专利名称：用于诱导或加强结缔组织修复的组合物和方法
技术领域：
本发明一般意义上涉及用于治疗和预防温血对象中的过度血小板活化和因此产生的病理生理后遗症的组合物和方法，包括但不限于使用这样的组合物和方法来诱导或加强损伤的结缔组织的修复。
背景技术：
对于部分破裂、撕裂或切断的肌腱和韧带(总称“筋(cord) ”)的修复技术依据损伤的性质和受影响的具体肌腱/韧带而有很大区别。根据对象的物种(例如，人、哺乳动物、鸟)、以最小的侵袭性方式可获得的接近程度，目前对损伤筋的治疗中主要的差异在于筋移动的量、周围的环境、不同筋通常所受到的压力，以及在于不同筋的愈合特征。此外，通常没有对修复给定筋之整体最好方法的共识。具有不同的可接受的修复技术的经常损伤的筋的实例是人手屈肌肌腱、人膝前十字韧带(anterior cruciate ligament,ACL)和马趾浅屈肌(superficial digital flexor, SDF)肌腱。例如，已被切断的长屈肌肌腱的修复典型地通过面对面地缝合被切断肌腱末端而实现。从历史上看，将肌腱作用的接合处固定3至8周以在其愈合时保护该肌腱，尤其是新缝合的肌腱仅可承受在正常使用期间健康肌腱所受张力的小部分。然而，固定肌腱可导致沿该肌腱的长度形成瘢痕和黏附，以及可不利地影响该肌腱的运动范围(尤其是在屈肌肌腱的情况中)。近来，已发现屈肌肌腱具有内在的愈合能力，并且有限的运动事实上会加快愈合。最经常部分固定受影响的接合处以防止不慎过度用力。在前十字韧带(连接股骨底部和胫骨顶部)的情况中，由施加的力引起的应力远远更大(尤其是由于与周围的组织和骨相互作用较少)，筋移动的较小，并且治愈趋势的大不相同。尽管有大量的研究，仍然没有普遍可接受的修复方法，并且现行方法是困难且复杂的。目前的“标准护理”仍然是利用骨-肌腱-骨自体移植物(即，从患者中获得)的ACL重建。然而，骨-肌腱-骨移植有许多问题。完整的ACL拥有重要的机械感受和本体感受能力。移植重建牺牲了这些能力。自体移植与相当大的供体部位的发病率相关。为避免供体部位的发病率，偶尔使用尸体移植物；然而，这带来了疾病传播的风险。在部分破裂肌腱的情况中，或在损伤肌腱的手术操作或重建中，有时使用透明质素(hyaluronan)(亦称为透明质酸(hyaluronic acid, HA))的黏性溶液,主要用作腱鞘中的润滑剂。虽然它在这种情形中充当适当有效的润滑剂，但在马中进行的用于证明改善 治愈或缩短恢复时间而设计的大量试验未显示相对于仅对照操作的任何对病灶内HA(或PSGAG,另一种 GAG,或 B-氨基丙臆富马酸盐(B-aminoproprionitrile fumarate, BAPN),这三种都常用于马跛行的处方)的益处(见Dyson S，1977 &2004) 0在现有技术中，以及如美国专利NO. 5，358，973中所描述的那样，本发明人已经证明HA与葡聚糖的组合还充当有效的润滑剂，其预防并列的损伤表面之间形成粘连，在受损的肌腱中，所述粘连形成可经常发生在肌腱与肌腱通常在其中自由滑动的腱鞘之间。关于损伤的结缔组织再生后非弹性瘢痕的出现，众所周知皮肤和其他结缔组织的愈合经常因混乱和难看的瘢痕组织的形成而复杂化，例如涉及但不限于烧伤、切口和溃疡的伤口中的情况。在大多数形式的侵入性手术以及尤其在整形手术(例如，乳房增大)之后，除了上述肌腱和韧带中的瘢痕问题以及表面(皮肤)和内部瘢痕形成的明显的美学和功能性并发症之外，所公开的组合物还可用于预防其他组织中的瘢痕并发症，包括但不限于预防由眼损伤引起瘢痕之后的失明，通过清除胶质瘢痕促进在中枢和周围神经系统中的神经元重新连接，以及复原正常的肠和生殖功能，预防在胃肠和生殖系统中发生损伤后的狭窄和粘连。在上述的适应症中以及在一般的结缔组织修复中，血小板在调节结缔组织修复中 发挥普遍关键且非常早期的作用。这部分地通过启动防御级联反应的一系列细胞信号物质(细胞因子)的早期迅速释放(脱颗粒)以及部分地通过它们一起牵引(收缩)血液凝固时形成的多数止血栓子的纤维蛋白纤维网而实现。因此血小板调节纤维蛋白凝块的收缩、密度和孔隙度，这些部分地决定参与伤口愈合过程的干细胞、成纤维细胞以及其他细胞随后侵入止血凝块的速率(见s. Neuss, 2010)。的确，长期以来认为血小板在引起血液凝结(止血)和炎性应答事件的早期启动中发挥中心作用。在进化过程中，当通常伴随大失血的威及生命的严重感染的弄脏的创伤伤口是普遍事件时，血小板和白细胞在存活中发挥关键作用，充当快速早期预警防御系统，由此通过快速分泌吸引白细胞到达未处理损伤(crude injury)和潜在脓毒部位的趋化因子和细胞因子，活化的血小板有助于非适应性免疫和炎症。当今，当在低生物负荷(bioburden)的环境中使用无菌器具进行外科手术时，这样的级联倾向于过度发挥它们的防御作用和效用，反而对患者构成病理生理风险，诱发并发症，例如过度炎症、手术后血栓形成、大栓塞及小栓塞、血管壁过度增厚(增生)及随后的再狭窄或阻塞、导管阻塞和有害的血小板-白细胞微栓子脱落，这些反过来又可触发短暂性脑缺血发作(transient ischemic attack, TIA)、中风或心肌梗死或者可阻塞或损害例如重建/整形手术过程中移位皮肤或者肌瓣(muscle flap)中的微循环。在粥样斑块表面形成血小板聚集体以及随后这些白色栓子组织化成为纤维阻塞性内膜病变，这毋庸置疑地是动脉粥样硬化病变发展成严重梗阻和完全阻塞的一个机制；引起心肌梗死的冠状动脉血栓形成几乎总是发生在粥样斑块的位置。经皮腔内冠状血管成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)已成为通过部分阻塞的血管重建流向心脏之血流的重要方法。不幸的是，约30%至40%的冠状血管成形术的患者在治疗的6个月内遭受被治疗血管的再狭窄；目前，没有可靠的预防血管再狭窄的方法。因此,经常需要血运重建方法,例如旁路手术或其他PTCA方法。这些并发症在多数形式的血管手术中是尤其破坏性的，但也在较小侵入性血管手术(例如PCTA(球囊血管成形术)和以血液供应受损为特征的不同的医疗状况(例如但不限于急性中风、急性胰腺炎、冻伤/坏疽、失聪等)中提出了挑战。活化的血小板不仅涉及这些病症的病因，而且也通过与白细胞的相互作用在触发“缺血-再灌注损伤”起作用，所述损伤通常发生在当移除夹钳、栓子或其他对血流的梗阻(例如，在器官或组织移植、阻塞凝块的溶解或出血性休克之后恢复血量时)后缺血血管床恢复含氧血流时。这种下游“再灌注损伤”通常由从白细胞中释放的自由基介导，所述白细胞反过来被活化的血小板所释放的细胞因子活化(见Salter2001)。因此，一方面活化的血小板与另一方面内皮细胞、白细胞、其他细胞、凝块收缩的表面及其中的纤维蛋白等之间的相互作用很大程度上启动并确定机体对抗损伤和脓毒症之早期防御的命运。组织损伤后的血小板活化/脱颗粒通常是活化白细胞滚动(rolling)及与血管内皮细胞之黏着的触发因素并且在一些损伤情形中可先于白细胞募集和动员长达3 5小时,例如在对肝微循环的内毒素血症损伤中的情况(见Croner, 2006)。然而,在其他一些情况中，该时间延迟可仅为几分钟或几秒。
