、100 %。随后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中某一位置由与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在此位置上一致(如本文所用的氨基酸或核酸“一致性”等效于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的一致性百分比随所述序列所共有的一致位置的数目而变化，其中考虑为两个序列的最佳对准而需要引入的间隙的数目和各间隙的长度。可使用数学演算法完成两个序列之间的序列比较和同源性百分比测定。可使用此项技术中已知的任何方法测定两个氨基酸序列之间的同源性百分比。举例来说，尼德曼 (Needleman)和乌尼史(Wunsch)(分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) 48 :444-453(1970))演算法，其已被并入GCG软件包中的GAP程序中，所述演算法使用Blossum 62矩阵或PAM250 矩阵，以及间隙权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6。也可使用GCG软件包(艾斯勒有限公司(Accelerysdnc.)，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego5CA))中的 GAP程序，使用NWSgapdna. CMP矩阵以及间隙权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、 4、5或6来测定两个核苷酸序列之间的同源性百分比。用于测定同源性的示范性参数集为 Blossum 62计分矩阵，其中间隙罚分(gap penalty)为12，间隙延长罚分为4，且读框转移间隙罚分为5。如本文所用的术语“在严格条件下杂交”描述杂交和洗涤的条件。有关执行杂交反应的规则可见于现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology), 约翰威立出版公司(John Wiley & Sons)，纽约(N. Y.) (1989),6. 3. 1-6. 3. 6中。所述参考文献描述水性和非水性方法且可使用任一方法。本文提到的特定杂交条件如下1)低严格度杂交条件，在约45°C下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，随后至少在50°C (对于低严格度条件，洗涤温度可提高到)下用0. 2XSSC、0. 1% SDS洗涤两次；2)中等严格度杂交条件，在约45°C下在6 X SSC中，随后在60°C下用0. 2 X SSC、0. 1 % SDS洗涤一次或一次以上；3)高严格度杂交条件，在约45°C下在6XSSC中，随后在65°C下用0. 2XSSC、0. 1% SDS 洗涤一次或一次以上；和4)极高严格度杂交条件为在65°C下0. 5M磷酸钠、7% SDS，随后在 65°C下用0.2XSSC、1% SDS洗涤一次或一次以上。极高严格度条件(4)通常为优选的条件，且除非另外规定，否则应使用所述条件。应了解，本发明的抗体和其抗原结合片段可具有额外保守性或非必需氨基酸取代，其对多肽功能无实质影响。特定取代是否容许(即，不会不利地影响所需生物特性， 例如结合活性)可如鲍维JU(Bowie，JU)等人，科学，247 :1306-1310(1990)或帕德兰 (Padlan)等人，美国实验生物学学会联合会杂志(FASEB J)9 :133-139(1995)所述确定。 “保守性氨基酸取代”为氨基酸残基经具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在此项技术中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。“非必需”氨基酸残基是可由结合剂(例如抗体)的野生型序列改变而不会消除或不会实质上改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基会产生所述变化。在抗体中，必需氨基酸残基可为特异性决定残基(SDR)。如本文所用的术语“经分离”是指物质自其原始环境(例如如果其天然存在，那么为自然环境)移出。举例来说，活体动物中存在的天然存在的聚核苷酸或多肽是未分离的， 但与自然系统中共存物质中的一些或全部分离的相同聚核苷酸或DNA或多肽是经分离的。 所述聚核苷酸可为载体的一部分，和/或所述聚核苷酸或多肽可为包含含有所述聚核苷酸或多肽的经分离细胞或培养细胞的组合物(例如混合物、溶液或悬浮液)的一部分，且其在所述载体或组合物不是自然环境的一部分的情况下仍为经分离的。如本文所用的术语“复制子”是指在细胞内表达为聚核苷酸复制的自主单元的任何遗传元件，例如质粒、染色体或病毒。如本文所用的术语“可操作地连接”是指所述组分处于使其能以其预定方式发挥作用的关系中的情形。因此，例如，“可操作地连接”到编码序列的控制序列是以某种方式连接以使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。如本文所用的术语“载体”是指连接有另一聚核苷酸区段例如以便引起所连接区段的复制和/或表达的复制子。如本文所用的术语“控制序列”是指这样一种聚核苷酸序列，其为实现其所连接的编码序列的表达所必需的。所述控制序列的性质视宿主生物体而不同。在原核生物中，所述控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和终止子，且在一些情况下包括强化子。因此， 术语“控制序列”意图至少包括存在是表达所必需的所有组分，且也可包括存在将有利的其它组分，例如前导序列。如本文所用的术语“经纯化产物”是指产物的制剂，其已与所述产物通常缔合的细胞组分和/或与可存在于相关样品中的其它类型的细胞分离。如本文所用的术语“表位”是指能够特异性结合于抗体的蛋白质抗原决定子。表位抗原决定子通常由例如氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面群组成，且通常具有特定的三维结构特征和特定的电荷特征。一些表位为线性表位，而其它为构象表位。线性表位是邻接氨基酸一级序列包含所识别的表位的表位。线性表位通常包括至少3个且更通常至少5个，例如约8到约10个邻接氨基酸。构象表位可由至少两种情形产生，例如a)仅以某些蛋白质构象(例如取决于配体结合，或取决于信号传导分子进行的修饰(例如磷酸化)) 暴露于抗体结合的线性序列；或b)在蛋白质中超过一个部分或在多亚单元蛋白质中超过一个亚单元的结构特征的组合，其中所述特征在三维空间中足够紧密接近以参与结合。如本文所用的“同型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgGl)。如本文所用的术语“可检测剂”、“标记，，或“经标记，，用于指在多肽或糖蛋白上并入可检测标记物。标记多肽和糖蛋白的各种方法是此项技术中已知的且都可使用。用于多肽的标记的实例包括(但不限于)以下放射性同位素或放射性核素(例如铟(1" )、碘 (131I 或 125I)、钇(90Y)、镥(177Lu)、锕(225Ac)、铋(212Bi 或 213Bi)、硫(35S)、碳(14C)、氚(3H)、铑 (■Rh)、锝(99mTc)、镨或磷(32P)或发射正电子的放射性核素，例如碳_11("0、钾-40(4°K)、 氮-13 (13N)、氧-15 (15O)、氟-18 (18F)和碘-121 (121I))、荧光标记(例如 FITC、若丹明 (rhodamine)、镧系元素磷光体)、酶标记(例如辣根过氧化酶、β _半乳糖苷酶、荧光素酶、 碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基团(其可通过经标记的抗生物素蛋白(例如含有抗生蛋白链菌素部分的分子)和荧光标记物或可通过光学方法或量热法检测的酶促活性来检测) 和由二次报导子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二次抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施例中，标记通过各种长度的间隔子臂连接以减少可能的位阻。对于抗GCC抗体分子，如本文所用的“特异性结合”或“结合特异性”意谓抗体分子结合于GCC(例如人类GCC蛋白)的亲和力大于其结合于非GCC蛋白(例如BSA)的亲和力。通常，抗GCC分子对于非GCC蛋白(例如BSA)的Kd将是其对于GCC(例如人类GCC蛋白)的Kd的大于2倍、大于10倍、大于100倍、大于1，000倍、大于IO4倍、大于IO5倍或大于IO6倍。在测定Kd时，对于GCC和非GCC蛋白(例如BSA)的Kd应在相同条件下测定。如本文所用的术语“治疗”定义为向个体(例如患者)投予抗GCC抗体分子，或向个体的经分离组织或细胞投予(例如通过施用)，所述经分离组织或细胞将返回到个体中。 抗GCC抗体分子可单独投予或与第二药剂组合投予。治疗可为治愈、复原、缓和、缓解、改变、补救、改善、减轻、改良或影响病症、病症的症状或病症(例如癌症)倾向。尽管不希望受理论束缚，但相信治疗可在体外或在体内抑制、消除或杀灭细胞，或以其它方式降低细胞 (例如异常细胞)介导病症(例如，如本文所述的病症，例如癌症)的能力。如本文所用的术语“个体”意图包括哺乳动物、灵长类动物、人类和非人类动物。举例来说，个体可为患有癌症(例如胃肠起源的癌症，例如结肠癌)、具有癌症(其中至少一些细胞表达GCC;例如胃肠起源的癌症，例如结肠癌)症状或具有癌症(其中至少一些细胞表达GCC;例如胃肠起源的癌症，例如结肠癌)倾向的患者(例如人类患者或兽类患者)。除非另外说明，否则术语本发明的“非人类动物”包括所有非人类脊椎动物，例如非人类哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、绵羊、狗、母牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。在一个实施例中，个体不包括小鼠、大鼠、兔或山羊中的一者或一者以上或全部。如本文所用的抗GCC抗体分子“有效”或“足以”治疗病症的量，或“治疗有效量” 或“治疗上足够的量”是指在投予个体单次或多次剂量后有效治疗细胞(例如癌细胞，例如表达GCC的肿瘤细胞)或延长患有本文所述病症的个体的生命、治愈、缓和、缓解或改良所述个体超过在无所述治疗的情况下预期的结果的抗体分子的量。如本文所用的“抑制肿瘤或癌症的生长”是指减缓、中断、停滞或停止其生长和/或转移且未必表示肿瘤生长的完全消除。如本文所用的“GCC” (又称“5丁八1 ”、“6阢2(”、“6阢￥2(”或“51受体”蛋白)是指哺乳动物GCC，优选为人类GCC蛋白。人类GCC是指SEQ ID NO :2 中所示的蛋白质和其天然存在的等位基因蛋白质变体。SEQ ID NO :2 中的等位基因可由SEQ ID NO :227中所示的 GCC核酸序列编码。其它变体是此项技术中已知的。参见例如寄存编号EnSp000(^61170、 恩瑟布数据库(Ensembl Database)、欧洲生物信息学研究院(European Bioinformatics Institute)和韦尔科姆基金会桑格研究院(Wellcome Trust Sanger hstitute)，其在残基观1处具有亮氨酸；公开的美国专利申请案第US 20060035852号的SEQ ID NO 14 ；或基因库寄存编号AAB19934。通常，天然存在的等位基因变体的氨基酸序列与SEQ ID NO 228 的GCC序列至少95^^97%或99%—致。转录物编码具有1073个氨基酸的蛋白质产物，且描述于基因库寄存编号NM_004963中。GCC蛋白表征为一种跨膜细胞表面受体蛋白，且相信其在维持肠液、电解质体内平衡和细胞增殖方面起关键作用。除非另外说明，否则术语“烷基”是指具有约1到约20个碳原子(和其中的碳原子范围和特定数目的所有组合和子组合)、优选约1到约8个碳原子的饱和直链或分支烃。烷基的实例为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、 3-戊基、2-甲基-2- 丁基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、3-甲基-2- 丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基_2_戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2，3-二甲基-2-丁基和3，3-二甲基-2- 丁基。单独或作为另一基团的一部分的烷基可称作“经取代”。经取代烷基是经一个或一个以上如下基团、优选1到3个如下基团(和选自卤素的任何其它取代基)取代的烷基包括(但不限于)_卤素、-0-(C1-C8烷基)、-0-(C2-C8烯基)、-0-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R ‘、-OC(O)R ‘、-C(0)OR ‘、-C(0)NH2, -C(0)NHR ‘、-C(0)N(R ‘ )2、-NHC(0) R' , -SR'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、= 0、_N3、_NH2、_NH(R ‘ )、_N(R' )2 和-CN，其中各R'独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-ο- (C1-C8 烷基)、-0- (C2-C8 烯基)、-0- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C1-C8 烷基、-C2-C8 烯基和-C2-C8炔基可任选经一个或一个以上如下基团进一步取代包括(但不限于PC1-C8烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 炔基、-卤素、-0-(C1-C8 烷基)、-ο-(C2-C8 烯基)、-ο-(C2-C8 炔基)、-芳基、-C(O)R “、-OC(O)R “、-C(O)OR “、-C(O)NH2, -C(O)NHR “、-C(O)N(R “ )2、-NHC(O) R〃 ,-SR" ,-SO3R"、-S(O)2R"、-S(O)R"、-OH、_N3、_NH2、_NH(R〃)、_N(R〃)2 禾口 _CN，其中各R"独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。