因此，主要通过血小板活化而触发的事件(例如，缺血-再灌注(I/R)损伤之后的白细胞活化、滚动及与血管内皮细胞的黏着)可用作潜在的血小板活化的替代指示物。因此我们推测我们在下文中公开的多糖与HA的组合的出人意料的协同作用可能具有多因素病因，其涉及多个相互关联的协同因素，包括血小板活化的抑制、透明质素的存在、以及聚合物诱导的应答于急性损伤中所形成的纤维蛋白凝块在形态学、脆性和溶解能力上的改变。在许多上述的外科和医学情形中，多糖(例如，葡聚糖)和(在某种程度上)HES(以及更最近的GAG(例如，HA)，例如美国专利5，585，361中所讨论的那样)长期以来已被用于抑制血小板超活化及其炎性并发症，但是需要达到有效并且维持保护的剂量通常高于这些药剂的安全推荐剂量。例如，葡聚糖和HES的显著出血或肾脏并发症的风险是与剂量正相关的，并且在同时给予肝素或其他抗凝剂的情况下，葡聚糖或HES的剂量必须被进一步降低或被略去以使出血的风险最小化。葡聚糖和HES还都是有效的血容量扩充剂。在一些治疗情形中(例如,在患者尚未遭受显著失血的中风或威胁性的坏疽的情形中)容量扩充可能经常是不期望的或者禁忌的。因此，葡聚糖或其他多糖与HA之间协同的相互作用提供了重要的治疗优势，该优势在于所期望的效果可通过每种成分的更低和更安全的剂量而实现。因此，HA与葡聚糖或HES (或二者)有效的协同组合允许降低总葡聚糖或HES的剂量，而不失去对过度血小板活化的有益抑制，因此在所设计的最佳剂量方案中，从根本上改善了患者的安全性，并为医生提供了更大的灵活性。本发明意在改善并且解决以上讨论的相关领域中这些已知缺陷中的一些。
发明内容
本发明提供组合物和方法，其用于在组织损伤后减弱组织过度的血小板活化和随后的病理生理后遗症或并发症，包括例如以下并发症血栓形成、微栓塞、再狭窄、缺血-再灌注损伤、炎症和瘢痕。所述组合物和方法尤其可用于诱导或加强结缔组织修复而没有不适当的纤维化和非弹性瘢痕组织形成。根据本发明的某些方面，所述组合物包含水溶液中生物相容性聚合物的协同组合，其中所述组合包括糖胺聚糖(GAG)与中性多糖。根据本发明的某些实施方案，提供能够减弱血小板超活化的组合物，其包含水溶液，所述水溶液含有以重量计约0. I %至约7.0%的糖胺聚糖和以重量计约1.0%至约32%的中性多糖。所述糖胺聚糖选自以下至少一种透明质素、软骨素、皮肤素、角蛋白、类肝素(heparan)、肝素和GAG类似物硫酸葡聚糖、硫酸戊聚糖，而所述中性多糖选自以下至少种异麦芽糖寡聚物、葡聚糖、羟乙基淀粉、聚乙二醇(PEG)和岩藻多糖(fucoidan)。根据另一些实施方案，所述糖胺聚糖成分可以是透明质素并且所述中性多糖成分可以是葡聚糖。根据这个实施方案，所述透明质素具有约I. 5kD至约6，OOOkD的重均分子量，而所述葡聚糖具有约0. 3kD至约IlOkD的重均分子量。在更多的一些具体实施方案中，所述透明质素具有约2. 5kD至约2，500kD的重均分子量，而所述葡聚糖具有约0. 5kD至约50kD的重均分子量。在本发明的某些方面中，所述能够减弱血小板超活化的组合物的中性多糖可以是 具有约IOkD至约500kD重均分子量的羟乙基淀粉，而在其他一些实施方案中，所述的重均分子量为约20kD至约350kD。根据本发明的另一些方面，所述中性多糖是异麦芽糖的寡聚物并且具有约0. 3kD至约IOkD (更具体地约0. 5kD至约4kD)的重均分子量。在其一种形式中，所述能够减弱血小板超活化的本发明组合物的糖胺聚糖是具有小于约25%交联度的部分交联的透明质素。在另一些实施方案中，所述能够减弱血小板超活化的组合物还包括抗氧化剂、清除剂(scavenger)、细胞因子、生长因子、白介素、基因治疗剂、黏弹剂和干细胞中的至少一种。根据本发明的另一个实施方案，提供用于治疗血小板超活化及其相关疾病、病症或病理生理后遗症的方法。根据这个实施方案，向对象施用含有糖胺聚糖和中性多糖的有效量的水溶液。根据本发明某些示例性的方面，与所治疗的血小板超活化病症相关的疾病、病症或病理生理后遗症包括选自以下的疾病血栓形成、动脉粥样硬化疾病的血栓性并发症、动脉粥样硬化疾病之介入的血栓性并发症、与手术或机械损伤相关的血栓性并发症、机械诱导的血小板活化、分流阻塞(shunt occlusion)、继发于血管损伤和炎症的血栓形成、弥漫性血栓或血小板消耗成分的适应症(indication with a diffuse thrombotic plateletconsumption component)、静脉血栓形成、冠状动脉血栓形成、动脉粥样硬化和动脉硬化的病理作用、储存期间血液和血液制品中的血小板凝集和凝块形成、超凝集能力的慢性或急性状态、纤溶治疗后的动脉或静脉的再阻塞、与体外循环相关的血小板黏附、与溶栓治疗相关的血栓性并发症、与冠状和其他血管成形术相关的血栓性并发症、与冠状动脉旁路手术相关的血栓性并发症和以血小板脱颗粒所触发的炎性级联为特征的疾病、手术或后遗症，包括选自以下的疾病内膜增生，动脉或静脉粥样斑(artheroma)和再狭窄，血小板-白细胞-纤维蛋白微栓塞和大栓塞，中风，心肌梗死，与凝块溶栓、松开钳夹、血管形成术、器官和组织移植、组织抢救性重建手术或在低血容量症中血量恢复之后的缺血-再灌注损伤有关的白细胞激活、聚集、黏附和自由基损伤升高，炎性关节疾病和过度纤维蛋白凝块收缩后遗症,包括结缔组织中的纤维化和瘢痕。在其一种形式中，向对象施用有效量水溶液的步骤包括向所述对象表面应用所述水溶液或者向所述对象注射所述水溶液的至少一种。在某些实施方案中，被治疗的对象包括哺乳动物，例如温血动物(包括人)。根据本发明另一个方面，提供通过向对象施用水溶液来修复、再生、治疗结缔组织损伤、缺损或病症或诱导其修复的方法，所述水溶液含有以重量计约0. 1%至约7. 0%的糖胺聚糖和以重量计约I. 0%至约32%的中性多糖。提供了通过向对象施用水溶液来修复、再生、治疗结缔组织损伤、缺损或病症或诱导其修复的方法，所述水溶液含有以重量计约0. I %至约7.0%的糖胺聚糖、以重量计约1.0%至约25%的中性胶体多糖以及以重量计从0.3%至约35%的亚胶体晶体样多糖。根 据这个示例性的实施方案，所述糖胺聚糖具有约2kD至约5，OOOkD的重均分子量，所述中性胶体多糖具有约20kD至约IOOkD的重均分子量，并且所述亚胶体晶体样多糖具有约0. 4%至约4kD的重均分子量。