除非另外说明，否则术语“烯基”和“炔基”是指具有约2到约20个碳原子(和其中的碳原子范围和特定数目的所有组合和子组合)、优选约2到约8个碳原子的直链和分支碳链。烯基链在链中具有至少一个双键，且炔基链在链中具有至少一个三键。烯基的实例包括(但不限于)乙烯(ethylene)或乙烯基、烯丙基、丁烯基、_2_ 丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基和-2，3-二甲基-2-丁烯基。炔基的实例包括(但不限于)乙炔基(acetylenic)、炔丙基、乙炔基(acetylenyl)、 丙炔基、-1- 丁炔基、-2- 丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基和-3-甲基-1- 丁炔基。与烷基一样，烯基和炔基可经取代。“经取代”烯基或炔基是经一个或一个以上如下基团、优选1到3个如下基团(和选自卤素的任何其它取代基)取代的烯基或炔基包括(但不限于)_卤素、-0-(C1-C8烷基)、-0-(C2-C8烯基)、-0-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R ‘、-OC(O)R ‘、-C(0)OR ‘、-C(0)NH2, -C(0)NHR ‘、-C(0)N(R ‘ )2、-NHC(0) R' , -SR'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、= 0、_N3、_NH2、_NH(R ‘ )、_N(R' )2 和-CN，其中各R'独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-ο- (C1-C8 烷基)、-0- (C2-C8 烯基)、-0- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C1-C8 烷基、-C2-C8 烯基和-C2-C8炔基可任选经一个或一个以上如下取代基进一步取代包括(但不限于)-(^-(8烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 炔基、-卤素、-ο- (C1-C8 烷基)、-ο- (C2-C8 烯基)、-O- (C2C8 炔基)、-芳基、-C(O)R “、-OC(O)R “、-C(O)OR “、-C(O)NH2, -C(O)NHR “、-C(O)N(R “ )2、-NHC(O) R〃 ,-SR" ,-SO3R"、-S(O)2R"、-S(O)R"、-OH、_N3、_NH2、_NH(R〃)、_N(R〃)2 禾口 _CN，其中各R"独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。除非另外说明，否则术语“亚烷基”是指具有约1到约20个碳原子(和其中的碳原子范围和特定数目的所有组合和子组合)、优选具有约1到约8个碳原子且具有通过自母烷烃的同一个或两个不同碳原子移除两个氢原子获得的两个单价基团中心的饱和分支链或直链烃基。典型亚烷基包括(但不限于)亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、 亚庚基、亚辛基、亚壬基、亚癸基、1，4_亚环己基等。单独或作为另一基团的一部分的亚烷基可任选经一个或一个以上如下基团、优选1到3个如下基团(和选自卤素的任何其它取代基)取代包括(但不限于)-卤素、-0- (C1-C8烷基)、-0- (C2-C8烯基)、-0- (C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R ‘、-OC(O)R ‘、-C(0)OR ‘、-C(0)NH2, -C(0)NHR ‘、-C(0)N(R ‘ )2、-NHC(0) R' , -SR'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、= 0、_N3、_NH2、_NH(R ‘ )、_N(R' )2 和-CN，其中各R'独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-ο- (C1-C8 烷基)、-0- (C2-C8 烯基)、-0- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C1-C8 烷基、-C2-C8 烯基和-C2-C8炔基可任选经一个或一个以上如下取代基进一步取代包括(但不限于)-(^-(8烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 炔基、-卤素、-0-(C1-C8 烷基)、-ο-(C2-C8 烯基)、-ο-(C2-C8 炔基)、-芳基、-C(O)R “、-OC(O)R “、-C(O)OR “、-C(O)NH2, -C(O)NHR “、-C(O)N(R “ )2、-NHC(O) R〃 ,-SR" ,-SO3R"、-S(O)2R"、-S(O)R"、-OH、_N3、_NH2、_NH(R〃)、_N(R〃)2 禾口 _CN，其中各R"独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。除非另外说明，否则术语“亚烯基”是指含有至少一个碳-碳双键的任选取代的亚烷基。示范性亚烯基包括例如亚乙烯基(-CH = CH-)和亚丙烯基(-CH = CHCH2-)。除非另外说明，否则术语“亚炔基”是指含有至少一个碳-碳三键的任选取代的亚烷基。示范性亚炔基包括例如亚乙炔基(-C ^ C")、炔丙基(-CH2C ^ C")和4-戊炔基(-CH2CH2CH2C = CH-)。除非另外说明，否则术语“芳基”是指具有6到20个碳原子(和其中的碳原子范围和特定数目的所有组合和子组合)且通过自母芳香族环系统的单一碳原子移除一个氢原子获得的单价芳香族烃基。一些芳基在示范性结构中以“Ar”表示。典型芳基包括(但不限于)衍生自苯、经取代苯、苯基、萘、蒽、联苯等的基团。单独或作为另一基团的一部分的芳基可任选经一个或一个以上如下基团、 优选1到5个或甚至1到2个如下基团取代包括(但不限于)_卤素、-C1-C8烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 炔基、-O-(C1-C8 烷基)、-0-(C2-C8 烯基)、-0-(C2-C8 炔基)、-芳基、-C(O)R ‘、-OC(O)R ‘、-C(0)OR ‘、-C(0)NH2, -C(0)NHR ‘、-C(0)N(R ‘ )2、-NHC(0) R' ,-SR' ,-SO3R'、-S(O)2R' ,-S(O)R'、-0H、_N02、-N3、-NH2、-NH(R' )、_N(R' )2iP_CN， 其中各R'独立地选自-H^C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-C1-C8 烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 炔基、0- (C1-C8 烷基)、-0- (C2-C8 烯基)、-0- (C2-C8 炔基)和-芳基可任选经一个或一个以上如下取代基进一步取代包括(但不限于PC1-C8烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 炔基、-卤素、-0-(C1-C8 烷基)、-ο-(C2-C8 烯基)、-ο-(C2-C8 炔基)、-芳基、-C(O)R “、-OC(O)R “、-C(O)OR “、-C(O)NH2, -C(O)NHR “、-C(O)N(R “ )2、-NHC(O) R〃 ,-SR" ,-SO3R"、-S(O)2R"、-S(O)R"、-OH、_N3、_NH2、_NH(R〃)、_N(R〃)2 禾口 _CN，其中各R"独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。除非另外说明，否则术语“亚芳基”是指任选取代的二价芳基(即，通过自母芳香族环系统的同一个或两个不同碳原子移除两个氢原子获得)且可呈如以下结构用苯基作为示范性芳基所示的邻位、间位或对位构型典型"-(C1-C8亚烷基)芳基”、"-(C2-C8亚烯基)芳基”和"-(C2-C8亚炔基)芳基” 包括(但不限于)苯甲基、2-苯基乙-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙-1-基、 2-萘基乙烯-1-基、萘并苯甲基、2-萘并苯基乙-1-基等。除非另外说明，否则术语“杂环”是指至少一个环中的至少一个环原子为选自N、0、 P或S的杂原子的具有3到14个环原子(又称环成员)的单环、双环或多环系统(和其中的碳原子和杂原子范围和特定数目的所有组合和子组合)。杂环可具有1到4个独立地选自N、0、P或S的环杂原子。杂环中的一个或一个以上N、C或S原子可经氧化。单环杂环优选具有3到7个环成员(例如2到6个碳原子和1到3个独立地选自N、0、P或S的杂原子)，且双环杂环优选具有5到10个环成员(例如4到9个碳原子和1到3个独立地选自N、0、P或S的杂原子)。包括杂原子的环可为芳香族或非芳香族环。除非另外说明，否则杂环在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处连接到其侧基。杂环描述于以下文献中帕奎特O^aquette)，“当代杂环化学原理(Principles of Modern Heterocyclic Chemistry) " (W. Α.本杰明(W. A. Benjamin)，纽约，1968)，尤其第 1 章、第3章、第4章、第6章、第7章和第9章；“杂环化合物化学系列丛书(The Chemistryof Heterocyclic Compounds,A series of Monographs) ，，( @草俞 出片反&司，參丑@，1950 年至今)，尤其第13卷、第14卷、第16卷、第19卷和第28卷；和美国化学协会杂志(J. Am. Chem. Soc.) 82 :5566(1960)。除非另外说明，否则术语“杂环”是指任选取代的如上文所定义的二价杂环基团 (即通过自母杂环系统的同一个或两个不同碳原子移除两个氢原子获得)。“杂环”的实例包括(例如且不限于)吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、 噻唑基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、噻萘基、吲哚基、吲哚烯基(indolenyl)、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、批咯啉基、四氢呋喃基、双-四氢呋喃基、四氢吡喃基、双-四氢吡喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、氮杂环庚烷基、三嗪基、6H-1， 2，5-噻二嗪基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、 咕吨基(xanthenyl)、啡噁噻基、2H-吡咯基、异噻唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲嗪基、 异吲哚基、3H-叼丨哚基、IH-叼丨唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4H-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、啡啶基、吖啶基、嘧啶基、啡啉基、啡嗪基、啡噻嗪基、呋咕基(furazanyl)、啡噁嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、 吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、吲哚啉基、异吲哚啉基、奎宁环基(quinuclidinyl)、吗啉基、 噁唑烷基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、羟吲哚基、苯并噁唑啉基和靛红酰基(isatinoyl)。 优选“杂环”基团包括(但不限于)苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基(coumariny 1 )、异喹啉基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基、异噁唑基和四唑基。单独或作为另一基团的一部分的杂环基可任选经一个或一个以上如下基团、优选1到2个如下基团取代包括(但不限于PC1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-0- (C1-C8 烷基)、-0- (C2-C8 烯基)、-O- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C (0) R ‘ >-OC (O)R'、-C (0) OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R' )2、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O) R'、-OH、-N3、-NH2、-NH(R' )、_N(R' )2和义队其中各 R'独立地选自-H、-C1-C8 烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-0-((^-(^烷基)、-0-(C2-C8烯基)、-0- (C2-C8炔基)、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基和-芳基可任选经一个或一个以上如下取代基进一步取代包括(但不限于)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-O- (CfC8 烷基)、-O- (C2-C8 烯基)、-O- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C (0) R 〃、-OC (0) R 〃、-C (0) 0R"、-C(O)NH2、-C(O)NHR"、-C(O)N(R" )2、-NHC(O)R"、-SR"、-SO3R"、-S(O)2R"、-S(O) R"、-OH、-N3 > -NH2, -NH (R ” )、_N(R" )2 和-CN，其中各 R"独立地选自-H、-C1-C8 烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或芳基。举例来说且不限于，碳键接的杂环可在如下位置键接吡啶的位置2、3、4、5或6 ； 哒嗪的位置3、4、5或6 ；嘧啶的位置2、4、5或6 ；吡嗪的位置2、3、5或6 ；呋喃、四氢呋喃、 硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的位置2、3、4或5 ；噁唑、咪唑或噻唑的位置2、4或5 ；异噁唑、吡唑或异噻唑的位置3、4或5 ；氮丙啶的位置2或3 ；氮杂环丁烷的位置2、3或4 ；喹啉的位置2、3、4、5、6、7或8 ；或异喹啉的位置1、3、4、5、6、7或8。碳键接的杂环更通常包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基、 6-哒嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。举例来说且不限于，氮键接的杂环可在如下位置键接氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、 吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、 3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、B引哚、B引哚啉或IH-吲唑的位置1 ；异吲哚或异吲哚啉的位置2 ；吗啉的位置4;和咔唑或β-咔啉的位置9。氮键接的杂环更通常包括1-氮丙啶基、1-氮杂环丁烷基(1-azetedyl)、1_吡咯基、咪唑基、吡唑基和1_哌啶基。除非另外说明，否则术语“碳环”是指具有3到14个环原子(和其中的碳原子范围和特定数目的所有组合和子组合)的饱和或不饱和非芳香族单环、双环或多环系统，其中所有环原子都为碳原子。单环碳环优选具有3到6个环原子，更优选具有5或6个环原子。 双环碳环优选具有7到12个环原子，例如布置成双环W，5]、[5，5]、[5，6]或W，6]系统， 或9或10个环原子布置成双环[5，6]或[6，6]系统。术语“碳环”包括例如与芳环稠合的单环碳环(例如与苯环稠合的单环碳环)。碳环优选具有3到8个碳环原子。单独或作为另一基团的一部分的碳环基团可任选经例如一个或一个以上如下基团、优选1或2个如下基团(和选自卤素的任何其它取代基)取代包括(但不限于)-卤素、-C1-C8 烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 炔基、-ο-(C1-C8 烷基)、-0-(C2-C8 烯基)、-O- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C(O)R ‘、-OC (O)R ‘、-C(O)OR ‘、-C (O)NH2, -C(O) NHR ‘、-C(O)N(R ‘ )2、-NHC(O)R ‘、-SR ‘、-SO3R ‘、-S(O)2R ‘、-S(O)R ‘、-OH、= O、-N3、-NH2、-NH(R' )、-N(R' )2和义队其中各 R'独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-0-(C1-C8烷基)、-ο-(C2-C8烯基)、-ο-(C2-C8炔基)和-芳基可任选经一个或一个以上如下取代基进一步取代包括(但不限于PC1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-ο-(C1-C8烷基)、-0- (C2-C8 烯基)、-O- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C (O)R"、-OC (O)R"、-C (0) OR"、-C (0) NH2、-C(O)NHR “、-C(O)N(R “ )2、-NHC(O)R “、-SR “ , -SO3R “、-S(O)2R “、-S(O) R"、-OH、-N3 > -NH2, -NH (R “ )、_N(R" )2 和-CN，其中各 R"独立地选自-H、-C1-C8 烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。单环碳环取代基的实例包括-环丙基、-环丁基、-环戊基、-1-环戊-1-烯基、-1-环戊-2-烯基、-1-环戊-3-烯基、环己基、-1-环己-1-烯基、-1-环己-2-烯基、-1-环己-3-烯基、-环庚基、-环辛基、-1，3-环己二烯基、-1，4-环己二烯基、-1，3-环庚二烯基、-1,3,5-环庚三烯基和-环辛二烯基。单独或作为另一基团的一部分使用的“碳环”是指任选取代的如上文所定义的二价碳环基团(即通过自母碳环系统的同一个或两个不同碳原子移除两个氢原子获得)。除非上下文另外指定，否则连字符(_)表示与侧位分子的连接点。因此，术语 "-(C1-C8亚烷基)芳基”或"-C1-C8亚烷基(芳基)”是指这样一种如本文所定义的c「c8亚烷基，其中所述亚烷基在所述亚烷基的任一碳原子处连接到侧位分子，且键接到亚烷基的一个碳原子的氢原子中的一者经如本文所定义的芳基置换。当特定基团“经取代”时，所述基团可具有一个或一个以上取代基，优选1到5个取代基，更优选1到3个取代基，最优选1到2个取代基，所述取代基独立地选自取代基清单。然而，所述基团一般具有选自卤素的任何数目的取代基。经取代基团如所示。预期在分子中特定位置处的任何取代基或变量的定义与其在所述分子中别处的
19定义无关。应了解，本发明化合物上的取代基和取代模式可由一般所属领域技术人员选择以提供化学上稳定且易于由此项技术中已知的技术以及本文所述的方法合成的化合物。如本文所用的保护基是指暂时或永久选择性阻断多官能化合物中的一个反应性位点的基团。适用于本发明中的羟基保护基是医药学上可接受的，且可能需要或可能不需要在投予个体后自母化合物裂解以使化合物具有活性。裂解是经由体内的正常代谢过程实现。羟基保护基是此项技术中众所周知的，参见τ. W.格里尼(T.W.Greene)和P. G. M伍兹(P. G.M. Wuts)，有机合成中的保护基(PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS)(约翰威立出版公司，第3版)(以全文引用的方式并入本文中且用于所有目的)，且包括例如醚(例如烷基醚和硅烷基醚，包括例如二烷基硅烷基醚、三烷基硅烷基醚、二烷基烷氧基硅烷基醚)、酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、磺酸酯和磷酸酯保护基。羟基保护基的实例包括(但不限于)甲基醚；甲氧基甲基醚、甲基硫甲基醚、(苯基二甲基硅烷基)甲氧基甲基醚、苯甲氧基甲基醚、对甲氧基苯甲氧基甲基醚、对硝基苯甲氧基甲基醚、邻硝基苯甲氧基甲基醚、 (4-甲氧基苯氧基)甲基醚、愈创木酚甲基醚、叔丁氧基甲基醚、4-戊烯氧基甲基醚、硅烷氧基甲基醚、2-甲氧基乙氧基甲基醚、2，2，2_三氯乙氧基甲基醚、双(2-氯乙氧基)甲基醚、 2-(三甲基硅烷基)乙氧基甲基醚、甲氧基甲基醚、四氢吡喃基醚、1-甲氧基环己基醚、4-甲氧基四氢硫吡喃基醚、4-甲氧基四氢硫吡喃基醚S，S-二氧化物、1-[(2_氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基醚、1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基醚、1，4- 二噁烷-2-基醚、四氢呋喃基醚、四氢硫呋喃基醚；经取代乙基醚，例如1-乙氧基乙基醚、1-(2-氯乙氧基)乙基醚、1-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]乙基醚、1-甲基-1-甲氧基乙基醚、1-甲基-1-苯甲氧基乙基醚、1-甲基-1-苯甲氧基-2-氟乙基醚、1-甲基-1苯氧基乙基醚；2-三甲基硅烷基醚、叔丁基醚、烯丙基醚、炔丙基醚、对氯苯基醚、对甲氧基苯基醚、苯甲基醚、对甲氧基苯甲基醚、3，4_ 二甲氧基苯甲基醚、三甲基硅烷基醚、三乙基硅烷基醚、三丙基硅烷基醚、二甲基异丙基硅烷基醚、二乙基异丙基硅烷基醚、二甲基己基硅烷基醚、叔丁基二甲基硅烷基醚、二苯基甲基硅烷基醚、苯甲酰基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯基乙酸酯、苯甲酸酯、碳酸烷酯甲酯、碳酸烷酯9-芴基甲酯、碳酸烷酯乙酯、碳酸烷酯2，2，2，-三氯乙酯、碳酸1，1，-二甲基-2，2，2-三氯乙酯、烷基磺酸酯、甲烷磺酸酯、苯甲基磺酸酯、甲苯磺酸酯、亚甲基缩醛、亚乙基缩醛和叔丁基次甲基缩酮。优选保护基由下式表示-R、-Si(R) (R) (R),-C(O) R、-C (0) OR、-C (0) NH(R)、-S (0) 2R、-S (0) 20H、P (0) (OH) 2 和-P (0) (OH) 0R，其中 R 为 C1-C20 烷 S > C2-C20烯基、C2-C2tl炔基、-c「c2Q亚烷基(碳环)、-C2-C^1亚烯基(碳环)、-C2-C^1亚炔基 (碳环)、-C6-C10芳基、-C1-C2tl亚烷基(芳基)、-C2-C20亚烯基(芳基)、-C2-C20亚炔基(芳基)、-C1-C2tl亚烷基(杂环)、-C2-C20亚烯基(杂环)或-C2-C2tl亚炔基(杂环)，其中单独或作为另一基团的一部分的所述烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、芳基、碳环和杂环基任选经取代。缩写“AFP”是指二甲基缬氨酸-缬氨酸-多拉索因(dolaisoleuine)-多拉普因 (dolaproine)-苯丙氨酸-对苯二胺(参见下文式(XVIII))。缩写“MMAE”是指单甲基奥瑞他汀E(monomethyl auristatin Ε)(参见下文式 (XIII))。缩“ΑΕΒ”是指通过使奥瑞他汀E(auristatin E)与对乙酰基苯甲酸反应产生的酯(参见下文式(XXII))。缩写“AEVB”是指通过使奥瑞他汀E与苯甲酰基戊酸反应产生的酯(参见下文式 (XXIII))。缩写“MMAF”是指单甲基奥瑞他汀F (参见下文式(XXI))。Si^在某些方面中，本发明涉及具有例如表1和2中概述的特征的抗GCC抗体分子。在其它方面中，本发明涉及具有例如表3、4、5和/或6中概述的特征的抗GCC抗体分子。在一个实施例中，抗GCC抗体分子是人类杂交瘤抗体，且为抗体5F9、5H3、6H8、 8C2、10C10、10D3和1D3中一者。在一个实施例中，抗GCC抗体分子来源于抗体5F9、5H3、 6H8、8C2、10C10、10D3或1D3。在一个实施例中，抗GCC抗体分子是由杂交瘤5F9 (PTA-8132) 产生。在一个实施例中，抗GCC抗体分子为选择的淋巴细胞抗体，且为抗体Abx-12、 Abx-020、Abx-106、Abx-198、Abx-221、Abx-229、Abx-338 和 Abx-393 中一者。在一个实施例中，抗 GCC 抗体分子来源于抗体 Abx-12、Abx-020、Abx-106、Abx-198、Abx-221、Abx-229, Abx-338 和 Abx-393。在一个实施例中，抗GCC抗体分子为鼠类抗体，且为抗体mAb 3G1、mAb 8E12、 mAblOB8和mAb 8F1中一者。在一个实施例中，抗GCC抗体分子来源于抗体mAb 3G1、mAb 8E12 和 mAb 8F1。在一个实施例中，抗GCC抗体分子对于GCC的亲和力(例如，如由直接结合或竞争结合分析所测量)将在本文所述的范围内。在一个实施例中，抗GCC抗体分子的Kd小于 1 X 10 小于 1 X IO^7M,小于 1 X 1(Γ8Μ，小于 1 X 10、，小于 1 X IO^10M,小于 1 X IO^11M,小于 1 X IO-12M或小于1 X IO-13M0在一个实施例中，抗体分子为IgG或其抗原结合片段，且Kd小于 1Χ10_6Μ，小于1Χ1(ΓΜ，小于1Χ10_%或小于1X101。在一个实施例中，抗GCC抗体分子 (例如5F9抗体或来源于其的抗体)的Kd为约80到约200ρΜ，优选为约100到约150ρΜ或约120ρΜ。在一个实施例中，抗GCC抗体分子(例如5F9抗体或来源于其的抗体)的ka为约 0. 9到约1. 25 X IO5M-1S-1,优选为约1. 1 XIOVs^10在一个实施例中，抗体分子为ScFv，且Kd 小于 1 X 1(Γ6Μ，小于 1 X IO^7M,小于 1 X 10、，小于 1 X 1(Γ9Μ，小于 1 X IO^10M,小于 1 X IO^11M, 小于 1 X KT12M 或小于 1 X IO^13Mo在实施例中，抗体分子不为免疫偶联物，即为“裸”抗体，且在实施例中在结合于 GCC时引起细胞反应。在相关实施例中，细胞反应是由抗体所结合的GCC表达细胞执行。所述细胞反应可为由GCC介导的信号转导，例如在抗体分子为GCC的激动剂的情况下(参见例如美国专利申请公开案第US20040258687号)。在其它实施例中，细胞反应是由识别结合于第一细胞上的GCC的抗体分子的第二细胞(例如免疫效应细胞，例如自然杀手细胞)执行。在一些实施例中，监视分子(surveillance molecule)，例如补体分子，接触结合GCC的抗体分子，随后发生细胞反应。这些实施例中的细胞反应可导致GCC表达细胞死亡。在其它实施例中，作为免疫偶联物的抗体分子可在结合于GCC时引起细胞反应， 且内在化以向其所结合的GCC表达细胞传递药剂。在一些实施例中，本发明的抗GCC抗体分子可阻断配体结合于GCC。在一个实施例中，抗GCC抗体分子不能显示与大鼠GCC和小鼠GCC中的一者或两者的实质交叉反应。在一个实施例中，抗体分子不为GCC:B10、GCC:4D7或GCC:C8。在另一个实施例中，抗GCC抗体分子不结合GCC的细胞内结构域，即SEQ ID NO :2 的约氨基酸残基455到 1073。举例来说，在此实施例中，抗GCC抗体分子不结合GCC的激酶同源结构域或鸟苷酸环化酶结构域。天然存在的哺乳动物抗体结构单元通常为四聚体。各四聚体是由两对多肽链构成，每一对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包括具有约100到110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。各链的羧基末端部分界定主要负责效应功能的恒定区。人类轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、Υ、α或ε重链，且抗体同型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区由具有约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，其中重链还包括具有约10个或更多个氨基酸的“D”区。一般参见基础免疫学(Fundamental Immunology)第 7章(保罗W. (Paul, W.)编，第2版，瑞文出版社(Raven Press)，纽约(1989))。每一轻链 /重链对的可变区形成抗体结合位点。抗GCC抗体分子的优选同型为IgG免疫球蛋白，其可分类成具有不同Y重链的4个子类IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。大多数治疗性抗体为IgGl 型的人类、嵌合或人源化抗体。在一个特定实施例中，抗GCC抗体分子具有IgGl同型。每一重链和轻链对的可变区形成抗原结合位点。因此，完整IgG抗体具有两个相同的结合位点。然而，双功能或双特异性抗体为人造杂交构筑体，其具有两个不同的重链/ 轻链对，从而产生两个不同的结合位点。所述链都展现相对保守的框架区(FR)由三个高变区(又称互补决定区或CDR)接合的相同一般结构。各对的两条链的CDR由框架区对准，从而能够结合于特定表位。从N末端到C末端，轻链与重链包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。根据如下参考文献的定义将氨基酸分配于各结构域卡贝特的免疫相关蛋白质序列(Kabat Sequences of Proteins of Immunological hterest)(马里兰州贝赛思达市国家卫生研究院(National Institutes of Health, Bethesda, Md.) (1987 和 1991)),或查塞(Chothia)和赖斯克 (Lesk)分子生物学杂志(J. Mol. Biol. ) 196 :901-917(1987)；查塞等人，自然(Nature) 342 878-883(1989)。如本文所用，重链和轻链的CDR分别称为(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和(LCDR1、 LCDR2、LCDR3)。抗GCC抗体分子可包含上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者的重链和轻链中一者或两者的CDR的全部或抗原结合子集。人类杂交瘤、所选淋巴细胞和鼠类抗体部分(包括可变区和CDR)的氨基酸序列可见于表3和表5。因此，在一个实施例中，抗体分子包括以下一者或两者(a)上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者的一个、两个、三个或抗原结合数量的轻链⑶R0XDR1、IXDR2和/或IXDR3)。在实施例中，⑶R可包含如下IXDR1-3 中一者或一者以上或全部的氨基酸序列IXDR1，或经修饰IXDR1，其中一到七个氨基酸经保守取代)；LCDR2，或经修饰LCDR2，其中一个或两个氨基酸经保守取代)；或者LCDR3或经修饰LCDR3，其中一个或两个氨基酸经保守取代；和(b)上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者的一个、两个、三个或抗原结合数量的重链CDR(HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)。在实施例中，CDR可包含如下HCDR1-3中一者或一者以上或全部的氨基酸序列HCDR1，或经修饰HCDR1，其中一个或两个氨基酸经保守取代；HCDR2，或经修饰HCDR2，其中一到四个氨基酸经保守取代；或者HCDR3，或经修饰HCDR3，其中一个或两个氨基酸经保守取代。适用于产生抗GCC抗体的免疫原包括GCC (例如人类GCC)表达细胞(例如肿瘤细胞系，例如T84细胞，或新鲜或冷冻的结肠肿瘤细胞 ’表达GCC的重组细胞)；GCC表达细胞的膜部分(例如结肠肿瘤细胞系，例如T84细胞，或新鲜或冷冻的结肠肿瘤细胞；表达GCC 的重组细胞，例如表达全长GCC的HT-29-GCC#2细胞，或表达GCC的一部分的重组细胞，例如表达包含GCC细胞外结构域(例如SEQ ID NO :318)的一部分的CHO GCC#27细胞)；经分离或纯化的GCC，例如人类GCC蛋白(例如以生物化学方式分离的GCC，例如自表达GCC 或其变体的胃肠肿瘤细胞或重组细胞分离)或其部分(例如GCC的细胞外结构域、GCC的激酶同源结构域、或GCC的鸟苷酸环化酶催化结构域，或对应于其部分的肽，例如包含SEQ ID