具体实施方案下文中描述的本发明的实施方案并不意在穷举或将本发明限制于以下的详细描述中所公开的精确形式。相反，这样选择和描述实施方案以使本领域其他技术人员可以领会并理解本发明的原理和实践。除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中一个普通技术人员之通常理解相同的含义。尽管相似或等同于本文所描述的任何方法或材料可以用于本发明的实践或测试，现描述具体的方法和材料。下文提到的所有文献均通过引用全文并入本文。除非另有提及，本文使用或考虑的技术是本领域的一个普通技术人员公知的标准方法，并且材料、方法和实施例仅是示例性并且目的不在于限制。本文中使用的术语“结缔组织”包括但不限于韧带组织、肌腱组织、软骨组织、皮肤、角膜和瘢痕组织。本文中使用的术语“韧带”目的在于指白色纤维性结缔组织的绳样结构(该结构附于相互作用的骨的前端)以及限定滑膜囊的组织。根据本发明非限制性的和示例性的实施方案，所述韧带可以是前交叉韧带、后交叉韧带、胫侧副韧带、腓侧副韧带、横韧带、板股后韧带、胚腓后上韧带(posterior superior tibiofibular ligament)或外侧副韧带(其是帮助支撑踝关节外侧的三个韧带的复合物)。本文中使用的术语“肌腱”意在定义将肌肉连接至骨的结缔组织结构，例如且包括但不限于跟腱(其是在小腿中部区域连接的由两个肌肉(腓肠肌和比目鱼肌)联合形成的肌腱，并且被称为腓肠肌-比目鱼肌复合物(gastroc-soleal complex))或背阔肌肌腱,胚后肌腱，館腱，妬屈肌肌肉-肌腱单元和回旋套肌腱(rotator cuff tendon)。如本发明所考虑的那样，植入或移植可在损伤、缺损或病症的部位或者可以邻近这些损伤、缺损或病症。可通过肌腱/韧带样组织的形成或者肌腱或韧带生长和/或修复的定期评价来监测分化、修复、再生或治疗。可通过现有技术中已知的方法(例如，X射线(CT)、超声、MRI、关节镜和组织形态学测定)监测该进展。除了诱导肌腱/韧带的蛋白质(例如，BMP-12或VL-UBMP-13))之外，本发明的组合物还可包含其他有用的治疗剂，包括但不限于MP52、表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(I3DGF)、转化生长因子(TGF-a和TGF-P )、成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)、甲状旁腺激素(PTH)、白血病抑制因子(LIF/HILDA/DIA)、胰岛素样生长因子(IGF-I和IGF-II)、富血小板血浆(platelet rich plasma, PRP)以及间充质或其他干细胞或祖细胞。此外，本文中应该了解和认识的是，部分这些治疗剂也可用于本发明的组合物，并且这样的组合物可用于治疗胚胎关节的缺损(其中肌腱、韧带和骨在相接触的解剖学位置同时形成)，并且可用于附着于骨的肌腱位置的组织再生。考虑本发明的组合物还可用于伤口愈合，例如皮肤愈合以及相关的组织修复以避免不希望的纤维化或瘢痕。伤口的类型包括但不限于烧伤、切口和溃疡。具有考虑到pH、等渗性、稳定性等的这种药学上/生理学上可接受的组合物的制备和配制是现有技术中已知的，并且施用方法包括作为可注射剂和/或植入剂或装置表面、全身或局部施用。
当施用时，根据本发明使用的组合物当然是无热原的、生理学上可接受的形式。另夕卜，所述组合物可以理想地以黏性形式注射，以递送至组织损伤的部位。此外，表面施用可适用于伤口愈合和组织修复。此外，为了加强或加速缝合或移植的愈合潜力，本发明的组合物可与目前用于肌腱/韧带损伤之可用治疗相联合，所述治疗例如缝合(如，伟克合缝合(vicryl suture)或者外科肠缝合(surgical gut suture))或肌腱/韧带异体移植或自体移植。例如,可在植入前将缝合物、异体移植物或自体移植物浸泡在本发明的组合物中。还可将白介素或通过载体将基因治疗并入本发明的组合物或者例如通过冷冻干燥将所述组合物并入到缝合材料上。所述组合物可以处于载体(例如，合适的基质和/或螯合剂)中。例如，所述基质可支持所述组合物或者提供用于肌腱/韧带样组织形成和/或其他组织形成的表面。为此，载体材料的选择可基于生物相容性、生物降解性、力学特性、化妆品外观以及界面特性。所述组合物的具体应用将确定合适的配方。用于所述组合物的潜在基质可以是可生物降解的和化学成分确定的。可生物降解的材料(例如纤维素膜或外科网(surgical mesh))还可用作基质。可将这种材料缝合到损伤部位或包在肌腱/韧带周围。根据本发明的具体载体种类可包括聚合物基质，例如聚(乳酸)的聚合物、聚(乙醇酸)的聚合物以及乳酸和乙醇酸的共聚物。这些基质可以是海绵的形式，或者是多孔颗粒的形式，并且也可以包含螯合剂。可用于本应用之实施中的其他任选成分包括例如抗菌防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯和丙酯以及苯甲醇；抗氧化剂，例如EDTA、肼苯哒嗪、谷胱甘肽、柠檬酸盐以及BHT(丁羟甲苯)；抗生素，表面活性剂，例如聚(山梨酸酯)和聚(氧乙烯)；以及黏弹剂， 例如高或非常高Mw的HA以调节黏度，等。有利地，所述组合物包括其他成分，例如骨诱导或骨引导材料、药物、干细胞或祖细胞以及三维结构框架。如下文中详细解释的那样，本发明涉及出人意料的发现，公开的包含糖胺聚糖(GAG)与一种或更多种中性多糖的所生物相容性聚合物的组合协同地作用以诱导、加强或加速结缔组织损伤的修复和有组织的再生，而在没有不期望的纤维化和非弹性瘢痕组织的形成。
根据本文的某些方面，本发明的组合物和方法是基于所述出人意料的发现而预测的，该发现是GAG与中性多糖的组合协同地相互作用以抑制组织损伤后血小板的过度活化，因此阻断或减弱许多内科和外科并发症病因中所涉及的广泛的炎性级联。鉴于过度血小板活化在广泛的病理生理过程和并发症(包括上文所描述的那些)的病因中至关重要的作用，通过本文所公开的组合物对过度血小板活化的调节在降低外科或内科治疗中的不期望或威胁生命的并发症风险中可以是价值不可估量的工具。通过本发明公开的聚合物组合对过度血小板活化的协同抑制自然地影响了许多其他的血小板活化在其中发挥关键作用的生理学过程和级联。一个公知的实例是血液凝块或血栓的形成和收缩，这涉及主要由陷入在凝块或血栓的纤维蛋白纤维网络中的血小板释放的一系列信号物质所介导的复杂事件级联。尤其是凝块的稳定性和收缩由活化的血小板介导，所述活化的血小板连接纤维蛋白纤维成分并将其牵拉得更加靠近，增加凝块密度并降低孔隙率(见，Carr&Carr, 1995)。自然，在这方面血小板功能的任何抑制将影响这些过程，即降低相互结合纤维蛋白网的收缩力，降低凝块密度并且升高其孔隙率和侵入间充质干细胞(mesenchymal stemcell, MSC)和成纤维细胞的穿透力，这两种细胞分泌纤溶酶以使它们能够更好地穿透纤维蛋白凝块。