的至少约8、10、12、14、16、20、24、沘或32个氨基酸残基)；或包含SEQ ID NO :229 或包含其成熟部分且无信号序列(即无SEQ ID NO 229的氨基酸残基1到约21或23)的免疫原，例如成熟T0K107-hIgG蛋白，SEQ ID NO :317。免疫原可与异源序列融合以有助于生物化学操作、纯化、免疫或抗体效价测量。所述免疫原可包含GCC的一部分，例如细胞外结构域，以及包含非GCC多肽的部分。有多种选择可用于构建融合蛋白以便利纯化或固定于固体支撑物(例如亲和柱或微量滴定板，或其它适合的分析衬底/芯片)上。举例来说，融合部分可添加结构域，例如谷胱甘肽-S-转移酶/激酶(GST)，其可结合谷胱甘肽；免疫球蛋白的Fc区，其可结合于蛋白质A或蛋白质G ；氨基酸残基，例如两个、三个、四个、五个、优选六个组氨酸残基，其可结合亲和柱上的镍或钴；表位标签，例如c-myc致癌基因的一部分(myc标签)、FLAG标签(美国专利第 4，703, 004号)、血凝素(HA)标签、T7基因10标签、V5标签、HSV标签或VSV-G标签，其可结合标签特异性抗体；或辅因子，例如生物素，其可结合抗生蛋白链菌素。包含免疫球蛋白的Fc部分的免疫原可使在溶液中或附着于细胞的GCC保持允许宿主免疫监视组分在结构上接近GCC表位的构型以便有效产生抗体。因为包含Fc区的免疫球蛋白重链经由链间二硫键缔合成二聚体，所以由与Fc区融合产生的免疫原为二聚体。 融合蛋白的价态可反映提供Fc区的免疫球蛋白的类型。举例来说，与IgG蛋白形成的融合物可为二聚体，IgA融合物可制备四聚免疫原，且IgM融合物可制备十聚免疫原，后两者易于通过共转染J链获得。Fc融合蛋白的示范性免疫球蛋白为IgGl。所用部分通常具有由单一外显子编码的IgGl铰链、CH2和CH3结构域。因为此外显子也具有CHl区的一部分， 其具有经定向以与轻链的半胱氨酸形成二硫键的半胱氨酸，所以适用的修饰是使CHl半胱氨酸突变为例如丝氨酸以确保融合蛋白中不存在未配对的半胱氨酸。这种突变也增加了铰链的柔性。用于与免疫原融合以在宿主物种(例如小鼠、大鼠、兔、山羊)中进行免疫的来源于非宿主物种的Fc部分(例如人类Ig Fc区)可起辅助作用。此辅助功能可引发针对Fc 与GCC表位的特异性抗体。在筛选期间可鉴别且去除Fc反应性抗体。Fc部分可具有野生型序列或经突变以改变效应功能的序列。举例来说，可将突变的恒定区(变体)并入融合蛋白中以使与Fc受体的结合和/或固定补体的能力减到最小(参见例如维特(Winter)等人，GB 2，209, 757B ；莫里森(Morrison)等人，WO 89/07142 ；摩根(Morgan)等人，WO 94/29351)。在一个优选实例中，使根据Fc区标准物编号的赖氨酸235和甘氨酸237突变为例如丙氨酸。具有突变Fc的IgG的免疫原/融合蛋白可具有减小的与宿主中Fc受体的相互作用。一种优选的可溶性免疫原融合蛋白(在成熟以裂解信号肽和分泌之后)为T0K-107-hIgG (又名tiGCC-ECD/hlgGlFc)，其由SEQ ID NO :2 的氨基酸残基M到430与突变的人类IgGl免疫球蛋白Fc(SEQ ID NO :317)融合而组成。为制备细胞表达的免疫原，免疫球蛋白部分可进行结构化以模拟B细胞受体的免疫球蛋白部分。举例来说，免疫球蛋白Fc区可进一步与包含免疫受体(例如Fcy受体、 Fca受体、Fca/μ受体或Fce受体)跨膜区的多肽融合。如果表达免疫原融合蛋白的细胞进一步包含抗原受体复合物(例如B细胞IgM受体或IgD受体)的其它组分，那么可改良充分暴露于细胞表面上的所述Fc受体细胞结合的免疫原的适当定向。所述复合物的适合组分包括免疫球蛋白(Ig)鞘蛋白，例如MB-I和B29(CD79A和CD79B;霍姆贝奇(Hombach) 等人，欧洲免疫学杂志(Eur. J. Immunol.) 20 :2795-2799 (1990)，对于IgM受体)，其形成杂二聚体。Ig鞘蛋白可由转染细胞内源性产生，例如，如果转染B细胞淋巴瘤细胞系的话；或通过共转染例如在单独载体中或在同一载体中的免疫原与鞘蛋白来提供。用于在小鼠中进行免疫的优选IgG鞘蛋白为小鼠⑶79a和⑶79b (基因库寄存编号分别为NM_007655和 NM_008339)。优选细胞结合的免疫原融合蛋白(在成熟以裂解信号肽和转位到细胞表面后)为TOKlll产物，其由T0K-107hIgG(hGCC-ECD/hIgGlFc)与小鼠IgG^i(例如基因肽寄存编号AAB59661)跨膜和细胞内结构域(SEQ ID NO :318)融合而组成。可结合本文所述的抗GCC抗体分子(例如单克隆抗体、人类抗体或人源化抗体) 的来自GCC分子的适用表位(例如参考表位)可在GCC的细胞外部分上发现。所述GCC表位可结合细胞表面上(例如细胞外部上)的抗体分子。举例来说，用于抗GCC抗体分子的表位可存在于以下中或包括来自以下的残基 SEQ ID NO :2 的残基1-50，或其结合本发明抗GCC抗体分子的片段，例如其5F9结合片段。所述片段可包含 SEQ ID NO :2 的残基 1-25、5-30、10-35、15-40、20-45、25-50、5-45、 10-40、15-35、20-30或33-50。在一些实施例中，用于抗GCC抗体分子(例如5F9抗体)的表位为构象表位，其进一步包含GCC氨基酸序列中残基50以外(即选自SEQ ID NO 228的约残基50到1073)的一个或一个以上其它氨基酸残基。在另一实例中，用于抗GCC抗体分子的表位可存在于以下中或包括来自以下的残基SEQ ID N0:225，或SEQ ID NO :2 的残基271-300，或其结合本发明抗GCC抗体分子的片段，例如其ABX-198、3G1、8F1或10B8结合片段。所述片段可包含SEQ ID NO :2 的残基 281-290,或SEQ ID NO 228的残基沘1_290 (其中残基281为亮氨酸)，或SEQ ID NO 228 的残基观1_300或残基27H90。在一些实施例中，用于抗GCC抗体分子(例如ABX-198、 3G1、8F1或10B8抗体)的表位为构象表位，其进一步包含一个或一个以上其它氨基酸残基， 即GCC氨基酸序列中的非SEQ ID NO :225残基，例如选自SEQ ID NO :2 的约残基1到270 和/或约301到1073者。在另一实例中，用于抗GCC抗体分子的表位可存在于以下中或包括来自以下的残基SEQ ID NO :2 ，或SEQ ID NO :2 的残基351-375，或其结合本发明抗GCC抗体分子的片段，例如其ABX-012、ABX-338或ABX-106结合片段。所述片段可包含SEQ ID NO :2 的 356-370，或 SEQ ID NO :2 的残基；351-370，或 SEQ ID NO :2 的残基 356-375。在一些实施例中，用于抗GCC抗体分子(例如ABX-012、ABX-338或ABX-106抗体)的表位为构象表位，其进一步包含一个或一个以上其它氨基酸残基，即GCC氨基酸序列中的非SEQ ID NO 226残基，例如选自SEQ ID NO 228的约残基1到350和/或约376到1073者。针对所述表位或细胞外结构域(例如存在于以下中或包括来自以下的残基的表位SEQ ID NO 228的氨基酸残基M到420或其参考部分，例如GCC的残基M到75、75到 150、150到225,225到300,300到375或375到420)产生的抗体或来源于其的抗体分子可适用作如本文所述的治疗性或诊断抗体。在一个实施例中，抗GCC抗体分子具有一个或一个以上以下特性a)其与表1和2中概述的上述抗GCC抗体分子(例如人类杂交瘤抗体(例如5F9)、 所选淋巴细胞抗体(例如Abx-229)或鼠类抗体(例如3G1))中一者竞争结合，例如结合于细胞表面GCC或经纯化GCC ；b)其与表1和2中概述的上述抗GCC抗体分子(例如人类杂交瘤抗体(例如5F9)、 所选淋巴细胞抗体(例如Abx-229)或鼠类抗体(例如3G1))中一者结合于GCC上的相同或实质上相同的表位。在一个实施例中，如由一种或一种以上肽阵列分析法或通过结合于在细胞表面或膜制剂上表达的截短突变体、嵌合体或点突变体(例如，这些分析法如本文所述)所确定，所述抗体结合相同表位；c)其结合于如下表位，所述表位具有至少1、2、3、4、5、8、10、15或20个邻接氨基酸残基与表1和2中概述的上述抗GCC抗体分子(例如人类杂交瘤抗体(例如5F9)、所选淋巴细胞抗体(例如Abx-229)或鼠类抗体(例如3G1))中一者的表位相同；d)其结合人类GCC中由本发明抗GCC抗体结合的区域，其中所述区域(例如细胞外或细胞质区)的长度为10-15、10-20、20-30或20-40个残基，且结合是例如通过结合于截短突变体来确定；在一个实施例中，抗GCC抗体分子结合人类GCC的细胞外区。在一个实施例中，抗GCC抗体分子可结合人类GCC中由SEQ ID NO :2 的氨基酸残基M到420界定的细胞外结构域部分。在一个实施例中，抗GCC抗体分子可结合在SEQ ID NO :2 的氨基酸残基931到％4处的鸟苷酸环化酶特征位点；或e)其结合于本文所述的参考表位。在一个实施例中，抗GCC抗体分子结合GCC序列ILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLT LS(SEQ ID NO :225)。 在一个实施例中，抗GCC抗体分子结合GCC序列FAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDV (SEQ ID NO 226)。在一个实施例中，抗体分子结合构象表位。在其它实施例中，抗体分子结合线性表位。抗GCC抗体分子可为多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、嵌合抗体(参见美国专利第6，020，153号)或人类或人源化抗体，或其抗体片段或衍生物。本发明也涵盖前述任一者的合成和遗传工程改造的变体(参见美国专利第6，331，415号)。单克隆抗体可通过多种技术制备，包括常规鼠类单克隆抗体方法，例如科勒(Kohler)和米尔斯坦 (Milstein)，自然256 :495(197 的标准体细胞杂交技术。一般说来，参见哈洛E.和莱恩 D. (1988)抗体实验指南，冷泉港实验出版社，纽约冷泉港。用蛋白质(例如GCC或可溶性部分，或包含GCC的一部分的融合蛋白(例如T0K107_hIg)，或细胞或来源于其的膜部分(例如表达表面暴露的GCC的细胞)或其部分 (例如PLKT0K4产物或pLKTOKlll产物))免疫可用制备用于以诱导反应的方式(例如在佐剂，例如完全傅氏佐剂(complete Freund' s adjuvant)存在下)注射的免疫原执行。其它适合的佐剂包括TITERMAXGOLD 佐剂(赛特斯公司(CYTRX Corporation)，加利福尼亚州洛杉矶(Los Angeles, CA))和矾。小肽免疫原可连接到较大分子(例如匙孔螺血氰蛋白(keyhole limpet hemocyanin))。小鼠可以多种方式(例如皮下、静脉内或肌肉内) 在多个部位(例如在腹膜中(i. P.)、尾基部或足垫中，或部位的组合，例如腹膜中和尾基部 (BIP))注射。增强注射可包括相同或不同免疫原且可另外包括佐剂，例如不完全傅氏佐剂 (incomplete Freund' s adiuvant)。用DNA (例如编码GCC或其部分或者包含GCC或其部分的融合蛋白(例如编码T0K107-hIg)的DNA)免疫可使用基因枪技术进行注射。举例来说，将DNA装载于微观金粒子上且经短期以频繁的时间间隔注射到小鼠中。一般说来，如果需要单克隆抗体，就通过将来自永生细胞系(例如骨髓瘤细胞系， 例如SP2/0、P3X63Ag8. 653或杂骨髓瘤)的适合细胞与抗体产生细胞融合来制备杂交瘤。 抗体产生细胞可自人类、人类抗体转基因动物或用相关抗原免疫的其它适合动物的周边血液或优选脾或淋巴结获得。产生人类起源的抗体(例如人类抗体)的细胞可使用适合方法制备，例如使人类抗体产生细胞与杂骨髓瘤或三体杂交瘤融合，或经由用艾伯斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus)感染对活化的人类B细胞进行永生化。(参见例如美国专利第6，197，582号(特克特(Trakht))；尼德贝拉(Niedbala)等人，杂交瘤(Hybridoma), 17 :299-304(1998)；泽尼拉(Zanella)等人，免疫法杂志(J Immunol Methods), 156 205-215(1992)；古斯塔夫松(Gustafsson)等人，人类抗体与杂交瘤(Hum Antibodies Hybridomas)，2 :26-32 (1991)。)融合或永生化的抗体产生细胞(杂交瘤)可使用选择性培养条件分离，且通过限制稀释进行克隆。产生具有所需特异性的抗体的细胞可使用适合分析(例如ELISA(例如用固定于微量滴定孔上的免疫原，例如T0K107-hIgG)或通过对表达GCC或其部分的细胞，例如表达pLKTOKlll产物的细胞进行FACQ鉴别。举例来说，如果GCC-免疫原包含作为亲和试剂的融合部分，那么此部分可允许包含GCC或其部分的融合蛋白结合于基质，例如涂布蛋白质G、涂布抗生蛋白链菌素、经谷胱甘肽衍生化或涂布抗体的微量滴定板或分析芯片，随后将其与免疫血清或来自杂交瘤或抗体表达重组细胞的条件培养基组合，且在有助于复合物形成的条件(例如在盐和PH值的生理条件)下培育混合物。培育之后，洗涤微量滴定板孔或芯片单元以移除任何未结合组分且测量抗GCC抗体的
纟口口。在实施例中，为进行治疗性应用，本发明的抗体为人类或人源化抗体。人类或人源化抗体的优势在于其潜在地降低或消除抗体在宿主接受者中的免疫原性，由此允许增加生物利用率且降低不利免疫反应的可能性，从而潜在地使得能够进行多次抗体投予。经修饰抗体包括人源化、嵌合或CDR移植抗体。人类抗小鼠抗体(HAMA)反应导致产生嵌合或人源化抗体。尽管嵌合抗体具有人类恒定区和鼠类可变区，但预期将会观测到某些人类抗嵌合抗体(HACA)反应，尤其在抗体的长期或多剂量利用中。所述鼠类或大鼠来源的蛋白质的存在可能导致抗体快速清除或可导致患者产生针对抗体的免疫反应。为避免利用鼠类或大鼠来源的抗体，已开发将序列引入抗体序列以使抗体更接近人类抗体序列的人源化抗体或通过在啮齿动物中引入人类抗体功能而产生的完全人类抗体，以使啮齿动物将产生具有完全人类序列的抗体。人类抗体避免了与具有鼠类、兔或大鼠可变区和/或恒定区的抗体有关的某些问题。人类抗体完全人类抗体分子可使小鼠mAb或小鼠来源的mAb所固有的免疫原性和过敏反应减到最少，并由此增加所投予抗体的功效和安全性。使用完全人类抗体分子可在治疗需要重复投予抗体的慢性和复发性人类疾病(例如发炎、自体免疫性和癌症)中提供相当大的优势。另外，人类抗体分子可使用遗传工程改造的动物品系制备，其中动物的抗体基因表达被抑制且在功能上用人类抗体分子基因表达置换。用于制备人类抗体的方法是此项技术中已知的。一种用于制备人类抗体的方法使用转基因动物(例如转基因小鼠)。这些转基因动物含有产生人类抗体的基因组的相当大的部分，例如可进行功能性重排，插入其自身基因组中的人类免疫球蛋白基因座，且在抗体产生时使动物自身的内源性抗体产生缺乏。用于制备所述转基因动物的方法是此项技术中已知的。所述转基因动物可使用XEN0M0USE 技术或通过使用“微基因座(minilocus)”法制备。用于制备XEN0MICE 的方法描述于美国专利第6，162，963号、第6，150，584号、第 6，114，598号和第6，075，181号中，所述专利以引用的方式并入本文中。使用“微基因座” 法制备转基因动物的方法描述于美国专利第5，545, 807号、第5，545, 806号和第5，625，825 号中；也参见国际公开案第W093/12227号，所述文献各自以引用的方式并入本文中。其它转基因人类抗体产生小鼠包括HUMAB-MOUSE 、KIRIN TC MOUSE 转染色体小鼠、 KM- MOUSE (麦德瑞斯公司(MEDAREX)，新泽西州普林斯顿(I^rinceton，NJ))。 使用人类抗体转基因动物技术(例如XEN0M0USE 技术)，可通过用相关抗原免疫 XENOMOUSEtsMh^ (艾伯吉尼斯公司，加利福尼亚州佛力蒙)来获得人类抗体。自表达抗体的小鼠回收(例如自脾组织分离)淋巴细胞(例如β细胞)。可使用标准方法将这些回收的细胞与骨髓型细胞系融合以制备永生杂交瘤细胞系。可对这些杂交瘤细胞系进行筛选和选择以鉴别产生对相关抗原具特异性的抗体的杂交瘤细胞系。人类抗体转基因动物提供可富集编码具有所需特性(例如特异性和亲和力)的抗体的核酸的核酸来源。举例来说，可自已用GCC蛋白或其变体或部分免疫的人类抗体转基因小鼠分离编码抗体或抗体可变区的核酸。分离的核酸或其部分(例如编码可变区、CDR、 框架区的部分)可使用任何适合方法(例如噬菌体呈现)表达，以产生富集结合GCC蛋白的抗体或抗原结合片段的抗体或抗体的抗原结合片段(例如单链抗原结合片段、双链抗原结合片段)的文库。相对于经免疫的人类抗体转基因动物中所产生的抗体谱系，所述文库可展现增强的多样性(例如经由重链可变区与轻链可变区配对产生的组合多样性)。文库可使用任何适合的分析(例如GCC蛋白结合分析)进行筛选以鉴别具有所需特性(例如特异性、亲和力)的抗体或抗原结合片段。编码具有所需特性的抗体或抗原结合片段的核酸可使用任何适合方法回收。(参见例如美国专利第5，871，907号(维特等人)和美国专利第 6，057，098 号(布奇勒(Buechler)等人)。)或者，抗体可在除杂交瘤细胞系外的细胞系中表达。更具体说来，可自产生抗体的细胞克隆编码特定抗体的序列，且用于转化适合的哺乳动物宿主细胞。在一种优选方法中， 自经免疫小鼠分离所述小鼠的脾和/或淋巴结淋巴细胞，且如先前在巴布库克(Babcook) 等人，美国国家科学院院刊，93 :7843-8(1996)(其以引用的方式并入本文中)中所述涂于斑块分析中。简单说来，将细胞涂于含有绵羊红细胞且用GCC抗原涂布的琼脂中，且分泌针对GCC抗原的mAb的细胞将固定补体且溶解紧邻mAb产生细胞周围的红细胞。将透明斑块内的细胞挑出以进行免疫球蛋白序列定序且亚克隆到表达载体中。随后通过ELISA且对于结合于细胞通过流式细胞术筛选含有GCC特异性mAb的经短暂转染细胞的上清液。所产生人类抗体的包含结合特定表位的CDR的可变序列或其部分可用于制备修饰的抗体。举例来说，可将所产生抗体的可变区拼接到表达盒中以便于转移构筑体、增加构筑体的表达和/ 或将构筑体并入能够表达全长抗体的载体中，参见例如US20060147445。在一个特定实施例中，表达盒包含IgGl同型的重链恒定区。也可使用选择淋巴细胞抗体法(SelectedLymphocyte Antibody Method, SLAM ；参见美国专利第5，627，052号，巴布库克等人，美国国家科学院院刊，93 7843-7848(1996))来鉴别可提供相关抗体的细胞。在SLAM中，直接培养B细胞，由此绕过通常仅捕捉低百分比的由小鼠最初产生的抗体的杂交瘤技术。使用基于微板的分析，可经数天的时间快速分析B细胞。通常，鉴别出数千个抗原反应性细胞克隆，代表数千个个别抗原特异性(例如GCC特异性)单克隆抗体。通常使单一实验中鉴别出的不同抗原反应性单克隆抗体的数目增加许多倍。在应用其它基于微板的快速分析测量抗体且通过亲和力和功能对抗体进行分级之后，可选择产生极高质量抗体的个别B细胞克隆。另外，通过绕过杂交瘤产生步骤，制备可快速进入重组体制造细胞系。分离使用所述技术选择的个别B细胞且可将抗体基因直接引入制造细胞系中。所得细胞系可随后经与杂交瘤细胞系产生所需基本上相同的时间进行发展以用于临床试验测试。人类mAb 5F9 (IgG2，κ )可由杂交瘤5F9产生，杂交瘤5F9又称杂交瘤 46. 5F9. 8. 2，其在 2007 年 1 月 10 日以千年制药公司(Millennium Pharmaceuticals Inc.) (美国马萨诸塞州剑桥市兰斯唐大街40号，02139 QOLandsdowne Street, Cambridge, ΜΑ,02139, USA))的名义以寄存编号PTA-8132寄存于美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)(美国弗吉尼亚州马纳萨斯市大学大道10801号，20110 (10801 University Boulevard,Manassas,Virginia 20110,U. S. Α.)) (所述寄存是根据国际承认用于专利程序目的的微生物寄存布达佩斯条约(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure)进行且满足所述条约。)本发明涉及杂交瘤5F9、其产生的抗体、其抗原结合片段以及编码所述抗体和其部分(例如重链、重链可变区、轻链、轻链可变区、CDR)的核酸。如本文所述，杂交瘤5F9产生IgG2 κ抗体。抗体的人源化和呈现技术以及修饰如上所述，宜制备具有降低的免疫原性的抗体。此可结合使用适当文库的人源化和呈现技术来完成。应了解，鼠类抗体或来自其它物种的抗体可使用此项技术中已知的技术进行人源化或灵长类化(primatized)。参见例如维特和哈里斯(Harris)，今日免疫学(Immunol Today) 14 :43-46 (1993)，以及怀特(Wright)等人，免疫学评论综述(Crit. Reviews in Immunol.) 12125-168 (1992)。相关抗体可通过重组DNA技术进行工程改造以用相应人类序列取代CHl、CH2、CH3、铰链结构域和/或框架结构域(参见WO 92/02190 以及美国专利第5，530，101号、第5，585, 089号、第5，693，761号、第5，693，792号、第 5，714，350号和第5，777，085号)。另外，使用Ig cDNA来构建嵌合免疫球蛋白基因是此项技术中已知的(刘(Liu)等人，美国国家科学院院刊，84:3439(1987)，和免疫学杂志 (J. Immunol.) 139 :3521 (1987))。自杂交瘤或产生抗体的其它细胞分离mRNA且用于产生 cDNA 相关cDNA可通过聚合酶链反应使用特定引物进行扩增(美国专利第4，683，195号和第 4，683，202 号)。或者，可使用噬菌体呈现技术(参见例如麦卡夫提(McCafferty)等人，自然， 348 :552-553(1990)),由例如来自未免疫供体的谱系的免疫球蛋白可变(V)结构域基因在体外制备人类抗体和抗体片段。根据此技术，使抗体V结构域基因同框克隆到丝状噬菌体(例如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，且以功能性抗体片段形式呈现于噬菌体粒子的表面上。由于丝状粒子含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，故基于抗体的功能特性进行的选择也使得可选择编码展现所述特性的抗体的基因。因此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。可以多种格式进行噬菌体呈现；关于其评述参见例如琼森(Johnson)和克利斯维尔(Chiswell)，结构生物学新观点(Current Opinion in Structural Biology) ,3 564-571(1993)。V基因区段的若干来源可用于噬菌体呈现。克拉克森(Clackson)等人，自然352 =624-628(1991)自来源于经免疫小鼠的脾的V基因的小随机组合文库分离出不同抗噁唑酮抗体阵列。可构建未免疫人类供体的V基因的谱系，且可基本上按照马克斯(Marks) 等人，分子生物学杂志(J. MoI. Biol. ),222 :581-597(1991)或格里夫斯(Griffith)等人， 欧洲分子生物学学会杂志(ΕΜΒ0 J.), 12 :725-734(1993)所述的技术分离针对不同抗原 (包括自体抗原)阵列的抗体。也参见美国专利第5，565，332号和第5，573，905号。呈现文库可含有包含人工氨基酸序列的抗体或抗体的抗原结合片段。举例来说，文库可含有 Fab片段，其含有人工CDR(例如随机氨基酸序列)和人类框架区。(参见例如美国专利第 6，300，064 号(克纳皮克(Knappik)等人)。)人类抗体也可由体外活化的B细胞产生(参见美国专利第5，567，610号和第 5，229，275 号)。人类恒定区基因的序列可见于卡贝特等人，(1991)免疫相关蛋白质序列， N. I. H.出版号91-3242中。人类C区基因易于自已知克隆获得。同型的选择受所需效应功能影响，例如补体固定，或在抗体依赖性细胞毒性中的活性。同型可为IgGl、IgG2、IgG3 或IgG4。在特定实施例中，本发明的抗体分子为IgGl和IgG2。可使用任一人类轻链恒定区κ或λ。嵌合、人源化抗体随后通过常规方法进行表达。 在一些实施例中，本发明的抗GCC抗体分子可对表达GCC的细胞(例如肿瘤细胞) 引起抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。具有IgGl和IgG3同型的抗体因其能够结合Fc受体而适用于引发抗体依赖性细胞毒性能力中的效应功能。具有IgG2和IgG4同型的抗体因其结合Fc受体的能力弱而适用于使ADCC反应减到最小。在相关实施例中，可例如通过在经修饰真核细胞系中生长来在抗体的Fc区中进行取代或改变抗体的糖基化组成以增强Fc受体识别、结合和/或介导抗GCC抗体所结合的细胞的细胞毒性的能力(参见例如美国专利第7，317，091号、第5，6 ，821号和公开案，包括WO 00/42072，谢尔德(Shields)等人，生物化学杂志(J. Biol. Chem.) 276 =6591-6604 (2001)；拉泽(Lazar)等人，美国国家科学院院刊，103 :4005-401(K2006)；佐藤(Satoh)等人，生物疗法专家评论(Expert Opin Biol. Ther. )6 :1161-1173(2006)) 0在某些实施例中，抗体或抗原结合片段(例如人类来源的抗体、人类抗体)可包括改变或调整功能(例如效应功能)的氨基酸取代或置换。举例来说，人类来源的恒定区(例如Y 1恒定区、Y 2恒定区)可设计成减少补体活化和/或Fc受体结合。(参见例如美国专利第5，648，260号(维特等人)、第5，624，821号(维特等人)和第5，834，597号(卓(Tso)等人)，其全部教示内容以引用的方式并入本文中。)优选地， 含有所述氨基酸取代或置换的人类来源恒定区的氨基酸序列在全长范围内与未改变的人类来源恒定区的氨基酸序列至少约95% —致，更优选在全长范围内与未改变的人类来源恒定区的氨基酸序列至少约99%—致。在另一个实施例中，效应功能也可通过调节抗体的糖基化模式来改变。改变意谓缺失抗体中所发现的一个或一个以上碳水化合物部分，和/或添加抗体中不存在的一个或一个以上糖基化位点。举例来说，美国专利申请公开案第2003/0157108号(普雷斯塔 (Presta))中描述具有增强的ADCC活性的抗体，其具有缺乏连接到抗体Fc区的海藻糖的成熟碳水化合物结构。也参见美国专利申请公开案第2004/0093621号(协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko Kogyo Co. , Ltd))。格莱科菲公司(Glycofi)也已开发出能够产生特定糖型的抗体的酵母细胞系。或者或另外，可制备糖基化类型已改变的抗体，例如海藻糖基残基量减少的低海藻糖基化抗体或对分GlcNac结构增加的抗体。已证明所述改变的糖基化模式将增加抗体的ADCC能力。所述碳水化合物修饰可通过例如在糖基化机构改变的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机构改变的细胞已描述于此项技术中且可用作经工程改造以表达本发明的重组抗体从而产生糖基化改变的抗体的宿主细胞。举例来说，杭(Hang)等人的EP 1，176，195描述具有功能被破坏的FUT8基因(其编码海藻糖基转移酶)的细胞系，以致在所述细胞系中表达的抗体展现低海藻糖基化。普雷斯塔的PCT公开案W003/035835描述一种变体型CHO细胞系Lecl3细胞，其使海藻糖连接到Asn (四7)-连接型碳水化合物的能力降低，也使得在所述宿主细胞中表达的抗体具有低海藻糖基化(也参见谢尔德R.L.等人， 2002生物化学杂志，277 :26733-26740)。乌玛纳(Umana)等人的PCT公开案WO 99/54342描述如下细胞系，其经工程改造成表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如β (1，4)-Ν乙酰基葡糖胺转移酶III (&1ΤΙΙΙ))，以致在所述工程改造的细胞系中表达的抗体展现对分GlcNac 结构增加，此使得所述抗体的ADCC活性增加(也参见乌玛纳等人，1999，自然生物技术 (Nat. Biotech.) 