不出人意料地是，这些祖细胞穿透所述凝块的容易程度和速率在加速胶原原纤维的有序再生中是显著的因素。同时，由于所形成的纤维更粗但也更不致密并且更容易被MSC和身体本身的酶所溶解，所述组合物中胶体的存在从根本上改变了形成凝块纤维网络的纤维蛋白的聚合，。对纤维蛋白网的形态学和孔隙度的这一额外的作用允许最初紊乱的凝块或血栓更快的地溶解和清除，为参与有组织修复的成纤维细胞和其他细胞的较早地流入铺平道路。目前的发现出人意料地显示出该后一方面在破裂的肌腱或韧带的修复中可能尤其重要，在这个修复中重要的是由血液或淋巴从撕裂的毛细管渗漏在病变(撕裂或损伤)处形成的纤维蛋白凝块不形成持续无组织的非弹性瘢痕组织，但是在早期阶段会被内源性溶解以便为最大弹性的主要为同轴排列的胶原原纤维的新生创造空间和有组织的环境。糖胺聚糖(GAG)和多糖(例如，葡聚糖或HES)都是包含不同大小分子混合物的聚合物，其各自由基本重复单元构成，对多糖而言，所述基本重复单元是葡萄糖，而对GAG (例如HA)而目,所述基本重复单兀是由D-匍萄糖醒酸和D-N-乙酸基-匍糖胺所组成的二糖。因为聚合物是多分散的，它们没有准确的分子量，必须由重均(Mw)或数均(Mn)分子量限定，或者更精确地由分子量分布曲线限定。本文中使用的术语Mw和Mn意在表示上述限定的含义。另外，例如所使用术语“葡聚糖60”或“HES130”等应意为具有约60，000道尔顿(或601^)1^的葡聚糖，正如“册3130”应意为具有约130，000道尔顿(或130kD)Mw的 HES。这些聚合物也是“多分散的”。例如，下文实施例I中提到的临床级葡聚糖60(即Mw = 60kD或60，000道尔顿(Da))中约80 %的分子通常将处于14kD与115kD之间，但是葡聚糖60还含有显著比例(>5%)的0. 5kD IOkD低端范围的小葡聚糖，以及类似比例的超过200kD的非常大的分子。本发明的GAG成分可包括但不限于天然蛋白聚糖，以及蛋白聚糖的糖胺聚糖部分。GAG可以是硫酸酯化的(例如，软骨素、皮肤素、角蛋白或类肝素)，或者可以是非硫酸酯化的(例如，透明质素(HA)或肝素)。或者，可以使用糖胺聚糖的类似物，例如硫酸葡聚糖或硫酸戊聚糖。根据本文中的其他一些实施方案，可以使用透明质素(HA)。一些所述的“交联” GAG (例如交联HA (例如,欣维可(Synvisc) (Genzyme)))含有相对低含量的交联物质。在这种情况下，多数分子以游离的非结合HA存在，对于本发明的目的而言，该制剂被视为HA。在循环中，透明质素被至少两种形式的透明质酸酶快速降解。因此，血管内(血浆)高分子量HA(例如，具有2，OOOkD的Mw)的半衰期相对较短，通常少于I小时，这取决于所给予的总剂量。在细胞水平上，HA被一系列酶促反应逐渐降解，所述反应产生降低了大小的聚合物，多种小级分(fraction)经常触发不同的信号转导通路。因此，高分子量的HA可通过肠胃外注射施用，并且充当前药以在体内产生更小级分(例如实施例I中使用的HA级分)。下文中的实施例I中研究了分子量(Mw)在I. 53kD与250kD之间的多个明显(sharp) HA级分的作用对HA和多糖对血小板活化的作用。尽管在这个范围中的所有的级分均显著地降低血小板活化，作用最明显的重均分子量为约2. 67kD。 与HA相比，正常情况下葡聚糖不在血浆中降解而仅被肝或网状内皮系统(RES)降解。因此，葡聚糖的血管内(血浆)半衰期比HA长得多，其范围从约30分钟(对于Mw约IkD的葡聚糖小级分)至超过10小时(对于70kD的葡聚糖)，这部分地取决于肾功能，因为小于约20kD的分子通过肾脏自由排泄(见，Arfors，Buckley，1997)。HES的血浆半衰期取决于Mw，但也比HA长得多。然而，应注意的是，当施用进入血液供应相对较差的组织(例如结缔组织(例如，软骨、肌腱、韧带、角膜等))或进入无血管的隔室(例如，滑膜(关节)空间)时，HA和多糖的半衰期可长得多。因此，本领域技术人员可在所公开的聚合物组合中调节每种成分的剂量和相对比例以及分子量，以为每个具体的应用和组织中的最佳作用时间以及为损伤的每个具体的类型和程度“量身定做”配方。所公开的组合物中的一个具体多糖成分是临床应用的葡聚糖，其与其他聚合物一样，作为不同大小分子的混合物出现，分子大小范围从具有约0. 3kD Mw的异麦芽糖寡聚物至具有远超过IOOkD Mw的大分子。在这个广泛的分子量范围中的葡聚糖级分抑制过度血小板活化及其随后的病理生理后遗症(包括白细胞活化、血栓形成等)是公知的(见，Arfors, Buckley,1997)。如上述指出的那样，所使用的葡聚糖级分的分子量将决定它的血浆或组织半衰期，尤其是如果多数级分处于低于肾葡聚糖阈(约20kD)时。因此，非常小分子的葡聚糖(例如，异麦芽糖寡聚物)被迅速地从循环中除去。然而，当以等同的或确定的血浆浓度研究不同的葡聚糖级分时，它们对血小板和下游级联的作用似乎基本上是类似的，至少对在可接受的“临床”Mw范围(约0.5kD至约IlOkD)内的葡聚糖级分而言基本上是类似的。例如，Steinbaueret al.，1997&1998 发现在具有 lkD、40kD、60kD、70kD、IlOkD 和150kD Mw值的葡聚糖级分在标准的仓鼠缺血-再灌注损伤模型中再灌注后30分钟之后对血小板活化的替代标志(白细胞黏附)的作用之间未发现显著的不同。然而，如所预期，再灌注后，在靠后的时间点上的测量尤其反映了所述更小葡聚糖级分的更短血浆半衰期。因此，在下文中的实施例I中，考虑到再灌注30分钟后葡聚糖对血小板激活和脱颗粒以及随后的白细胞黏附的特异性作用，选择80%分子处于约14kD至180kD之间并且> 5%分子处于约IOkD以下的代表性的葡聚糖60之广泛级分代表Mw范围从IkD至IlOkD的临床葡聚糖。将一个或更多个用于与上述GAG组合使用的本发明的多糖成分可由临床上可接受的中性多糖(例如，葡聚糖，或者经取代的淀粉(例如，轻乙基淀粉(Hydroxyethylstarch, HES))或聚乙二醇(PEG)的生物相容性级分或岩藻多糖)的一个或更多个级分组成。所述多糖成分可以是小的亚胶体级分(Mw < 15kD)，例如异麦芽糖寡聚物(即水解的葡聚糖)或甘露醇。或者，所述多糖成分可以是更高分子量的胶体级分，其中多数的多糖分子高于肾和毛细管阈(> 20kD)，例如葡聚糖40或60或者HES130或200。所述多糖成分可作为替代地是药学上可接受的亚胶体与胶体多糖的混合物。根据所公开组合物的某些方面，所述胶体多糖是Mw为约0. 3kD至约IOOkD的葡聚糖。在另一个实施方案中，所述多糖成分是亚胶体多糖，包括重均分子量(Mw)为约0.3kD至约IOkD的异麦芽糖寡糖。在本发明的另一个方面中，所述多糖成分是葡聚糖的亚胶体级分(亦称为异麦芽糖寡聚物)与葡聚糖的胶体级分的双峰混合物。