17 :176-180)。人源化抗体也可使用CDR移植法制备。产生所述人源化抗体的技术是此项技术中已知的。一般说来，人源化抗体是通过获得编码结合于GCC的抗体的可变重链和可变轻链序列的核酸序列，鉴别所述可变重链和可变轻链序列中的互补决定区或“CDR”并将CDR 核酸序列移植到人类框架核酸序列上来制备。(参见例如美国专利第4，816，567号和第 5，225，539号)。可确定⑶R和框架残基的位置(参见卡贝特Ε. A.等人(1991)免疫相关蛋白质序列，第5版，美国卫生与公众服务部(U. S. Department of Health and Human Services)，NIH出版号91-3M2 ；和查塞C.等人，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) 196 901-917 (1987))。本文所述的抗GCC抗体分子具有表5和表6中所列的⑶R氨基酸序列和编码CDR的核酸序列。在一些实施例中，表5和表6的序列可并入识别GCC的分子中以用于本文所述的治疗或诊断方法中。所选人类框架为适于体内投药的框架，意谓其不展现免疫原性。举例来说，所述确定可利用关于所述抗体的体内用法和氨基酸类似性研究的先前经验来进行。适合框架区可选自如下人类来源的抗体，其在框架区的长度范围内与供体抗体(例如抗GCC抗体分子，例如3G1)的等效部分(例如框架区)的氨基酸序列具有至少约65%氨基酸序列一致性，且优选至少约70%、80%、90%或95%氨基酸序列一致性。氨基酸序列一致性可使用适合的氨基酸序列比对演算法(例如CLUSTAL W)使用预设参数来测定。(汤普森J. D. (Thompson J. D.)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res. ) 22 4673-4680(1994)。)一旦鉴别出待人源化的克隆抗体的⑶R和FR，就鉴别编码⑶R的氨基酸序列且将相应核酸序列移植到所选人类FR上。此可使用已知引物和连接子进行，所述引物和连接子的选择是此项技术中已知的。特定人类抗体的全部CDR可用非人类CDR的至少一部分置换，或仅一些⑶R可用非人类⑶R置换。仅需要置换人源化抗体结合于预定抗原所需数目的⑶R。在⑶R移植到所选人类FR上之后，表达所得“人源化”可变重链和可变轻链序列以产生结合于GCC的人源化Fv或人源化抗体。优选地，CDR移植(例如人源化)抗体以与供体抗体类似、实质上相同或比其更佳的亲和力结合GCC蛋白。通常，人源化可变重链和轻链序列与人类恒定域序列表达成融合蛋白形式，从而获得结合于GCC的完整抗体。然而，可产生不含恒定序列的人源化Fv抗体。特定氨基酸已经取代、缺失或添加的人源化抗体也在本发明的范围内。详细说来，人源化抗体可在框架区中具有氨基酸取代，例如以便改良与抗原的结合。举例来说，人源化免疫球蛋白链的所选少数受体框架残基可经相应供体氨基酸置换。取代位置包括与 CDR相邻或能够与CDR相互作用的氨基酸残基(参见例如美国专利第5，585，089号或第 5，859，205号)。受体框架可为成熟人类抗体框架序列或共同序列。如本文所用的术语“共同序列”是指在相关家族成员中的区域的序列中的各位置最常发现或根据各位置的最常见残基设计的序列。可获得多个人类抗体共同序列，包括人类可变区的不同子群的共同序列 (参见卡贝特E.A.等人，免疫相关蛋白质序列，第5版，美国卫生与公众服务部，美国政府印刷局(U. S. Government Printing Office) (1991)) 可线上自由获得卡贝特数据库和其应用，例如经由马里兰州贝赛思达市的美国国立生物技术信息中心的IgBLAST(也参见琼森 G.和吴 Τ. T. (Wu, Τ. T.)，核酸研究，29 :205-206 (2001))。用于使抗体人源化的其它技术描述于1992年12月23日公开的帕德兰等人， EP519596A1 中。抗GCC抗体分子包括也可通过PCT公开案第WO 98/5四76号和WO 00/；34317(其内容以引用的方式并入本文中)中所揭示的方法特定缺失人类T细胞表位或进行“脱免疫化”而修饰的其它人源化抗体。简单说来，可分析抗GCC抗体的鼠类重链和轻链可变区中结合于II类MHC的肽；这些肽代表潜在T细胞表位。为检测潜在T细胞表位，可应用称作“肽穿线(ρ印tide threading)”的计算机模型化法，且另外可在人类II类MHC结合肽的数据库中搜索鼠类VH和VL序列中存在的基元，如PCT公开案第W098/5^76号和第WO 00/34317 号中所述。这些基元结合于18种主要II类MHC DR异型中的任一者，并由此构成潜在T细胞表位。检测到的潜在T细胞表位可通过取代可变区中的少数氨基酸残基或优选通过单一氨基酸取代来消除。尽可能进行保守性取代，通常但非排他地，可使用在人类生殖系抗体序列中此位置常见的氨基酸。人类生殖系序列揭示于汤姆林森I. A. (Tomlinson，I.A.)等人， 分子生物学杂志，227 :776-798(1992)；库克G.P. (Cook, G. P.)等人，今日免疫学，第16卷 (5) =237-242(1995)；查塞 D.等人，分子生物学杂志，227 :799-817 (1992)中。V BASE 目录
31提供了人类免疫球蛋白可变区序列的综合性目录(汤姆林森I. A.等人汇编，医学研究理事会蛋白质工程中心(MRC Centre for Protein Engineering)，英国剑桥(Cambridge，UK))。 在通过对鼠类VH和VL基因进行诱变来构建抗GCC抗体的脱免疫化VH和VL之后，可任选使经诱变的可变序列与人类恒定区(例如人类IgGl或κ恒定区)融合。在其它实施例中，减少CDR移植抗体的免疫原性反应可通过改变(例如缺失、 取代)CDR中的氨基酸残基来实现(克什米尔(Kashmiri)等人，方法(Methods) 36 25-34(2005)；美国专利第 6，818，749 号；谭(Tan)等人，免疫学杂志(J. Immunol.) 169 1119-1125(2006))。举例来说，优选不改变接触抗原所涉及的位置的残基。通常，所述残基 (SDR)处于在抗体间呈现高度可变性的位置中。举例来说，通过克鲁斯塔(Clustal)法(海金斯 D.G. (Higgins D. G.)等人，酶学方法(Meth. Enzymol. )266 :383-402(1996))自抗 GCC 抗体分子(例如本文所述的抗体)获得的共同序列(例如SEQ ID N0:302-307，表5)可帮助鉴别SDR。在本文所述的人类抗GCC抗体分子中，SDR为以下重链⑶Rl的至少第一个残基或在一些实施例中前4个残基；重链⑶R2的至少N末端部分，例如前7个、10个或13个残基；重链⑶R3的几乎全部；轻链⑶Rl的C末端部分，例如残基6、8或9后的部分；轻链 CDR2的大致第一残基、中间的残基和/或最后一个残基；和轻链CDR3的大部分，或至少残基2或3后的部分。因此，为使抗GCC抗体分子在进行人源化或修饰之后维持与GCC蛋白的结合，抗GCC抗体分子的CDR中的所述SDR残基相较于CDR的其它残基或框架区中的残基不太适合例如自鼠类残基变为人类共同残基。相反，宜将非人类(例如鼠类)CDR中的残基变为鉴别为人类CDR(例如本文所述的抗GCC抗体分子的CDR，例如表5中所列的序列) 的共同残基的残基。举例来说，丝氨酸可代表重链CDRlC末端的人类残基，和/或酪氨酸可代表重链CDRl的第二和/或第三残基的人类残基；重链CDR2可以S-(L/V)-K-(S/G) (SEQ ID NO 312)为末端以代表人类⑶R ；为代表人类⑶R3，在重链⑶R3中的4到6个残基和/ 或天冬氨酸6到9个残基之后可存在甘氨酸；轻链⑶Rl可由(K/ - (A/S) -SQS- (V/L) - (S/ L) (SEQ ID NO 313)开始以代表人类CDR ；轻链CDR2可在第三残基中具有丝氨酸和/或在第五残基中具有精氨酸以代表人类CDR ；和/或轻链CDR3可在第二残基中具有谷氨酰胺和 /或在第三残基中具有酪氨酸或丝氨酸以代表人类CDR。呈不完整抗体形式的抗GCC抗体也适用于本发明。所述抗体可来源于上述任何抗体。此类型的适用抗体分子包括(i) Fab片段，即由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，即包含在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii) 由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段； (ν)由VH结构域组成的dAb片段(沃德(Ward)等人，自然341 :544-546(1989)) ； (vii)由 VHH结构域组成的单结构域功能性重链抗体(称作纳米抗体)，参见例如科提兹-雷塔莫佐 (Cortez-Retamozo)等人，癌症研究(Cancer Res. )64 :2853-2857(2004)和其中所引用的参考文献；和(vii)分离的CDR，例如一个或一个以上分离的CDR连同足够框架一起提供抗原结合片段。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)由单独基因编码，但其可使用重组方法通过合成连接子接合，所述合成连接子使其能够制成VL和VH区配对形成单价分子的单一蛋白质链(称作单链Fv(SCFV)；参见例如博德等人，科学，242 :423-似6 (1988)；和休斯顿等人，美国国家科学院院刊，85 :5879-5883 (1988))。所述单链抗体也意图涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内。这些抗体片段是使用所属领域技术人员已知的常规技术获得，且以与完整抗体相同的方式针对效用对所述片段进行筛选。例如Fv、F(ab' 等抗体片段可通过对完整蛋白质进行裂解(例如，通过蛋白酶或化学裂解)来制备。在实施例中，重链和轻链中一者或两者的⑶R序列中的一些或全部可用于另一抗体分子中，例如CDR移植、人源化或嵌合抗体分子中。实施例包括包含足够⑶R(例如上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者的全部六个CDR)以允许结合于细胞表面GCC的抗体分子。在一个实施例中，将⑶R(例如全部HCDR或全部IXDR或所有六个OTR)嵌入人类框架区或人类来源的框架区中。人类框架区的实例包括人类生殖系框架序列、已进行亲和力成熟(体内或体外)的人类生殖系序列，或合成的人类序列，例如共同序列。在一个实施例中，重链框架为IgGl或IgG2框架。在一个实施例中，轻链框架为κ框架。在一个实施例中，抗GCC抗体分子(例如CDR移植或人源化抗体分子)包含足够CDR(例如本文所述抗体中一者的全部六个CDR，例如表5中所列的序列)以允许结合于 GCC0 (可编码表5中所列的CDR氨基酸序列的示范性核酸序列提供于本文的表6中)。在特定实施例中，抗GCC抗体分子可包含来自5F9或Abx-229的⑶R。用于体内治疗或诊断用途的抗体片段可获益于改良其血清半衰期的修饰。旨在增加抗体的体内血清半衰期的适合有机部分可包括选自以下的一个、两个或两个以上线性或分支部分亲水性聚合基团例如线性或分支聚合物(例如聚烷二醇，例如聚乙二醇、单甲氧基-聚乙二醇等)、碳水化合物(例如葡聚糖、纤维素、多糖等)、亲水性氨基酸的聚合物 (例如聚赖氨酸、聚天冬氨酸等)、聚烷烃氧化物和聚乙烯吡咯烷酮)、脂肪酸基团(例如单羧酸或二羧酸)、脂肪酸酯基、脂质基团(例如二酰基甘油基、鞘脂基(例如神经酰胺基)) 或磷脂基(例如磷脂酰乙醇胺基)。优选地，有机部分结合于使有机部分相较于非偶联抗体部分不会削弱所得免疫偶联物的功能(例如降低抗原结合亲和力)的预定位点。有机部分的分子量可为约500Da到约50，OOODa，优选为约2000,5000,10, 000或20，OOODa0用有机部分修饰多肽(例如抗体)的实例和方法可见于例如美国专利第4，179，337号和第 5，612，460号、PCT公开案第WO 95/06058号和第WO 00/26256号以及美国专利申请公开案第 20030026805 号中。抗GCC抗体分子可包含上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者的重链和轻链中一者或两者的可变区的全部或抗原结合片段。在一个实施例中，(a)的轻链氨基酸序列与(a) (i_ii)中所提到的参考氨基酸序列中一者可存在多达1、2、3、4、5、10或15个残基差异。在实施例中，所述差异为保守性取代。在实施例中，差异是在框架区中。在一个实施例中，(b)的重链氨基酸序列与(b) (i-ii) 中所提到的参考氨基酸序列中一者可存在多达1、2、3、4、5、10或15个残基差异。在实施例中，所述差异为保守性取代。在实施例中，差异是在框架区中。在一个实施例中，抗GCC抗体分子包含以下中的一者或两者(a)具有⑴表3的轻链可变区氨基酸序列(例如SEQ ID NO 20)或(ii)由表4 的核苷酸序列编码的轻链可变区氨基酸(SEQ ID NO 19)的全部或抗原结合片段的轻链氨基酸序列；和(b)具有(i)表3的重链可变区氨基酸序列(例如SEQ ID NO 18)或(ii)由表4 的核苷酸序列编码的重链氨基酸序列(SEQ ID NO 17)的全部或抗原结合片段的重链氨基酸序列。在一个实施例中，抗GCC抗体分子包含以下中的一者或两者a)与本发明的抗GCC抗体分子(例如上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者)的轻链可变区具有至少85、90、95、97或99%同源性的轻链可变区，或其抗原结合片段；和(b)与本发明的抗GCC抗体分子(例如上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者)的重链可变区具有至少85、90、95、97或99%同源性的重链可变区，或其抗原结合片段。人类杂交瘤、所选淋巴细胞和鼠类抗体的可变区的氨基酸序列可见于表3中。在一个实施例中，抗GCC抗体分子为5F9抗体分子且包括以下中的一者或两者a) 来自SEQ ID NO 231的重链恒定区的全部或片段；和b)来自SEQ ID NO :233的轻链恒定区的全部或片段。在另一个实施例中，抗GCC抗体分子为Abx-2^抗体分子且包括以下中的一者或两者a)来自SEQ ID NO 46的重链可变区的全部或GCC结合片段；和b)来自SEQ ID NO 48的轻链可变区的全部或GCC结合片段。在一种方法中，可使用编码重链和轻链J区的共同序列来设计用作引物的寡核苷酸以将适用的限制性位点引入J区中，以便随后将V区区段连接到人类C区区段。可通过定点诱变来修饰C区CDNA以将限制性位点放于人类序列中的类似位置。表达载体包括质粒、反转录病毒、粘质粒(cosmid)、YAC、EBV来源的游离基因体等。适宜载体为编码功能完整的人类CH或CL免疫球蛋白序列的载体，其具有经工程改造的适当限制性位点以便能容易地插入和表达任何VH或VL序列。在所述载体中，拼接通常在插入的J区中的拼接供体位点与在人类C区前的拼接受体位点之间进行，且也在人类CH 外显子内存在的拼接区进行。适合表达载体可含有多个组分，例如复制起点、可选择标记基因、一个或一个以上表达控制元件(例如转录控制元件(例如启动子、强化子、终止子))和 /或一个或一个以上翻译信号、信号序列或前导序列等。聚腺苷酸化和转录终止在编码区下游的原生染色体位点处进行。所得嵌合抗体可接合到任何强启动子。可使用的适合载体的实例包括适用于哺乳动物宿主和基于病毒复制系统的载体，例如猿猴病毒40(SV40)、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus, RSV)、腺病毒2、牛乳突状瘤病毒(BPV)、乳多泡病毒BK 突变体(BKV)或小鼠和人类巨细胞病毒(CMV)和莫洛尼鼠类白血病病毒(moloney murine leukemia virus，MMLV)、原生Ig启动子等。多种适合载体是此项技术中已知的，包括维持于单一拷贝或多个拷贝中或例如经由LTR或经由经工程改造成具有多个整合位点的人工染色体而整合到宿主细胞染色体中的载体(林登贝姆(Lindenbaum)等人，核酸研究， 32 :el72(2004)；克纳德(Kennard)等人，生物技术与生物工程(Biotechnol. Bioeng.)(在线)，2009年5月20日)。适合载体的其它实例列于以下章节中。因此，本发明提供一种表达载体，其包含编码结合GCC蛋白的抗体、抗体的抗原结合片段(例如人类、人源化、嵌合抗体或前述任一者的抗原结合片段)、抗体链(例如重链、 轻链)或抗体链的抗原结合部分的核酸。在真核宿主细胞中表达是适用的，因为这些细胞相较于原核细胞更可能组装和分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。然而，所产生的因不适当折叠而无活性的任何抗体可根据已知方法(吉姆(Kim)和博得韦(Baldwin)，“小蛋白质折叠反应中的特定中间物以及蛋白质折叠机制(Specific Intermediates in the Folding Reactions of Small Proteins and the Mechanism of Protein Folding) ”,生物化学年评(Ann. Rev. BioChem.)51，第459-89页(198 )复性。宿主细胞有可能产生完整抗体的部分，例如轻链二聚体或重链二聚体，其也为本发明的抗体同源物。另外，如本文别处所述，人类抗体或来自其它物种的抗体可经由呈现型技术(包括(但不限于)噬菌体呈现、反转录病毒呈现、核糖体呈现和其它技术)使用此项技术中众所周知的技术来产生，且可使所得分子再经历成熟(例如亲和力成熟)，所述技术是此项技术中已知的。维特和哈里斯，今日免疫学，14 :43-46(199 ；和怀特等人，免疫学评论综述，12125-168 (1992)；汉斯(Hanes)和普鲁索(Plucthau)，美国国家科学院院刊 (PNAS USA) 94 :4937-4942(1997)(核糖体呈现)；帕姆雷(Parmley)和史密斯(Smith)，基因(Gene) 73 :305-318 (1988)(噬菌体呈现)；斯科特(Scott)，生物化学趋势(TIBS) 17 241-245(1992)；卡维拉(Cwirla)等人，美国国家科学院院刊，87 :6378-6382 (1990)；鲁塞尔(Russel)等人，核酸研究，21 :1081-1085(1993)；霍根布姆(Hoganboom)等人，免疫学评论(Immunol. Reviews) 130 :43-68(199 ；克利斯维尔和麦卡夫提，生物技术趋势 (TIBTECH) 10 =80-84(1992)；和美国专利第5，733，743号。如果利用呈现技术来制备非人类抗体，那么所述抗体可如上所述进行人源化。应了解，所产生的抗体最初无需具有特定所需同型，而是相反，所产生的抗体可具有任何同型。举例来说，由5F9杂交瘤(ATCC寄存编号PTA-813》产生的抗体具有IgG2同型。所述抗体的同型可在之后使用此项技术中已知的常规技术转变为例如IgGl或IgG3以在抗体结合细胞上的GCC时引发ADCC反应。所述技术包括使用定向重组技术(参见例如美国专利第4，816，397号)、细胞与细胞融合技术(参见例如美国专利第5，916，771号)和其它技术。在细胞与细胞融合技术中，制备具有具任何所需同型的重链的骨髓瘤或其它细胞系，并制备具有轻链的另一骨髓瘤或另一细胞系。之后，所述细胞可进行融合且可分离表达完整抗体的细胞系。在某些实施例中，GCC抗体分子为人类抗GCC IgGl抗体。因为所述抗体具有所需的与GCC分子的结合性，所以所述抗体中任一者都容易发生同型转变，以产生例如人类 IgG4同型，同时仍具有相同可变区(其在某种程度上确定抗体的特异性和亲和力)。因此， 由于所产生的抗体候选物满足上述所需“结构”特征，故其一般可经由同型转变而具有至少某些所需的其它“功能”特性。在一个实施例中，可使可变区或其抗原结合片段与除与其一起产生的恒定区以外的恒定区(或其片段)，例如与来自另一抗体的恒定区(或其片段)或与合成恒定区(或其片段)偶合。在实施例中，恒定区为IgGl或IgG2恒定区(或其片段)。可在可变区或恒定区中进行序列改变，以改良抗体分子的效应活性。其它治疗剂的设计和产牛本文中针对GCC产生和表征的抗体有助于设计其它治疗形式，包括其它抗体、其它拮抗剂或除抗体以外的化学部分。所述形式包括(但不限于)具有类似结合活性或功能的抗体、先进的抗体治疗剂(例如双特异性抗体、免疫偶联物和放射性标记的治疗剂)、产生肽治疗剂(尤其细胞内抗体)和小分子。此外，如上所述，本发明抗体的效应功能可通过同型转变成IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgAU IgA2、IgE或IgM而发生改变，以用于各种治疗用途。对于双特异性抗体，可产生包含以下的双特异性抗体(i)偶联在一起的两个抗体，一者对GCC具特异性且另一者对第二分子具特异性；(ii)具有一条对GCC具特异性的链和对第二分子具特异性的第二链的单一抗体；或(iii)对GCC和另一分子具特异性的单链抗体。所述双特异性抗体可使用已知技术产生。举例来说，可通过使两个或两个以上抗体(相同类型或不同类型)交联来制备双特异性抗体。合适交联剂包括具有由适当间隔子隔开的两个不同反应性基团的杂双官能交联剂(例如间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基丁二酰亚胺酯)；或同双官能交联剂(例如辛二酸二丁二酰亚胺酯)。所述连接子可自伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯化学品公司(Pierce Chemical Company, Rockford, IL)获得。 也参见例如凡格(Fanger)等人，免疫学方法(Immunomethods)4 :72-81(1994)；以及维特和哈里斯，今日免疫学，14 43-46 (1993)；和怀特等人，免疫学评论综述，12125-168 (1992)， 且对于(iii)参见例如特劳内克(Traunecker)等人，国际癌症杂志(Int. J. Cancer)(增刊)7 :51-52 (1992)。松斯维拉(Songsivilai)和拉奇曼(Lachmann)，临床和实验免疫学(Clin. Exp. Immunol.) 79 :315-321 (1990)；科斯特尼(Kostelny)等人，免疫学杂志 (J. Immunol.)148 1547-1553(1992)。此外，也可制备“ κ型抗体(Kappa body) ”(伊尔(111.)等人，“具有重链和轻链可变区特性的杂交免疫球蛋白结构域的设计和构建(Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions) ”，蛋白质工程(Protein Eng) 10 :949-57 (1997))、“微型抗体”(马丁 (Martin)等人，欧洲分子生物学学会杂志，13 =5303-9 (1994)，美国专利第5，837，821号)、“双功能抗体” (Holliger 等人，Proc Natl Acad Sci USA 90 :6444-6448(1993))或“两面蛋白”(特劳内克等人，欧洲分子生物学学会杂志，10 =3655-3659 (1991)，和特劳内克等人，国际癌症杂志，增刊，7 :51-52(1992))。核酸和名肽在另一个实施例中，本发明涉及编码或代表本文所述的抗体分子的聚核苷酸和多肽序列。所述聚核苷酸编码重链和轻链各自的可变区与恒定区，但根据本文所述的组合物， 本发明也涵盖其它组合。本发明也涵盖来源于所揭示的聚核苷酸的寡核苷酸片段和与这些聚核苷酸互补的核酸序列。聚核苷酸可呈RNA或DNA的形式。DNA、cDNA、基因组DNA、核酸类似物和合成DNA 形式的聚核苷酸在本发明的范围内。DNA可为双链或单链DNA，且如果为单链DNA，那么可为编码(有义)链或非编码(反义)链。编码多肽的编码序列可与本文所提供的编码序列一致，或可为不同编码序列，所述编码序列由于遗传密码子的冗余或简并性而与本文所提供的DNA编码相同多肽。在所提供的实施例中，聚核苷酸编码本发明的至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，例如，如表4中所概述。本发明也包括含有修饰(例如聚核苷酸缺失、取代或添加)的变体聚核苷酸和由所述变体聚核苷酸序列引起的任何多肽修饰。本发明的聚核苷酸也可具有作为本文所提供的编码序列的变体的编码序列。举例来说，变体聚核苷酸可与表4中所列的聚核苷酸具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或97% —致性。在实施例中，变体聚核苷酸编码抗GCC抗体分子。本发明进一步涉及代表本发明的抗体的多肽以及所述多肽的片段、类似物和衍生物。本发明的多肽可为重组多肽、天然产生的多肽或合成多肽。本发明多肽的片段、衍生物或类似物可为如下片段、衍生物或类似物其中一个或一个以上氨基酸残基经保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代，且所述取代的氨基酸残基可能为或可能不为由遗传密码子编码的氨基酸残基；或其可为如下片段、衍生物或类似物其中一个或一个以上氨基酸残基包括取代基；或其可为如下片段、衍生物或类似物其中所述多肽与另一化合物(例如增加多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或其可为如下片段、衍生物或类似物其中其它氨基酸融合于所述多肽，例如前导序列或分泌序列或用于纯化多肽的序列或原蛋白序列。所述片段、衍生物和类似物在本发明的范围内。在各种方面中，本发明的多肽可为部分纯化或纯化的产物。本发明的多肽可具有与本文所述的抗体(例如表2或表3中所概述者)一致或因一个或一个以上氨基酸取代所致少量变化而不同的氨基酸序列。所述变化可为通常在约1到5个氨基酸范围内的“保守性改变”，其中取代的氨基酸具有类似结构或化学特性， 例如用异亮氨酸置换亮氨酸或用丝氨酸置换苏氨酸；用精氨酸或组氨酸置换赖氨酸。相反， 变化可包括非保守性改变，例如用色氨酸置换甘氨酸。类似的少量变化也可包括氨基酸缺失或插入或两者。可使用此项技术中已知的计算机程序，例如DNASTAR软件(丹斯塔公司 (DNASTAR，he.)，威斯康星州麦迪逊(Madison，Wis.))发现用于确定何种和多少种氨基酸残基可经取代、插入或缺失而不会改变生物或免疫活性的规则。在另一个方面中，本发明的特征在于编码抗GCC抗体分子的经分离和/或重组核酸。在实施例中，核酸编码以下中的一者或一者以上本文所述的抗体分子、抗体分子的重链、轻链、轻链可变区、重链可变区、重链和轻链的部分(例如当与全长重链可变区配对时结合抗原的轻链可变区片段，或当与全长轻链可变区配对时结合抗原的重链可变区片段)， 和⑶R。实施例包括安置于载体(例如表达载体)中的所述核酸。在特定实施例中，本发明包括质粒PT0K58D-5F9LC和pT0K58D-5F9HC。此外，本发明涵盖由宿主细胞(例如表达由质粒pT0K58D-5F9LC和pT0K58D-5F9HC编码的抗体分子的宿主细胞)产生的抗体分子。在一个实施例中，提供一种载体，例如表达载体，其包含以下中的一者或两者编码轻链可变区(例如表4中所列的序列)、其抗原结合片段，或本文例如在表6 中所述的轻链的一个、两个或三个CDR(和任选存在的框架区)的序列；和编码重链可变区(例如表4中所列的序列)、其抗原结合片段，或本文例如在表6 中所述的重链的一个、两个或三个CDR(和任选存在的框架区)的序列。在所提供的实施例中，聚核苷酸编码本发明抗体的至少一个重链可变区或至少一个轻链可变区。在所提供的实施例中，多肽可编码本发明抗体的至少一个重链可变区和一个轻链可变区。在一个实施例中，抗GCC抗体分子包含以下中的一者或两者(a)由在所选严格度条件下与以下杂交的核酸编码的轻链可变区或其抗原结合片段(i)本文例如在表4中所述的编码抗GCC抗体分子的核酸序列的互补序列，或(ii)编码表1和表2中所概述的本发明抗GCC抗体分子(例如上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者)的轻链的任何核酸序列；和(b)由在所选严格度条件下与以下杂交的核酸编码的重链可变区或其抗原结合片段(i)本文例如在表4中所述的编码抗GCC抗体分子的核酸序列的互补序列，或(ii)编码表1和表2中所概述的本发明抗GCC抗体分子(例如上述人类杂交瘤、所选淋巴细胞或鼠类抗体中一者)的重链的任何核酸序列。在一个实施例中，所选严格度条件为高严格度或极高严格度条件，例如，如本文所述的条件。在其它方面中，抗体或抗原结合片段包含由具有ATCC寄存编号PTA-8132的DNA 编码的抗体的轻链可变区氨基酸序列的氨基酸序列。在其它方面中，抗体或抗原结合片段包含由具有ATCC寄存编号PTA-8132的DNA编码的抗体的重链可变区序列的氨基酸序列。本发明也提供包括本发明的聚核苷酸的载体、用本发明的载体遗传工程改造的宿主细胞和通过重组技术制备本发明的抗体。适当DNA序列可通过多种程序插入载体中。一般说来，DNA序列是通过此项技术中已知的程序插入适当的限制性核酸内切酶位点中。表达载体中的聚核苷酸序列可操作地连接到适当表达控制序列(即启动子)以引导mRNA合成。所述启动子的实例包括(但不限于)劳斯肉瘤病毒LTR或者早期或晚期SV40启动子、大肠杆菌Iac或trp、噬菌体启动子和已知控制原核(例如大肠杆菌的tac、T3、T7启动子)或真核(例如巨细胞病毒启动子、腺病毒晚期启动子、EF-Ia启动子)细胞或其病毒中的基因表达的其它启动子。表达载体也含有用于起始翻译的核糖体结合位点和转录终止子。载体也可包括适用于扩增表达的序列。举例来说，载体可含有强化子，其为病毒来源的刺激转录的DNA序列(例如来源于猿猴病毒(例如SV40)、多瘤病毒、巨细胞病毒、牛乳突状瘤病毒或莫洛尼肉瘤病毒(Moloney sarcoma virus)的DNA序列)或基因组来源的刺激转录的DNA序列。载体优选还含有复制起点。载体可构建成含有外源复制起点，或所述复制起点可来源于SV40或另一病毒来源， 或通过宿主细胞染色体复制机制获得。此外，载体任选含有用于选择经转染宿主细胞的标记基因，例如允许在多种宿主中用甲氨蝶呤(methotrexate)进行选择的二氢叶酸还原酶标记基因；或抗生素标记基因， 例如β-内酰胺酶基因(安比西林(ampicillin)抗性)、Tet基因(四环素(tetracycline) 抗性)(用于原核细胞中)，或新霉素(neomycin)、GA418 (遗传霉素(geneticin)，一种新霉素衍生物)、gpt(霉酚酸)、安比西林或潮霉素(hygromycin)抗性基因；或补充宿主细胞的遗传损伤(例如无胸苷激酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶、二氢叶酸还原酶等)的基因。