所公开组合物可用于预防和治疗的后遗症和并发症包括但不限于过度的血小板活化的任何病理生理的或非期望的直接或间接的结果，该结果包括但不限于血栓形成、大栓子或微栓子的形成、白细胞超活化、粥样斑或增生形成和再狭窄、缺血-再灌注损伤、以及过度的纤维蛋白凝块收缩，包括在筋、皮肤或角膜中引起非弹性瘢痕或纤维化形成之结缔组织损伤的次优愈合。在本发明的一个方面中，提供在温血对象(例如，人)中治疗或预防创伤性或缺血性病症的方法。根据本发明的这个方面，所述方法包括向对象施用治疗性组合物，该组合物含有有效剂量的透明质酸(HA)和中性多糖用以在对象的血管系统中抑制血小板过度活化、黏附和聚集。在某些方面中，创伤性或缺血性病症是创伤性事故(例如，钝性或穿透性损伤)，并且可涉及大失血、骨折、破裂的肌腱或韧带、有意的创伤(例如，外科手术，特别是重大的时间长的手术)、失血或血管阻塞，这些可导致肺栓子的发生(例如，髂股血栓形成、肠系膜静脉血栓形成以及巴-吉综合征(Budd-Chiari syndrome))。在本文的一个形式中，本发明尤其可用于在患者中治疗或预防血栓形成或微栓子，所述患者例如在出血性中风中没有持续的大失血并因此可不耐受大剂量的葡聚糖或其他容量扩充剂。在本文的另一个形式中，缺血性病症是动脉血栓形成(尤其是冠状动脉血栓形成)，其中进一步的血小板活化可以是有害的。根据本发明的另一些方面，提供在处于发生这样的并发症之风险的温血对象中预防和降低血栓形成或微栓子形成的方法。根据本发明的这个方面，向对象施用治疗性的组合物，该组合物含有有效抑制血小板的黏附和聚集之剂量的透明质酸和多糖。根据本发明这个方面的一个示例性实施方案，由于破坏止血的医疗状况(包括肝素诱导的血小板减少、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、妊娠、中风、瘤形成、肥胖、系统型红斑狼疮、肾病 综合症、真性红细胞增多症、炎性肠病、高胱氨酸尿症(homocyteinemia)、高高胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、休克和充血性心力衰竭)，所述对象可具有升高的发生血栓的风险。在其他一些方面中，所述哺乳动物由于医疗过程可具有升高的发生血栓或微栓子的风险，包括心脏手术、心肺分流术、导管插入术、经皮腔内冠状血管成形术和粥样斑切开术(atherotomy)，以及涉及合成的或生物假体的修复术(例如，心血管瓣)的过程。本文中应该理解和领会的是，根据本发明某些公开的方面，可全身或局部施用HA与多糖的组合。此外，HA与多糖的施用可以发生在医学或手术操作或者用其他药剂(例如，溶血栓剂)治疗之前、之中或之后。在本发明的另一个方面中，提供抑制血小板与假体装置表面黏附的方法，该方法是通过用一定量的透明质酸加多糖包被所述装置实现的，所述量足以在所述装置暴露于所述血小板之前抑制所述血小板与所述装置表面的相互作用。根据本发明的这个方面，所述装置可由通常用于医疗过程的任何适合的全部或部分合成的生物相容性材料制成。在某些实施方案中，所述假体装置是冠状瓣、血管 移植物或支架。在本发明的另一个方面中，提供诱导或加强损伤的结缔组织或皮肤的修复和再生而没有非期望的非弹性瘢痕组织之形成的方法。依据这个实施方案，将所公开的组合物与损伤的结缔组织(例如，肌腱或韧带、皮肤或角膜)相接触。依据某些实施方案，本发明还提供在对象(例如，哺乳动物)中通过以本发明的组合物接触对象破裂组织之末端来治疗关节内和关节外损伤的方法。根据本发明的这个方面，关节内损伤包括例如半月板和韧带撕裂，而关节外损伤包括例如韧带、肌腱或肌肉的损伤。根据本发明的某些方面，提供了通过将所公开组合物引入关节来治疗急性关节炎症的方法，所述急性关节炎症例如在与膝骨关节炎有关的(运动)损伤中创伤或急性过载后的急性关节炎症。本文中应该了解和领会的是，本发明的方法和组合物还可以类似地用于治疗慢性炎性状态(例如，类风湿性关节炎性的关节疾病)，其中已经报道从活化的血小板中释放的细胞因子在炎症的产生中发挥关键作用(见，Boilard, 2010)。在该情况下应注意的是，将单独的葡聚糖(单-或双-峰级分)注射进入发炎的关节表现出对炎症和痛苦的降低，如美国专利号5，902，800中本发明的一个发明人所报道的那样。而本领域普通技术人员已知内源性高分子量HA存在于关节滑液中，并且已知可通过加入黏弹剂(其可包括HA)调节葡聚糖溶液的黏度或润滑特性，按照(或关于)目前公开的它们对血小板活化及其相关的后遗症(包括炎症)的作用，或者对损伤的结缔组织之再生的新的协同作用，本发明人无法得知葡聚糖与HA之间具体协同相互作用的任何教导或者提示。根据本文所公开的葡聚糖和HA的新协同作用，技术人员能够设计用于炎性关节疾病(尤其是过度多糖所诱导的滑膜关节体积膨胀为非期望或禁忌的炎性关节疾病)的更知情和灵活的剂量策略。在这个方面中，HA与高浓度的非常小分子的葡聚糖或异麦芽糖寡聚物(Mw 0. 3kD IOkD)的组合将会降低过度体积膨胀以及与高Mw葡聚糖相关的副作用，但仍然满足下文中所公开的与HA协同的情况。此外，下述实施例I中公开的发现表明，当HA具有低Mw( < 250kD)时，葡聚糖与HA之间的协同是最佳的。因为高Mw HA的酶促降解发生在循环血液中，将高Mw的HA(例如，Mw 2，OOOkD)血管内施用进入血流将充当用于将更低Mw的HA部分递送至发炎组织的前药。
然而，在无血管的隔室(例如滑膜(关节)空间)中，不发生这种迅速的降解。因为滑膜空间正常地含有非常高Mw (> 3，OOOkD)的内源性HA，并且很少接近循环中的透明质酸酶，降解(以及产生< 250kD的HA部分)的速率显著慢于血液中的速率。因此，单独将葡聚糖注射进入所述关节(即其与很高Mw的内源性HA体内混合)将不会产生用于促进葡聚糖与HA之间协同相互作用的最佳条件，这是因为滑膜HA的Mw太高了。尽管在关节的严重的炎性急性发作中的内源性滑膜HA的Mw通常较低，但它很少低于2，OOOkD，这仍然远高于与葡聚糖或其他多糖协同的最佳HA Mw范围(< 250kD)。因此，根据本发明的某些方面，在温血动物(包括人)中治疗炎性关节疾病的方法可包括关节 内注射生物相容的中性多糖(例如，葡聚糖、异麦芽糖寡聚物、HES、PEG或岩藻多糖)与HA的共混物，所述中性多糖具有低于2，OOOkD (或者更具体地低于500kD)的Mw。根据本发明的这个方面，所述葡聚糖的Mw可处于约0. 3kD至约IlOkD之间。然而，本文中应该了解和领会的是，目前公开的方法不排除添加合适量的高或很高分子量的HA (线性的或交联的)或者其他，仅用于调节黏度或润滑性目的的黏弹剂，如美国专利5，902，800中所提到的那样。在本发明某些具体的方面中，当用于在血液中全身施用以预防血小板活化或黏附及其病理生理的后遗症时，以约3mg/kg体重至约600mg/kg体重的范围给以所公开组合物的HA成分，其中以约3mg/kg体重至约2，000mg/kg体重的范围给以用于相同目的所述组合物的多糖成分。所公开的溶液形式的HA与多糖的组合物的黏度应低于1000厘泊并且高于15厘泊。可根据具体浓度的HA和多糖所需的黏度来调节HA与多糖成分的分子量。根据某些实施方案，HA的平均分子量高于约I. 5kD ;更具体地，在约2. 6kD与约3，OOOkD之间，并且甚至更具体地，在约IOOk至约2000kD之间。在其他一些实施方案中，多糖的平均分子量在约0. 3kD至IlOkD之间，更具体地在约0. 5kD至约70kD之间，并且甚至更具体地，所述多糖具有双峰分子量分布，其是通过将Mw范围为约500D至约IOkD的很低分子量的多糖与Mw范围为约20kD至约75kD的较高分子量的多糖混合而获得。对于在目的作用的部位局部施用HA和多糖溶液以预防过度血小板活化或者凝块收缩，HA成分的浓度处于约0. 1%至约7%之间并且多糖成分处于约1%至约32%之间，并且HA加多糖之组合的黏度处于约20厘泊至约300，000厘泊的范围之内。根据本发明的某些实施方案，所述组合物是生物聚合物的水溶液，其含有含量为约0.1%至约7% (w/v)的透明质素以及含量为约I至约25% (w/v)的葡聚糖或HES,所述透明质素具有范围为约I. 5kD至约6，OOOkD的重均分子量(Mw),所述葡聚糖具有范围为约0. 3kD至约IlOkD的Mw，并且所述HES具有范围为约IOkD至约500kD的Mw。根据本发明的另一些实施方案，提供将上述的多聚物组合移植或注射进入需要这种治疗的组织的损伤、缺损或病症的方法，而根据另一些实施方案，所述组合物可用于再生结缔组织，并且可施用至具有结缔组织(例如，骨、软骨、肌腱和韧带)损伤或失去结缔组织的区域。在以下实施例中展示本发明的过程、方法和组合物的优点和改进。这些实施例只是示例性的，并且并不意在限制或排除本发明的其他实施方案。
实施例I
使用在再灌注过程中i. V.输注的以罗丹明-6G离体标记的血小板，通过活体内荧光显微镜检查，在标准化的小鼠小肠模型中体外研究透明质素(HA)和葡聚糖的各种明显级分对在微循环中血小板滚动和黏着(sticking)的影响。在麻醉下，雌性Balb/c小鼠经受中线剖腹术，轻轻地取出空肠段；用微型夹阻塞节段动脉而诱导肠缺血90分钟，随后再灌注30分钟以模拟缺血-再灌注损伤(I/R)。与假手术(sham)对照相比，该标准损伤诱导血小板滚动以及血小板与小动脉和小静脉内皮细胞之黏附的高度显著的升高。给予其他组动物低静脉内(i. V.)剂量(10 30mg/kg)的Mw 1，530D至Mw约250，000D的纯的无热原HA的几种不同的明显(单体)级分。所有的组由5只或6只动物组成，以平均值+/-SEM记录数值。在30mg/kg和10mg/kg剂量水平,HA的所有级分显著降低了在小动脉中I/R损伤对血小板滚动和黏附的作用(P < 0. 05相对于I/R)。当最低HA剂量(10mg/kg)对血小板活化的作用与很低剂量的葡聚糖60 (5mg/kg) 相比以及与在相同的模型中以相同剂量的这些相同聚合物的组合相比时，获得了以下结果。在小动脉中，血小板的牢固的附着从单独经受I/R之组中的平均805mm_2降低至经受I/R之后以HA(10mg/kg)处理之组中的平均410mm_2。在I/R后接受单独的5mg/kg葡聚糖60的那些组中，血小板黏附的平均值为约190mm-2。I/R后接受10mg/kg HA与5mg/kg葡聚糖60之组合组的相应平均值为130mm-2(p < 0. 05，相对于I/R)。小动脉中血小板的滚动以相似的方式应答于I/R、HA和葡聚糖60 ;I/R诱导血小板滚动急剧升高，从2mm-l/秒/mm(假手术组)升高至30mm_l/秒/mm,而I/R后10mg/kgHA使滚动降低至24mm-l/秒/mm。I/R后单独的葡聚糖60 (以5mg/kg)所诱导的滚动降低至约2Imm-I/秒/mm,而I/R后10mg/kg HA+5mg/kg葡聚糖60之组合使滚动降低至6mm_l/秒 /mm(p < 0. 05，相对于 I/R)。尽管上述HA和葡聚糖在小动脉中有显著的抗黏附作用，在小静脉方面，10mg/kgHA或5mg葡聚糖60没有显著降低血小板黏附。然而，单独的HA和单独的葡聚糖都显著地降低小静脉中的血小板滚动，并且10mg/kg HA+5mg/kg葡聚糖之组合使其远远更大程度地降低(假手术组、I/R、10mg/kg HA、5mg/kg葡聚糖和HA/葡聚糖组合的对应值分别为3、34、20、15和IOmm-I/秒/mm)。因此，在选定的时间点(再灌注后30分钟)，以非常低的剂量分别注射的HA和葡聚糖显著地降低由缺血90分钟所诱导的强烈血小板活化和黏附。一起(同时地)给予很低剂量(5mg/kg)的葡聚糖(即以远低于发挥任何容积扩充、血液稀释或对循环具有其他流变作用的剂量)与HA的组合逆转了 I/R对血小板的作用，比分别单独给予HA或葡聚糖的作用大得多；因此，表现出显著的协同作用。如上所述,在“临床”分子量范围(IkD至IlOkD)内的所有葡聚糖级分在相当于血管内的浓度下表现出相似且公知的对血小板超活化和下游血小板诱导的级联的抑制(例如，与白细胞活化和募集相关的那些)。因此，在上述的实施例I中作为代表性葡聚糖而使用葡聚糖60相对广泛的级分，其中约80%的摩尔质量分布处于14kD和180kD之间，并且显著的级分(> 5% )的范围是0. 5kD IOkD和190kD 210kD。尽管HA的血管内半衰期远短于葡聚糖的半衰期，当炎症级联开始触发时，在创伤后至关重要的早期阶段，应当足以协同地增强葡聚糖在减弱过度血小板活化和脱颗粒中的作用。如果要预防随后的过度血小板活化的下游并发症，在级联产生中抑制这个早期阶段是很重要的。因此，i. V. HA与葡聚糖的公正组合不仅确保在创伤后立即在血小板活化至关重要的早期阶段最大控制过度血小板超活化，而且允许更长时间(长达8 10小时)地的维持控制(例如手术后过夜)以确保对并发症的最佳预防。在这个方面中，在许多治疗情形中不选择单独使用HA抑制超活化的血小板。
实施例2关于背景，肌腱和韧带是在马相关产业中是“停工时间(down time) ”的主要原因。尤其是趾浅屈肌肌腱(superficial digital flexor tendon, SDFT)的损伤通常是具有高再损伤发生率的限制职业生涯(career)的损伤(见，Dyson S，2004)。这些损伤在当前提供的过多的新的通常无效的治疗选择中消耗了的宝贵时间和资源。尽管已声称一些有限的 进步(例如，使用自体干细胞的情况)，停工时间(非生产性的恢复期时间)仍然超过12个月(见，Stashak，2002，p 617)。以前的研究利用病灶内透明质素(HA) (Dyson S，1977，2004)得出结论“与单独的对照实验相比，用透明质素或者PSGAG的治疗未表现出益处”。因此，开展研究以查明在单独使用病灶内1%透明质素(HA)治疗SDF肌腱损伤中之前糟糕的历史结果是否可通过病灶内注射透明质酸与胶体和亚胶体多糖混合物的组合(代号GLVlI，由本发明中所描述的1% HA(Mw为约l，500kD)、10%的葡聚糖70和I. 2%的异麦芽糖低聚糖组成)而被改善。将HA与葡聚糖的组合直接注射进入肌腱核心的病灶而不是注射进入腱鞘或邻近的组织，以明确地将其物理润滑特性与本文中公开的出人意料的加速肌腱核心中损伤结缔组织再生的能力区分开来。到目前为止，具有急性肌腱或悬韧带损伤之超声证据的246匹马已进入本研究。