通常使用编码宿主的营养缺陷标记物的基因产物的基因(例如LEU2、URA3、HIS3)作为酵母中的可选择标记物。为获得本发明的抗体，应将编码本发明抗体的轻链和重链可变区以及轻链和重链恒定区的一个或一个以上聚核苷酸序列并入载体中。可将编码本发明抗体的轻链和重链的聚核苷酸序列并入一个或多个载体中，随后并入宿主细胞中。用于在哺乳动物细胞中表达的适合表达载体包括例如pCDM8、ρ⑶NAl. 1/amp、 pcDNA3. 1、pRc/RSV、pEF-1 (英杰生命技术公司 Qnvitrogen Life ^Technologies)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad, CA))、pCMV-SCRIPT、pFB、pSG5、pXTl (斯塔杰公司 Gtratagene)，加利福尼亚州拉荷亚(La Jolla，CA))、pCDEF3 (古德曼(Goldman, L. Α.)等人，生物技术(Biotechniques) ,21 1013-1015 (1996))、pSVSPORT (英杰生命技术公司吉博分公司(GIBCO division, Invitrogen Life Technologies)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)、 PEF-Bos (水岛 S. (Mizushima, S.)等人，核酸研究，18 :5322 (1990))、双顺反子GPEX 反转录病毒载体(盖拉生物技术公司(Gala Biotech)，威斯康星州米德尔顿(Middleton，WI)) 等。也可利用适用于各种表达宿主中的表达载体，所述宿主例如原核细胞(大肠杆菌)、昆虫细胞(果蝇施耐德S2细胞(Drosophila Schnieder S2cell)，Sf9)和酵母(甲醇毕赤酵母(P. methanolica)、巴斯德毕赤酵母(P. pastoris)、酿酒酵母(S. cerevisiae))。示范性载体为pLKT0K58 (野生型IgGlFc序列)和pLKT0K59 (突变型IgGlFc序列)(参见美国专利申请公开案第20060147445号)。应了解，本发明的抗体可在除杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达。编码特定抗体的cDNA或基因组克隆的序列可用于适合哺乳动物或非哺乳动物宿主细胞。转化可如下进行通过用于将聚核苷酸引入宿主细胞中的任何已知方法，包括例如将聚核苷酸包装于病毒中(或病毒载体中)并用所述病毒(或载体)转导宿主细胞；或通过此项技术中已知的用于将异源聚核苷酸引入哺乳动物细胞中的转染程序，例如葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将聚核苷酸囊封于脂质体中和直接显微注射DNA分子。所用转化程序取决于待转化的宿主。用于将异源聚核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法是此项技术中已知的，且包括(但不限于)葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、粒子轰击、将聚核苷酸囊封于脂质体中、肽偶联物、 树枝状聚合物和将DNA直接显微注射到细胞核中。在另一个方面中，本发明的特征在于包含本文所述核酸的宿主细胞。在实施例中， 所述细胞表达本文所述的抗体分子或其组分。另一个实施例提供一种制备抗体分子(例如本文所述的抗GCC抗体分子，例如人类或人源化抗体分子)的方法，其包含将宿主细胞维持于适于表达的条件下，借此表达免疫球蛋白链且产生抗体分子。另一个实施例提供一种宿主细胞，其包含编码重链和轻链抗体序列的任何前述表达载体。宿主细胞可为真核细胞，例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；或原核细胞，例如大肠杆菌。举例来说，哺乳动物细胞可为培养的细胞或细胞系。示范性哺乳动物细胞包括淋巴细胞细胞系(例如NSO)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、COS细胞。在一个特定实施例中，培养的宿主细胞为包含编码5F9抗体分子的核酸序列的COS细胞。在另一个实施例中，宿主细胞为杂交瘤5F9(PTA-8132)。另外，细胞包括卵母细胞，和来自转基因动物的细胞，例如乳腺上皮细胞。举例来说，编码本文所述的抗体分子的核酸可在转基因非人类动物中表达。可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是此项技术中已知的且包括可自美国菌种保藏中心(ATCC)获得的许多永生化细胞系，包括(但不限于)中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO 细胞、海拉细胞(HeLa cell)、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和多种其它细胞系。非哺乳动物细胞，包括(但不限于)细菌、酵母、昆虫和植物，也可用于表达重组抗体。为防止由非人类糖基化作用引起的免疫原性、药物动力学和/ 或效应功能的变化，可优选对抗体CH2结构域进行定点诱变以消除糖基化作用。通过确定哪一系统产生最高表达水平且产生具有组成型GCC结合特性的抗体来选择表达方法。另一个实施例提供一种制备抗GCC抗体分子(例如人类或人源化抗体分子)的方法，其包含将包含本文所述的核酸(例如表4或表6中所列的一个或一个以上核酸序列)的宿主细胞维持于适于表达免疫球蛋白的条件下，借此表达免疫球蛋白链且产生结合GCC的抗体分子(例如人类或人源化抗体分子)或其片段或变体。举例来说，表达抗体分子的方法包括使用宿主细胞，其中编码抗体分子(例如人类或人源化抗体)轻链的第一重组核酸分子和编码抗体分子(例如人类或人源化抗体)重链的第二重组核酸分子被包含在单一表达载体中。在其它实施例中，其处于单独载体中。必要时，所述方法可进一步包含分离或回收抗体、抗体的抗原结合片段、抗体链或抗体链的抗原结合片段的步骤。举例来说，可使用适于所选宿主细胞的任何方法(例如转化、转染、电穿孔、感染)将编码结合GCC蛋白的人类抗体的重链和轻链的核酸分子(即一个或一个以上核酸分子)，或包含所述核酸分子的表达构筑体(即一个或一个以上构筑体)引入适合宿主细胞中以产生重组宿主细胞，以致所述核酸分子可操作地连接到一个或一个以上表达控制元件(例如在载体中、在通过于细胞中的处理产生的构筑体中、整合到宿主细胞基因组中)。 可将所得重组宿主细胞维持于适于表达的条件下(例如在诱导剂存在下、在适合非人类动物中、在补充有适当盐、生长因子、抗生素、营养补充剂等的适合培养基中)，借此产生所编码的多肽。必要时，可分离或回收(例如自动物、宿主细胞、培养基、奶)编码的蛋白质。 此方法涵盖在转基因非人类动物(参见例如WO 92/03918，吉恩法玛国际公司(GenWiarm International))或植物的宿主细胞中进行表达。另外，可使用多种已知技术增强生产细胞系中本发明抗体(或来源于其的其它部分)的表达。举例来说，谷氨酰胺合成酶和DHFR基因表达系统是用于在某些条件下增强表达的常用方法。可使用常规技术，例如限制性稀释克隆、微滴技术(Microdrop technology) 或此项技术中已知的任何其它方法来鉴别高表达细胞克隆。GS系统完全或部分结合欧洲专利第0216846号、第0256055号和第0323997号以及欧洲专利申请案第89303964. 4号进行了论述。在用于重组表达本发明的经修饰抗体或其抗原结合部分的示范性系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链与抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体中，抗体重链和轻链基因各自可操作地连接到强化子/启动子调节元件(例如来源于SV40、CMV、腺病毒等，例如CMV强化子/AdMLP启动子调节元件或SV40强化子/AdMLP 启动子调节元件)以驱动基因的高水平转录。重组表达载体也带有DHFR基因，其允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选转化体宿主细胞以允许表达抗体重链和轻链且自培养基回收完整抗体。使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和自培养基回收抗体。也可以转基因方式经由产生转殖相关免疫球蛋白重链和轻链序列的基因的哺乳动物或植物且自其产生可回收形式的抗体来制备本发明的抗体。对于在哺乳动物中以转基因方式制备，可在山羊、母牛或其它哺乳动物的奶中产生且自其回收抗体。参见例如美国专利第 5，827，690 号、第 5，756，687 号、第 5，750，172 号和第 5，741，957 号。本文所述的抗体、抗原结合片段、抗体链和其抗原结合部分也可在适合的体外表达系统中，通过化学合成或通过任何其它适合方法制备。融合蛋白和免疫偶联物本文所述的抗GCC抗体可通过任何适合方法(例如化学偶合、基因融合、非共价缔合或其它方法)功能性连接到一个或一个以上非抗体分子实体。
可制备如下融合蛋白，其中本文所述的抗GCC抗体分子和非抗体部分是单个连续多肽链的组分。非抗体部分可相对于抗体部分位于N末端、C末端或内部。举例来说，一些实施例可通过将编码免疫球蛋白序列的核酸插入适合表达载体，例如PET载体 (例如pET-15b，诺瓦杰公司(Novagen))、噬菌体载体(例如pCNATAB 5E，法玛西亚公司 (Pharmacia))或其它载体(例如pRIT2T蛋白质A融合载体，法玛西亚公司)中来制备。所得构筑体可经表达以产生包含非抗体部分(例如组氨酸标签、E标签或蛋白质A IgG结合结构域)的抗体链。可使用任何适合技术分离或回收融合蛋白，例如使用适合亲和基质进行色谱法(参见例如现代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology) (奥苏贝尔F.M(Ausubel，F.M)等人编，第2卷，增刊沈，第16.4. 1-16. 7. 8页(1991))。本发明提供被引导到细胞中且在实施例中内在化到细胞中的抗GCC抗体分子。其能够将治疗剂或可检测试剂传递到或传递入表达GCC的细胞中，但不会传递到或传递入不表达目标的细胞中。因此，本发明也提供包含如本文所述的抗GCC抗体分子的抗GCC免疫偶联物，所述抗GCC抗体分子偶联于治疗剂或可检测试剂。在实施例中，抗GCC免疫偶联物对GCC的亲和力是未偶联抗体对GCC的亲和力的至少10、25、50、75、80、90或95%。此可使用细胞表面GCC或经分离的GCC来测定。在一个实施例中，如由本文所述的分析所测定，抗 GCC抗体分子(例如免疫偶联物)的LD50小于1，000、500、250、100或50pM。抗GCC抗体分子可利用此项技术中已知的技术进行修饰从而以免疫偶联物形式发挥作用。参见例如维特塔(Vitetta)，今日免疫学，14:252(1993)。也参见美国专利第 5，194，594号。放射性标记的抗体的制备也易于利用此项技术中已知的技术来制备。参见例如嘉格汉斯(Junghans)等人，癌症化学疗法与生物疗法(Cancer Chemotherapy and Biotherapy)655-686(第2版，察夫纳(Chafner)和隆格(Longo)编，利平科特雷文出版公司(Lippincott Raven) (1996))。也参见美国专利第 4，681，581 号、第 4，735，210 号、 第5，101，827号、第5，102，990号(美国再颁发专利第35，500号)、第5，648，471号和第 5，697，902 号。在一些实施例中，抗体分子与非抗体部分借助于连接子连接。在所述实施例中，免疫偶联物由式⑴表示
权利要求
1.一种抗GCC抗体分子，其中所述抗GCC抗体分子的轻链可变区和重链可变区选自 表2中所揭示任一以下抗体的轻链和重链序列5F9 ；Ab 229 ；或 3G1。
2.根据权利要求1所述的抗GCC抗体分子，其中所述抗GCC抗体分子为IgGl抗体。
3.根据权利要求1所述的抗GCC抗体分子，其中所述抗GCC抗体分子未偶联到治疗剂。
4.根据权利要求1所述的抗GCC抗体分子，其中所述抗GCC抗体分子偶联到治疗剂。
5.根据权利要求1所述的抗GCC抗体分子，其中所述抗GCC抗体分子偶联到可检测标记。
6.一种抗GCC抗体分子，其包含表5中所揭示任一以下抗体的轻链⑶Rl、⑶R2和⑶R3 以及重链CDR1、CDR2和CDR3 5F9 ；Ab 229 ；或 3G1。
7.根据权利要求6所述的抗GCC抗体分子，其进一步包含人类或人类来源的轻链和重链可变区框架。
8.根据权利要求7所述的抗GCC抗体分子，其中所述抗GCC抗体分子为IgGl抗体。
9.一种式(I)的免疫偶联物，
10.根据权利要求9所述的免疫偶联物，其中Z为可检测标记。
11.根据权利要求9所述的免疫偶联物，其中-Z为美登素(maytansine)或奥瑞他汀 (auristatin)。
12.根据权利要求9所述的免疫偶联物，其中-Z为DMl或DM4。
13.根据权利要求9所述的免疫偶联物，其中-Z为MMAE或MMAF。
14.根据权利要求9所述的免疫偶联物，其中所述连接子-X-具有式-Aa-Ww-Yy-，且所述免疫偶联物的特征为式(II)
15. 一种式(1-4)的免疫偶联物，
16. 一种式(1-5)的免疫偶联物，
17. —种式(1-7)的免疫偶联物，
18.根据权利要求15所述的免疫偶联物，其中m为1到3。
19.根据权利要求15所述的免疫偶联物，其中m为3到5。
20.根据权利要求16所述的免疫偶联物，其中m为3到5。
21.根据权利要求18所述的免疫偶联物，其中m为3到5。
22.—种治疗患有结肠癌的个体的方法，其包含投予所述个体治疗有效量的根据权利要求1或6所述的抗体分子，由此治疗所述个体。
23.一种治疗患有结肠癌的个体的方法，其包含投予所述个体治疗有效量的根据权利要求9到17中任一权利要求所述的免疫偶联物。
24.一种分离的核酸序列，其编码根据权利要求1或6所述的抗体分子。
25.一种细胞，其包含根据权利要求M所述的分离的核酸序列。
26.一种制备根据权利要求1或6所述的抗体分子的方法，其包含在允许产生抗体分子的条件下培养根据权利要求25所述的细胞，由此产生根据权利要求1或6所述的抗体分子。
27.一种载体，其包含根据权利要求1或6所述的抗体分子的所述轻链和重链中的一者或两者。
28.一种检测GCC分子的方法，其包含使所述分子与根据权利要求1或6所述的抗体分子接触，和确定所述抗体分子是否结合到所述GCC分子。
全文摘要
本发明揭示结合GCC的抗体和抗体的抗原结合片段。所述抗体结合GCC的细胞外结构域且可内在化。在一些实施例中，所述抗体为人源化、嵌合或人类抗体。也揭示编码所述抗体或其部分的核酸和载体、含有所述核酸的重组细胞以及包含所述抗体或抗原结合片段的组合物。本发明还提供利用本文所提供的抗体和抗原结合片段的治疗方法和诊断方法。
文档编号A61K39/395GK102573908SQ201080043591
公开日2012年7月11日 申请日期2010年10月22日 优先权日2009年10月23日
发明者塞缪尔·S·纳姆, 爱德华·A·格林菲尔德, 特雷莎·奥基夫, 秦士新, 约翰·巴布库克 申请人:安美基卑斯公司, 米伦纽姆医药公司