对象群包括所有主要的品种、性别、年龄和表现水平-54%标准种马(Standardbred)、
12<% 夸特马(Quarterhorse)、8 纯血马(Thoroughbred)、8 绕桶马(barrel horse)、13%猎马(hunter)和4%其他马。年龄范围为3岁到17岁，平均年龄7. 12岁，且中位年龄为7岁。50%的马有悬韧带病变，31%有浅屈肌肌腱病变，并且13%有XYZ韧带或远侧籽骨韧带(distal sesmoidianligament)损伤。病变的范围为I % 80%的肌腱以及5% 50%的悬韧带损伤。这些马中，69%是骧马，25%是公马，其余是母马。施:所有的马在损伤的24至48小时内接受超声。对损伤的区域进行手术准备，并且以每立方厘米损伤组织约I立方厘米(cc)的剂量病灶内无菌注射GLV11。应用Gelocast并且在48小时后更换。另外48小时之后除去第二个Gelocast。当可能时，使马在接下来的14天中浸泡在水中(aquasized)。在无法获得水疗的情况下，每天牵着所述马行走两次，40分钟。第18天后，使该马返回轻量工作14天，随后，超声检查后恢复训练。多数的马以伸长快跑(extended trot)每天运动6英里。随后,根据驯兽师的决定，允许该马继续比赛或表演。到目前为止的结果到目前为止治疗的246匹急性肌腱/悬(韧带)损伤中，94%在少于50天恢复竞赛，其中根据品种，92%在最少3个月或12场比赛保持良好。这与尽管用单独的HA进行治疗仍然通常需要12个月使马恢复比赛反差明显。根据Sue Dyson博士(马肌腱损伤的主要国际权威)，在由她以前进行的一项研究中，在仅用1% HA治疗的马中，复发性肌腱损伤的发生率范围为约20至57% (见Dyson S.，2004)。对肌腱损伤的其他历史数据表明，这些马中的仅20 60%恢复比赛。约80%在比赛中再次受伤，并且44 %的表演马也再次受伤。益论考虑到马的年龄、品种以及性别的广范差异，对于给定的不同损伤，恢复表演水平的时间是极其短的。“停工时间”的这种出人意料的降低与非常低的损伤复发率一起表明HA与异麦芽糖寡聚物和胶体葡聚糖之组合不但加速肌腱/韧带的修复，而且使这些组织的强度和弹性恢复至其原来的损伤前的状态。展现的结果通过超声图像和早期恢复正常比赛而没有过度的再损伤率十分客观地表明，通过对照实验或单独用透明质素、PSGAG或BAPN常规治疗的马中病灶发生的再生或维持愈合少于正常需要时间的四分之一。在这个方面中，对于马产业而言，降低表演的“停工时间”的经济益处是非常显著的。就降低痛苦和花费而言，相同的益处也适用于人结缔组织损伤，特别是运动员或创伤患者的肌腱和韧带损伤。马研究结果表明不仅恢复时间显著地降低，而且恢复比赛后的再损伤率出人意料地低，这表明在病灶处再生的新胶原原纤维的弹性和强度与未损伤的肌腱很好地媲美，即以与张力梯度很好地同轴一致地发生多数胶原原纤维的再生。相比之下，当没有具体治疗而使病灶自愈时，所报道的无组织的非弹性瘢痕和持续的次优胶原新生发生在肌腱损伤后的至少 14 个月(见，Williams, IF, 1985)。关于急性肌腱或其他结缔组织损伤后非弹性瘢痕组织的预防，本发明人推测所公开组合物的其他因素或成分理论上也可有助于上述实施例中所观察到的所公开组合物的重要成分之间出人意料的协同。例如，公知的是，发现透明质素(HA)在胚胎和胎儿组织中的浓度比在成人相应组织中的浓度高的多。因此胎儿伤口愈合需要最少的炎性应答并且没有明显的瘢痕，并且这似乎(见，01utoVe，0 0，1997年的体外研究)与HA的存在有关，试图推测本发明组合物的HA成分可有助于本文中公开的出人意料的结果。然而，其他作者(见，Dyson S, 1997&2004)在对219匹马的大量体内试验中，单独使用HA在肌腱修复中未表现出任何显著的改善。同样公知的是，在中性糖类多聚物(例如，葡聚糖、羟乙基淀粉(HES)或岩藻多糖)存在下形成的纤维蛋白在聚合过程中倾向于形成远远更粗的纤维，并且引起的凝块更脆以及更容易被内源性纤溶酶tPA所溶解(见，Strauss 1985，Carr 1995)。虽然并入了本发明原理的示例性的实施方案已经在上文中公开，但本发明不限于所公开的实施方案。相反，本申请意在覆盖使用其一般原理的本发明的任何变化形式、应用或修改。此外，本申请意在覆盖本公开内容的这样的偏离其来自于与本发明所属的领域和落入所附权利要求书中所限制的领域中已知或常规的实践。参考文献以下参考文献通过引用全文并入本文:
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权利要求
1.能够减弱血小板超活化的组合物，其包含水溶液，所述水溶液含有以重量计约0.1%至约7.0%的糖胺聚糖和以重量计约1.0%至约32%的中性多糖。
2.权利要求I的组合物，其中所述糖胺聚糖(GAG)选自以下至少一种透明质素、软骨素、皮肤素、角蛋白、类肝素、肝素和GAG类似物硫酸葡聚糖、硫酸戊聚糖。
3.权利要求I的组合物，其中所述中性多糖选自以下至少一种异麦芽糖寡聚物、葡聚糖、羟乙基淀粉、聚乙二醇(PEG)和岩藻多糖。
4.权利要求I的组合物，其中所述糖胺聚糖是透明质素并且所述中性多糖是葡聚糖，所述透明质素具有约I. 5kD至约6，OOOkD的重均分子量并且所述葡聚糖具有约0. 3kD至约IlOkD的重均分子量。
5.权利要求4的组合物，其中所述透明质素具有约2.5kD至约2，500kD的重均分子量。
6.权利要求4的组合物，其中所述葡聚糖具有约0.5kD至约50kD的重均分子量。
7.权利要求I的组合物，其中所述中性多糖是具有约IOkD至约500kD重均分子量的羟乙基淀粉。
8.权利要求7的组合物，其中所述中性多糖是具有约20kD至约350kD重均分子量的羟乙基淀粉。
9.权利要求I的组合物，其中所述中性多糖是具有约0.3kD至约IOkD重均分子量的异麦芽糖寡聚物。
10.权利要求9的组合物，其中所述中性多糖是具有约0.5kD至约4kD重均分子量的异麦芽糖寡聚物。
11.权利要求I的组合物，其中所述糖胺聚糖是具有低于约25%交联度的部分交联的透明质素。
12.权利要求I的组合物，其还包含抗氧化剂、清除剂、细胞因子、生长因子、白介素、基因治疗剂、黏弹剂和干细胞中的至少一种。
13.通过向对象施用有效量的含有糖胺聚糖和中性多糖的水溶液来治疗血小板超活化及其相关疾病、病症或病理生理后遗症的方法。
14.权利要求13的方法，其中所述相关疾病、病症或病理生理后遗症包括选自以下的疾病血栓形成、动脉粥样硬化疾病的血栓性并发症、动脉粥样硬化疾病之介入的血栓性并发症、与手术或机械损伤相关的血栓性并发症、机械诱导的血小板活化、分流阻塞、继发于血管损伤和炎症的血栓形成、弥漫性血栓或血小板消耗成分的适应症、静脉血栓形成、冠状动脉血栓形成、动脉粥样硬化和动脉硬化的病理作用、血液和血液制品储存期间的血小板凝集和凝块形成、超凝集能力的慢性或急性状态、纤溶治疗后的动脉或静脉的再阻塞、与体外循环相关的血小板黏附、与溶栓治疗相关的血栓性并发症、与冠状和其他血管成形术相关的血栓性并发症、与冠状动脉旁路手术相关的血栓性并发症和以血小板脱颗粒所触发的炎症级联为特征的疾病、手术或后遗症，包括选自以下的疾病内膜增生，动脉或，心肌梗死，与凝块溶栓、松开钳夹、血管形成术、器官和组织移植、组织抢救性重建手术或在低血容量症中血量恢复之后的缺血-再灌注损伤有关的白细胞活化、聚集、黏附和自由基损伤升高，炎性关节疾病和过度纤维蛋白凝块收缩的后遗症，包括结缔组织中的纤维化和瘢痕。
15.权利要求13的方法，其中所述糖胺聚糖以所述水溶液重量的约0.1%至约7.0%的量存在。
16.权利要求13的方法，其中所述中性多糖以所述水溶液重量的约I.0%至约32%的量存在。
17.权利要求13的方法，其中所述糖胺聚糖(GAG)选自以下至少一种透明质素、软骨素、皮肤素、角蛋白、类肝素、肝素和GAG类似物硫酸葡聚糖、硫酸戊聚糖。
18.权利要求13的方法，其中所述中性多糖选自以下至少一种异麦芽糖寡聚物、葡聚糖、羟乙基淀粉、聚乙二醇(PEG)和岩藻多糖。
19.权利要求13的方法，其中所述糖胺聚糖是透明质素并且所述中性多糖是葡聚糖，所述透明质素具有约I. 5kD至约6，OOOkD的重均分子量并且所述葡聚糖具有约0. 3kD至约IlOkD的重均分子量。
20.权利要求19的方法，其中所述透明质素具有约2.5kD至约2，500kD的重均分子量。
21.权利要求19的方法，其中所述葡聚糖具有约0.5kD至约50kD的重均分子量。
22.权利要求13的方法，其中所述中性多糖是具有约IOkD至约500kD重均分子量的羟乙基淀粉。
23.权利要求22的方法，其中所述中性多糖是具有约20kD至约350kD重均分子量的羟乙基淀粉。
24.权利要求13的方法，其中所述中性多糖是具有约0.3kD至约IOkD重均分子量的异麦芽糖寡聚物。
25.权利要求24的方法，其中所述中性多糖是具有约0.5kD至约4kD重均分子量的异麦芽糖寡聚物。
26.权利要求13的方法，其中所述糖胺聚糖是具有低于约25%交联度的部分交联的透明质素。
27.权利要求13的方法，其中向所述对象施用有效量水溶液的步骤包括向所述对象表面应用所述水溶液或者向所述对象注射所述水溶液的至少一种。
28.权利要求13的方法，其中所述对象包括哺乳动物。
29.通过向对象施用水溶液来修复、再生、治疗结缔组织损伤、缺损或病症或诱导其修复的方法，所述水溶液含有以重量计约0. 1%至约7. 0%的糖胺聚糖和以重量计约I. 0%至约32%的中性多糖的。
30.权利要求29的方法，其中所述对象包括哺乳动物。
31.权利要求29的方法，其中所述糖胺聚糖选自以下至少一种透明质素、软骨素、皮肤素、角蛋白、类肝素、肝素和GAG类似物硫酸葡聚糖、硫酸戊聚糖。
32.权利要求29的方法，其中所述中性多糖选自以下至少一种异麦芽糖寡聚物、葡聚糖、羟乙基淀粉、聚乙二醇(PEG)和岩藻多糖。
33.权利要求29的方法，其中所述糖胺聚糖是透明质素并且所述中性多糖是葡聚糖，所述透明质素具有约I. 5kD至约6，OOOkD的重均分子量并且所述葡聚糖具有约0. 3kD至约IlOkD的重均分子量。
34.权利要求33的方法，其中所述透明质素具有约2.5kD至约2，500kD的重均分子量。
35.权利要求33的方法，其中所述葡聚糖具有约0.5kD至约50kD的重均分子量。
36.权利要求29的方法，其中所述中性多糖是具有约IOkD至约500kD重均分子量的羟乙基淀粉。
37.权利要求36的方法，其中所述中性多糖是具有约20kD至约350kD重均分子量的羟乙基淀粉。
38.权利要求29的方法，其中所述中性多糖是具有约0.3kD至约IOkD重均分子量的异麦芽糖寡聚物。
39.权利要求38的方法，其中所述中性多糖是具有约0.5kD至约4kD重均分子量的异麦芽糖寡聚物。
40.权利要求29的方法，其中所述糖胺聚糖是具有低于约25%交联度的部分交联的透明质素。
41.权利要求29的方法，其中所述结缔组织选自以下至少一种肌腱、韧带、软骨、骨、皮肤和角膜。
42.权利要求29的方法，其中所述施用步骤包括将所述水溶液植入所述对象以增强所述结缔组织的直接修复。
43.通过向对象施用水溶液来修复、再生、治疗结缔组织损伤、缺损或病症或诱导其修复的方法，所述水溶液含有以重量计约0. 1%至约7. 0%的糖胺聚糖、以重量计约I. 0%至约25%的中性胶体多糖以及以重量计约0. 3%至约35%的中性亚胶体晶体样多糖，其中所述糖胺聚糖具有约2kD至约5，OOOkD的重均分子量，所述中性胶体多糖具有约20kD至约IOOkD的重均分子量，并且所述亚胶体晶体样多糖具有约0. 4%至约4kD的重均分子量。
44.权利要求43的方法，其中所述对象包括哺乳动物。
45.权利要求43的方法，其中所述糖胺聚糖选自以下至少一种透明质素、软骨素、皮肤素、角蛋白、类肝素、肝素和GAG类似物硫酸葡聚糖、硫酸戊聚糖。
46.权利要求43的方法，其中所述中性胶体多糖选自以下至少一种异麦芽糖寡聚物、葡聚糖、羟乙基淀粉、聚乙二醇(PEG)和岩藻多糖。
47.权利要求43的方法，其中所述糖胺聚糖是具有低于约25%交联度的部分交联的透明质素。
48.权利要求43的方法，其中所述结缔组织选自以下至少一种肌腱、韧带、软骨、骨、皮肤和角膜。
49.权利要求43的方法，其中所述施用步骤包括将所述水溶液植入所述对象以增强所述结缔组织的直接修复。
全文摘要
能够减弱血小板超活化的组合物以及用于向对象施用所述组合物的相关方法，所述组合物包含水溶液，其含有以重量计约0.1％至约7.0％的糖胺聚糖和以重量计约1.0％至约32％的中性多糖。
文档编号A61K31/715GK102665412SQ201080051615
公开日2012年9月12日 申请日期2010年9月21日 优先权日2009年9月23日
发明者巴克利·皮特·拜伦, 梅斯麦·康瑞德, 菲利普·马克·威廉 申请人:克能药物有限公司